專利名稱：細(xì)胞外Hsp90的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明受到National Institutes of Health授予的CA81668的政府支持。政府具有本發(fā)明的一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤脫落細(xì)胞，其遷移到新的組織并產(chǎn)生繼發(fā)性腫瘤。產(chǎn)生繼發(fā)性腫瘤的過程稱為轉(zhuǎn)移并且是復(fù)雜的過程，其中腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)離原發(fā)性腫瘤的部位定居。Liotta((1986)Cancer Res.46，1-7)已經(jīng)提出轉(zhuǎn)移過程的三步假說第一步是腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞表面受體附著。然后錨定的腫瘤細(xì)胞分泌水解酶或者誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌酶，所述酶局部降解基質(zhì)。在接近腫瘤細(xì)胞表面的高度局部化區(qū)域最可能發(fā)生基質(zhì)裂解。第三步是腫瘤細(xì)胞移動(dòng)到被蛋白水解改變的基質(zhì)區(qū)域。從而，基質(zhì)的侵襲不僅僅是由于被動(dòng)生長壓力而且需要主動(dòng)生物化學(xué)機(jī)制。周圍正常組織的降解是惡性腫瘤侵襲力的主要特征。轉(zhuǎn)移形成的過程取決于腫瘤細(xì)胞的侵襲力。因此，開發(fā)抑制侵襲力從而防止原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物是有用的。
最近，研究集中在鑒定參與轉(zhuǎn)移的特定蛋白，其可以用作更好的診斷或者改進(jìn)的治療策略的基礎(chǔ)。已經(jīng)鑒定為分子伴侶分子并且對于幾種致癌蛋白的穩(wěn)定性和功能必需的一種蛋白是熱激蛋白90(Hsp90)。該名稱是一般術(shù)語，用于描述稱作Hsp90α和β的兩種同種型。Hsp90同種型的結(jié)構(gòu)和功能在Csermely等人Pharmacol.Ther.卷79，1998，No.2，The 90-kDa Molecular Chaperone FamilyStructure，F(xiàn)unction，and Clinical Applications.AComprehensive Review，p.131，p.146中描述。Hsp90是真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中最豐富的伴侶蛋白并且約組成細(xì)胞中所有蛋白的1-2％。Hsp90的細(xì)胞內(nèi)功能包括蛋白(類固醇受體)的穩(wěn)定和諸如激酶和其他信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的蛋白的成熟。然而，Hsp90與多種功能有牽連，所述功能包括突變蛋白的進(jìn)化穩(wěn)定性、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡、蛋白降解、抗原呈遞和脂多糖識(shí)別。Hsp90在細(xì)胞中非常豐富，還與許多疾病有關(guān)，所述疾病為從癌癥到自身免疫病到心血管疾病。例如，針對Hsp90的免疫顯性LKVIRK表位的單克隆抗體在真菌感染的治療中顯示出治療活性并且由Neutec公司以商標(biāo)名Mycogrip用于臨床試驗(yàn)。
還表明細(xì)胞對應(yīng)激應(yīng)答而分泌Hsp90(Liao等人(2000)J.Biol.Chem.275，189-96)，但是還未知該分泌的相關(guān)的功能。
盡管Hsp90在細(xì)胞內(nèi)具有確定的功能，但是關(guān)于其在細(xì)胞外的發(fā)生和其功能報(bào)導(dǎo)很少。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hsp90是抗原呈遞細(xì)胞上受體的有效抗原肽呈遞分子(presenter)。還發(fā)現(xiàn)Hsp90是與細(xì)胞的細(xì)胞外表面上脂質(zhì)筏(lipid raft)結(jié)合的四種蛋白之一，所述蛋白結(jié)合脂多糖并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答(Triantafilou等人(2002)Trends inImmunology 23，301-4)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hsp90在某些腫瘤細(xì)胞的表面上超表達(dá)，這些細(xì)胞為microcitomas、黑素瘤和肝癌細(xì)胞系(Ferrarini等人(1992)Int.J.Cancer 51，613-19)。已經(jīng)假定這些細(xì)胞系表面上的Hsp90的表達(dá)與抗原呈遞有關(guān)，但是還不能得到清楚的證據(jù)。
由于Hsp90與調(diào)節(jié)在腫瘤的表型驅(qū)動(dòng)中重要的幾種信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)，所以Hsp90當(dāng)前正被評估作為抗癌藥物開發(fā)的細(xì)胞內(nèi)靶。Hsp90功能的抑制已經(jīng)表明導(dǎo)致參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的選擇性降解。最近已經(jīng)表明一些已知的抗生素(例如，格爾德霉素、根赤殼素和香豆霉素A1)是Hsp90的抑制劑并且在WO 00/53169中描述。在該文獻(xiàn)中，提出了抑制伴侶蛋白與其客戶分子結(jié)合的方法，其中所述方法提出將伴侶蛋白與香豆素或者香豆素衍生物接觸。然而，WO 00/53169的教導(dǎo)僅涉及細(xì)胞間Hsp90蛋白的抑制。
已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中測試了例如格爾德霉素類似物17-AAG的抑制劑，但是存在穿過所有細(xì)胞區(qū)室的蛋白的非特異抑制導(dǎo)致的毒性問題(Dunn(2002)J.Natl.Cancer Inst 94，1194-5)。此外，缺乏對多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中Hsp90與其客戶蛋白之間相互作用的了解使得存在用毒性抑制劑抑制細(xì)胞內(nèi)Hsp90的潛在危險(xiǎn)。
確定蛋白的生理功能是確定干擾該蛋白功能是否是治療疾病的可能方法的先決條件。必須記住在生理?xiàng)l件下，即在患者的天然發(fā)生的腫瘤細(xì)胞中，Hsp90與其他蛋白一起作用，所述蛋白可以相互調(diào)節(jié)和干擾。Hsp90和相互作用蛋白之間的功能相互作用決定了其生理作用。
還報(bào)導(dǎo)Hsp90作為細(xì)胞核中跨膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的分子伴侶(Schlatter等人(2002)Biochem.J.362，675-84)，并且與白血病、肺癌和卵巢癌細(xì)胞中藥物流出有關(guān)(Rappa等人，(2002)Oncol.Res.12，113-9和Rappa，等人(2000)Anticancer Drug Des15，127-34)。
本發(fā)明首次闡明細(xì)胞外Hsp90的抑制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲力的降低。本發(fā)明還表明了抑制細(xì)胞外Hps90的新方法，從而可以防止與攻擊細(xì)胞外Hsp90有關(guān)的副作用。
本發(fā)明還表明了Hsp90抑制和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的分泌之間的相互關(guān)系。MMPs通過消化周圍細(xì)胞外基質(zhì)以允許細(xì)胞通過穿過致密組織進(jìn)行侵襲。我們的結(jié)果表明Hsp90當(dāng)在纖維肉瘤細(xì)胞中超表達(dá)時(shí)通過增加MMPs的分泌或者活性而對于癌細(xì)胞的侵襲是關(guān)鍵的。我們還證明使用本發(fā)明的分子可以抑制依賴Hsp90的侵襲。
本發(fā)明涉及使用干擾腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞外Hsp90功能的分子治療特定癌癥。提供了可用于減少或者抑制特定腫瘤細(xì)胞的侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛力的化合物、組合物和方法。此外，提供了允許確定腫瘤細(xì)胞是否依賴于功能性細(xì)胞外Hps90實(shí)現(xiàn)其侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛力的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可以特異結(jié)合細(xì)胞外Hsp90的分子。此外，如果需要，本發(fā)明的分子可以用可檢測基團(tuán)標(biāo)記，或可以是生物綴合物(bioconjugate)的部分。
本發(fā)明還涉及含有細(xì)胞外Hsp90的抑制劑的藥物組合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼細(xì)胞外Hsp90的抑制劑的核酸分子(如果抑制劑選自多肽、抗體或者抗體片段)，以及含有這類核酸的載體和含有這類載體的宿主細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及抑制細(xì)胞外Hsp90功能的分子用于生產(chǎn)治療或者預(yù)防癌細(xì)胞的侵襲和/或轉(zhuǎn)移潛力的藥物的用途。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療或者預(yù)防患者中細(xì)胞的侵襲和/或轉(zhuǎn)移潛力的方法，其中所述方法包括對有需要的人施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的分子，和/或藥物組合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及確定癌細(xì)胞侵襲力對細(xì)胞外Hsp90的功能性的依賴性的方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定用于抑制癌細(xì)胞的侵襲力的分子，尤其鑒定結(jié)合Hsp90的此類配體的方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性的分子類別的用途。
定義如文中所用，除非另外說明，將應(yīng)用下面的定義。
如文中所用“多肽”是含有多于10個(gè)、優(yōu)選多于20個(gè)、最優(yōu)選多于30個(gè)，且少于10000個(gè)，更優(yōu)選少于2500個(gè)，最優(yōu)選少于1000個(gè)氨基酸的分子。還包括含有修飾或者非天然氨基酸的多肽。
如文中所用術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”指任意免疫結(jié)合劑，包括多克隆抗體和單克隆抗體。依賴于重鏈中的恒定結(jié)構(gòu)域的類型，將抗體分成5大類之一IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些大類的一些還分成亞類或者同種型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等等。
抗體還可以選自經(jīng)修飾的免疫球蛋白，例如，化學(xué)或者重組產(chǎn)生的抗體、CDR移植抗體或者人源化抗體、定點(diǎn)誘變抗體，它們在它們的CDR區(qū)，尤其CDR3區(qū)中顯示出與本發(fā)明的相應(yīng)抗體片段相當(dāng)大的氨基酸序列同一性并且保持與相應(yīng)抗體片段基本相同的對Hsp90結(jié)合的親和力。
抗體的CDRs(互補(bǔ)決定區(qū))是這些分子的部分，它們決定抗體的特異性并且與特定配體接觸。CDRs是該分子的最易變的部分并且造成這些分子的多樣性。
本文中所用的“相當(dāng)大氨基酸序列同一性”指兩條所比對的氨基酸序列，尤其比對的CDRs具有至少70％，優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％相同，更優(yōu)選僅5個(gè)氨基酸不同，更優(yōu)選僅3個(gè)氨基酸不同，更優(yōu)選僅1個(gè)氨基酸不同。
術(shù)語“抗體片段”用于指具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體樣分子的任意片段，并且該術(shù)語包括諸如scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體(DABs)、微型雙功能抗體(diabody)等等的抗體片段。制備和使用多種基于抗體的構(gòu)建體和片段的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(見Kabat等人(1991)J.Immunol.147，1709-19)，特別并入本文作用參考。
“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈中。通常，scFv多肽還包括VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，該接頭使得scFv形成用以抗原結(jié)合的所需的結(jié)構(gòu)。
“Fv”片段是保留完整抗原結(jié)合部位的最小的抗體片段。
“dsFv”是二硫化物穩(wěn)定的Fv。
“Fab”片段是抗原結(jié)合片段，其含有與重鏈的VH和CH1結(jié)構(gòu)域配對的完整輕鏈。
“Fab’”片段是還原的F(ab’)2片段。
“F(ab’)2”片段是含有通過鉸鏈區(qū)二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段。
“單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)”是具有僅一條(而不是兩條)來源于抗體結(jié)構(gòu)的僅一個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白鏈的抗體。Dab利用如下發(fā)現(xiàn)，即對于某些抗體，抗體分子的一般幾乎和完整分子一樣好地結(jié)合其靶抗原(Davies等人，(1996)Protein Eng.9531-537)。
“微型雙功能抗體”是二價(jià)或者雙特異抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在一條多肽鏈上表達(dá)，但是使用的接頭太短而不允許相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對，從而強(qiáng)迫所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合部位(Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6444-6448)。
文中所用術(shù)語“生物綴合物”指細(xì)胞外Hsp90的抑制劑分別共價(jià)或者非共價(jià)連接和/或偶聯(lián)另一種蛋白、固體基質(zhì)(例如，珠子)，從而該抑制劑自身形成多聚體，或者連接和/或偶聯(lián)細(xì)胞毒性劑，其增強(qiáng)對靶定細(xì)胞的毒性，或者連接和/或偶聯(lián)細(xì)胞抑制劑、前體藥物或者效應(yīng)分子，其能夠修飾表達(dá)Hsp90的細(xì)胞或者募集免疫細(xì)胞。
術(shù)語“標(biāo)記”或者“被標(biāo)記的”分別指可檢測的標(biāo)記或者所述標(biāo)記的摻入，例如，通過摻入熒光團(tuán)-、生色團(tuán)-或者放射-標(biāo)記的氨基酸或者使熒光團(tuán)-，生色團(tuán)-或放射標(biāo)記與配體附著，或者使通過經(jīng)標(biāo)記的第二種分子檢測的部分附著來實(shí)現(xiàn)摻入，所述經(jīng)標(biāo)記的第二種分子含有可以通過光學(xué)或者比色方法檢測的熒光標(biāo)記或者酶活性。這種兩步檢測系統(tǒng)的實(shí)例是眾所周知的生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)。標(biāo)記多肽和糖蛋白的多種方法是本領(lǐng)域公知的(例如，見Lobl等人(1988)Anal.Biochem.，170，502-511)并且可應(yīng)用于不同類別的分子。
