專利名稱：測量血漿長正五聚蛋白ptx3水平的方法
測量血漿長正五聚蛋白PTX3水平的方法 本發(fā)明涉及測量生物流體，尤其是人或動物血槳中的PTX3的方法。
長正五聚蛋白PTX3是屬于正五聚蛋白家族的蛋白，其是用于早 期診斷患心血管病個體的死亡風(fēng)險的生物學(xué)標(biāo)記。正五聚蛋白的稱謂 緣于其形成五聚體的能力，是由肝臟響應(yīng)炎癥介質(zhì)而產(chǎn)生的一組蛋白， 包括C-反應(yīng)蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白P (SAP) 。 CRP禾卩SAP 被認(rèn)為是最典型的急性期蛋白，其循環(huán)水平在炎癥，感染和組織損傷 期間升高。PTX3是該家族的新成員，并已從白細胞介素-l刺激的內(nèi)皮 細胞克隆。該分子由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成， 一個是與任何已知蛋白不同源 的N-末端，和一個是與短正五聚蛋白，如CRP和SAP相似的C-末端。 與短正五聚蛋白的主要產(chǎn)生部位為肝臟的情形相反的是，PTX3由多種 類型的細胞，尤其是內(nèi)皮細胞，單核細胞-巨噬細胞和樹突細胞響應(yīng)促 炎蛋白，如IL-I和TNF及細菌產(chǎn)物而產(chǎn)生。先前的研究顯示，PTX3 的循環(huán)水平在患有急性或慢性炎性病癥，如敗血病和心肌梗塞的患者 中升高。尤其是，本發(fā)明的發(fā)明人在37名心肌梗塞患者中進行了試驗， 并發(fā)現(xiàn)PTX3的水平在入院冠心病科后7.5小時便達到了峰值6.94 ng/ml± 11.26，而CRP的峰值在入院后24小時才觀察到。近來，一項 更廣泛的研究(724名心肌梗塞患者)顯示，梗塞后第一天PTX3水平 的升高與該事件后最初三個月內(nèi)死亡或心力衰竭發(fā)作的風(fēng)險增加有 關(guān)。PTX3與血液中存在的分子，如CRP和成纖維細胞生長因子-2均
5口 口 o
這些關(guān)于PTX3與血液中存在的分子結(jié)合的能力的最新觀察可能 是迄今為止遇到的與測量PTX3循環(huán)水平有關(guān)的困難的原因。的確，美 國專利公開物US 2004137544描述了測定PTX3血漿水平的方法，然而它卻有明顯的缺點。的確，實施所述方法時，血清PTX3的值平均為在 EDTA-血漿中測得的值的一半，并且所述差異并不總是恒定，而有個 體差異。此外，雖然血清的值隨時間和在一個或兩個凍融循環(huán)后可以 重現(xiàn)，而在EDTA-血漿或檸檬酸鹽-血槳中，該值通常趨于隨著時間和 在重復(fù)凍融后增加。還觀察到在血清和EDTA-血漿或擰檬酸鹽-血漿中 存在著抑制測量的因子，因為在前述成分中加入標(biāo)準(zhǔn)曲線的PTX3時， 不可能獲得與用相同濃度的PTX3在RPMI 1640培養(yǎng)基+ 2%牛血清白 蛋白(BSA)或PBS + 2% BSA中的溶液獲得的值相同的光密度(O.D.) 值。
因此，現(xiàn)在需要提供一種測定PTX3血漿水平的方法，其允許測 量試驗樣品中存在的所有PTX3，從而避免假陰性的測量。
所述需求通過所附權(quán)利要求書中所限定的測量體液中的長正五聚 蛋白PTX3的方法得到了滿足，所述權(quán)利要求書的限定形成了本說明書
不可或缺的部分。
附圖簡述


圖1的柱狀圖顯示了添加和未添加凝集劑(polybrene )時EDTA-血漿中PTX3的水平；
圖2的柱狀圖顯示了立即測量和在4。C放置24小時后測量的補充 有凝集劑(polybrene )的EDTA-血漿中PTX3的水平；
圖3顯示了有和無凝集劑(polybrene )的EDTA-血漿中PTX3的 標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖4的柱狀圖分別顯示了在1， 2和3個凍融循環(huán)后補充有凝集劑 (polybrene )的EDTA-血槳中PTX3的水平；
本發(fā)明是基于這樣的觀察結(jié)果，即，如圖1所示，向EDTA-血槳 中添加陽離子聚合物，尤其是已知商品名為polybrene⑧的聚合物，測 得的PTX3水平比在相同的不添加polybrene⑧的EDTA-血漿樣品中觀察到的PTX3水平高。此外，圖2的柱狀圖清楚地顯示，由解凍樣品立 即獲得的PTX3值或解凍后在4°C放置24小時后的樣品獲得的PTX3 值之間無顯著差異，這與之前在未添加陽離子聚合物的EDTA-血漿樣 品中觀察到的結(jié)果相反。
