納米銀聯(lián)合自噬抑制劑殺傷腫瘤的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及納米銀聯(lián)合自噬抑制劑殺傷腫瘤，具體涉及納米銀與自噬抑制劑和/或敲低/敲除自噬相關基因表達的試劑用于制備抗腫瘤藥物的用途及自噬抑制劑和/或敲低/敲除自噬相關基因表達的試劑用于促進納米銀對腫瘤細胞殺傷的用途。
【專利說明】納米銀聯(lián)合自噬抑制劑殺傷腫瘤

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種納米銀與自噬的抑制劑或者敲低/敲除自噬必須基因表達的試 劑用于制備抗腫瘤藥物的用途。

【背景技術】
[0002] 納米銀就是將粒徑做到納米級的金屬銀單質。納米銀由于其很好的殺菌作用，被 應用于醫(yī)療領域，比如抗菌類醫(yī)藥及醫(yī)療器械，抗菌塑料及橡膠制品，抗菌紡織品及服裝鞋 襪等。納米銀還具有很多別的生物學效應，比如抗真菌、抗病毒、消炎。作為為數(shù)不多的已 經被應用于臨床的納米材料，近年的細胞以及小鼠實驗研究表明，納米銀還可能是一種潛 在的抗腫瘤藥物。納米銀已經在多種癌細胞中被證實具有很強的細胞殺傷效果，包括氧化 壓力、DNA損傷、細胞周期停滯、凋亡、壞死。
[0003] 納米銀在動物模型中的抗腫瘤效果也得到了驗證。在道爾頓淋巴腹水瘤小鼠模 型中，相對于沒加納米銀處理組，納米銀對腹水中癌細胞進行殺傷，很好的控制了腹水的體 積，使得小鼠的體重還原至腹水瘤接種前的體重。另外一項研究顯示，納米銀對惡性黑色素 瘤具有很好的殺傷效果，用細胞穿膜肽TAT修飾納米銀以增加其穿透細胞的效果后，黑色 素瘤的殺傷效果得到了進一步的提升，與用阿霉素處理的抑瘤效果相似。不過不同的是阿 霉素處理組小鼠體重明顯下降，而納米銀處理組小鼠的體重還有一定程度的增加，顯示了 其更小的副作用。納米銀抗腫瘤的另外一個特點是抑制腫瘤血管的生長，腫瘤血管的生成 是腫瘤生長、侵潤、轉移過程中至關重要的一步。在鏈唑霉素刺激誘導大鼠腫瘤模型中，可 以見到明顯的腫瘤血管生成，納米銀處理后，新腫瘤血管生成的現(xiàn)象被抑制。
[0004] 自噬是真核生物細胞內一種基本降解過程，當自噬發(fā)生時，雙層膜包裹細胞內非 必要的或者功能失常的組分形成自噬體，自噬體與溶酶體融合對內容物進行降解，這個過 程具有很重要的生理以及病理學意義。自噬在發(fā)育分化、癌癥、神經退行性疾病、衰老、免疫 等生理病理方面起著非常重要的作用。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中被認為起著促進腫瘤 生長和抑制腫瘤生長兩方面的作用。
[0005] 自噬在腫瘤發(fā)生過程中起著雙刃劍的作用。一方面來講，自噬可以增強腫瘤細胞 對壓力（包括低氧環(huán)境、饑餓、一些治療手段）的耐受。即使在更長時間的壓力下，自噬可以 延長腫瘤細胞的生存時間，產生休眠的腫瘤細胞，使其在生存條件變好之后能重新復活。由 自噬帶來的壓力下存活、休眠、重生等一系列效應可能是腫瘤治療的一個阻礙。另一方面， 正是由于自噬可以減輕壓力造成的損傷，這對抑制腫瘤的生長意義重大。因為通過消除損 壞的蛋白和細胞器，自噬可以避免基因組的損傷，基因組的損傷往往會促進腫瘤發(fā)生。慢性 細胞死亡和炎癥反應都可能促進腫瘤的發(fā)生，自噬能對這些損壞進行消除，從這方面講自 噬可以抑制腫瘤發(fā)生。但是如果自噬被抑制，細胞內的平衡遭到破壞，這樣更加會導致腫瘤 的發(fā)生。腫瘤細胞可以適應環(huán)境，并且對體內特定的壓力產生更強的適應性，這就導致腫瘤 細胞更加難以被清除。自噬在這個過程中，通過維持新陳代謝狀態(tài)可能阻止腫瘤細胞演變 為更加惡性的狀態(tài)。所以盡管自噬可能會保護腫瘤細胞的生存，但是作為補償?shù)氖?，自噬?時也可以對損傷進行消除。在自噬被抑制的細胞里面，腫瘤存活率減少變得并不重要了，因 為自噬的抑制導致基因組損壞的增多和慢性炎癥的增強，這些都會導致腫瘤的生長。所以 總的說來，自噬在腫瘤發(fā)生里面雖然起著兩方面的作用，但是主要的作用還是抑制腫瘤細 胞的發(fā)生和惡化。