“表位”包括能夠特異結(jié)合免疫球蛋白或者抗體片段的任意蛋白決定簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，如暴露的氨基酸、氨基糖或者其他糖側(cè)鏈組成并且通常具有特異三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定電荷特征。
如文中所用的“治療轉(zhuǎn)移性腫瘤”或者“治療微轉(zhuǎn)移”指腫瘤的轉(zhuǎn)移受到作為單一藥物或者與其他藥物聯(lián)合的本發(fā)明分子的穩(wěn)定化、預(yù)防、延遲或者抑制。穩(wěn)定疾病或者“無變化”(NC)描述如下疾病過程，其中在至少四周內(nèi)轉(zhuǎn)移無變化或者減小少于50％或者增加少于25％。預(yù)防可以為例如，治療開始后沒有檢測到新轉(zhuǎn)移。這可以導(dǎo)致與未受治療的患者相比受到治療的患者的2-到3倍中位數(shù)和/或％-年存活率。延遲可以表示治療開始后在至少8周、3個(gè)月、6個(gè)月或者甚至1年內(nèi)沒有檢測到新的轉(zhuǎn)移。抑制可以指與未受治療的組相比，用本發(fā)明的分子治療的組的新轉(zhuǎn)移的平均大小或者總數(shù)低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或者甚至90％。腫瘤學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員按照用于檢測轉(zhuǎn)移的通常接受的實(shí)踐和診斷方法，例如，Harrisons Principles of Internal Medicine第15版，2001Mc Graw Hill中概述的可以檢測轉(zhuǎn)移的數(shù)目、大小和流行。
如文中所用“轉(zhuǎn)移瘤”包括能夠轉(zhuǎn)移的處于原發(fā)部位的腫瘤和處于繼發(fā)部位的轉(zhuǎn)移的腫瘤。
“微轉(zhuǎn)移”是大小小于2mm的腫瘤細(xì)胞的積累，其通常僅可以通過組織學(xué)方法檢測。
如文中所用“侵襲力”是細(xì)胞通過其他細(xì)胞層遷移或者通過細(xì)胞外基質(zhì)遷移的能力?？梢酝ㄟ^實(shí)施例中描述的Matrigel測定法評估侵襲力。侵襲測量為在一定溫育期間內(nèi)達(dá)到濾器的下表面的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
如文中所用“轉(zhuǎn)移潛力”是腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)離該腫瘤細(xì)胞所來源的原發(fā)腫瘤的部位形成新腫瘤(轉(zhuǎn)移)的能力。“治療有效量”是除去或者減小患者的腫瘤負(fù)擔(dān)，或者防止、延遲或者抑制轉(zhuǎn)移的量。劑量將依賴于許多參數(shù)，包括腫瘤的性質(zhì)、患者病史、患者狀況、細(xì)胞毒性劑的可能的共同使用和施用方法。施用方法包括注射(例如，腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)，等等)，其中抑制細(xì)胞外Hsp90功能的分子在無毒的藥學(xué)上可接受的載體中提供。通常選擇適宜的載體和稀釋劑以便不顯著損害結(jié)合劑的生物學(xué)活性(例如，結(jié)合特異性、親和性和穩(wěn)定性)，如水、鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液、5％人血清清蛋白、固定油類、油酸乙酯或者脂質(zhì)體。可接受的載體可以包括生物相容的、惰性或者生物可吸收的鹽、緩沖劑、寡糖或多糖、聚合物、粘彈性化合物如透明質(zhì)酸、粘性提高劑、防腐劑等等。此外，藥物組合物或者制劑還可以包括其他載體、佐劑或者無毒、非治療性、非免疫原性穩(wěn)定劑等等。一般的劑量可以為約0.01到約20mg/kg，或者更具體地，約1到約10mg/kg。
使用抑制Hsp90功能的分子的治療方法可以與化學(xué)療法、手術(shù)和放射療法聯(lián)合，這依賴于腫瘤的類型、患者狀況、其他健康問題和多種因素。抑制Hps90功能的分子還可以用作治療組合物的單一有效藥物。
“抑制細(xì)胞外Hps90的分子”是導(dǎo)致細(xì)胞外Hsp90的生物學(xué)活性的抑制的分子。細(xì)胞外Hsp90的生物學(xué)活性的抑制可以通過測量細(xì)胞外Hsp90的生物學(xué)活性的一種或多種指標(biāo)(如Hsp90依賴性的侵襲力)來評估。Hsp90的生物學(xué)活性的這些指標(biāo)可以通過幾種體外或者體內(nèi)測定法的一種或多種來評估(見實(shí)施例)。優(yōu)選地，通過侵襲性人細(xì)胞，尤其實(shí)施例中所用的細(xì)胞的Hsp90誘導(dǎo)的侵襲力的抑制來評估分子抑制Hsp90活性的能力。
本發(fā)明的“抑制細(xì)胞外Hsp90功能的分子”不是作為蛋白功能的通常抑制劑的分子，像蛋白酶，像變性劑，例如，尿素或者鹽酸胍，像重金屬原子或者像與生物分子(脂質(zhì)、蛋白、糖)共價(jià)和非特異反應(yīng)的小分子(例如，醛或者異氰酸鹽)。抑制理解為與在相同實(shí)驗(yàn)條件下不含本發(fā)明的分子的陰性對照相比功能的降低。
此外，對于本發(fā)明的多肽，尤其本發(fā)明的抗體或者抗體片段，如果當(dāng)所述抗體片段以1nM到50μM，優(yōu)選約20μM存在時(shí)，本發(fā)明多肽在如實(shí)施例描述的實(shí)驗(yàn)中降低癌細(xì)胞的侵襲力30％以上，優(yōu)選60％以上，那么認(rèn)為本發(fā)明的多肽抑制細(xì)胞外Hsp90的生物功能。
此外，對于細(xì)胞外Hsp90的抑制劑，如果所述抑制劑當(dāng)以10nM到100μM，優(yōu)選約1μM濃度存在時(shí)，在如實(shí)施例描述的實(shí)驗(yàn)中降低侵襲性癌細(xì)胞的侵襲力30％以上，優(yōu)選60％以上，那么本發(fā)明包括所述抑制劑。
文中所用“細(xì)胞外Hsp90”是與細(xì)胞膜松散結(jié)合且在細(xì)胞外的Hsp90，并且不將其理解為包括分離的Hsp90。這可以包括通過翻譯后修飾或者物理整合將Hsp90插入細(xì)胞膜從而將Hsp90暴露于細(xì)胞的細(xì)胞外表面或者將Hsp90分泌到細(xì)胞外空間。
術(shù)語細(xì)胞外Hsp90的“抑制劑乃是任意實(shí)體，其結(jié)合細(xì)胞外Hsp90并且降低其功能，特別是關(guān)于細(xì)胞性質(zhì)，如侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛力。這種實(shí)體可以是離子或者非離子的有機(jī)或無機(jī)小分子(例如，優(yōu)選具有小于1500Da的分子量)；天然和非天然發(fā)生的大分子；可以經(jīng)修飾，尤其經(jīng)天然發(fā)生的或者非天然發(fā)生的糖部分或者化學(xué)修飾的多肽；抗體，尤其單克隆抗體、抗體片段，等等。
如果不另外指出，術(shù)語“a”不被理解為“一個(gè)”并且可以指“一個(gè)和/或一個(gè)以上”。
發(fā)明詳述為了更完整地理解本發(fā)明，提供了下面的詳細(xì)描述。
本發(fā)明涉及抑制劑，其可以特異結(jié)合細(xì)胞外Hsp90或者更具體地，可以抑制與癌細(xì)胞的侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛力有關(guān)的Hsp90功能。細(xì)胞外Hsp90的抑制劑優(yōu)選基本上不能進(jìn)入細(xì)胞或者以如此方式修飾從而該修飾基本上抑制其細(xì)胞攝入。本發(fā)明抑制劑的修飾可以通過將所述抑制劑綴合到天然發(fā)生的大分子，如多肽、糖或者人造生物相容的聚合物來實(shí)現(xiàn)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抑制劑為分別與另一種蛋白、固體基質(zhì)(例如，珠子)的生物綴合物，從而該抑制劑自身形成多聚體，或者與將增強(qiáng)對靶定細(xì)胞的毒性的細(xì)胞毒性劑、能夠修飾表達(dá)Hsp90的細(xì)胞或者募集免疫細(xì)胞的細(xì)胞抑制劑、前體藥物或者效應(yīng)分子的生物綴合物。
從而，用于抑制細(xì)胞外Hsp90的本發(fā)明抑制劑可以是細(xì)胞內(nèi)Hsp90的公知的抑制劑，如格爾德霉素及其類似物，如17 AAG；根赤殼素；香豆素抗生素，如新生霉素或者基于嘌呤的Hsp90抑制劑，如PU3(當(dāng)用于抑制細(xì)胞外Hsp90時(shí))。然而，優(yōu)選修飾公知抑制劑從而細(xì)胞攝入基本上被阻止從而消除與(細(xì)胞內(nèi))Hsp90的抑制劑的可能的毒性有關(guān)的任何副作用。
一組細(xì)胞毒性劑包括，但不限于，柔紅霉素、紫杉醇、阿霉素、氨甲蝶呤、5FU、長春滅瘟堿、放線菌素D、依托泊苷、順鉑、阿霉素、金雀黃素和核糖體抑制劑(例如，trichosantin)，或者多種細(xì)菌毒素(例如，假單胞菌外毒素、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)A蛋白)。
本發(fā)明的抑制劑優(yōu)選選自多肽、抗體、抗體片段、香豆素和/或基于嘌呤的Hsp90抑制劑和它們的類似物。
使用多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑制備含有本發(fā)明的多肽，尤其本發(fā)明的抗體片段或者抗體以及細(xì)胞毒性部分的生物綴合物。這些試劑的一些實(shí)例為3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)；亞氨酸酯的雙功能衍生物，如dimethyl adipimidate HCl；活性酯，如辛二酸二琥珀酰亞胺酯；醛如戊二醛；雙疊氮基(bisazido)化合物，如his(R-疊氮基苯甲酰)己二胺；雙重氮衍生物，如雙-(R-重氮基苯甲酰)乙二胺；二異氰酸酯，如甲苯2，6-二異氰酸酯；和雙活化的含氟化合物，如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。用于產(chǎn)生生物綴合物的方法在March′s Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms and Structure，第五版，Wiley-Interscience；或Bioconjugate Techniques，Ed.Greg Hermanson，Academic Press中詳述。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽為抗體，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，為來源于scFv抗體片段的抗體，在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，為多克隆或者單克隆抗體，尤其是人單克隆抗體。
結(jié)合細(xì)胞外Hsp90的抗人Hsp90抗體可以選自經(jīng)修飾的免疫球蛋白，例如，化學(xué)或者重組產(chǎn)生的抗體或者人源化抗體、定點(diǎn)誘變抗體，所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白在它們的CDR區(qū)，尤其在它們的CDR3區(qū)域中顯示出與本發(fā)明的相應(yīng)抗體片段相當(dāng)大的氨基酸序列同一性，并且保持與相應(yīng)抗體片段基本相同的對Hsp90結(jié)合的親和性。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，抗人Hsp90抗體選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，尤其IgG和IgM，更具體地，IgG1、IgG2a、Ig2b、IgG3、IgG4。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制劑具體為抗體片段。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抑制劑為抗體片段，尤其scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或者微型雙功能抗體，更具體地，scFv、dsFv、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體或者微型雙功能抗體，更具體地，scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體或者微型雙功能抗體，更優(yōu)選地，scFv。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段特異識(shí)別Hsp90的一個(gè)或多個(gè)表位，或者Hsp90的保守變體的表位，或者Hsp90的肽片段。
作為實(shí)例，增加本發(fā)明分子的生物學(xué)活性的一種方法是聯(lián)合使用所述分子(或者配體)與CALI(生色團(tuán)輔助激光/光滅活)。
CALI(生色團(tuán)輔助激光/光滅活)的原理是基于光化學(xué)反應(yīng)的局部起始，其導(dǎo)致產(chǎn)生短暫的活性種類，這些活性種類又選擇性修飾靶分子并導(dǎo)致其功能失活。高度特異但是非抑制性配體(例如，抗體、抗體片段、小分子)經(jīng)適宜的熒光團(tuán)(例如，異硫氰酸熒光素)標(biāo)記。在靶分子(例如，蛋白)和配體之間形成復(fù)合體后，用激光或者白色光照射復(fù)合體以分別激發(fā)生色團(tuán)或者熒光團(tuán)。該激發(fā)觸發(fā)光化學(xué)反應(yīng)，其啟動(dòng)產(chǎn)生短暫活性種類(例如，羥基自由基或者高度活性氧種類)。這些活性種類在它們產(chǎn)生部位周圍的小半徑范圍內(nèi)修飾該蛋白。由于活性種類的短壽命，其可以行進(jìn)的距離非常短。因此，蛋白內(nèi)氨基酸殘基的修飾在非常接近配體的結(jié)合位點(diǎn)處發(fā)生。損傷效果局限于15-40的半徑，其遠(yuǎn)低于細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白的平均距離，該平均距離為約80，(假設(shè)平均胞質(zhì)蛋白濃度為300mg/ml，平均蛋白大小為50kDa)，從而確保該過程的高度空間分辨率。該原理在

圖12中顯示。對于配體的結(jié)合位點(diǎn)接近或者位于所述蛋白的重要功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)的情況，這些誘導(dǎo)的修飾導(dǎo)致該蛋白的永久失活。該蛋白的功能失活以適宜的讀出測定法測量并且在疾病相關(guān)的生理功能背景，像細(xì)胞侵襲、細(xì)胞粘著、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)或細(xì)胞凋亡中評價(jià)。
用CALI失活蛋白對于各自蛋白是非常特異的。Linden等人表明用孔雀綠標(biāo)記的抗-β-半乳糖苷酶抗體甚至在該相同溶液中存在堿性磷酸酶的條件下也可以使β-半乳糖苷酶有效失活。激光照射10分鐘后95％的β-半乳糖苷酶被滅活而堿性根本不受影響(Linden等人(1992)Biophys.J.61，956-962)。Jay還闡明結(jié)合到蛋白的單個(gè)表位的染料標(biāo)記的抗體足夠滅活乙酰膽堿酯酶(Jay(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5454-58)。
Henning等人描述針對多種蛋白成功應(yīng)用CALI(Henning等人Drug Discovery 62-71)。這些蛋白包括膜蛋白(例如，T細(xì)胞受體的α-、β-、ε-鏈，β1整聯(lián)蛋白、ephrin A5或者FAS受體)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(例如，Calicineurin、親環(huán)蛋白A或者PKC)、細(xì)胞骨架蛋白(例如，肌動(dòng)蛋白、埃茲蛋白或驅(qū)動(dòng)蛋白)或者轉(zhuǎn)錄因子。Henning等人還描述CALI可用于鑒定作為藥物靶的新蛋白，并且同時(shí)闡明它們在目的生物背景中的功能(Henning等人(2002)CurrentDrug Discovery May，17-19)。
