鴨坦布蘇病毒e蛋白和ltb的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗，即篩選獲得鴨坦布蘇病毒E蛋白具有優(yōu)勢(shì)抗原表位的DomainIII結(jié)構(gòu)域，并通過(guò)Lingker與腸毒素LTB組成新型融合蛋白LTB-Es，并以該融合蛋白作為抗原來(lái)制備鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明中鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO:1；其中一種核苷酸序列為SEQIDNO:2。本發(fā)明利用原核表達(dá)載體構(gòu)建了能表達(dá)鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。將重組表達(dá)的蛋白純化后制備成基因工程亞單位疫苗，可使免疫后鴨群獲得免疫保護(hù)。
【專利說(shuō)明】鴨坦布蘇病毒E蛋白和LTB的融合蛋白及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鴨坦布蘇病毒E蛋白和LTB的融合蛋白 及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是世界養(yǎng)鴨大國(guó)，鴨肉年生產(chǎn)總量約占世界總量的70%，自2000年的186. 6萬(wàn) 噸增長(zhǎng)到2008年的258. 1萬(wàn)噸，年均增長(zhǎng)率約3. 8%，大大高于世界平均水平。鴨坦布蘇病 毒是2010年在中國(guó)率先發(fā)現(xiàn)的一種新發(fā)病毒，主要引起鴨群采食量和產(chǎn)蛋大幅下降、卵巢 出血、神經(jīng)癥狀等，因此初期該病又稱為鴨出血性卵巢炎、產(chǎn)蛋下降綜合征等。通過(guò)病毒分 離、基因解析，目前鴨坦布蘇病毒定位于黃病毒科、黃病毒屬、蚊媒病毒的恩塔亞病毒群。據(jù) 不完全統(tǒng)計(jì)，在蛋鴨和肉鴨主產(chǎn)區(qū)，約有1. 2億只蛋鴨和1500多萬(wàn)只肉鴨發(fā)生該病，累計(jì)經(jīng) 濟(jì)損失超過(guò)50億元。同時(shí)作為新發(fā)病毒，目前尚無(wú)商業(yè)化的鴨坦布蘇病毒疫苗面世。
[0003] 鴨坦布蘇病毒為單股正鏈RNA病毒，基因組10990bp，95-10278bp為0RF區(qū)域，編 碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、 NS3、NS4a、NS4b、NS5)，其中包膜蛋白E具有較高免疫原性，含有多個(gè)重要的細(xì)胞受體結(jié)合 位點(diǎn)，并能引起強(qiáng)烈和持久的免疫反應(yīng)，是黃病毒屬病毒的主要基因工程疫苗開(kāi)發(fā)候選蛋 白。黃病毒包膜E蛋白按其空間結(jié)構(gòu)可分為DomainI、DomainII和DomainIII三個(gè)結(jié)構(gòu) 域，其中DomainIII結(jié)構(gòu)域可被病毒的中和抗體識(shí)別，且基因大小適中，更適于用于基因工 程亞單位疫苗開(kāi)發(fā)。Chu等構(gòu)建了表達(dá)西尼羅病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域III的重組質(zhì)粒，并用寡脫 氧核苷酸（CpG-DNA)作為佐劑，腹腔注射途徑免疫BALB/C小鼠，結(jié)果獲得高滴度的西尼羅 病毒中和抗體，表明輔以佐劑西尼羅病毒E蛋白DomainIII可使小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，具有 疫苗開(kāi)發(fā)的潛力。
[0004] 產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（ETEC)產(chǎn)生不耐熱腸毒素（heat-labileenterotoxin,LT) 具有良好的免疫原性和免疫佐劑作用，其又分為A亞（LTA)和B亞基（LTB)。LTB是LT的免 疫原性部位，是受體結(jié)合部位，具有良好的免疫佐劑作用，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道其用于疫苗的 免疫佐劑。李潤(rùn)成等（2009年）將腸毒素LTB蛋白基因與口蹄疫VP1蛋白基因進(jìn)行融合表 達(dá)，發(fā)現(xiàn)LTB可有效促進(jìn)口蹄疫VP1蛋白的免疫效果，增效明顯。余興龍等將LTB與豬圓環(huán) 病毒0RF2基因融合表達(dá)制備的融合蛋白制成基因工程亞單位，免疫后也取得理想的免疫 效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒E蛋白和LTB的融合蛋白，即通過(guò)篩選獲 得優(yōu)勢(shì)抗原表位的鴨坦布蘇病毒E蛋白DomainIII部分，并通過(guò)Lingker(GGGSGGGS)與 腸毒素LTB組成新型融合蛋白LTB-Es，并以該融合蛋白作為抗原來(lái)制備鴨坦布蘇病毒基因 工程亞單位疫苗。
[0006] 本發(fā)明首先提供一種鴨坦布蘇病毒E蛋白DomainIII和LTB的融合蛋白LTB-Es， 其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO: 1 ; 上述蛋白的一種核苷酸序列為SEQIDNO:2 ; 本發(fā)明還提供一種鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗，其中的抗原為上述的新型融合 蛋白LTB-Es，其濃度為0? 1-0. 5mg/ml之間； 本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗，其制備步驟如下： 1) 將新型融合蛋白LTB-Es基因插入表達(dá)載體中，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒； 2) 將構(gòu)建的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建了能表達(dá)新型融合蛋白LTB-Es的重組基 因工程菌；用該重組基因工程菌表達(dá)出新型融合蛋白LTB-Es; 3) 對(duì)重組表達(dá)的LTB-Es蛋白進(jìn)行純化后，加入白油佐劑制成疫苗。
[0007] 本發(fā)明利用pET30a( + )表達(dá)性載體構(gòu)建了能表達(dá)鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白 LTB-Es的大腸桿菌BL21 (DE3)宿主菌。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)出了 26kD重組目的蛋白。 將重組蛋白純化后制備成基因工程亞單位疫苗，免疫14日齡鴨群，免疫后可以使鴨群獲得 免疫保護(hù)。

【具體實(shí)施方式】
[0008] 申請(qǐng)人:在獲得一個(gè)具有免疫特性的鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es，并進(jìn)一步 通過(guò)大腸桿菌稀有密碼子優(yōu)化獲得其基因，然后通過(guò)pET30a( + )原核表達(dá)載體構(gòu)建出能表 達(dá)蛋白LTB-Es的大腸桿菌BL21 (DE3)重組基因工程菌，通過(guò)對(duì)工程菌的誘導(dǎo)、超聲破碎、蛋 白純化、定量、與佐劑配比等制備和生產(chǎn)方法制備出了鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗。
