敲除yncD-aroC雙基因的甲型副傷寒沙門菌減毒疫苗技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種敲除yncD基因和aroC基因的甲型副傷寒沙門菌減毒疫苗。

背景技術(shù)：
傷寒仍然是全球性的公共衛(wèi)生問題。傷寒是由傷寒沙門菌、甲型、乙型和丙型副傷寒沙門菌引起的人類腸道傳染病據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年的傷寒患者有1600-3300萬感染者，死亡病例在50-60萬左右[1]。傷寒病例長(zhǎng)期位居我國(guó)法定甲乙類傳染病的前10位，各地每年仍有大量散發(fā)病例，還時(shí)有局部的爆發(fā)流行，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。而近兩年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，甲型副傷寒沙門菌在所有傷寒病原中的分離比率和感染絕對(duì)數(shù)量逐年上升，所占比例從18％到47％不等。這一變化在我國(guó)表現(xiàn)尤為突出，在我國(guó)主要流行區(qū)，甲型副傷寒沙門菌已逐漸取代傷寒沙門菌，成為傷寒病的主要病原。例如最新的數(shù)據(jù)顯示在廣西,甲型副寒和傷寒發(fā)病率分別為180/1O萬和30/10萬，甲型副傷寒占所有病例的85.8％。隨著流行區(qū)人群和旅行者中甲型副傷寒感染病例的增加，一些地區(qū)開始出現(xiàn)多重耐藥的甲型副傷寒沙門菌。過去傷寒病的預(yù)防一直以針對(duì)傷寒沙門菌感染為主，正在使用的兩種傷寒疫苗(Vi疫苗和傷寒沙門菌Ty21a減毒活疫苗)對(duì)甲型副傷寒均缺乏有效的預(yù)防作用。而目前市場(chǎng)上尚沒有可以應(yīng)用的甲型副傷寒疫苗。因此相關(guān)的疫苗研制工作刻不容緩。接種疫苗的基本目的是誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)病原體的感染起到免疫保護(hù)的作用?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得我們可以通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建遺傳背景清楚的減毒疫苗株。這種方式往往需要對(duì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)的某些重要基因或者與細(xì)菌致病性有關(guān)的毒力基因進(jìn)行敲除操作。到目前為止，采取這種方式，已經(jīng)針對(duì)沙門菌構(gòu)建了很多的減毒株，涉及的基因包括aro,pur,htrA,ompR,ompF,ompC,galE,cya,crpandphoP等。申請(qǐng)人擁有的公開號(hào)為CN102172399B的發(fā)明專利，是通過將沙門菌yncD基因敲除得到的沙門菌減毒疫苗，雖然該技術(shù)也可以用于甲型副傷寒疫苗株的構(gòu)建，但是和雙基因敲除的減毒疫苗相比較，卻存在一個(gè)關(guān)鍵問題，即由于該減毒疫苗只敲除了一個(gè)基因，因此在實(shí)際使用過程中存在回復(fù)突變的可能性，也就是細(xì)菌的毒力恢復(fù)到基因敲除前的水平，對(duì)接種者的健康和安全造成威脅。而雙基因的敲除則可以在保持疫苗原有的免疫原型和免疫保護(hù)性的前提下，最大程度的規(guī)避潛在的毒力回復(fù)突變風(fēng)險(xiǎn)，以保證接種者的健康和安全。當(dāng)然，在實(shí)際的疫苗制備過程中，如果涉及兩個(gè)以上的毒力基因敲除，減毒株的構(gòu)建就必須把握一個(gè)平衡，即首先要將病原體的毒力減弱，使其接種宿主后不會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生；但同時(shí)還需保證其能有效誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，不至于減毒過低而導(dǎo)致免疫保護(hù)效果不佳，從而喪失疫苗株的作用，因此，對(duì)于所敲除基因的選擇就成了問題的關(guān)鍵所在。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種敲除yncD-aroC雙基因的甲型副傷寒沙門菌減毒疫苗，所述疫苗為將yncD-aroC雙基因敲除而實(shí)現(xiàn)減毒的甲型副傷寒沙門菌減毒疫苗，其不僅相對(duì)于甲型副傷寒沙門菌野生株毒力明顯減弱，與yncD單基因敲除株比較，其毒力也進(jìn)一步降低。表現(xiàn)在其生長(zhǎng)速率顯著減低，在單核巨噬細(xì)胞中的胞內(nèi)生存能力也較yncD單敲株顯著減弱。