CALI的一些應(yīng)用實(shí)例表明該技術(shù)能夠?qū)⑻禺惖欠且种菩耘潴w轉(zhuǎn)化成阻斷試劑。因此，這些配體可用于調(diào)節(jié)抑制性配體的作用。CALI還可以用于進(jìn)一步增強(qiáng)本身已經(jīng)具有抑制效果的配體的抑制效果。實(shí)驗(yàn)部分說明了實(shí)施例，其中在侵襲力或者粘著測定中整合CALI。
分子的化學(xué)修飾可以是加入生色團(tuán)或者熒光團(tuán)。生色團(tuán)是由于與光相互作用的流動(dòng)電子而具有高度光學(xué)活性的分子的部分。如果生色團(tuán)吸收光譜的可見范圍的光，那么生色團(tuán)稱作熒光團(tuán)。生色團(tuán)的一些實(shí)例為例如，熒光素衍生物、羅丹明衍生物、香豆素衍生物、卟啉衍生物、酞菁衍生物、萘酞菁(naphthalocyanines)衍生物、伊紅衍生物、三苯基甲烷衍生物或者吖啶衍生物?；瘜W(xué)修飾生物分子的一組生色團(tuán)和有用的衍生物在The Sigma Aldrich Handbooks of Stainsand Dyes，Ed.，F(xiàn).J.Green(1990)ISBN No.0-941633-22-5中公開。
在本發(fā)明的另一方面，用可檢測標(biāo)記標(biāo)記抑制劑。具體地，可檢測標(biāo)記的實(shí)例為放射性同位素、生色團(tuán)、熒光團(tuán)或者酶。
通過使用本發(fā)明的生物綴合物或者多肽，尤其本發(fā)明的抗體或者抗體片段可以檢測癌相關(guān)的Hsp90抗原的表達(dá)。從受試者采集樣品，例如，從懷疑患有腫瘤的組織采集活組織檢查樣品。通常，在進(jìn)行測定前處理樣品?？梢允褂玫臏y定法包括ELISA、RIA、EIA、蛋白印跡分析、免疫組織學(xué)染色等等。依賴于所用的測定法，可以通過酶、熒光團(tuán)或者放射性同位素標(biāo)記抗原或者抗體。(見，例如，Coligan等人(1994)Current Protocols in Immunology，John Wiley & SonsInc.，New York，New York；和Frye等人(1987)Oncogene4，1153-1157.)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多肽或者生物綴合物結(jié)合人細(xì)胞外Hsp90并減小癌細(xì)胞的侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛力。一種測量人癌細(xì)胞的侵襲力程度的方法在實(shí)施例中給出。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其含有有效量的細(xì)胞外Hsp90的抑制劑，所述藥物組合物具體用于減小癌細(xì)胞的侵襲力和/或轉(zhuǎn)移潛力。優(yōu)選地，所述抑制劑基本上不能進(jìn)入細(xì)胞或者以如此方式修飾從而該抑制劑的細(xì)胞攝入基本上被阻止。本發(fā)明的藥物組合物可用于制備預(yù)防和/或治療增殖性疾病如癌癥或者轉(zhuǎn)移的藥物。
本發(fā)明還涉及含有有效量的至少一種抑制劑，尤其一種抗體或者抗體片段的藥物組合物，還涉及所述抗體或者抗體片段用于制備預(yù)防和/或治療增殖性疾病、癌癥或者轉(zhuǎn)移的藥物的用途。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括診斷試劑盒。這種試劑盒含有至少一種生物綴合物和/或至少一種抑制劑或者它們的標(biāo)記形式，并且還由實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)競爭或者夾層測定法所需的試劑和材料組成。所述診斷試劑盒可用于測定生物樣品，尤其某些癌細(xì)胞類型的侵襲潛力。試劑盒將通常還包含容器。
另一方面，本發(fā)明包括篩選或者轉(zhuǎn)體內(nèi)(ex vivo)測試細(xì)胞的侵襲和/或轉(zhuǎn)移行為的方法，該方法包括步驟a)在基本上阻止Hsp90抑制劑的細(xì)胞攝入條件下將細(xì)胞與一種或多種所述Hsp90抑制劑接觸；b)分析根據(jù)步驟a)處理的細(xì)胞的遷移；c)比較根據(jù)步驟a)處理的細(xì)胞與未處理細(xì)胞的遷移，和任選地d)測定根據(jù)步驟a)處理的細(xì)胞與未處理細(xì)胞的遷移百分比。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，實(shí)施篩選從而細(xì)胞在適于該細(xì)胞生長的條件下與凝膠樣基質(zhì)接觸并且步驟b)包括分析細(xì)胞通過所述基質(zhì)的遷移。
文中所用術(shù)語“凝膠樣基質(zhì)”理解為水含量為至少90％的半固體物質(zhì)，其允許與所述基質(zhì)接觸培養(yǎng)癌細(xì)胞并允許侵襲性癌細(xì)胞通過所述“凝膠樣基質(zhì)”的0.1mm到1mm，優(yōu)選0.3mm厚的片層遷移，但是非侵襲性細(xì)胞不能遷移。這種“凝膠樣基質(zhì)”的實(shí)例是類似蛋白和糖組合物中細(xì)胞外基質(zhì)的物質(zhì)，尤其通過商業(yè)途徑可以獲得的“Matrigel”。具體地，“凝膠樣基質(zhì)”含有選自IV型蛋白膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白的蛋白之一。更具體地，凝膠樣基質(zhì)含有IV型蛋白膠原，纖連蛋白和層粘連蛋白。更具體地，凝膠樣基質(zhì)含有IV型蛋白膠原、層粘連蛋白、觸覺蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或者IV型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白、觸覺蛋白和玻連蛋白。
本發(fā)明還提供了通過篩選ALDUs的文庫鑒定特異結(jié)合Hsp90的抑制劑的方法，其中這些抑制劑能夠抑制癌細(xì)胞的Hsp90相關(guān)的侵襲力、粘著性和/或轉(zhuǎn)移潛力。所述方法包括步驟a)將可擴(kuò)增的配體展示單位(ALDU)的文庫與癌細(xì)胞，例如，與肉瘤細(xì)胞接觸；b)將所述癌細(xì)胞和結(jié)合所述癌細(xì)胞的ALDUs與未結(jié)合所述癌細(xì)胞的ALDUs分離；c)擴(kuò)增結(jié)合到所述癌細(xì)胞的ALDUs；d)通過功能篩選測定法鑒定影響Hsp90的所述生物活性的步驟c)后的ALDU或者衍生自ALDU的配體。
e)鑒定能夠結(jié)合Hsp90的步驟d)后的ALDU或者衍生自ALDU的配體。
f)測定所述配體的化學(xué)特性。
優(yōu)選的——但不是唯一可能的——所述步驟的順序是a、b、c、d、e和任選f。
文中所用“可擴(kuò)增的配體展示單位”(ALDU)是具有雙重功能的分子或者一組分子它們可以通過配體結(jié)合靶細(xì)胞；并且它們具有與所述配體物理結(jié)合的關(guān)于其特性的信息，其允許個(gè)別的單位被鑒定和擴(kuò)增。ALDUs的實(shí)例為可用于選擇擴(kuò)增(SELEX)方法的寡核苷酸，尤其是RNAs，噬菌體展示文庫的噬菌體、病毒展示文庫的病毒、核糖體展示技術(shù)的核糖體，還包括個(gè)別化珠子，其攜帶可鑒定的分子或者配體，尤其是化學(xué)實(shí)體，例如，結(jié)合到珠子的小分子，其能夠被惰性化學(xué)標(biāo)記識(shí)別。優(yōu)選這樣的ALDUs，其含有作為可鑒定組分的核酸。例如，通過核酸擴(kuò)增方法像RT-PCR、PCR、LCR等可以體外擴(kuò)增這些ALDUs，或者它們可以在體內(nèi)擴(kuò)增，例如，單個(gè)噬菌體可以感染細(xì)菌并且?guī)纵喐腥竞罂梢援a(chǎn)生數(shù)百萬基本上相同的后代。ALDUs文庫是一組相似但是通常不同的ALDUs，例如，噬菌體文庫的噬菌體，其在另外相同的噬菌體表面的背景中展示不同的scFvs。
文中提到的“來源于ALDU”的配體是這樣的配體，其已經(jīng)通過這種ALDU展示并且已經(jīng)通過與靶細(xì)胞表面的結(jié)合進(jìn)行選擇。作為實(shí)例，如果ALDU是展示scFv的噬菌體文庫的噬菌體，那么“來源于ALDU的配體”在該情況中是多肽，這里為scFv。作為另一實(shí)例，對于核糖體展示，“來源于ALDU”的配體是這樣的多肽，其通過含有核糖體、RNA和該多肽的復(fù)合體呈遞。
所述方法有利地組合了基于結(jié)合到癌細(xì)胞表面的篩選步驟和基于功能測定的篩選步驟。因此，將ALDUs的文庫與癌細(xì)胞以如此方式接觸從而文庫的那些對癌細(xì)胞的表面抗原具有特異性的ALDUs可以結(jié)合與例如癌細(xì)胞的表面有關(guān)的結(jié)構(gòu)。例如，可以允許展示抗體或者抗體片段的噬菌體文庫的噬菌體結(jié)合所培養(yǎng)的癌細(xì)胞，或者，作為另一實(shí)例，可以允許RNA-寡核苷酸文庫的RNA結(jié)合這類癌細(xì)胞。
代表用步驟d)得到的抗體或者抗體片段的ALDUs的特性可以通過例如，對編碼所述抗體或者抗體片段的DNA測序來確定，或者對于使用柵格化或編號(hào)的噬菌體的商業(yè)文庫，通過確定柵格位置或者噬菌體數(shù)目來確定。柵格位置或者數(shù)目可以揭示ALDU代表的抗體或者抗體片段的特性。
文中所用“配體”是通過可擴(kuò)增的配體展示單位(ALDU)可以展示的分子。配體可以是結(jié)合細(xì)胞外Hsp90并抑制其功能的任意實(shí)體。配體是ALDU的部分，ALDU通過該部分可以結(jié)合靶。
如文中提到的“特異結(jié)合細(xì)胞外Hsp90”的配體可以是在實(shí)施例中給出的緩沖液條件下結(jié)合Hsp90的配體?？梢岳?，通過使用所稱作的BIACORE系統(tǒng)(見，例如，F(xiàn)ivash等人Curr Opin Biotechnol.(1998)9，97-101)測量配體和Hsp90之間的解離常數(shù)，且“特異結(jié)合”可以理解為指如果在標(biāo)準(zhǔn)條件下測量，配體和Hsp90之間的解離常數(shù)低于10μM，優(yōu)選低于1μM，更優(yōu)選低于500、400、300、200、100、50、20nM，最優(yōu)選為0.1nM到20nM，所述標(biāo)準(zhǔn)條件為例如，20℃，環(huán)境壓力，和適宜的緩沖液，例如，20mM Tris，100mM NaCl，0.1mM EDTA中，總pH7.0。
文中所用兩種組分的“接觸”指允許兩種組分物理上相互接觸并相互結(jié)合。
文中所用“分離”指兩種或多種組分的物理分離，例如，結(jié)合ALDU的細(xì)胞可以與游離的ALDU通過離心分離，其中結(jié)合ALDU的細(xì)胞沉淀下來而游離ALDU仍然在上清液中。
文中所用“擴(kuò)增”是將ALDU或者來源于ALDU的配體數(shù)目增加至少2倍，優(yōu)選10、100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或甚至十億倍的任意過程。例如，單個(gè)噬菌體可以通過感染細(xì)菌擴(kuò)增，并且受感染的細(xì)菌產(chǎn)生感染噬菌體的若干大部分相同的拷貝，或者DNA分子可以通過PCR方法擴(kuò)增產(chǎn)生104個(gè)或更多大部分相同的子DNA分子。
文中所用“鑒定”指定位或者識(shí)別具有特定性質(zhì)的個(gè)別組分，例如，ALDU，并分離所述個(gè)別組分。
文中所用“確定配體的化學(xué)特性”指確定配體的結(jié)構(gòu)組成。例如，如果ALDU文庫是展示scFv的噬菌體文庫，那么“確定配體的化學(xué)特性”指測定scFv多肽的序列，例如，通過對編碼其所來源的噬菌體的scFv的區(qū)域進(jìn)行測序來測定。
文中所用“篩選測定法乃旨在檢測在具有稍微不同的性質(zhì)的其他相似個(gè)體中具特定性質(zhì)的個(gè)體，例如，ALDU。為了具有篩選測定法的資格，必須在某一功能測定中試驗(yàn)至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或甚至100個(gè)個(gè)體以發(fā)現(xiàn)其中所檢測的個(gè)體中具有所需要的功能的一個(gè)個(gè)體/多個(gè)個(gè)體。
在根據(jù)本發(fā)明的分離步驟(b)中，癌細(xì)胞和結(jié)合癌細(xì)胞的ALDUs與未結(jié)合的ALDUs分離，以便選擇對癌細(xì)胞具有特異性的那些ALDUs。例如，通過除去溶液可以實(shí)現(xiàn)分離，其中已經(jīng)從培養(yǎng)瓶中貼壁生長的經(jīng)培養(yǎng)的癌細(xì)胞并且與未結(jié)合的ALDUs的溶液進(jìn)行所述接觸步驟；或者作為另一實(shí)例，具有在其上結(jié)合的SELEX文庫RNA的癌細(xì)胞可以通過離心分離，而未結(jié)合的RNAs作為溶液的部分保留在上清液中，其中已經(jīng)進(jìn)行了接觸步驟。備選地，通過離心、密度離心、過濾、FACS分選、免疫沉淀或者固定到固體支持體可以實(shí)現(xiàn)分離。例如，利用結(jié)合靶的ALDU的復(fù)合體與未結(jié)合的ALDU相比具有不同的生物化學(xué)性質(zhì)這一事實(shí)可以將結(jié)合癌細(xì)胞的ALDU與未結(jié)合的ALDUs分離。那些改變的生物化學(xué)性質(zhì)可以是大小、特異結(jié)合、電荷密度、密度等等。
過濾可以分離結(jié)合的ALDUs與未結(jié)合的ALDUs，例如，如果濾器的大小使得結(jié)合癌細(xì)胞的ALDUs被該濾器的孔保留，而未結(jié)合的ALDUs可以穿過該濾器的孔。如果靶很大，像癌細(xì)胞，并且ALDU很小，例如，噬菌體、病毒、核酸或者展示配體的核糖體，那么通過大小過濾是有用的。
密度離心根據(jù)生物分子的密度將它們分離。如果結(jié)合靶的ALDU的密度與未結(jié)合的ALDU的密度不同，那么可以進(jìn)行密度離心。例如，如果ALDU是致密的，例如，展示配體的核糖體，并且靶不是那么致密，像肉瘤細(xì)胞或者來源于癌細(xì)胞膜的載體，那么可以應(yīng)用密度離心。
FACS可以基于靶標(biāo)的熒光分離結(jié)合癌細(xì)胞的ALDU復(fù)合體和未結(jié)合的ALDUs。通過用熒光染料標(biāo)記癌細(xì)胞然后使懸浮培養(yǎng)基中的經(jīng)標(biāo)記的癌細(xì)胞穿過狹窄的下滴噴嘴(dropping nozzle)從而每個(gè)癌細(xì)胞都是在小的、分開的小滴中來實(shí)施FACS。通常用基于激光的檢測系統(tǒng)激發(fā)熒光染料并且使具有例如熒光陽性癌細(xì)胞的小滴帶電。帶電和不帶電的小滴當(dāng)穿過電板時(shí)分離并且可以收集到兩個(gè)不同的管中。這樣，含有結(jié)合到癌細(xì)胞的ALDUs的小滴與含有未結(jié)合的ALDUs的大批溶液分離。
可以將癌細(xì)胞固定到固體支持體以便分離結(jié)合到固定化癌細(xì)胞的ALDUs與未結(jié)合的ALDUs。癌細(xì)胞向固體支持體的固定通常通過使用表面活化的固體支持體或者固體支持體表面與癌細(xì)胞的特異結(jié)合來進(jìn)行，在所述特異結(jié)合中使用例如，對癌細(xì)胞具有特異結(jié)合性質(zhì)的生物分子。為了分離結(jié)合到固定化癌細(xì)胞的ALDUs與未結(jié)合的ALDUs，將固定的癌細(xì)胞與含有未結(jié)合的ALDUs的大批溶液分離。
通過從固定化癌細(xì)胞除去含有未結(jié)合的ALDUs的大批溶液可以進(jìn)行結(jié)合到固定化癌細(xì)胞的ALDUs與含有未結(jié)合的ALDUs的大批溶液的分離。例如，如果癌細(xì)胞通過共價(jià)相互作用固定到例如，塑料微量滴定板的孔上，那么通過除去溶液并用洗滌溶液洗滌所述孔可以分離含有未結(jié)合的ALDUs的大批溶液。
在根據(jù)本發(fā)明方法的擴(kuò)增步驟(c)中，擴(kuò)增結(jié)合靶的ALDUs，以便得到足夠高濃度的ALDUs，從而它們可用于功能篩選中。該擴(kuò)增步驟利用ALDU的可擴(kuò)增的內(nèi)在性質(zhì)。例如，已經(jīng)與步驟b)中未結(jié)合的噬菌體分離，但是仍然結(jié)合癌細(xì)胞的展示例如，抗體或者抗體片段的噬菌體可以通過如下方法擴(kuò)增，即首先回收結(jié)合的噬菌體，例如，通過從癌細(xì)胞洗脫噬菌體，然后使用回收的噬菌體洗脫物感染細(xì)菌，例如，大腸桿菌(Escherichia coli)。然后大腸桿菌中噬菌體的擴(kuò)增導(dǎo)致總噬菌體數(shù)目的顯著增加，但是這樣，能夠結(jié)合癌細(xì)胞的那些單獨(dú)噬菌體的濃度顯著增加了。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，通過洗脫結(jié)合癌細(xì)胞的ALDU，或者通過在ALDU保持可擴(kuò)增的條件下裂解癌細(xì)胞并隨后擴(kuò)增可以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增步驟。結(jié)合癌細(xì)胞的ALDUs可以例如，通過使用如實(shí)施例中闡明的具有低pH和/或高鹽的溶液首先從癌細(xì)胞洗脫，并隨后擴(kuò)增，例如，從而所洗脫的噬菌體用于感染大腸桿菌以便產(chǎn)生大量子代噬菌體。然而，從靶的洗脫步驟盡管是方便的，但是不是必需的，因?yàn)?，例如，對于噬菌體文庫，甚至仍然結(jié)合癌細(xì)胞的噬菌體也能夠感染大腸桿菌，并因而能夠產(chǎn)生大量相同的后代，從而甚至當(dāng)仍然結(jié)合癌細(xì)胞時(shí)也是可以擴(kuò)增的。因此，不必從靶細(xì)胞除去噬菌體，因?yàn)槿匀唤Y(jié)合靶細(xì)胞的噬菌體可以感染所加入的細(xì)菌并因而擴(kuò)增。