[0006] 相對于自噬在腫瘤發(fā)生過程中主要起抑制腫瘤的作用，自噬在腫瘤發(fā)展過程中則 主要起著促進腫瘤生長存活的作用。研究表明，自噬在癌細胞中起著最主要的作用就是抵 抗壓力，這就保護了腫瘤的正常生長。在很多種腫瘤細胞中，如果將自噬必需基因的表達敲 低，則表現(xiàn)出細胞死亡的增強。腫瘤細胞由于生長快需要很高的代謝速度，在體內模型中， 自噬缺陷的腫瘤細胞相對自噬正常的細胞，在遭遇壓力的時候更容易死亡。在人胰腺癌細 胞系和腫瘤樣本中都觀察到了自噬水平升高的現(xiàn)象，自噬可以通過維持細胞內能量的產生 來保證腫瘤細胞的快速生長。另外，在癌細胞接受化療或者放療的情況下，自噬效應可能幫 助癌細胞進入休眠狀態(tài)，這可能是腫瘤復發(fā)以及腫瘤耐受的一個原因。并且現(xiàn)在已經有很 多證據(jù)顯示抑制自噬可以增強抗癌藥物的效果。當自噬處于一定的范圍內，主要體現(xiàn)為促 進腫瘤細胞存活。但是也存在過度激活的自噬導致腫瘤細胞死亡的現(xiàn)象，這也是一個可能 的抑瘤機制。
[0007] 很多納米顆粒都已經被報道可以引起細胞自噬，比如稀土材料：如氧化釤Sm20 3、 氧化銪Eu2O3、氧化禮Gd2O 3、氧化試Tb2O3、氧化釔（Y2O3)、氧化鑭（La 2O3)、氧化鐿（Yb2O3);量 子點：羧基化的CdSe/ZnS QDs、羧基化的CdTe QDs ;碳基材料：水溶性納米富勒烯C6tl、內嵌 釹原子的C6ciONcU C00H-CNT、C6tl的羥基衍生物C6tlOHx ;另外還有不同粒徑的納米金顆粒、磁 性納米顆粒、氧化錳顆粒等都被報道可以引起細胞自噬現(xiàn)象。然而銀納米顆粒是否能引起 細胞自噬，以及引起的納米銀引起的自噬對細胞的存亡起著怎樣的作用還沒有報道。另外， 納米銀在對腫瘤細胞的殺傷過程中，自噬起著怎樣的作用也沒有報道。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的第一個方面提供納米銀與自噬抑制劑和/或敲低/敲除自噬相關基因表 達的試劑用于制備抗腫瘤藥物或試劑盒的用途。
[0009] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述腫瘤為宮頸癌或黑色素瘤。
[0010] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述自噬抑制劑為自噬泡形成抑制劑或自噬下游降解 阻斷劑，優(yōu)選選自》〇1'1：1]^1111；[11、1^294002、3-敵、氯化銨士311101115^;[1141464(1和口6口8丨31:;[11 A或其組合。所述自噬抑制劑均購自Sigma Aldrich，USA(參見Mizushima N.et al. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 2010Feb5 ; 140 (3) : 313-26) 0
[0011] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述自噬相關基因選自Atg3、Atg5、Beclinl、Atg7、 Atg9a、Atgl6Ll、FIP200、和 Ambral 或其組合（參見 Mizushima N.et al.Methods in mammalian autophagy research. Cell. 2010Feb5 ; 140 (3) : 313-26. ) 〇
[0012] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述敲低/敲除自噬相關基因表達的試劑選自siRNA、 shRNA，和miRNA或其組合。
[0013] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述納米銀可以具有不同形貌、粒徑和表面修飾，所述 形貌包括球形，薄片狀、立方體或其他多面體，所述粒徑為5-300納米，所述表面修飾包括 PVP、PEG或肽修飾等。
[0014] 本發(fā)明的第二個方面提供自噬抑制劑和/或敲低/敲除自噬相關基因表達的試劑 用于制備促進納米銀對腫瘤細胞殺傷的藥物或試劑盒的用途。
[0015] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述腫瘤為宮頸癌或黑色素瘤。
[0016] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述自噬抑制劑為自噬泡形成抑制劑或自噬下游降解 阻斷劑，優(yōu)選選自》〇1'1：1]^1111；[11、1^294002、3-敵、氯化銨士311101115^;[1141464(1和口6口8丨31:;[11 A或其組合。
[0017] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述自噬相關基因選自Atg3、Atg5、Beclinl、Atg7、 Atg9a、Atgl6Ll、FIP200、和 Ambral 或其組合。