[0009] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是， 在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案的情況下可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或 替換，這些修改和替換均落入本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。
[0010] 實(shí)施例1鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es的獲得 1、利用生物軟件對(duì)鴨坦布蘇代表毒株ZJ-6(GenBank登錄號(hào)JF459991. 1)的包膜蛋白E進(jìn)行抗原表位分析，選定E蛋白抗原性較強(qiáng)DomainIII位置（303-410aa)與LTB序列進(jìn)行 拼接，中間設(shè)計(jì)Lingker(GGGSGGGS)進(jìn)行連接，獲得一種新型鴨坦布蘇病毒E蛋白Domain III和LTB的融合蛋白LTB-Es，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO: 1，并利用在線生物 軟件DNAWorks進(jìn)行大腸桿菌稀有密碼子優(yōu)化，獲得融合蛋白LTB-Es的核苷酸序列SEQID N0:2。
[0011]將新獲得的融合蛋白LTB-Es的核苷酸序列進(jìn)行全基因合成，同時(shí)兩端分別加上BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)。
[0012] 實(shí)施例2基因工程蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與工程菌的獲得 1、上述全基因合成的融合蛋白LTB-Es基因用BamHI和HindIII雙酶切后連入pET30a載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pET30a/Es表達(dá)載體。
[0013] 2、用CaCl2法將pET30a/Es表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于含50iig/ ml卡那霉素的瓊脂平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。選取10個(gè)單菌落提取質(zhì)粒，BamHI和HindIII 雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性的菌落進(jìn)一步測(cè)序鑒定。將測(cè)序驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培 養(yǎng)至0. 6?0. 8時(shí)加入0. 3mMIPTG誘導(dǎo)4?5小時(shí)，離心收集菌體跑SDS-PAGE電泳，同時(shí) 設(shè)立未誘導(dǎo)菌體作為對(duì)照。結(jié)果誘導(dǎo)后陽(yáng)性克隆比對(duì)照菌在26kD處多出一條蛋白條帶，與 重組蛋白理論分子量一致，表達(dá)量約為30%以上。經(jīng)鴨坦布蘇病毒抗體免疫印跡檢定，顯示 陽(yáng)性反應(yīng)。證明獲得的陽(yáng)性克隆為高效表達(dá)基因工程蛋白的工程菌，命名為L(zhǎng)E株。
[0014] 實(shí)施例3發(fā)酵、純化與鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗的制備規(guī)程 1菌毒種 1.1制造用菌種為鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗生產(chǎn)菌LE株；檢測(cè)用的強(qiáng)毒株 為鵝源坦布蘇SD株。
[0015] 1.2生產(chǎn)用菌種標(biāo)準(zhǔn) 1. 2. 1形態(tài)和生化特性 含有卡那霉素的LB瓊脂平板上過(guò)夜培養(yǎng)，在培養(yǎng)板上呈現(xiàn)圓形、邊緣整齊、突起、乳白 色有光澤的光滑菌落，革蘭氏染色后，鏡下顯示為革蘭氏陰性短桿菌；生化試驗(yàn)結(jié)果均為葡 萄糖發(fā)酵+，吲哚試驗(yàn)+，甲基紅試驗(yàn)+，VP_，枸櫞酸利用試驗(yàn)_。
[0016] 1.2. 2培養(yǎng)特性可在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
[0017] 1.2.3鑒別檢驗(yàn) 1. 2. 3. 1PCR檢測(cè)將本菌的LB液體培養(yǎng)物3ill做模板，用以下PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)能擴(kuò)增出418bp左右的片段。

【權(quán)利要求】
1. 一種鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es基因，其特征在于，所述的基因的編碼蛋白 的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2. 如權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
3. -種鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列為 SEQ ID N0:1。
4. 權(quán)利要求1所述的鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es基因在制備疫苗中的應(yīng)用。
5. -種鴨坦布蘇病毒亞單位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原為權(quán)利要求3所述 的鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白LTB-Es。
6. 如權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白 LTB-Es 的濃度為 0? 1-0. 5mg/ml。
7. 權(quán)利要求5所述的疫苗的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括有如下的步 驟： 1) 將LTB-Es基因連入原核表達(dá)載體中，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒； 2) 將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建能表達(dá)鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白 LTB-Es的重組基因工程菌，用該重組基因工程菌表達(dá)出新型融合蛋白LTB-Es ; 3) 對(duì)重組表達(dá)的新型融合蛋白LTB-Es進(jìn)行純化后，加入白油佐劑制成疫苗。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK104328135SQ201410569393
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】侯竹美 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)