作為另一實(shí)例，核糖體展示文庫的mRNA(其通過與展示相應(yīng)于該mRNA的多肽的核糖體附著而與癌細(xì)胞表面結(jié)合)可以直接用于RT-PCR，而不必在擴(kuò)增靶前從靶除去完整ALDU。從而其中在擴(kuò)增ALDU前從靶回收結(jié)合靶的ALDU的步驟是任選步驟。
擴(kuò)增ALDU還可以是確定結(jié)合到癌細(xì)胞的這種ALDUs的配體的化學(xué)特性，然后擴(kuò)增該配體。也就是說，例如，對于展示抗體或者抗體片段的噬菌體文庫，例如，通過PCR可以從結(jié)合癌細(xì)胞的噬菌體克隆編碼這些配體的DNA，并且可以重組產(chǎn)生配體，例如，抗體或者抗體片段，以產(chǎn)生用于功能篩選測定法的足夠量配體。這樣，不是ALDU自身而是ALDU展示的配體得到擴(kuò)增。然而，這在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因?yàn)閿U(kuò)增步驟的目標(biāo)是產(chǎn)生足夠高濃度的配體以用于功能篩選測定法中，并且這可以通過擴(kuò)增所述配體或者展示該配體的ALDU來實(shí)現(xiàn)。
在根據(jù)本發(fā)明方法的鑒定步驟(d)中，結(jié)合癌細(xì)胞的ALDU或者來源于ALDU的配體可基于其在功能篩選測定法中對Hsp90的生物功能的影響來鑒定。對于這種功能篩選測定法，ALDUs或者來源于它們的配體有利地個(gè)別化，從而來自功能篩選測定法的信號(hào)或者模式與個(gè)體ALDU或者配體的個(gè)體類型相關(guān)。這可以通過例如，用每種單獨(dú)配體填充多孔板的不同孔，然后在那些單獨(dú)孔中進(jìn)行Hsp90的所需要的生物功能的測定法來完成。
在另一實(shí)例中，已經(jīng)結(jié)合癌細(xì)胞并且與未結(jié)合的噬菌體分離的噬菌體可以通過感染細(xì)菌并在例如軟瓊脂中接種受感染的細(xì)菌，從而形成代表單獨(dú)噬菌體的克隆的單個(gè)噬菌斑來完成個(gè)別化。可以在Hsp90功能的生物篩選測定中檢查那些單獨(dú)噬菌斑的效應(yīng)。在這種測定中，可以鑒定在對Hsp90功能的功能篩選測定中具有效應(yīng)的個(gè)體噬菌斑。然后例如通過對所分離的噬菌斑的噬菌體DNA進(jìn)行測序可以鑒定噬菌斑的噬菌體展示的配體，所述噬菌斑代表通過其結(jié)合癌細(xì)胞的能力初步選擇的單個(gè)噬菌體克隆。從而，對于ALDU自身用于功能篩選測定法的情況，如果需要，可以確定ALDU展示的配體的特性。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述配體能夠抑制Hsp90的生物功能。例如，Hsp90的生物功能可以是侵襲或者粘著。
在另一實(shí)施方案中，ALDU或者來源于ALDU的配體用于鑒定根據(jù)本發(fā)明的未經(jīng)修飾的配體的根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟d)中的功能篩選測定法中。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的鑒定配體的方法的步驟d)中的功能篩選測定法的ALDU或者來源于ALDU的配體經(jīng)化學(xué)修飾以增加它們的生物活性或者賦予ALDU或者所述配體生物活性。作為實(shí)例，增加ALDU或者配體的生物活性或者賦予ALDU或者配體生物活性的一種方法是聯(lián)合使用ALDU或者所述配體與前面描述的生色團(tuán)輔助激光滅活(CALI)。CALI還可以用于進(jìn)一步增強(qiáng)自身已經(jīng)具有中和和抑制作用的配體的抑制效果。
這也表明ALDU上展示的配體的性質(zhì)對于鑒定適宜的分子不是關(guān)鍵的，對成功篩選根據(jù)本發(fā)明的Hsp90抑制分子具有影響的更多是ALDU可被鑒定和擴(kuò)增的能力。
然而，如前面解釋的，通過增加個(gè)體ALDU的數(shù)目，但也通過增加個(gè)體ALDU所展示的配體的數(shù)目，可以實(shí)現(xiàn)ALDU的擴(kuò)增。因?yàn)檫@在原則上也可以通過在組合化學(xué)文庫中展示小化學(xué)分子的個(gè)體珠子來實(shí)現(xiàn)(見Ohlmeyer等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90，10922-26；Liu等人J.Am.Chem.Soc.(2002)124，7678-80；Liang等人Science(1996)274，1520-2)，所以這些珠子形式文庫也是ALDUs的文庫?？梢栽谖⑶蝮w珠上合成小分子，所述微球體珠可以以惰性化學(xué)標(biāo)記做索引。在合成方案的每一步期間，編碼步驟號(hào)和該步驟所用的化學(xué)試劑的標(biāo)記分子附著到該珠子。然后該標(biāo)記陣列用作二進(jìn)制代碼以記錄每個(gè)珠子的反應(yīng)歷史。然后可以以更大規(guī)模容易地合成所鑒定的化合物。
根據(jù)本發(fā)明所用的ALDU是生物ALDU，從而關(guān)于其特性的信息以核酸，例如RNA或者DNA形式存儲(chǔ)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，ALDU選自用于病毒展示的病毒、用于噬菌體展示的噬菌體、用于細(xì)菌展示的細(xì)菌、用于核糖體展示的所核糖體、用于酵母展示的酵母和用于選擇和擴(kuò)增的寡核苷酸。
用于噬菌體展示的噬菌體可以是可以培養(yǎng)得到并且適合基因工程技術(shù)改造并且能夠在它們的表面展示外源配體的所有噬菌體。噬菌體展示已經(jīng)在Smith等人(1985)Science，228，1315-17中公開，抗體的噬菌體展示已經(jīng)在WO 91/17271中公開。
用于細(xì)菌展示的細(xì)菌是可以在培養(yǎng)物中保持、適合基因工程技術(shù)改造并且能夠在它們的表面展示配體的細(xì)菌。用于細(xì)菌展示的細(xì)菌的實(shí)例在Dougherty等人，(1999)Protein Eng.12，613-21；和Westerlund-Wickstrom B.(2000)Int.J.Meth.Microbiol.290，223-30中公開。
用于核糖體展示的核糖體已經(jīng)在Shaffizel等人，(1999)J.Immunol.Methods 231，119-35；和Willson等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，3750-5中公開。
用于選擇/擴(kuò)增(Selex)的寡核苷酸已經(jīng)在Tuerk和Gold(1990)Science 249，505-10，和Tuerk等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6988-92中公開。
然而，可以培養(yǎng)并且適合基因工程技術(shù)改造并且從而能夠在它們的表面展示外源配體的低級真核生物也可以用作ALDUs，例如，如Boder和Wittrup(2000)Methods Enzymol.328，430-44中公開的遺傳修飾的酵母。
本發(fā)明的方法、鑒定本發(fā)明的配體的方法包括如下鑒定步驟d)，即在空間上分離ALDUs庫的不同ALDU然后如此篩選空間上分離的ALDUs對Hsp90的生物功能的影響從而所得結(jié)果可以分配給個(gè)體ALDU。ALDUs庫的不同ALDU的空間分離可以例如，通過用各種個(gè)體配體填充多孔板的不同孔并將那些多孔板用于功能篩選測定來實(shí)現(xiàn)。如果例如，在一個(gè)孔中Hsp90的生物功能受到抑制，那么可鑒定抑制Hsp90的所述生物功能的一個(gè)配體，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)人員知道他放入每個(gè)單獨(dú)孔中的每種配體的特性。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的鑒定配體的方法可以包括確定所述配體的特性的步驟，其中該確定步驟通過對所鑒定的ALDU的DNA進(jìn)行測序、采集所鑒定的ALDU的核酸的PCR指紋圖譜或者，對于來源于ALDU的配體，通過這種配體的質(zhì)譜法來實(shí)現(xiàn)。在Marks等人(J.Mol.Biol.(1991)222，581-97)中公開了例如噬菌體的PCR指紋法。在Shevchenko等人((1996)Anal.Chem.68，850-58)或Spengler等人((1992)Rapid.Commun.Mass.Spectrom.6，105-8.)中公開了配體，例如，多肽的質(zhì)譜分析。
根據(jù)本發(fā)明的鑒定配體的方法還可以包括至少一個(gè)額外的篩選ALDUs的步驟，例如，其中篩選是基于ALDUs的生物化學(xué)性質(zhì)的。這種額外的篩選步驟可以包括選自流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、免疫沉淀、結(jié)合測定法、免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)、親和力研究、免疫印跡法和蛋白陣列的方法。通過ALDU或者來自ALDU的配體的大小、形狀、密度、電荷密度、疏水性或者結(jié)合特異性可以確定生物化學(xué)性質(zhì)。ALDU或者來自ALDU的配體的生物化學(xué)性質(zhì)形成上述篩選ALDUs的方法的適用性的基礎(chǔ)。通常通過用熒光染料標(biāo)記細(xì)胞然后使懸浮培養(yǎng)基中的那些標(biāo)記細(xì)胞穿過狹窄的下滴噴嘴從而每個(gè)細(xì)胞在一個(gè)小的分開的小滴中來進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)?；诩す獾臋z測系統(tǒng)通常用于激發(fā)熒光染料，并登記含有例如，熒光陽性細(xì)胞的小滴。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，鑒定本發(fā)明的配體的方法可以還包括扣除選擇步驟。扣除選擇步驟是除去具有不需要的性質(zhì)的ALDUs的步驟。例如，如果結(jié)合對照細(xì)胞的性質(zhì)是不需要的，那么除去能夠結(jié)合對照細(xì)胞的ALDUs可以實(shí)現(xiàn)扣除選擇步驟。作為實(shí)例，如果想要選擇對癌細(xì)胞特異的ALDUs，那么可以首先選擇結(jié)合癌細(xì)胞的那些ALDUs，洗脫結(jié)合的ALDUs，例如，噬菌體，然后通過例如將所洗脫的ALDUs庫與非癌細(xì)胞接觸并除去結(jié)合非癌細(xì)胞的那些ALDUs，以除去能夠結(jié)合非癌細(xì)胞的那些ALDUs。保持在上清液中的ALDUs是癌細(xì)胞特異的ALDUs，其可以用于根據(jù)本發(fā)明鑒定配體的方法的功能篩選測定法中。
在步驟e)中，ALDUs(例如，噬菌體)庫富含結(jié)合Hsp90的ALDUs。那些結(jié)合Hsp90的ALDUs可以最終通過本領(lǐng)域中公知的多種方法在步驟f)中鑒定。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，上面的方法包括替代步驟e)和f)的進(jìn)一步的步驟e)將ALDUs，例如分離的噬菌體與重組Hsp90接觸；f)用緩沖的去污劑和/或高鹽溶液洗滌所述Hsp90；和g)洗脫ALDUs，例如，結(jié)合Hsp90的噬菌體；和h)確定所述洗脫的ALDU，例如噬菌體所代表的配體，例如，抗體或者抗體片段的特性。
所用的“去污劑”可以是去污劑溶液，優(yōu)選緩沖的，并且可以是濃度為0.001-0.5％，優(yōu)選0.01-0.1％的Tween。文中所用“高鹽”指高鹽溶液，優(yōu)選緩沖的，并且離子強(qiáng)度為10mM到1M，具體是20-500mM，更具體是50-350mM，甚至更優(yōu)選80-250mM。通常有用的陰離子為例如，氯離子、檸檬酸根、磷酸根、磷酸氫根或者硼酸根。通常有用的陽離子為，例如，鈉、鉀、鋰、鈣或者鎂。
上面段落中的緩沖液通常具有7-8的pH。例如，具有具體是1-20％，更具體是5-15％，甚至更優(yōu)選約10％FCS的DMEM或者PBS可以用作緩沖液。
通過以200到300的g值溫和離心3到20分鐘，具體是5到10分鐘實(shí)現(xiàn)結(jié)合噬菌體的細(xì)胞的分離。結(jié)合到細(xì)胞和固定化Hsp90的噬菌體的洗脫通過用2-100mM，具體是4-50mM，更具體是5-20mM，甚至更優(yōu)選約10mM，pH為0到2.5，具體是1到2.5，更具體是1.5到2.5的甘氨酸洗滌來實(shí)現(xiàn)。
此外，根據(jù)本發(fā)明可以使用細(xì)胞外Hsp90的所有抑制劑調(diào)節(jié)并特別是減小基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的活性和/或減小基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌。
提供了下面的實(shí)施例(包括所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和得到的結(jié)果)僅用于闡明目的并且不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。
附圖簡述圖1顯示了染色的HT-1080細(xì)胞通過Matrigel涂覆的8μm濾器的侵襲(左圖)。右圖顯示了作為對照的HS-27細(xì)胞的侵襲。37℃溫育6小時(shí)后定量熒光。所給出的數(shù)據(jù)為n＝3孔的平均值+/-SD。
圖2顯示了mAb1.5.1對HT-1080細(xì)胞侵襲的抑制作用。光照射(用CALI)后用Matrigel涂覆的細(xì)胞遷移室在趨化性測定中測定侵襲。將不存在任何抑制分子時(shí)HT-1080細(xì)胞的侵襲作為對照(左邊條形)。mAb1.5.1抑制HT-1080細(xì)胞侵襲的約35％(p值＜0.001)。
圖3顯示了scFv1對HT-1080細(xì)胞的侵襲的抑制作用。光照射(用CALI)后用Matrigel涂覆的細(xì)胞遷移室在趨化性測定中測定侵襲。將不存在任何抑制分子時(shí)HT-1080細(xì)胞的侵襲作為對照(左邊條形)。scFv1抑制HT-1080細(xì)胞侵襲的約46％(p值＜0.05)。
圖4顯示了侵襲的抑制與抗體濃度的相關(guān)性。將對Hsp90、Hsp90α、Hsp90β的特異抗體(都來自Stressgen)、α輔肌動(dòng)蛋白4(MartinR.Pollak，Children′s Hospital，Boston，MA)和mAb1.5.1用FITC標(biāo)記并能在光照射后以3種濃度(10μg/mL，20μg/mL和40μg/mL)在侵襲測定中試驗(yàn)。還顯示了陽性對照β1整聯(lián)蛋白(Chemicon，20μg/mL)和陰性對照(0，無抗體)。mAb1.5.1、Hsp90和Hsp90α抗體都表現(xiàn)出侵襲的濃度依賴性抑制，而Hsp90β和α輔肌動(dòng)蛋白4卻不表現(xiàn)出所述抑制。每個(gè)條形對都黑暗對照標(biāo)準(zhǔn)化并且代表一式三份的至少2個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±s.e.m。
圖5顯示了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將mAb1.5.1或者抗-Hsp90抗體(Stressgen#SPA-830)與HT-1080細(xì)胞的裂解物溫育。通過SDS-PAGE分離免疫復(fù)合物并用mAb1.5.1或者抗-Hsp90抗體進(jìn)行免疫印跡。兩種抗體識(shí)別相同的特異帶，表明兩種抗體結(jié)合相同的蛋白。