[0018] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述敲低/敲除自噬相關基因表達的試劑選自siRNA、 shRNA，和miRNA或其組合。
[0019] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述納米銀可以具有不同形貌、粒徑和表面修飾，所述 形貌包括球形，薄片狀、立方體或其他多面體，所述粒徑為5-300納米，所述表面修飾包括 PVP、PEG或肽修飾等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1納米銀掃描電鏡分析：合成的納米銀的粒徑為26. 5±8. 4nm ;
[0021] 圖2納米銀DLS分析：動態(tài)光散射分析顯示，納米銀的水合粒徑為58. 8 ± I. 7nm ;
[0022] 圖3納米銀引起HeLa細胞自噬：
[0023] a與陽性對照雷帕霉素（Rap)相同，納米銀引起EGFP_LC3/HeLa細胞內發(fā)生熒光點 聚集；
[0024] b納米銀在EGFP_LC3/HeLa細胞中引起的自噬效應隨時間增加而增強；
[0025] c納米銀在HeLa細胞中引起的自噬效應隨使用濃度加大而增強；
[0026] 圖4wortmannin抑制自噬促進納米銀對細胞的殺傷：
[0027] a MTT分析：wortmannin抑制自噬后，納米銀處理造成Hela細胞活性減弱 20. 91% ；
[0028] b ANXA5-FITC PI流式分析：wortmannin抑制自噬后，納米銀對Hela細胞殺傷效 果增強了 29. 37% ;
[0029] c Η0/ΡΙ染色統(tǒng)計：wortmannin抑制自噬后，納米銀對Hela細胞殺傷效果增強了 20. 18% ；
[0030] 圖5bafilomycin Al抑制自噬促進納米銀對細胞的殺傷：
[0031] a MTT :BFA抑制自噬后，納米銀處理造成Hela細胞活性減弱25. 01% ;
[0032] b ANXA5-FITC PI流式分析：BFA抑制自噬后，納米銀對Hela細胞殺傷效果增強了 31. 28% ；
[0033] c Η0/ΡΙ染色統(tǒng)計：BFA抑制自噬后，納米銀對Hela細胞殺傷效果增強了 20. 58%;
[0034] 圖6通過轉染ATG5siRNA抑制自噬促進納米銀對細胞的殺傷：
[0035] a HeLa細胞轉染ATG5siRNA后，敲低了 HeLa細胞中的ATG5表達水平和自噬水平；
[0036] b MTT分析：轉染ATG5siRNA后，納米銀處理造成Hela細胞活性減弱了 27. 41% ;
[0037] c ANXA5-FITC PI流式分析：轉染ATG5siRNA后，納米銀對Hela細胞殺傷效果增 強了 20. 23% ;
[0038] d Η0/ΡΙ染色統(tǒng)計：轉染ATG5siRNA后，納米銀對Hela細胞殺傷效果增強了 20. 58% ；
[0039] 圖7B16細胞中wortmannin抑制自噬促進納米銀對細胞的殺傷：
[0040] a MTT分析：wortmannin抑制自噬后，納米銀處理造成B16細胞活性減弱了 28. 54% ；
[0041] b ANXA5-FITC ΡΓ流式分析：wortmannin抑制自噬后，納米銀對B16細胞殺傷效果 增強了 23. 66% ;
[0042] 圖8wortmannin抑制自噬促進納米銀對黑色素瘤的殺傷：
[0043] a納米銀或wortmannin處理，不會造成小鼠體重的減輕；
[0044] b給藥過程中小鼠黑色素瘤體積變化；
[0045] c給藥結束后小鼠瘤重統(tǒng)計顯示，納米銀處理組中，小鼠瘤重減輕了 42. 10%， wortmannin與納米銀共處理組瘤重則減輕了 60. 91%，這表明抑制自噬后納米銀的抗腫瘤 效果增強了 18.81%。

【具體實施方式】
[0046] 本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)。
[0047] 實驗方法 [0048] 納米銀合成方法
[0049] 我們用基于連續(xù)流技術的電化學法合成了 PVP包裹的納米銀顆粒，具體方法為，將 純的銀棒進行拋光和清洗，然后安裝在密封容器的蓋子上，通電電壓為15V，反應過程中每 分鐘變化一次電極方向，反應溫度為90°C。將5毫克/毫升的PVP K30 (30154484, Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd)溶液通過注射器以100毫升/小時的速度持續(xù)勻速注入容器， 最后，將收集到的銀顆粒溶膠通過0. 22微米的濾膜進行過濾即得到了所需的納米銀顆粒。