為了證明用本發(fā)明的方法測量PTX3的可靠性，在上述觀察結(jié)果 的啟示下完成了進一步的實驗。的確，圖3顯示了光密度(O.D.)值對 PTX3在RPMI + 2% BSA的PTX3標(biāo)準(zhǔn)溶液，無polybrene 的EDTA-血漿和有polybrene 的EDTA-血漿中的PTX3血漿水平的曲線圖。如 圖可見，摻加標(biāo)準(zhǔn)量PTX3的具有polybrene 的EDTA-血漿樣品的曲 線幾乎與PTX3標(biāo)準(zhǔn)溶液的曲線重疊，而補充有相同量PTX3標(biāo)準(zhǔn)品的 無任何polybrene⑧的EDTA-血漿樣品顯示出完全不同的趨勢。本實驗 證明，EDTA-血漿樣品中陽離子聚合物的添加使得可以測量樣品中存 在的所有PTX3，因此可以測量出正確的蛋白水平。相反，正常EDTA-血漿樣品中存在的PTX3水平的測定結(jié)果向下變形，則有在相反含有高 水平PTX3的血液樣品中測得假陰性的結(jié)果風(fēng)險。
因此，圖4顯示的柱狀圖代表了分別在1， 2和3個凍融循環(huán)后在 補充有polybrene⑧的相同EDTA-血漿樣品中測得的PTX3水平?？梢?觀察到的是，由于最有可能的事實，即，PTX3分子不受血漿中的任何 螯合作用的影響，PTX3水平在所述三種情況下無變化。
不受到任何特定理論的限制的前提下，所觀察到的效果可能是由 于陽離子聚合物破壞了 PTX3分子與任何血漿成分例如，紅細胞或血液 蛋白，如clq蛋白之間的相互作用，和因此沒有任何這樣的相互作用的 PTX3可以完全被測量的事實。此外，關(guān)于理論上的可能性，可以假設(shè) 的是，觀察到的效果與陽離子聚合物的非特異性和可逆性紅細胞凝集 活性有一定關(guān)系。
因此，本發(fā)明的目的是測量人或動物來源的血漿樣品中的PTX3水平的方法，包括用紅細胞凝集劑處理所述血漿樣品的階段。 優(yōu)選所述血漿樣品是人血槳。
優(yōu)選所述凝集劑是陽離子介質(zhì)，更優(yōu)選為季銨鹽。在本發(fā)明的一 個尤其優(yōu)選的實施方案中，所述凝集劑是包括一或多個季銨基的陽離
子聚合物。更優(yōu)選所述所述陽離子聚合物是1,5-二甲基-1，5-二氮十一亞 甲基聚甲溴化物 (1，5-dimethyl-l,5-diazaundecamethylene polymethobromide)， 其也叫海美溴銨(hexadimethrine bromide)， 由 Sigma-Aldrich以商品名polybrene⑧銷售。
根據(jù)本發(fā)明的方法，用具有<^++螯合作用的抗凝劑，優(yōu)選EDTA (乙二胺四乙酸)或檸檬酸鹽，如檸檬酸鈉處理，然后離心過的血漿， 以下稱為"螯合劑-血漿"，其補充的凝集劑高至凝集劑的最終濃度按 重量計為樣品重量的0.01-0.3%。優(yōu)選凝集劑的最終濃度按重量計為 0.02-0.1%,更優(yōu)選按重量計為0.5%左右。所述濃度通過向每ml螯合 劑陽血漿中加入4-120 ^，優(yōu)選8-40 ^，更優(yōu)選約20 |il的2.5%凝集劑 的無0&++和無1\^++的PBS溶液來實現(xiàn)。
優(yōu)選在測定PTX3水平之前將凝集劑處理過的螯合劑-血漿樣品在 室溫下靜置10-20分鐘，更優(yōu)選約15分鐘。
然后用標(biāo)準(zhǔn)免疫分析技術(shù)對用本發(fā)明的凝集劑處理過的螯合劑-血漿樣品進行分析。根據(jù)本發(fā)明的典型免疫分析法包括以下階段i) 將處理過的螯合劑-血漿樣品暴露于針對PTX3的單克隆或多克隆抗 體，優(yōu)選單克隆抗體，及ii)測定特異性抗原/抗體結(jié)合。
抗原/抗體結(jié)合可以用放射性同位素或非放射性同位素方法測定。 例如，這些方法包括IRMA (免疫放射免疫測量分析法)，EIA (酶免 疫分析法)，ELISA (酶聯(lián)免疫吸附分析法)，F(xiàn)IA (熒光免疫分析法)和CLIA (化學(xué)發(fā)光免疫分析法)技術(shù)。該方法涉及檢測手段，如放射 性核素標(biāo)記，酶，輔酶，熒光團，化學(xué)發(fā)光劑，色原體，底物，酶輔 因子或抑制劑，自由基產(chǎn)生，染料等的應(yīng)用。
在優(yōu)選實施方案中，免疫分析法是ELISA型分析法，并涉及能與 PTX3以小于100 pg/ml的靈敏度特異性結(jié)合的大鼠單克隆抗體MNB4 (IgG2a)和兔抗-PTX3單克隆抗體(生物素?；疘gG)的使用。
以下實施例描述了根據(jù)ELISA分析法測量人血漿樣品中的PTX3 的典型方法。所用血漿樣品是每ml血漿用20 ^tl 2.5% polybrene②的無 Ca++和無Mg++的PBS溶液處理，以得到樣品中polybrene⑧的終濃度 按重量計為0.05%的螯合劑-血漿樣品
實施例