圖6顯示了Hsp90和mAb 1.5.1的共免疫細(xì)胞化學(xué)。第一個(gè)圖顯示了HT-1080細(xì)胞前沿附近Hsp90α/β(Affinity Bioreagents#PA3012 &PA3-013)的定位。第二個(gè)圖顯示了使用mAb 1.5.1的前沿附近的相同定位。當(dāng)圖像重疊時(shí)，可以看到完全的蛋白共定位(右圖)。這表明mAb 1.5.1和Hsp90識(shí)別相同的蛋白。對于羅丹明(紅色，Hsp90α/β)和FITC(綠色，mAb 1.5.1)使用546和480的激發(fā)濾色片組和590和535的發(fā)射濾色片組收集圖像(Zeiss Axiovert 10，使用Neofluar40-x/0.75數(shù)值孔徑透鏡)。圖中定標(biāo)線代表10μm。
圖6.1使用針對β1-整聯(lián)蛋白(c)和Hsp90α(e)的抗體對HT-1080細(xì)胞的表面免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示了不同的表面染色。陰性對照[僅小鼠第二抗體(a)和僅兔第二抗體(b)]、α輔肌動(dòng)蛋白4(d)和Hsp90β(f)沒有顯示可檢測的表面染色。用Olympus BH-3顯現(xiàn)圖像并使用SPOT數(shù)碼相機(jī)(Digital Instruments)收集。
圖6.2使用針對β1-整聯(lián)蛋白(c)和Hsp90α(e)的抗體對MD-MDA231腺癌細(xì)胞的表面免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示了不同的表面染色。陰性對照[僅小鼠第二抗體(a)和僅兔第二抗體(b)]、α輔肌動(dòng)蛋白4(d)和Hsp90β(f)沒有顯示可檢測的表面染色。用OlympusBH-3顯現(xiàn)圖像并使用SPOT數(shù)碼相機(jī)(Digital Instruments)收集。
圖6.3使用Hsp90α和Hsp90β特異抗體對HT-1080條件培養(yǎng)基的免疫印跡顯示了Hsp90α但不是Hsp90β的細(xì)胞外定位。Hsp90α存在于HT-1080細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基中，但是Hsp90β不存在于所述培養(yǎng)基中。
圖7顯示了用如前面描述的活HT-1080細(xì)胞進(jìn)行的表面蛋白生物素化實(shí)驗(yàn)。通過SDS-PAGE分離表面生物素化蛋白和未生物素化的細(xì)胞內(nèi)蛋白。將Hsp90和α輔肌動(dòng)蛋白4抗體用于免疫印跡分析。Hsp90顯示了表面(S)和細(xì)胞內(nèi)(IC)定位，但是α輔肌動(dòng)蛋白僅在細(xì)胞內(nèi)庫中發(fā)現(xiàn)。
圖8顯示了FACS分析的結(jié)果。闡明了scFv1對HT-1080細(xì)胞(粗線)和作為對照的HS-27細(xì)胞(細(xì)線)的結(jié)合活性。
圖9顯示了從肽質(zhì)譜分析得到的肽匹配物。來自mAb 1.5.1的免疫沉淀的胰蛋白酶消化的肽片段在Survevor HPLC上和具有75μM納噴霧(nanospray)C18柱(New Objectives)的LCO Deca離子阱質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan)上運(yùn)行。將所得的PMF(肽質(zhì)量片段)用于在NCBI和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中檢索智人(Homo sapiens)的所有條目。所匹配的肽覆蓋24％(172/732殘基)Hsp90α和33％(241/724殘基)Hspβ。
圖10顯示了新生霉素對HT-1080細(xì)胞侵襲的濃度依賴性作用。用新生霉素或者萘啶酮酸預(yù)處理HT-1080細(xì)胞1小時(shí)并進(jìn)行侵襲測定。新生霉素顯示出對侵襲的劑量依賴性抑制(通過ANOVA分析在＞0.05mM時(shí)p≤0.01)。萘啶酮酸對侵襲沒有影響。該測定中細(xì)胞的生存力未受影響(數(shù)據(jù)未顯示)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)對無藥物對照標(biāo)準(zhǔn)化并代表一式三份的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±s.e.m。
圖11表明加入新生霉素后MMP分泌減少。以給定濃度的新生霉素或者萘啶酮酸(作為對照)處理40,000 HT-1080細(xì)胞6小時(shí)。在所測試的新生霉素的最高濃度時(shí)MMP活性減少了＞75％，用萘啶酮酸沒有看到酶活性的減少。兩條帶(A和B)對應(yīng)于未鑒定的MMP(為了清楚將圖像倒轉(zhuǎn))。
圖12顯示了生色團(tuán)輔助的激光/光滅活(CALI)的原理。
圖13顯示了scFv展示載體pXP10的載體圖和相應(yīng)序列。
圖14顯示了scFv表達(dá)載體pXP14的載體圖和相應(yīng)序列。
圖15顯示了小鼠文庫的構(gòu)建引物的序列。
圖16顯示了scFv1的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)(CDR3區(qū)域加下劃線)和核苷酸序列(SEQ ID NO.2)。
圖17表明抗-Hsp90α抗體共免疫沉淀來自HT-1080條件培養(yǎng)基的MMP2。將免疫沉淀的蛋白用抗-MMP2或者Hsp90α進(jìn)行免疫印跡。Hsp90的抑制抑制了MMP2分泌。
圖18顯示了格爾德霉素(GA)處理后條件培養(yǎng)基中的MMP2含量。用無血清培養(yǎng)基中的20μM格爾德霉素(GA)處理HT-1080細(xì)胞并通過酶譜法進(jìn)行測定。GA處理后MMP2(72kDa明膠酶)活性降低～35％。通過銀染顯現(xiàn)總蛋白含量以確保相等加樣。
圖19顯示了MMP2含量和Hsp90α含量之間的相關(guān)性。將HT-1080細(xì)胞用格爾德霉素綴合的瓊脂糖珠(GA-珠)或者對照珠(珠)處理或者不處理(0)。條件培養(yǎng)基對MMP2或者Hsp90α進(jìn)行免疫印跡。GA珠處理后活性MMP2水平降低了80％，原-MMP2水平降低了15％。
圖20表明用不同量的格爾德霉素綴合的瓊脂糖珠(GA-珠)處理后腫瘤細(xì)胞的侵襲力降低。將HT-1080細(xì)胞不用珠子處理、用5％或10％(v/v)GA-珠或者對照珠處理并測定侵襲力。GA-珠處理的細(xì)胞顯示出侵襲力的45％降低，而對照珠處理的細(xì)胞僅顯示侵襲力的15％降低(p＜0.01，t-檢驗(yàn))。將每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)對未處理對照標(biāo)準(zhǔn)化并且代表兩個(gè)一式三份測定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。
實(shí)施例實(shí)施例1產(chǎn)生單克隆抗體(例如mAb1.5.1)在三個(gè)月內(nèi)用固定或者裂解的HT-1080細(xì)胞免疫小鼠2次。對于固定，將匯合的(1×107/75cm2瓶)HT-1080細(xì)胞用PBS洗滌一次，然后用PBS和刮擦來移出。通過吹吸重懸細(xì)胞，以220×g離心5分鐘，并用10mL 2％多聚甲醛在4℃固定10分鐘。將細(xì)胞用PBS洗滌，然后重懸在1mL PBS中。通過胰蛋白酶消化匯合的HT-1080細(xì)胞產(chǎn)生裂解細(xì)胞，將其用PBS洗滌1次，然后以12000×g沉淀1分鐘。然后室溫下在裂解緩沖液(溶于0.33M Tris-HCl，pH 7.5中的0.67Triton-X-100)中裂解細(xì)胞5分鐘。以12000×g離心裂解物5分鐘。通過向PD-10柱加入裂解物來除去Triton-X-100并用3.5mL PBS洗脫蛋白。用Micro-BCA試劑盒(Pierce)定量蛋白，并將150μg/mL/小鼠用于免疫。
如以前描述的(Harlow和Lane，1988)進(jìn)行雜交瘤的產(chǎn)生。
通過首先將HT-1080細(xì)胞的匯合單層(96孔透明薄底板的每孔40,000個(gè))在4％多聚甲醛/PBS中室溫下固定30分鐘，然后在0.2％Triton-X-100中透化5分鐘，以初次篩選雜交瘤上清液。用未稀釋的雜交瘤上清液溫育后，用溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的0.1％牛血清清蛋白(BSA)洗滌3次，每次5分鐘。在室溫下加入FITC-標(biāo)記的兔抗小鼠第二抗體并保持1小時(shí)。重復(fù)相同的0.1％BSA/PBS洗滌，并在室溫下加入第三FITC-標(biāo)記的山羊抗兔抗體并保持1小時(shí)。最后一輪洗滌后，將細(xì)胞保存在4℃ PBS中直到成像。對于FITC使用480的激發(fā)濾色片組和535的發(fā)射濾色片組收集圖像(ZeissAxiovert 10，使用Neofluar 40X/0.75數(shù)值孔徑透鏡)。相對于陽性對照(抗-β1整聯(lián)蛋白，Chemicon#MAB1963和抗凝溶膠蛋白，Sigma#G4896)和陰性對照(無第一抗體)對細(xì)胞的染色打分。
然后通過表面免疫細(xì)胞化學(xué)對經(jīng)試驗(yàn)對HT-1080結(jié)合陽性的雜交瘤進(jìn)行表面表達(dá)試驗(yàn)。對于表面蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)，將HT-1080細(xì)胞的匯合單層(96孔透明薄底板的每孔40,000個(gè))與雜交瘤上清液在37℃/5％CO2下溫育1小時(shí)。用溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的0.1％牛血清清蛋白(BSA)洗滌3次，每次5分鐘后，將細(xì)胞在2％多聚甲醛中固定2分鐘。進(jìn)行另一輪0.1％BSA/PBS洗滌，并在室溫下加入FITC-標(biāo)記的兔抗小鼠第二抗體并保持1小時(shí)。重復(fù)相同的洗滌，并在室溫下加入第三FITC-標(biāo)記的山羊抗兔抗體并保持1小時(shí)。最后一輪洗滌后，將細(xì)胞保存在4℃PBS中直到成像。通過顯微鏡術(shù)在ZeissAxiovert 10上使用Neofluar 40X/0.75數(shù)值孔徑透鏡顯現(xiàn)表面染色。在對于FITC使用480的激發(fā)濾色片組和535的發(fā)射濾色片組收集圖像。相對于陽性對照(抗-β1整聯(lián)蛋白，Chemicon#MAB1963和抗凝溶膠蛋白，Sigma#G4896)和陰性對照(無第一抗體)對細(xì)胞的表面染色打分。
實(shí)施例2免疫文庫的構(gòu)建將兩BALB/c小鼠的每一只用2×107個(gè)多聚甲醛固定的HT-1080細(xì)胞(人纖維肉瘤細(xì)胞系；ATCC，CCL-121)進(jìn)行皮內(nèi)免疫。第一次免疫后，在39天內(nèi)重復(fù)注射兩次，處死小鼠并分離脾臟并將其在液氮中冷凍。
使用RNeasy Midi試劑盒(QIAGEN#75142)按照生產(chǎn)商描述的使用每種脾臟制劑的一半分離總RNA。通過變性甲醛凝膠和光度測量確定RNA濃度和純度。
用8.9μg新鮮制備的RNA和10pmol引物混合物(IgG1-c，IgG2a-c，IgG2b-c，IgG3-c，VLL-c，VLK-c)使用SuperscriptTMII試劑盒(GibcoBRL Life Technologies#18064-014)合成cDNA。這些引物與編碼κ和λ家族的IgG重鏈(VH)基因和輕鏈(VL)基因的RNA退火。使用無限制位點(diǎn)的9種正向引物(M-VH1、M-VH2、M-VH3、M-VH4、M-VH5、M-VH6、M-VH7、M-VH8、M-VH9)和4種反向引物(M-JH1、M-JH2、M-JH3、M-JH4)的36種獨(dú)立組合從1μl cDNA通過PCR擴(kuò)增VH基因。用無限制位點(diǎn)的引物混合物(M-VK1、M-VK2、M-VK3、M-VK4、M-VL1、M-JK1、M-JK2、M-JK3、M-JL1)PCR擴(kuò)增VL基因。凝膠純化PCR產(chǎn)物(QIAquick凝膠提取試劑盒，#28706)，并對于VH使用有限制位點(diǎn)的9種正向引物(MVH1 SfiI、MVH2 SfiI、MVH3 SfiI、MVH4 SfiI、MVH5 SfiI、MVH6 SfiI、MVH7 SfiI、MVH8 SfiI、MVH9 SfiI)和4種反向引物(M-JH1 SalI、M-JH2 SalI、M-JH3 SalI、M-JH4 SalI)的獨(dú)立組合再擴(kuò)增，并且對于VL使用有限制位點(diǎn)的引物混合物(M-VK1 ApaLI，M-VK2 ApaLI，M-VK3 ApaLI，M-VK4 ApaLI，M-VL1 ApaLI，M-JK1 NotI，M-JK2 NotI，M-JK3 NotI，M-JL1 NotI)再擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物凝膠純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，#28706)并對于VH使用限制性位點(diǎn)SfiI/SalI和對于VL使用ApaLI/NotI克隆到噬菌體展示載體pXP10。通過電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)染到大腸桿菌TG-1中，得到107個(gè)獨(dú)立克隆(噬菌體)的文庫大小，該文庫表達(dá)不同的單鏈抗體片段(scFv)。
實(shí)施例3scFv的選擇和篩選(對固定細(xì)胞的選擇)從用固定的HT-1080細(xì)胞免疫的小鼠產(chǎn)生的噬菌體展示文庫選擇單鏈Fv。用噬菌體展示載體pXP10產(chǎn)生文庫。
如下所述選擇表達(dá)對腫瘤細(xì)胞具有高親和性的scFv的噬菌體將HT-1080細(xì)胞用0.05％EDTA收獲，用多聚甲醛固定，在PBS中稀釋到1×107個(gè)細(xì)胞/ml，并固定到96孔UV交聯(lián)板(Corning Costar)的孔上。將UV交聯(lián)板的孔用溶于PBS中的5％脫脂奶粉(#70166，F(xiàn)1uka)(MPBS)封閉。將1012cfu(集落生成單位)噬菌體文庫/106個(gè)細(xì)胞用MPBS在25℃下預(yù)封閉1小時(shí)并隨后與細(xì)胞在室溫(RT)溫育1.5小時(shí)。UV交聯(lián)板的孔經(jīng)PBS+0.05％Tween-20洗滌6次，隨后用PBS洗滌6次。通過加入10mM甘氨酸pH2.2洗脫結(jié)合的噬菌體并用1M Tris/HCl pH 7.4中和。通常，在第一輪選擇中洗脫103到106cfu，從而與最初所有組成成分相比富集的所有組成成分的多樣性減少了。通過感染指數(shù)生長的大腸桿菌TG1來擴(kuò)增含有富集的所有組成成分的洗脫物。通過在補(bǔ)加100μg/ml氨芐青霉素和1％葡萄糖的LB瓊脂板上30℃過夜(o/n)生長選擇和增殖含有噬菌粒的大腸桿菌。該步驟后，富集的所有組成成分可以作為多克隆庫進(jìn)行擴(kuò)增并以反復(fù)方式用于其他輪的選擇直到實(shí)現(xiàn)會(huì)聚到所需要的性質(zhì)或者在空間上分開并在單個(gè)克隆水平上篩選。通過用輔助噬菌體VCS-M13(Stratagene，La Jolla，CA)超感染前幾輪選擇的指數(shù)生長的培養(yǎng)物并在補(bǔ)力100μg/ml氨芐青霉素(amp)和50μg/ml卡那霉素(kan)的2xTY中20℃下過夜生長培養(yǎng)物來產(chǎn)生用于下一輪選擇的噬菌體顆粒。將來自澄清細(xì)菌上清液的準(zhǔn)備進(jìn)行選擇的噬菌體用0.5M NaCl/4％PEG-6000沉淀并重懸在PBS中。如實(shí)施例4中描述的進(jìn)行一輪選擇，然后在單個(gè)克隆水平上篩選。
實(shí)施例4scFv的選擇和篩選(對固定細(xì)胞的篩選)為了篩選，將噬菌體展示載體中所含的編碼所選scFv的基因再克隆到表達(dá)載體pXP14中。該載體指導(dǎo)與Strep-標(biāo)記和E-標(biāo)記融合的scFv的表達(dá)并且不含有絲狀噬菌體基因-3。來自單個(gè)菌落的含有表達(dá)載體的大腸桿菌TG1在微量滴定板的各個(gè)孔中生長從而每個(gè)孔僅含有一個(gè)scFv克隆。細(xì)菌在30℃生長在96孔微量滴定板中(#9297，TPP)補(bǔ)加100μg/ml氨芐青霉素和0.1％葡萄糖的2xTY中直到OD600為0.7。用終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并在25℃持續(xù)過夜。通過加入雞蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)到終濃度50μg/ml并在25℃下保持1小時(shí)然后以3000×g離心15分鐘制備含有單鏈Fv的澄清裂解物。篩選ELISA前，通過加入等體積DMEM+10％FCS并保持1小時(shí)封閉澄清的裂解物。對于篩選ELISA，將HT-1080細(xì)胞用0.05％EDTA收獲，用多聚甲醛固定，在PBS中稀釋到1×107個(gè)細(xì)胞/ml，并固定到96孔UV交聯(lián)板(Corning Costar)的孔上。用MPBS封閉UV交聯(lián)板的孔并加入含有scFv的封閉的澄清裂解物并在25℃保持1.5小時(shí)。將板用PBS+0.1％Tween 20洗滌2次并用PBS洗滌1次，與HRP綴合的α-E-標(biāo)記(#27-9413-01，Pharmacia Biotech；用MPBS+0.1％Tween-20以1∶5000稀釋)溫育1小時(shí)，用PBS+0.1％Tween-20洗滌3次并用PBS洗滌3次，用POD(#1 484281，Roche)顯影并在370nm讀信號(hào)。