[0050] 納米銀表征
[0051] 透射電鏡分析：將分散于去離子水中的納米銀溶液滴到銅網的碳膜上，室溫干燥， 無需染色，直接用透射電子顯微鏡（JE0L，Tokyo, Japan)進行觀察拍照。直接用拍得的圖片 進行納米銀粒徑分析，通過Image J軟件分析超過800個納米顆粒的粒徑，統(tǒng)計后得到納 米銀的平均粒徑、標準差和大小分布。
[0052] 用 Malvern ZetasizerNano 檢測 儀(Malvern Instrument Ltd. ,Worcestershire, UK)檢測動態(tài)光散射以及zeta電勢時，用去離子水配制納米銀溶液 至30 μ g/mL，室溫進行檢測。
[0053] 細胞培養(yǎng)以及EGFP_LC3/HeLa細胞系構建
[0054] 細胞培養(yǎng)試劑均購買于GIBIC0(Carlsbad，CA)。在本研究中用到的細胞（均來 源于上海細胞庫）均連續(xù)單層培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37°C， 含 5 % CO2。構建 HeLa EGFP-LC3 細胞系時，用 Lipofectamine2000 轉染 pEGFP-LC3 質粒 (參見 Y. Kabeya, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J.2000Nov I; 19 (21):5720-8.)到 HeLa細胞中，具體操作為：
[0055] 1)分HeLa細胞于24孔板，IxlO5個細胞/孔；
[0056] 2)次日，將800ng質粒pEGFP-LC3溶于50 μ L雙無培養(yǎng)基（無血清無抗生素）中， 2 μ LI ipo2000溶于50 μ L雙無培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘；
[0057] 3)將兩管輕輕混勻，室溫放置20分鐘；
[0058] 4)轉染細胞，轉染前先將培養(yǎng)基換為100 μ L雙無培養(yǎng)基；
[0059] 5)轉染后的細胞于培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時后換液；
[0060] 6)轉染24小時后，細胞傳代于一個新的細胞培養(yǎng)板中，用添加了 0.6mg/mL G418 (Promega, Madison, WI, USA)的 DMEM 培養(yǎng)基進行選擇培養(yǎng)；
[0061] 7)大約10天后，經過擴大培養(yǎng)就獲得了在熒光顯微鏡下強烈表達綠色熒光的細 胞克隆。
[0062] EGFP-LC3點聚集形成分析
[0063] 1)分EGFP_LC3HeLa細胞于24孔板，IxlO5個細胞/孔；
[0064] 2)當EGFP-LC3HeLa細胞長到約60%密度時，加納米銀或者陽性對照雷帕霉素處 理細胞；
[0065] 3)處理到指定時間后拍照；
[0066] 4)對圖片中含有熒光點聚集的細胞比率進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計方法為，計算含有至 少5個EGFP-LC3點聚集的細胞在所有表達綠色熒光蛋白的細胞（在我們構建的穩(wěn)定表達 EGFP-LC3的細胞中，100%的細胞表達綠色熒光蛋白）中的比例。這個實驗需要兩個不同的 實驗者進行雙盲實驗。
[0067] Western blot蛋白印跡實驗
[0068] 1)細胞樣品處理及制作電泳用樣品：胰酶消化收集處理后的細胞，SOOxg離 心后去除上清，加入含有蛋白酶抑制劑（Sigma，P8340)的細胞裂解液（1 % Nonidet P-40(Beyotime, ST366), 1% sodium deoxycholate(Pierce, #89905), 25mMTris-HCl, 150mM NaCl，pH7. 6)于冰上裂解細胞，然后加入等體積2x SDS電泳上樣緩沖液。置沸水中煮樣10 分鐘制成SDS電泳樣品。
[0069] 2)SDS_PAGE電泳：根據(jù)所需蛋白的大小配制合適濃度的SDS電泳凝膠，待測樣品 等量上樣后進行電泳分離（上層濃縮膠恒壓80伏特，下層分離膠恒壓120伏特）。
[0070] 3)轉膜：SDS-PAGE電泳完成后進行轉膜（若為硝酸纖維素膜則直接使用，PVDF膜 需要用甲醇激活才能使用），350安培恒流90分鐘，轉膜過程在冰水浴中進行。