96孔ELISA板包被100 pl在15 mM pH 9.6的碳酸鹽緩沖液中濃 度為700 ng/ml的MNB4單克隆抗體，然后在4°C孵育過夜。單克隆抗 體通過將用重組PTX3免疫的小鼠的脾細胞與鼠骨髓瘤細胞系SP2/0 融合得到。
然后用洗滌緩沖液(PBS + 0.005%吐溫20)將板洗滌三次(300 p1/ 孔)，隨后向各孔中加入300 ^11含5%奶粉的洗滌緩沖液，以封閉非特 異性結(jié)合位點。
室溫孵育2小時后，將板用300 ^1洗滌緩沖液洗滌三次。
向一式兩份的孔中各加入50 nl重組人PTX3標(biāo)準(zhǔn)品(1.2 ng/ml-75 pg/ml的兩倍系列稀釋溶液)，向其它孔中加入如上所述處理的，用PBS + 2。/。BSA稀釋兩倍的EDTA-血漿樣品，接著將板在37°C孵育2小時。
然后將板用洗滌緩沖液洗滌5次，再向各孔中加入100 pl在洗滌緩沖液中的兔抗-PTX3生物素?；疘gG (25ng/ml)。
在37°<:孵育1小時后，將板用300 ^洗滌緩沖液洗滌5次。
向各孔中加入100 nl稀釋8000倍的Amdex鏈親和素辣根過氧化 物酶軛合物(RPN4401 Amersham)，將板在室溫孵育1小時。
用洗滌緩沖液將板洗滌5次后，向各孔中加入100nlTMB (四甲 基聯(lián)苯胺)，將板在室溫孵育5分鐘。加入50 ^ 1MH2S04溶液，使 酶反應(yīng)終止，然后在反應(yīng)終止的30分鐘內(nèi)于450 nm處讀取吸光度。
本發(fā)明的另一個目的是測定心血管和腦血管病預(yù)后的方法，包括 根據(jù)前述方法測量人或動物，優(yōu)選人的血漿樣品中的PTX3水平的階 段，和將這樣測得的PTX3血漿水平與參考值進行比較的階段，其中高 于所述參考值的PTX3血漿水平指示心肌梗塞后死亡或心臟代償失調(diào)， 或腦卒中后死亡或并發(fā)癥增加的風(fēng)險。
尤其是，所述PTX3參考值等于可以在健康個體中測得的PTX3 血漿水平，其優(yōu)選等于2ng/ml，更優(yōu)選為5 ng/mlPTX3。
更優(yōu)選的是，所述血漿樣品是來自于采樣之前8-12小時發(fā)生了心 肌梗塞，或采樣之前約24小時發(fā)生了腦卒中的患者的樣品。
包括預(yù)定量和濃度的抗-PTX3單克隆和多克隆抗體及紅細胞凝集 劑的試劑盒構(gòu)成了本發(fā)明的另一個目的。
優(yōu)選所述抗體是大鼠單克隆抗體MNB4 (IgG2a)和兔多克隆抗體 (生物素酰化IgG)。
優(yōu)選所述凝集劑選自上文所定義的凝集劑，尤其是1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物。
任選的是，本發(fā)明的試劑盒可以包括在相連或獨立容器中的重組
人PTX3，檢測試劑，緩沖劑，稀釋劑，穩(wěn)定劑及其它用于進行免疫分 析的試劑。
本發(fā)明的方法具有給出血漿樣品中精確可靠的PTX3測定結(jié)果， 從而避免假陰性的優(yōu)點。
本發(fā)明的方法進一步允許試驗血漿樣品中PTX3的穩(wěn)定，從而甚 至在反復(fù)凍融循環(huán)后仍能給出精確水平。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點在于，與之前的方法不同，所要求保護的分 析方法允許以相同的可靠度同樣好地測定EDTA-血漿或檸檬酸鹽-血漿 樣品中的PTX3血漿水平。
1權(quán)利要求
1.測量人或動物來源的血漿樣品中PTX3水平的方法，包括用紅細胞凝集劑處理所述血漿樣品的階段和隨后的測定PTX3血漿水平的階段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述紅細胞凝集劑是陽離子介質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述陽離子介質(zhì)是季銨鹽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述紅細胞凝集劑是含 有一或多個季銨基的陽離子聚合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述陽離子聚合物是1,5-二甲基 -1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5任一項的方法，其中所述血漿是經(jīng)(^++螯合 抗凝劑處理過的血漿。