用上述ELISA篩選方法針對HT-1080細(xì)胞和對照人成纖維細(xì)胞Hs-27(ATCC CRL-1634)再試驗(yàn)陽性克隆并將其以甘油原液保存。在通常的篩選中，篩選2760(30×92)個(gè)克隆對HT-1080細(xì)胞的結(jié)合，其中5％陽性定義為扣除背景的信號(hào)＞0.1的克隆。對155個(gè)陽性克隆再試驗(yàn)與Hs-27對照細(xì)胞相比對HT-1080細(xì)胞的特異結(jié)合，其中28％陽性定義為對HT-1080的扣除背景的信號(hào)為Hs-27對照細(xì)胞的信號(hào)值的至少2倍的克隆。
實(shí)施例5測序和大規(guī)模表達(dá)通過Sequiserve GmbH，Vaterstetten，德國，使用引物pXP2Seq2(5′-CCCCACGCGGTTCCAGC-3′和pXP2 Seq1(5′TACCTATTGCCTACGGC-3′)進(jìn)行scFv1及其基因的測序。氨基酸序列和核苷酸序列在圖中顯示。
通過測序鑒定的獨(dú)特克隆從甘油原液在LB/Amp(100μg/ml)/1％葡萄糖瓊脂板上劃線并在30℃溫育過夜。將10mlLB/Amp/Glu(1％)培養(yǎng)基接種一個(gè)菌落并在30℃和200rpm搖動(dòng)下生長過夜。次日上午將過夜培養(yǎng)物置于冰上直到接種2L錐形瓶中的補(bǔ)加100μg/ml氨芐青霉素和0.1％葡萄糖的1L 2xTY培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在25℃搖動(dòng)生長直到OD600達(dá)到0.5-0.6，然后用0.1mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)。加入新鮮氨芐青霉素至50μg/ml并繼續(xù)在22℃搖動(dòng)溫育過夜。上午將培養(yǎng)物以5000×g在4℃離心15分鐘，拋棄上清液并將沉淀用移液器小心地在冰上重懸浮在含有完全蛋白酶抑制劑(#1697498，Roche)的10ml預(yù)冷PBS-0.5M Na緩沖液中。重懸浮完成后，將細(xì)菌懸浮液轉(zhuǎn)移到20ml oak-ridge離心管并在冰上加入雞蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)至終濃度50μg/ml并保持1小時(shí)。在4℃下以20000×g離心裂解的細(xì)菌15分鐘并將上清液(裂解物)轉(zhuǎn)移到15ml塑料管中。為了親和純化，將裂解物以1ml/分鐘加到通過平行蛋白純化系統(tǒng)用10個(gè)柱體積(CV)PBS-0.5M Na緩沖液平衡的1mlStrepTactin(#2-1505-010，IBA)柱上。用PBS洗滌10CV后，用5CV PBS/5mM脫硫生物素(#D-1411，Sigma)進(jìn)行洗脫并收集1ml級分。在UV280下測量級分，合并含有蛋白的級分并用Amicon超速離心過濾裝置(Ultra Centrifugal Filter Devices)10.000 MWCO(#UFC801024，Millipore)以4700×g濃縮。在用考馬斯藍(lán)染色的12％Bis-Tris SDS-PAGE凝膠上檢查濃縮的scFv的純度并將所述scFv與20％甘油以等分試樣在-80℃冷凍。
實(shí)施例6FACS分析腫瘤細(xì)胞的特異結(jié)合為了檢驗(yàn)所純化的抗HT-1080 scFv特異結(jié)合靶細(xì)胞的能力，我們用HT-1080細(xì)胞(ATCC CCL-121)和作為對照細(xì)胞系的Hs-27細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞/ml)進(jìn)行了熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析(見圖)。細(xì)胞與CellWash(BD(Becton，Dickinson and Company)#349524)中的10μg/ml純scFv在4℃溫育20分鐘，洗滌，用第二FITC-標(biāo)記的抗E-標(biāo)記mab(Amersham #27-9412-01)檢測結(jié)合的scFv。洗滌樣品并在Becton Dickinson FACSscan上分析。圖8顯示了與scFv1反應(yīng)的細(xì)胞的log熒光強(qiáng)度(FL1-H；x軸)對相對細(xì)胞數(shù)(計(jì)數(shù)；y軸)。細(xì)線代表對照細(xì)胞系(HS-27)，粗線代表HT-1080細(xì)胞。與對照細(xì)胞系相比，scFv1以最高達(dá)10倍的信號(hào)特異染色腫瘤細(xì)胞系。
實(shí)施例7用FITC標(biāo)記scFv通過下面的方法用異硫氰酸熒光素(FITC)(Molecular Probes，Eugene，美國#F1906)標(biāo)記scFv將溶于無水二甲亞砜中的10mg/mlFITC溶液的等分試樣以30∶1(FITC∶scFv1)的比率加入溶于PBS/0.5M NaHCO3，pH 9.5的100μg scFv1中。在攪拌下將樣品在室溫溫育2小時(shí)，用脫鹽柱(2Micro Spin G-25，Pharmacia 27-5325-01)分離游離FITC。通過質(zhì)譜法和UV/VIS光譜學(xué)測定標(biāo)記比率，從而在280nm下計(jì)算蛋白濃度和在494nm下計(jì)算FITC濃度。
實(shí)施例7.1用FITC標(biāo)記mAb1.5.1將新鮮制備的溶于無水二甲亞砜中的10mg/ml FITC(MolecularProbes，Eugene，美國#F1906)溶液以1∶5的比率加入純化的mAb1.5.1抗體(T-gel Absorbant，Pierce Biotechnology #20500)。向反應(yīng)物加入等體積0.5M NaHCO3，pH 9.5，并在室溫?fù)u動(dòng)下將反應(yīng)物溫育2小時(shí)。用脫鹽柱(PD-10，Amersham#17-0851-01)分離游離FITC。通過494nm下的VIS光譜學(xué)并假設(shè)從標(biāo)記完全回收蛋白來計(jì)算FITC的濃度來測定比率。
實(shí)施例8用于鑒定抑制性抗體片段的侵襲測定法將ChemoTx系統(tǒng)(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)用作96孔形式的一次性趨化性/細(xì)胞遷移室，其具有8μm濾器Track蝕刻的聚碳酸酯孔徑，5.7mm直徑/位點(diǎn)。
將在Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)中稀釋的13.3μl的0.3mg/ml Matrigel(Matrigel是從Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤，即富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的腫瘤提取的溶解的基膜制劑。其主要組分是層粘連蛋白，然后是膠原IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、觸覺蛋白和巢蛋白。其還含有TGF成纖維細(xì)胞生長因子、組織纖溶酶原激活物和EHS腫瘤中天然發(fā)生的其他生長因子)(Becton Dickenson，BD #356234)應(yīng)用于96孔板上B-H行和A行的膜濾器。將1.2μg/位點(diǎn)I型膠原S(Roche #10982929)在0.05M HCl(Sigma #945-50)中稀釋并在干燥器中20℃下溫育過夜以凝膠化。使HT-1080細(xì)胞在補(bǔ)加GlutamaxI(862mg/l(Gibco #31966-021)與10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中生長至70-80％匯合。將細(xì)胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)洗滌2次，然后在原位用Bisbenzimide H 33342(Sigma#B-2261)標(biāo)記，然后以1∶100在DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中在37℃，7.5％CO2下稀釋15分鐘。將細(xì)胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗滌兩次并用DMEM/Glutamax I/0.1％BSA在37℃，7.5％CO2中裝載15分鐘以進(jìn)行回收。用無Ca2+、Mg2+的PBS(Gibco，10010-015)洗滌兩次后，用0.5mM EDTA(Sigma#E8008)使細(xì)胞脫離，并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco#15630-056)收集，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗滌兩次，懸浮在Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes中并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes稀釋到6.7×106個(gè)細(xì)胞/ml。將6.7×106個(gè)細(xì)胞/ml與作為侵襲抑制的陰性對照的40μg/ml對照scFv和HT-1080特異的scFv以1∶1在冰上溫育1小時(shí)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀釋到6.7×105個(gè)細(xì)胞/ml后，將HT-1080細(xì)胞和HT-1080細(xì)胞/scFv稀釋液一式三份地以3.4×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度移液到趨化性室(B-H行)并在37℃，7.5％CO2中溫育6小時(shí)。將含有5％FCS的DMEM/Glutamax I用作下面室中的化學(xué)引誘劑。在趨化性室的I型膠原S涂覆的A行中從1×104到4×104個(gè)細(xì)胞/位點(diǎn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA用于下面室中(細(xì)胞不遷移)。從膜的頂部刮除未遷移的細(xì)胞后(除了A行上的標(biāo)準(zhǔn)曲線)，在FluostarGalaxy(bMG)微量滴定板讀出器上使用370/460nm的激發(fā)/發(fā)射波長測量通過膜遷移(對于標(biāo)準(zhǔn)曲線未遷移)的細(xì)胞的熒光。
實(shí)施例9用CALI進(jìn)行靶鑒定的侵襲測定該實(shí)施例一般與實(shí)施例8相同，只是使用FITC-標(biāo)記的scFv(見，實(shí)施例7關(guān)于標(biāo)記的內(nèi)容)并且在侵襲測定中整合CALI方法。
將ChemoTx系統(tǒng)((Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)用作具有96孔形式的一次性趨化性/細(xì)胞遷移室，其具有8μm濾器Track蝕刻的聚碳酸酯孔徑，5.7mm直徑/位點(diǎn)。
將13.3μl在Dulbecco PBS(Gibco#14040-091)中稀釋的0.3mg/ml Matrigel(見實(shí)施例8)應(yīng)用于96孔板B-H行和A行的膜濾器。將1.2μg/位點(diǎn)I型膠原S(Roche#10982929)在0.05M HCl(Sigma#945-50)中稀釋并在干燥器中20℃溫育過夜以凝膠化。使HT-1080細(xì)胞在補(bǔ)加GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021)與10％FCS(Gibco#10270106))的DMEM中生長至70-80％匯合。將細(xì)胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)洗滌2次，然后在原位用Bisbenzimide H 33342(Sigma#B-2261)標(biāo)記，然后以1∶100在DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中37℃下，7.5％CO2中稀釋15分鐘。將細(xì)胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗滌2次，并用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA在37℃，7.5％CO2中裝載15分鐘以進(jìn)行回收。用無Ca2+，Mg2+的PBS(Gibco，10010-015)洗滌兩次后，用0.5mMEDTA(Sigma#E8008)使細(xì)胞脫離，并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco#15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗滌兩次，懸浮在DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes中并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mMHepes稀釋到6.7×106個(gè)細(xì)胞/ml。將6.7×106個(gè)細(xì)胞/ml與CALI后作為侵襲抑制對照的40μg/ml FITC-標(biāo)記的抗β1整聯(lián)蛋白單克隆抗體(JB1，Chemicon#MAB1963)和HT-1080特異FITC-標(biāo)記的scFv以1∶1在冰上溫育1小時(shí)。將1.3×105個(gè)HT-1080細(xì)胞/孔或HT-1080細(xì)胞/scFv或Ab稀釋液一式三份地移液到兩個(gè)96孔板、黑色、超薄透明平底特定光學(xué)器件(Costar#3615)。一個(gè)板在黑暗中在冰上保持，另一個(gè)板在冰塊上以488nm的連續(xù)波激光照射(0.5W，30秒)。在用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀釋到6.7×105個(gè)細(xì)胞/ml后，將HT-1080細(xì)胞和HT-1080細(xì)胞/scFv稀釋液一式三份地以3.4×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度移液到趨化性室(B-H行)(未照射的一式三份在照射的一式三份旁邊)，并在37℃，7.5％CO2中溫育6小時(shí)。將含有5％FCS的DMEM/Glutamax I用作下面室中的化學(xué)引誘劑。在趨化性室的I型膠原S涂覆的A行中從1×104到4×104個(gè)細(xì)胞/位點(diǎn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA用于下面室中(細(xì)胞不遷移)。從膜的頂部刮除未遷移的細(xì)胞后(除了A行上的標(biāo)準(zhǔn)曲線)，在FluostarGalaxy(bMG)微量滴定板讀出器上使用370/460nm的激發(fā)/發(fā)射波長測量通過膜遷移(對于標(biāo)準(zhǔn)曲線未遷移)的細(xì)胞的熒光。在一般實(shí)驗(yàn)中，45000值與100％遷移細(xì)胞相對應(yīng)。
通過使用上述Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)比較侵襲腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)(Matrigel)的能力評估HT-1080細(xì)胞的侵襲表型。scFv1顯示CALI后對HT-1080細(xì)胞侵襲的抑制效果為46％。用CALI進(jìn)行的侵襲測定的結(jié)果在圖3中顯示。圖3表明CALI轉(zhuǎn)化抑制性抗體片段中的scFv1。