[0071] 4)封閉：轉膜完成后，將載有蛋白的膜置于TBST緩沖液配置的5%脫脂牛奶中，搖 床室溫封閉1小時。
[0072] 5) -抗孵育：根據(jù)蛋白抗體的使用說明或預實驗結果，配制合適濃度的一抗，封 閉后的轉移膜室溫孵育一抗3小時或4°C過夜。
[0073] 6)洗滌一抗：用TBST緩沖液于室溫搖床震蕩清洗3次，每次5分鐘。
[0074] 可以根據(jù)實驗需要適當減少或增加洗滌次數(shù)。
[0075] 7)二抗孵育：用一抗相對應的二抗室溫搖床孵育膜40分鐘到1小時。
[0076] 8)洗滌二抗：用TBST緩沖液于室溫搖床震蕩清洗3次，每次5分鐘。
[0077] 9)顯色檢驗：膜上的蛋白含量信號用ECL顯影試劑盒（Biological Industries, Beit Haemek, Israel)和柯達醫(yī)用膠片進行顯色檢測。
[0078] MTT細胞活力分析
[0079] 噻唑藍（MTT)比色法檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。實驗步驟為：
[0080] DHeLa細胞培養(yǎng)于96孔板中，當細胞接近IxlO4個細胞/孔的時候，加納米材料 進行處理，每個組5個復孔。
[0081] 2)加入5毫克/毫升的MTT至終濃度0. 5mg/mL，于37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小 時。
[0082] 3)小心吸去孔內培養(yǎng)基終止培養(yǎng)。
[0083] 4)每孔加入150 μ L DMS0,置搖床上搖晃至結晶物充分溶解均勻，注意液體不能溢 出。
[0084] 5)然后在酶聯(lián)免疫檢測儀0D570nm處測量各孔吸光值（Elx800, BioTek，Winooski ,VT, USA)〇
[0085] 細胞凋亡檢測
[0086] 檢測原理：ΑΝΧΑ5選擇性結合磷酯酰絲氨酸。正常情況下，磷酯酰絲氨酸主要分布 在細胞膜內側，在細胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細胞 表面。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit) (購自碧云天生物技術研究所）則是利用了這一原理，用FITC標記的重組人ANXA5直接地 檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。碘化丙陡（Propidium Iodide, PI) 可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細胞，由 于細胞膜已經不完整，Annexin V-FITC可以進入到細胞質內，與細胞膜內側的磷酯酰絲氨 酸結合，從而使壞死細胞也呈現(xiàn)綠色熒光。
[0087] 實驗步驟：
[0088] 1)把處理后的細胞培養(yǎng)液吸出至合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適 量胰酶消化細胞。消化好后加入之前收集的細胞培養(yǎng)液，終止消化，這樣可以保證收集到已 經懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞。
[0089] 2)將收集到的細胞IOOOxg離心5分鐘，棄上清，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。
[0090] 3)取5-10萬重懸的細胞，IOOOg離心5分鐘，棄上清，加入195μ I Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞。
[0091] 4)加入 5 μ I Annexin V-FITC，輕輕混勻。
[0092] 5)加入10 μ 1碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
[0093] 6)室溫（20-25°C )避光孵育10-20分鐘，孵育過程中可以重懸細胞2-3次，隨后 置于冰浴中。
[0094] 7)隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。
[0095] 細胞死亡檢測