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述(^++螯合抗凝劑選自EDTA 和檸檬酸鹽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l-7任一項的方法，其中所述紅細胞凝集劑加入 到血漿中指導(dǎo)最終濃度按重量計為樣品重量的0.01-0.3%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述凝集劑的最終濃度按重量計 為樣品重量的0.02-0.1%，優(yōu)選按重量計為樣品重量的約0.5%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述凝集劑作為2.5%的無Ca++ 和無Mg—的PBS溶液以每ml血漿4-120 的量加入。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述凝集劑作為2.5%的無(^++ 和無1^^++的PBS溶液以每ml血漿8-40 ^，優(yōu)選約20 |il的量加入。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l-ll任一項的方法，其中用所述紅細胞凝集劑 處理的所述血漿樣品在所述測定PTX3血漿水平的階段之前在室溫靜 置10-20分鐘，優(yōu)選約15分鐘。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l-12任一項的方法，其中所述測定PTX3血漿 水平的階段通過免疫分析法進行，并且包括以下階段i)將血漿樣品 暴露于針對PTX3的單克隆和/或多克隆抗體，以及ii)測定特異性抗 原/抗體結(jié)合。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述特異性抗原/抗體結(jié)合的測 定通過選自IRMA (免疫放射免疫測量分析法)，EIA (酶免疫分析法)， ELISA (酶聯(lián)免疫分析法)，F(xiàn)IA (熒光免疫分析法)，CLIA (化學(xué)發(fā) 光免疫分析法)的方法進行。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述免疫分析法是使用大鼠單 克隆抗體MNB4 (IgG2a)和抗-PTX3兔多克隆抗體(生物素?；疘gG) 的ELISA型分析法。
16. 用于測定心血管和腦血管病預(yù)后的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求 1-15任一項所述方法測量人或動物血漿樣品中的PTX3水平的階段， 和將這樣測得的PTX3血漿水平與參考值進行比較的階段，其中高于所 述參考值的PTX3血漿水平指示心肌梗塞后死亡或心臟代償失調(diào)，或腦 卒中后死亡或并發(fā)癥風(fēng)險的增加。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述PTX3參考值等于能夠在 健康個體中測得的PTX3血漿水平。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其中所述PTX3參考值等于2 ng/ml PTX3 ，優(yōu)選5 ng/ml PTX3 。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項的方法，其中所述血漿樣品來自于 采樣之前8-12小時發(fā)生心肌梗塞，或采樣之前約24小時發(fā)生腦卒中的患者o
20. 用于測定血漿樣品中的PTX3血槳水平的試劑盒，包括預(yù)定量 和濃度的抗-PTX3單克隆和/或多克隆抗體和紅細胞凝集劑。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述抗體是大鼠單克隆抗體 MNB4 (IgG2a)和兔多克隆抗體(生物素?；疘gG)。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21的試劑盒，其中所述紅細胞凝集劑如 權(quán)利要求2-5任一項的限定。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20-22任一項的試劑盒，包括在相連或獨立容器 中的一種或多種選自重組人PTX3，檢測試劑，緩沖劑，稀釋劑，穩(wěn)定 劑的組分。
全文摘要
本發(fā)明涉及測量生物流體，尤其是人或動物血漿中的PTX3的方法。尤其是，本發(fā)明涉及測量人或動物來源的血漿樣品中的PTX3水平的方法，包括用紅細胞凝集劑處理所述血漿樣品的階段和隨后的測定PTX3血漿水平的階段。
文檔編號G01N33/68GK101606067SQ200680056666
公開日2009年12月16日 申請日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者朱塞佩·佩爾, 法比奧·帕斯夸利尼, 阿爾貝托·曼托瓦尼 申請人:仁愛米拉索萊有限公司