實(shí)施例9.1用CALI以抗體(例如mAb1.5.1)進(jìn)行侵襲測定法以鑒定靶將ChemoTx系統(tǒng)(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)用作具有96孔形式的一次性趨化性/細(xì)胞遷移室，其具有8μm濾器Track蝕刻的聚碳酸酯孔徑，5.7mm直徑/位點(diǎn)。
將13.3μl在冷Dulbecco PBS(Gibco#14040-091)中稀釋的0.3mg/ml Matrigel(見實(shí)施例8)應(yīng)用于96孔板上B-H行和A行的膜濾器。將0.3μg/位點(diǎn)小鼠IV型膠原(Becton-Dickenson#354233)在0.05M HCl(Sigma#945-50)中稀釋并在干燥器中20℃溫育過夜以凝膠化，使HT-1080細(xì)胞在補(bǔ)加MEM非必需氨基酸(IX，Gibco#11140050)和青霉素/鏈霉素(1X，Gibco#15140122)與10％FBS(Hyclone#SH30070.03)的DMEM中生長至70-80％匯合。將細(xì)胞用DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-鏈霉素(BSA，Sigma#A-7030)洗滌1次，然后在原位用溶于DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-鏈霉素中的3μM Cell TrackerOrange(Molecular Probes#C-2927)在37℃下，7.5％CO2中標(biāo)記15分鐘。將細(xì)胞用DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-鏈霉素于37℃、7.5％CO2洗滌一次15分鐘，以進(jìn)行回收。用無Ca2+、Mg2+的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)(Gibco#14170112)洗滌1次后，用Versene(Gibco#15040066)使細(xì)胞脫離，并用HBSS/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-鏈霉素(HBSS，Gibco+14025092)收集，用HBSS/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-鏈霉素洗滌兩次，懸浮在HBSS/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-鏈霉素中并用HBSS/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-鏈霉素稀釋到8×106個(gè)細(xì)胞/ml。將8×106個(gè)細(xì)胞/ml與CALI后作為侵襲抑制對照的40μg/mlFITC-標(biāo)記的抗β1整聯(lián)蛋白單克隆抗體(JB1，Chemicon#MAB1963)和mAbs以1∶1在冰上溫育1小時(shí)。將3×105個(gè)HT-1080細(xì)胞/孔或HT-1080細(xì)胞/mAbs一式三份地移液到兩個(gè)透明96孔板(Costar#3370)。一個(gè)板在黑暗中在冰上保持，而另一個(gè)板在冰塊上以300W藍(lán)色濾光(blue filtered-light)(Roscolux#69，BrillantBlue)照射1小時(shí)。在用DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-鏈霉素稀釋到8×105個(gè)細(xì)胞/ml后，將HT-1080細(xì)胞和HT-1080細(xì)胞/mAbs稀釋液一式三份地以4×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度移液到趨化性室(B-H行)(未照射的一式三份在照射的一式三份旁邊)，并在37℃，7.5％CO2中溫育6小時(shí)，將含5％FCS的DMEM在下面的室中做為化學(xué)引誘劑。對趨化性室的小鼠IV型膠原S涂覆的A行進(jìn)行從1×104到4×104個(gè)細(xì)胞/位點(diǎn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-鏈霉素用于下面室中(細(xì)胞不遷移)。從膜的頂部刮除未遷移的細(xì)胞后(除了A行上的標(biāo)準(zhǔn)曲線)，在Tecan Spectrafluor Plus熒光板讀出器(激發(fā)544，發(fā)射590nm)上測量通過膜遷移(對于標(biāo)準(zhǔn)曲線未遷移)的細(xì)胞的熒光。識(shí)別β1整聯(lián)蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)和mAb1.5.5的陽性對照在暴露于光后都顯示出侵襲力的顯著降低(p＜0.01，未配對t檢驗(yàn))(數(shù)據(jù)在圖2中顯示)。陰性對照(無抗體)不顯示出降低。每個(gè)條形對陰性對照標(biāo)準(zhǔn)化并且代表一式三份的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+s.e.m。
實(shí)施例10細(xì)胞基質(zhì)粘著測定用溶于Dulbecco PBS(Gibco#14040-091)中的I型膠原S以1μg/孔(Roehe#10982929)涂覆96孔板(TPP#9296)(細(xì)胞培養(yǎng)物處理的)的B-H行，用2％BSA(Sigma#A-7030)/Dulbeccos PBS在4℃涂覆A行孔10-12過夜。將板用Dulbeccos PBS洗滌，用2％BSA/Dulbeccos PBS將B-H行和A行孔10-12在37℃封閉1小時(shí)，并用Dulbeccos PBS再次洗滌。使HT-1080細(xì)胞在補(bǔ)加GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021)與10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中生長至70-80％匯合。將細(xì)胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)洗滌兩次，然后在原位用Bisbenzimide H 33342(sigma#B-2261)進(jìn)行標(biāo)記，并在DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中以1∶100在37℃、7.5％CO2下稀釋15分鐘。將細(xì)胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗滌兩次并用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA在37℃、7.5％CO2下裝載15分鐘以進(jìn)行回收。用無Ca3+，Mg2+的PBS(Gibco，10010-015)洗滌2次后，用0.5mM EDTA(Sigma#E8008)使細(xì)胞脫離，并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco#15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗滌兩次，懸浮在Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes中并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes稀釋到6.7×106個(gè)細(xì)胞/ml。將6.7×106個(gè)細(xì)胞/ml與CALI后作為粘著抑制對照的40μg/ml FITC-標(biāo)記的抗β1整聯(lián)蛋白單克隆抗體(JB1，Chemicon#MAB1963)和HT-1080特異的FITC標(biāo)記的scFv以1∶1在冰上溫育1小時(shí)。將1.3×105個(gè)HT-1080細(xì)胞/孔或HT-1080細(xì)胞/scFV或Ab稀釋液一式三份地移液到兩個(gè)96孔板、黑色、超薄透明平底特定光學(xué)器件(Costar#3615)。一個(gè)板在黑暗中保持在冰上，而另一板在冰塊上用488nm的連續(xù)波激光照射(0.5W，30秒)。在用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀釋到6.7×105個(gè)細(xì)胞/ml后，將HT-1080細(xì)胞和HT-1080細(xì)胞/scFv稀釋液一式三份地移液到涂覆和封閉的板上(未照射的一式三份在照射的一式三份旁邊)。在A行10-12孔中，將6.7×105個(gè)細(xì)胞/ml與DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA作為背景對照移液。將板在37℃，7.5％CO2下溫育1小時(shí)并用Dulbeccos PBS洗滌兩次，從而洗除未粘著的細(xì)胞。在A行1-9孔中，進(jìn)行從1×104到4×104個(gè)細(xì)胞/孔作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在所有其他孔中，移取50μlDulbeccos PBS。用370/460nm的激發(fā)/放射波長在Fluostar Galaxy(bMG)微量培養(yǎng)板讀出器上測量粘著1型膠原S(對于標(biāo)準(zhǔn)曲線為未粘著的)的細(xì)胞的熒光。scFv1將HT-1080細(xì)胞與1型膠原S的粘著抑制50％(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例11免疫沉淀對于mAbs的免疫沉淀，將HT-1080細(xì)胞的匯合單層用含有蛋白酶抑制劑混合物(Bohrenger Mannheim)的1mM Tris-Cl，pH 8.0在4℃裂解15分鐘。用dounce勻漿器進(jìn)一步裂解細(xì)胞5分鐘。將裂解物用抗小鼠IgG-瓊脂糖(Sigma)在4℃預(yù)吸附1小時(shí)。將來自靶雜交瘤克隆的腹水液(10μL/1mg細(xì)胞提取物)在4℃溫育過夜。用抗-小鼠IgG瓊脂糖珠在4℃分離抗體-蛋白復(fù)合體1小時(shí)。通過SDS-PAGE和考馬斯染色分析免疫沉淀的蛋白，通過與靶腹水的免疫印跡進(jìn)一步分析mAb免疫沉淀物。
對于scFv免疫沉淀，將HT-1080特異的scFv偶聯(lián)到StreptactinSepharose(50μg/50μl樹脂)并將洗過的scFv-珠加入澄清的裂解物中(1mg總蛋白)，并在4℃保持2-3小時(shí)。用溶于PBS 0.1％Tween20中的50μl 10mM D-脫硫生物素洗脫scFv-靶復(fù)合物。通過SDS-PAGE和銀染分析免疫沉淀的蛋白。
實(shí)施例12通過質(zhì)譜法鑒定蛋白對于mAb靶鑒定，下一步將來自通過SDS-PAGE從免疫沉淀物分離的考馬斯染色條帶進(jìn)行凝膠內(nèi)消化。胰蛋白酶消化的肽片段在Surveyor HPLC和安裝75μM納噴霧C18柱(New Objectives)的LCQDeca離子阱質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan)上運(yùn)行。將所得PMF(肽質(zhì)量片段)用于檢索NCBI和Swiss Prot數(shù)據(jù)庫中智人的所有條目。
對于scFv靶鑒定，切下染色的條帶并用胰蛋白酶進(jìn)行凝膠內(nèi)消化。從凝膠片提取肽片段，在ZipTipμC18上脫鹽并將洗脫的肽在涂有特氟隆的MALDI靶(Applied Biosystems)上點(diǎn)樣。樣品在STR-DEVoyager MALDI質(zhì)譜儀(Applied Biosystems)上分析并將所得肽質(zhì)量用于通過PMF(肽質(zhì)量指紋圖譜)進(jìn)行蛋白鑒定，檢索NCBI和SwissProt數(shù)據(jù)庫中智人的所有條目。
實(shí)施例13免疫細(xì)胞化學(xué)對于表面蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)，將匯合單層的HT-1080細(xì)胞(96孔透明薄底板的每孔40,000個(gè))與雜交瘤上清液在37℃/7％CO2下溫育1小時(shí)。在溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的0.1％牛血清清蛋白(BSA)中洗滌3次，每次5分鐘后，將細(xì)胞在2％多聚甲醛中固定2分鐘。進(jìn)行另一輪0.1％BSA/PBS洗滌并在室溫加入FITC-兔-抗-小鼠第二抗體并保持1小時(shí)。重復(fù)相同洗滌并在室溫加入第三FITC-山羊-抗-兔抗體并保持1小時(shí)。最后一輪洗滌后，將細(xì)胞在4℃保存在PBS中直到成像。通過顯微鏡術(shù)在Zeiss Axiovert 10上使用Neofluar 40X/0.75數(shù)字孔徑透鏡顯現(xiàn)表面染色。對于FITC用設(shè)置在480的激發(fā)濾色片和535的發(fā)射濾色片收集圖像。結(jié)果在圖6、6.1和6.2中顯示結(jié)果。
實(shí)施例14細(xì)胞表面的生物素化如Hanwel1等人(J Biol Chem 2779772)中描述的實(shí)施細(xì)胞表面蛋白的生物素化。在SDS-PAGE凝膠上分離表面生物素化庫和未生物素化細(xì)胞內(nèi)庫，并轉(zhuǎn)移以用抗-Hsp90(Stressgen#SPA-830)或者α-輔肌動(dòng)蛋白-4(Martin A.Pollak，Children Hospital，Boston，MA)進(jìn)行免疫印跡。結(jié)果在圖7中顯示。Hsp90顯示出表面(S)和細(xì)胞內(nèi)(IC)都定位，但是僅在細(xì)胞內(nèi)庫中發(fā)現(xiàn)α輔肌動(dòng)蛋白。mAb1.5.1也顯示出表面和細(xì)胞內(nèi)定位(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例15新生霉素或萘啶酮酸對HT-1080細(xì)胞侵襲的濃度依賴性將8×106個(gè)HT-1080個(gè)細(xì)胞/mL以所顯示的濃度的新生霉素或者萘啶酮酸預(yù)處理1小時(shí)并如實(shí)施例9.1中描述的進(jìn)行侵襲測定。新生霉素顯示出侵襲的劑量依賴的抑制(＞0.5mM時(shí)p＜0.01)。萘啶酮酸對侵襲沒有影響。在該測定中新生霉素處理的細(xì)胞的生存力不受影響(數(shù)據(jù)未顯示)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)對無藥物對照標(biāo)準(zhǔn)化并代表一式三份地兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+s.e.m。結(jié)果在圖10中顯示。
實(shí)施例16MMP分泌的抑制以給定濃度的新生霉素或萘啶酮酸處理40,000個(gè)HT-1080細(xì)胞6小時(shí)。用含有10mg/mL明膠的SDS-PAGE凝膠分離來自所處理細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。在室溫下用2.5％Triton-X-100處理30分鐘從凝膠分離SDS。允許蛋白在37℃消化溶于消化緩沖液(0.1M Tris-Cl2，pH8.0，5mM CaCl2，0.04％ NaN3)中的明膠48小時(shí)。將凝膠進(jìn)行考馬斯染色并干燥以用于光密度分析法。平行的凝膠用銀染以顯示相等的蛋白上樣(數(shù)據(jù)未顯示)。在受試新生霉素的最高濃度下MMP活性減小＞75％，而用萘啶酮酸沒有看到酶活性的減少。結(jié)果在圖11中顯示。
實(shí)施例17新生霉素與瓊脂糖的共價(jià)偶聯(lián)和MMP活性的抑制該實(shí)施例闡明HT-1080細(xì)胞表面上Hsp90功能的抑制。已經(jīng)顯示用新生霉素——一種香豆素抗生素處理HT-1080纖維肉瘤細(xì)胞減小了細(xì)胞侵襲基膜屏障的能力并且顯著減小了基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性/分泌。因?yàn)橐远痰臅r(shí)間表(6小時(shí))進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，所以不會(huì)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)Hsp90靶的顯著耗竭。