[0096] H〇eChst33342是一種可以穿透活細胞細胞膜的藍色熒光染料。PI不可以透過活 細胞的細胞膜，只能透過破損的細胞膜從而對核染色呈現(xiàn)紅色熒光，所以可以指示死細胞。 簡單說來，用培養(yǎng)基配制IOmM Hoechst33342和IOmM PI混合液，于37°C恒溫培養(yǎng)箱染色 20分鐘，然后在熒光顯微鏡下拍照。每組統(tǒng)計600個細胞，PI陽性的細胞在Hoechst陽性 細胞中所占的比例則為細胞死亡率。這個實驗需要兩個作者進行雙盲檢測。
[0097] siRNA轉染細胞實驗
[0098] ATG5siRNA(由4條siRNAs按照相同質量比混合使用，以下為各自的序列：Sense 5'-GGA AUA UCC UGC AGA AGA ATT-3'（SEQ ID No: 1)，Anti-sense 5'-UUC UUC UGC AGG AUA UUC CTT-3'（SEQ ID No :2) ;Sense 5'-CAU CUG AGC UAC CCG GAU ATT-3'（SEQ ID No :3) ,Anti-sense 5'-UAU CCG G ⑶ AGC UCA GAU GTT-3'（SEQ ID No :4) ;Sense 5'-GAC AAG AAG ACA UUA GUG ATT-3'（SEQ ID No:5)，Anti-sense5'-UCA CUA AUG UCU UCU U⑶ CTT-3'（SEQ ID No :6) ;Sense 5' -CAA UUG GUU UGC UAU UUG ATT-3'（SEQ ID No :7) ,Anti-sense 5'-UCA AAU AGC AAA CCA AUU GTT-3'（SEQ ID No :8))，和陰 性對照 siRNA (序列信息為：Sense 5'-UUC UCC GAA CGU ⑶ C ACG UTT-3'（SEQ ID No: 9)，Antisense 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'（SEQ ID No :10))購自上海吉瑪生物 科技公司。實驗步驟為：待24孔板中細胞55%到65%細胞密度時，每孔轉染20nM siRNA， RNAimax (Invitrogen, 13778-075)用作轉染試劑，轉染操作為：將 20nM siRNA 溶于 100 μ L opti-MEM培養(yǎng)基中，2 μ L RNAimax溶于100 μ L opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5 分鐘；將兩管輕輕混勻，室溫放置20分鐘，24孔板中預先加入300 μ L含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基，將混合物轉染細胞。24小時后換液。轉染36到48小時后，可加納米銀進行處理。
[0099] 荷瘤鼠構建以及給藥
[0100] 首先我們構建了小鼠動物模型，我們購買了 16只6-8周的SPF級的C57BL/6雄鼠 (購自北京維通利華實驗動物技術有限公司），剃掉其左側腋下的毛，然后將lx IO6個重懸 于100微升無菌PBS中的Β16細胞注入左側腋下。4天后，就構建成功了帶直徑為4-6毫米的 Β16皮下腫瘤的小鼠模型。將小鼠隨機分為4個組：對照組、wortmannin組、納米銀組、納米 銀加 wortmannin組，每組4只鼠。從接種Β16細胞開始的第五天開始給藥：wortmannin組每 天注射25nmol/kg wortmannin ;納米銀組每天注射I. 5mg/kg納米銀；納米銀加 wortmannin 組每天注射I. 5mg/kg納米銀加上25nmol/kg wortmannin ;對照組則為等量的生理鹽水。每 天給藥一次，均為在位給藥。每天測量小鼠體重和腫瘤的直徑，連續(xù)給藥8天后，犧牲小鼠， 剝取皮下腫瘤并進行稱重統(tǒng)計。
[0101] 實施例1 :電化學法合成水溶性納米銀顆粒
[0102] 我們用基于連續(xù)流技術的電化學法合成了 PVP包裹的納米銀顆粒，通過掃描電鏡 (圖1)分析得知，我們合成的納米銀的粒徑為26. 5±8. 4nm。動態(tài)光散射分析（圖2)顯示， 納米銀的水合粒徑為58. 8±1. 7nm，多分散指數(shù)為0. 29±0. 04。納米銀在水中的zeta電勢 為-12. 9±L lmV。
[0103] 實施例2 :納米銀處理引起細胞內自噬
[0104] 我們構建了穩(wěn)定轉染EGFP-LC3的HeLa細胞系，當自噬發(fā)生時，便可以看到細胞內 有綠色熒光點聚集（圖3a)。在24孔板中，當EGFP-LC3/H eLa細胞長到約60(%密度時，力口 入10微克/毫升的納米銀處理細胞，分別于〇、2、4、6、8、10、12小時拍照，并對含有熒光點 聚集的細胞比率進行統(tǒng)計分析，我們發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，含有熒光點聚集的細胞的比例 就越大，表明引起的細胞自噬就越強（圖3b)。在24孔板中，當HeLa細胞長到約60%密度 時，加不同濃度（〇、5、10、15、20微克/毫升）的納米銀處理細胞24小時，然后用細胞裂解 液裂解細胞收樣，通過western blotting進行檢測，我們發(fā)現(xiàn)隨著納米銀使用濃度的增加， 引起的自噬效果增強（圖3c)。
[0105] 實施例3 :wortmannin抑制自噬促進納米銀對細胞的殺傷
[0106] 在24孔板中，當HeLa細胞密度長到約60 %時，我們分別用濃度為ΙμΜ的 wortmannin (購自 Sigma-Aldrich)、10 微克 / 毫升納米銀、1 μ M 的 wortmannin 加上 10 微克 /毫升納米銀共處理細胞24小時，然后通過MTT、Annexin A5 (ANXA5) -FITC PI流式分析、 Η0/ΡΙ染色分析三種方法對細胞凋亡情況進行檢測。MTT結果顯示1 μ M的wortmannin與10 微克/毫升納米銀共處理與單用納米銀處理相比，細胞活性減弱了 20. 91%，wortmannin單 處理對細胞活性沒有影響（圖4a) JNXA5-FITC PI流式分析（圖4b)，與MTT分析結果一致， wortmannin將納米銀導致的細胞死亡（位于右下和右上區(qū)域的細胞的相對比例，右下代表 早期凋亡細胞，右上代表凋亡晚期的細胞以及壞死的細胞，下文均同）增加了 29. 37%。接 下來我們用到了 Hoechst (HO)/PI染色分析，由于PI不可以透過活細胞的細胞膜，只能透過 破損的細胞膜而對核染色，所以可以指示死細胞，從圖中可以看出，wortmannin將納米銀導 致的細胞死亡增加了 20. 18%，wortmannin單處理對細胞死亡沒有影響（圖4c)。
[0107] 實施例4 :bafilomycin Al抑制自噬促進納米銀對細胞的殺傷
[0108] 我們還嘗試了別的自噬抑制劑來檢測抑制自噬對納米銀處理下細胞命運的影響。 與上面實驗方法相同，我們使用了一種自噬下游的抑制劑IOOnM bafilomycin Al(BFA)(購 自Sigma-Aldrich)與10微克/毫升的納米銀共處理，通過MTT、ANXA5 - FITC PI流式分 析、Η0/ΡΙ染色分析三種方法對細胞凋亡情況進行檢測，均取得了同wortmannin處理相似 的結果。MTT分析結果顯示BFA與納米銀共處理與單用納米銀處理相比，細胞活性減弱了 25. 01% (圖5a)。ANXA5 - FITC PI流式分析與MTT分析結果一致，BFA將納米銀導致的細 胞死亡增加了 31. 28% (圖5b)。最后，Η0/ΡΙ染色分析顯示，與單用納米銀處理相比，BFA 與納米銀共處理細胞死亡增加了 20. 58% (圖5c)。
[0109] 實施例5 :通過ATG5基因敲減抑制自噬促進納米銀對細胞的殺傷
[0110] 接下來，我們還用到了一個更為專一的抑制自噬的方法一轉染自噬相關基因 ATG5siRNA，用來檢測抑制自噬對納米銀處理下細胞命運的影響。當24孔板里面的HeLa細 胞長到約55%-65%密度后，利用1?隱丨11^轉染2〇11麻1658丨1?隱或者對照8丨1?隱，轉染36小 時后收樣通過western blotting檢測ATG5siRNA對細胞自噬敲減的效果。我們發(fā)現(xiàn)我們 成功的敲減了細胞內本底的自噬水平（圖6a)。這個時候利用10微克/毫升的納米銀處理 轉染ATG5siRNA的細胞24小時，與用10微克/毫升的納米銀處理的轉染對照siRNA的細 胞相比，ATG5siRNA處理過的細胞對納米銀處理表現(xiàn)得更加敏感，通過MTT、ANXA5-FITC PI 流式分析、Η0/ΡΙ染色分析三種方法對細胞凋亡情況進行檢測。MTT結果顯示轉染ATG5特 異性siRNA的細胞中，納米銀引起的細胞活性減弱了 27. 41% (圖6b)。ANXA5 - FITC PI流 式分析顯示，與轉染對照siRNA的細胞相比，自噬水平降低的細胞中納米銀導致的細胞凋 亡與壞死增加了 20. 23% (圖6c)。最后，Hoechst/PI染色分析顯示，納米銀處理后，轉染 ATG5特異性siRNA的細胞比轉染對照siRNA細胞死亡增加了 20. 58% (圖6d)。但是轉染 ATG5特異性siRNA組并沒觀察到明顯的細胞凋亡或壞死。