新生霉素與大分子載體像瓊脂糖的共價(jià)偶聯(lián)抑制新生霉素的細(xì)胞攝入，并從而導(dǎo)致Hsp90的任何細(xì)胞內(nèi)抑制。Marcu等人描述了將新生霉素綴合到瓊脂糖的方法(Marcu等人(2000)J Natl CancerInst 92，242-8；Staudenbauer和Orr(1981)Nucleic Acids Res.9，3589-603)。在該方法中，首先將環(huán)氧活化的瓊脂糖6B(SigmaChemical Co)用蒸餾水洗滌和膨脹。膨脹的珠子用偶聯(lián)緩沖液(0.3M碳酸鈉，pH9.5)進(jìn)一步洗滌。將新生霉素通過與偶聯(lián)緩沖液中的膨脹的珠子在37℃溫育20小時(shí)而有效地與珠子綴合。用偶聯(lián)緩沖液洗除未綴合的新生霉素，且剩余的未結(jié)合的環(huán)氧活化基團(tuán)用1M乙醇胺在30℃封閉12小時(shí)。用溶于偶聯(lián)緩沖液中的0.5M NaCl、蒸餾水、溶于0.1M乙酸鈉(pH 4.0)中的0.5M NaCl充分洗滌珠子以除去任何多余的新生霉素和乙醇胺。然后將新生霉素-瓊脂糖珠在含有1mMEDTA、10％乙二醇和200mM KCl的25mM HEPES(pH 8.0)中在4℃黑暗中平衡。
進(jìn)行明膠酶實(shí)驗(yàn)前，通過體外結(jié)合測定法證明綴合Hsp90的新生霉素-瓊脂糖的有效結(jié)合。將HT-1080細(xì)胞在含有蛋白酶抑制劑(片劑，Boehringer Mannheim)的TNESV(1％Nonidet P-40，2mM EDTA，和100mM NaCl，和1mM原釩酸鈉)中裂解。使300μg該裂解物與100μL新生霉素-瓊脂糖綴合物在4℃溫育1小時(shí)。用TNESV充分洗滌后，將結(jié)合珠子的蛋白用2×SDS-PAGE上樣緩沖液(125mMTris-HCl pH6.8，10％2-巰基乙醇，10SDS，10％甘油，和痕量溴酚藍(lán))洗脫并煮沸5分鐘。蛋白在10％SDS-PAGE凝膠上電泳。這些凝膠或者進(jìn)行銀染或者轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上用抗-Hsp90抗體(AC88，Stressgen，Inc.)進(jìn)行免疫印跡。
對于明膠酶測定，用Versene將貼壁的HT-1080細(xì)胞首先輕輕從組織培養(yǎng)皿取出。將無血清DMEM中的5×104個(gè)細(xì)胞與0.1μL、1μL或者10μL新生霉素-瓊脂糖綴合物合并并在輕微搖動(dòng)下在硅氧烷化eppendorf管中室溫下溫育1小時(shí)。平行進(jìn)行含有未綴合新生霉素的瓊脂糖珠子的對照樣品。所述溫育后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)物處理的96孔板，并在37℃/5％CO2下再溫育6小時(shí)。來自這些樣品的條件培養(yǎng)基然后與2×SDS-PAGE上樣緩沖液(無2-巰基乙醇)合并。這些樣品在含有10mg/ml明膠的10％SDS-PAGE凝膠上電泳。通過與2.5％Triton-X-100在室溫溫育30分鐘從凝膠除去SDS。允許蛋白在消化緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH8.0，5mM CaCl2，0.04％NaN3)中38℃下消化明膠48小時(shí)。將凝膠進(jìn)行考馬斯染色并干燥以用于光密度分析法。平行凝膠進(jìn)行銀染以顯示蛋白的相等上樣。MMP活性隨著新生霉素-瓊脂糖的量的增加而降低。
實(shí)施例18通過格爾德霉素和固定化格爾德霉素(GA-珠)抑制MMP活性可以顯示基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2與來自HT-1080條件培養(yǎng)基的Hsp90α共免疫沉淀(圖17)。我們?nèi)缓髮⒁阎腍sp90抑制劑格爾德霉素應(yīng)用于HT-1080細(xì)胞以試驗(yàn)Hsp90的抑制是否減小了MMP2活性。將HT-1080細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基中的20μM格爾德霉素(GA)處理并通過酶譜法測定分泌的MMP2。GA處理后MMP2(72kDa明膠酶)活性減少～35％(p＜0.01)。通過銀染顯現(xiàn)條件培養(yǎng)基中的總蛋白含量以確保相等上樣(見圖18)。
格爾德霉素是Hsp90的眾所周知的細(xì)胞透膜抑制劑。用10μM格爾德霉素(GA)處理1小時(shí)導(dǎo)致HT-1080細(xì)胞侵襲的顯著的～35％減少(p＜0.05，t檢驗(yàn))，當(dāng)加入活化的MMP2(100ng)時(shí)消除所述減少(數(shù)據(jù)未顯示)。由于其細(xì)胞通透性，格爾德霉素不能隔離Hsp90的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外定位。為了顯示Hsp90在腫瘤細(xì)胞侵襲中的細(xì)胞外作用，將格爾德霉素固定在瓊脂糖珠(GA-珠)上以防止質(zhì)膜的交換(實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見Whitesell等人，Proc Natl Acad Sci USA 91，8324-8(1994))。用GA-珠處理HT-1080細(xì)胞后，在條件培養(yǎng)基中見到活性MMP2的80％減少，但是原-MMP2僅減少15％(圖19)。使用體外侵襲測定法(見，實(shí)施例8)，用GA-珠處理的HT-1080細(xì)胞顯示出侵襲力的顯著的45％減少(p＜0.01，t檢驗(yàn))。未處理珠也以有限程度(＜15％)抑制侵襲，可能是由于珠子對孔的物理封閉(見圖20)。所有這些結(jié)果一起表明如下機(jī)制其中細(xì)胞外Hsp90α與原-MMP2的結(jié)合幫助該蛋白酶的活化，導(dǎo)致侵襲表型。Hsp90α的抑制導(dǎo)致活性MMP-2的減小和腫瘤細(xì)胞的侵襲力減小。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.含有人細(xì)胞外Hsp90的抑制劑的藥物組合物，其中所述抑制劑基本上不能進(jìn)入細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中抑制劑選自多肽、抗體、抗體片段、香豆素和綴合到載體的基于嘌呤的Hsp90抑制劑和它們的類似物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中Hsp90抑制劑包含選自格爾德霉素和其類似物如17AAG、根赤殼素和香豆素抗生素如新生霉素和基于嘌呤的Hsp90抑制劑如PU3的一種或多種化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中抑制劑是抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其中抑制劑是單克隆抗體。
6.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中抑制劑是抗體片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中抑制劑經(jīng)可檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抑制劑用于制備預(yù)防和/或治療增殖性疾病、癌癥或者轉(zhuǎn)移的藥物組合物的用途。
9.權(quán)利要求8的用途，其中抑制劑選自多肽、抗體、抗體片段、香豆素和基于嘌呤的Hsp90抑制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中抑制劑是抗體，具體地是單克隆抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中抑制劑是抗體片段。
12.編碼人細(xì)胞外Hsp90的抑制劑的核酸分子，其中抑制劑是抗體或者抗體片段。
13.試劑盒，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抑制劑和適宜的試驗(yàn)容器。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其中抑制劑是受到標(biāo)記的。
15.轉(zhuǎn)體內(nèi)篩選或者試驗(yàn)細(xì)胞的侵襲和/或轉(zhuǎn)移行為的方法，其包括步驟a)在基本阻止所述Hsp90抑制劑的細(xì)胞攝入的條件下將細(xì)胞與一種或多種人Hsp90抑制劑接觸；b)分析根據(jù)步驟a)處理的細(xì)胞的遷移；
c)比較根據(jù)步驟a)的細(xì)胞與未處理細(xì)胞的遷移；和任選地d)確定與未處理細(xì)胞相比的遷移百分?jǐn)?shù)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中步驟a)還包括在適于細(xì)胞生長的條件下將所述細(xì)胞與凝膠樣基質(zhì)接觸的步驟，并且步驟b)包括分析細(xì)胞通過凝膠樣基質(zhì)的遷移的步驟。
17.使用根據(jù)權(quán)利要求7的標(biāo)記分子診斷細(xì)胞的增殖疾病、癌癥或者轉(zhuǎn)移潛力的方法。
18.鑒定特異結(jié)合人細(xì)胞外Hsp90的配體的方法，其中所述配體能夠抑制癌細(xì)胞的侵襲力、粘著和/或轉(zhuǎn)移潛力，所述方法包括步驟a)將可擴(kuò)增的配體展示單位(ALDUs)的文庫與癌細(xì)胞接觸；b)將所述癌細(xì)胞和結(jié)合所述癌細(xì)胞的ALDUs與不結(jié)合所述癌細(xì)胞的ALDUs分離；c)擴(kuò)增結(jié)合所述癌細(xì)胞的ALDUs；d)鑒定影響癌細(xì)胞的侵襲力、粘著和/或轉(zhuǎn)移潛力的步驟c)后的ALDU或者衍生自ALDU的配體；e)鑒定能夠結(jié)合Hsp90的步驟d)后的ALDU或者衍生自ALDU的配體；f)及任選地確定所述ALDU代表的配體的特性。
19.權(quán)利要求18的方法，其具有代替步驟e)和f)的進(jìn)一步的步驟e)將步驟c)的ALDUs與固定化Hsp90接觸；f)將所述固定化Hsp90和與其結(jié)合的ALDUs與不結(jié)合所述固定化Hsp90的ALDUs分離；g)擴(kuò)增結(jié)合所述固定化Hsp90的ALDUs；h)及任選確定所述ALDU代表的配體的特性。
20.通過權(quán)利要求20或21的方法可以得到的細(xì)胞外Hsp90的抑制劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的抑制劑用于調(diào)節(jié)和尤其是降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的活性和/或減少其分泌的用途。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞外Hsp90的抑制劑，前提條件是所述抑制劑不是Mycograb單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抑制劑，其中所述抑制劑受到修飾從而所述修飾基本上阻止了其細(xì)胞攝入。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的抑制劑，其中所述抑制劑的修飾包括將該抑制劑綴合到載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的抑制劑，其中所述抑制劑選自多肽、抗體、抗體片段、香豆素和基于嘌呤的Hsp90抑制劑和它們的類似物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的抑制劑，其中Hsp90抑制劑是選自格爾德霉素和其類似物如17AAG、根赤殼素和香豆素抗生素如新生霉素和基于嘌呤的Hsp90抑制劑如PU3的一種或多種化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的抑制劑，其中所述抑制劑是抗體，具體地是單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的抑制劑，其中所述抑制劑是抗體片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的抑制劑，其中所述抑制劑經(jīng)可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。
9.藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-8的抑制劑，其中所述抑制劑基本上不能進(jìn)入細(xì)胞，前提條件是該抑制劑不是Mycograb單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8的抑制劑用于制備預(yù)防和/或治療增殖性疾病、癌癥或者轉(zhuǎn)移的藥物組合物的用途。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述抑制劑選自多肽、抗體、抗體片段、香豆素和基于嘌呤的Hsp90抑制劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11用途，其中所述抑制劑是抗體，具體地是單克隆抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12用途，其中所述抑制劑是抗體片段。
14.編碼細(xì)胞外Hsp90的抑制劑的核酸分子，其中所述抑制劑是抗體或抗體片段。
15.試劑盒，其含有權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的抑制劑和適宜的試驗(yàn)容器。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述抑制劑是受到標(biāo)記的。
17.轉(zhuǎn)體內(nèi)篩選或者試驗(yàn)細(xì)胞侵襲和/或轉(zhuǎn)移行為的方法，其包括步驟a)在基本阻止所述Hsp90抑制劑的細(xì)胞攝入的條件下將細(xì)胞與一種或多種Hsp90抑制劑接觸；b)分析根據(jù)步驟a)處理的細(xì)胞的遷移；c)比較根據(jù)步驟a)的細(xì)胞與未處理細(xì)胞的遷移；和任選地d)確定與未處理細(xì)胞相比的遷移百分?jǐn)?shù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中步驟a)還包括在適于細(xì)胞生長的條件下將所述細(xì)胞與凝膠樣基質(zhì)接觸的步驟，并且步驟b)包括分析細(xì)胞通過凝膠樣基質(zhì)的遷移的步驟。
19.使用根據(jù)權(quán)利要求8的標(biāo)記分子診斷細(xì)胞的增殖疾病、癌癥或者轉(zhuǎn)移潛力的方法。
20.鑒定特異結(jié)合Hsp90的配體的方法，其中所述配體能夠抑制癌細(xì)胞的侵襲力、粘著和/或轉(zhuǎn)移潛力，所述方法包括步驟a)將可擴(kuò)增的配體展示單位(ALDUs)的文庫與癌細(xì)胞接觸；b)將所述癌細(xì)胞和結(jié)合所述癌細(xì)胞的ALDUs與不結(jié)合所述癌細(xì)胞的ALDUs分離；c)擴(kuò)增結(jié)合所述癌細(xì)胞的ALDUs；d)鑒定影響癌細(xì)胞的侵襲力、粘著和/或轉(zhuǎn)移潛力的步驟c)后的ALDU或者衍生自ALDU的配體；e)鑒定能夠結(jié)合Hsp90的步驟d)后的ALDU或者衍生自ALDU的配體；f)及任選地確定所述ALDU代表的配體的特性。
21.權(quán)利要求20的方法，其具有代替步驟e)和f)的進(jìn)一步的步驟e)將步驟c)的ALDUs與固定化Hsp90接觸；f)將所述固定化Hsp90和與其結(jié)合的ALDUs與不結(jié)合所述固定化Hsp90的ALDUs分離；g)擴(kuò)增結(jié)合所述固定化Hsp90的ALDUs；h)及任選確定所述ALDU代表的配體的特性。
22.通過權(quán)利要求20或21的方法可以得到的細(xì)胞外Hsp90的抑制劑。
23.權(quán)利要求1到8的抑制劑用于調(diào)節(jié)和尤其是降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的活性和/或減少其分泌的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了細(xì)胞外Hsp90的抑制劑。細(xì)胞外Hsp90的抑制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲力降低。此外，本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞外Hsp90功能的分子用于生產(chǎn)治療或者預(yù)防癌細(xì)胞的侵襲和/或轉(zhuǎn)移潛力的藥物的用途。
文檔編號(hào)C07K16/30GK1860132SQ200480012810
公開日2006年11月8日 申請日期2004年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者D·G·杰伊, B·K·尤斯塔斯, T·薩庫賴, G·貝斯特 申請人:塔夫茲大學(xué)