[0111] 總的說來，實施例1-5證明了，無論是利用自噬泡形成抑制劑，還是自噬下游降解 阻斷劑，或者使用ATG5敲低的方法來阻斷自噬，都使得納米銀對細胞的毒性增加。這就表 明納米銀引起的細胞自噬起著保護細胞的作用。
[0112] 實施例6 :B16細胞中wortmannin抑制自噬促進納米銀對細胞的殺傷
[0113] 為了在一個惡性程度很強的腫瘤模型一B16黑色素模型中檢驗我們的結果，我們 首先探究了在B16細胞中納米銀的效果。在24孔板中，當B16細胞密度長到約60%時，我們 用1 μ M的自噬抑制劑wortmannin、50微克/毫升的納米銀、1 μ M的自噬抑制劑wortmannin 加上50微克/毫升的納米銀分別處理細胞24小時，然后利用MTT和ANXA5-FITC PI流式分 析對細胞凋亡情況進行檢測。MTT分析結果顯示，1 μ M的自噬抑制劑wortmannin與50 μ g/ mL的納米銀共處理組比納米銀單處理組細胞活性減弱了 28. 54% (圖7a)。ANXA5-FITC PI 流式分析顯示，wortmannin將納米銀導致的B16細胞凋亡和壞死增加了 23. 66% (圖7b)。 這和在HeLa細胞中取得的結果是類似的。這表明在B16細胞中，納米銀引起的自噬也起著 保護性細胞的作用。
[0114] 實施例7 :wortmannin抑制自噬促進納米銀對黑色素瘤的殺傷
[0115] 在B16細胞實驗的基礎上，我們開展了動物實驗。首先我們構建了荷瘤小鼠動物 模型，帶直徑為4-6毫米的B16皮下腫瘤的小鼠模型構建成功后。將小鼠隨機分為4個組： 對照組、wortmannin組、納米銀組、納米銀加 wortmannin組，每組4只鼠。從接種B16細 胞開始的第五天開始給藥：wortmannin組每天注射25nmol/kg wortmannin ;納米銀組每天 注射I. 5mg/kg納米銀；納米銀加 wortmannin組每天注射I. 5mg/kg納米銀加上25nmol/ kg wortmannin;對照組則為等量的生理鹽水。每天給藥一次，均為在位給藥。每天測量小 鼠體重和腫瘤的直徑，連續(xù)給藥8天后，犧牲小鼠，剝取皮下腫瘤并進行稱重統(tǒng)計。統(tǒng)計顯 示，納米銀處理組中，小鼠瘤重減輕了 42. 10%，wortmannin與納米銀共處理組瘤重則減輕 了 60. 91%，這表明抑制自噬后納米銀的抗腫瘤效果增強了 18. 81%，同樣，wortmannin單 處理組沒有明顯的抗腫瘤效果（圖8)。
【權利要求】
1. 納米銀與自噬抑制劑和/或敲低/敲除自噬相關基因表達的試劑用于制備抗腫瘤藥 物或試劑盒的用途。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用途，所述腫瘤為宮頸癌或黑色素瘤。
3. 根據(jù)權利要求1所述的用途，所述自噬抑制劑為自噬泡形成抑制劑或自噬下游降解 阻斷劑，優(yōu)選選自》〇1'1：1]^1111；[11、1^294002、3-敵、氯化銨士3111〇1115^;[1141464(1和口6口8丨31:;[11 A或其組合。
4. 根據(jù)權利要求1所述的用途，所述自噬相關基因選自以下的一種或多種：Atg3、 Atg5、Beclinl、Atg7、Atg9a、Atgl6Ll、FIP200、和 Ambral。
5. 根據(jù)權利要求1所述的用途，所述敲低/敲除自噬相關基因表達的試劑選自siRNA、 shRNA，和miRNA或其組合。
6. 自噬抑制劑和/或敲低/敲除自噬相關基因表達的試劑用于制備促進納米銀對腫瘤 細胞殺傷的藥物或試劑盒的用途。
7. 根據(jù)權利要求6所述的用途，所述腫瘤為宮頸癌或黑色素瘤。
8. 根據(jù)權利要求6所述的用途，所述自噬抑制劑為自噬泡形成抑制劑或自噬下游降解 阻斷劑，優(yōu)選選自》〇1'1：1]^1111；[11、1^294002、3-敵、氯化銨士3111〇1115^;[1141464(1和口6口8丨31:;[11 A或其組合。
9. 根據(jù)權利要求6所述的用途，所述自噬相關基因選自以下的一種或多種：Atg3、 Atg5、Bee 1 ini、Atg7、Atg9a、Atgl6Ll、FIP200、和 Ambral。
10. 根據(jù)權利要求6所述的用途，所述敲低/敲除自噬相關基因表達的試劑包括 siRNA、shRNA，和 miRNA 或其組合。
【文檔編號】A61K33/38GK104258394SQ201410509906
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權日:2014年9月28日
【發(fā)明者】溫龍平, 林俊, 顧寧, 張云嬌, 周偉, 金佩佩 申請人:中國科學技術大學