但同時(shí)雙基因敲除株仍然具有良好的免疫原性，對(duì)接種過疫苗株的小鼠具有顯著的保護(hù)效果，并且疫苗株是兩個(gè)毒力基因的敲除，最大程度避免了毒力回復(fù)的可能性。本發(fā)明所述的甲型副傷寒沙門菌減毒疫苗，包含甲型副傷寒沙門菌yncD-aroC敲除株。所述敲除株是通過甲型副傷寒沙門菌yncD基因敲除載體敲除yncD基因和通過甲型副傷寒沙門菌aroC基因敲除載體敲除aroC基因。所述甲型副傷寒沙門菌yncD基因敲除載體包含pYG4質(zhì)粒和中間去掉yncD基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的yncD基因上下游序列SEQIDNO:14；所述甲型副傷寒沙門菌aroC基因敲除載體包含pYG4質(zhì)粒和中間去掉aroC基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的aroC基因上下游序列SEQIDNO:15-16。所述沙門菌yncD基因敲除載體采用引物為SEQIDNO:1-4所示序列的PCR方法制得；所述沙門菌aroC基因敲除載體采用引物為SEQIDNO:7-10所示序列的PCR方法制得。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種甲型副傷寒沙門菌yncD雙基因的敲除載體以及甲型副傷寒沙門菌aroC該敲除載體能夠準(zhǔn)確敲除甲型副傷寒沙門菌yncD-aroC。甲型副傷寒沙門菌yncD基因敲除載體，包含pYG4質(zhì)粒序列和中間去掉yncD基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的yncD基因上下游序列，所述中間去掉yncD基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的yncD基因上下游序列如SEQIDNO:17-18所示；所述甲型副傷寒沙門菌yncD基因敲除載體采用引物為SEQIDNO:1-4所示序列的PCR方法制得。甲型副傷寒沙門菌aroC基因敲除載體，包含pYG4質(zhì)粒序列和中間去掉aroC基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的aroC基因上下游序列，所述中間去掉aroC基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的aroC基因上下游序列如SEQIDNO:15-16所示；所述甲型副傷寒沙門菌aroC基因敲除載體采用引物為SEQIDNO:7-10所示序列的PCR方法制得。yncD敲除株的構(gòu)建：首先設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其序列分別為SEQIDNO:1-4，分別擴(kuò)增yncD基因上游和下游各1000bp片段，由于兩對(duì)引物中的內(nèi)側(cè)引物(SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)有21個(gè)堿基的重疊，故可以采用2個(gè)外側(cè)引物(SEQIDNO:1和SEQIDNO:4)，兩端設(shè)計(jì)了NdeⅠ酶切位點(diǎn))對(duì)前述PCR產(chǎn)物進(jìn)行交疊PCR，獲得去除了yncD基因的序列。將PCR產(chǎn)物連接到T載體上，再經(jīng)NdeⅠ酶切后，連接到同樣酶切并去磷酸化的敲除載體pYG4，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌S17-1/λpir，卡那霉素平板上篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切、PCR測(cè)序鑒定。將載體通過電轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)移到受體菌中，采用卡那平板(含有卡那霉素100μg/ml)進(jìn)行篩選。將獲得的整合體細(xì)菌在無選擇培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于含有5％蔗糖的LB平板進(jìn)行第2次篩選，對(duì)獲得的重組菌株進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)，篩選敲除株。aroC敲除株的構(gòu)建：aroC基因編碼的分支酸合酶，在芳香族氨基酸合成途徑中有十分重要的作用。該基因的突變株對(duì)某些芳香族化合物，如色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，對(duì)氨基苯甲酸和2,3-二羥基苯甲酸等表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)缺陷，在缺乏芳香族化合物的環(huán)境，比如人體中，其生長(zhǎng)會(huì)受到抑制而導(dǎo)致毒力下降。因此，申請(qǐng)人選擇在yncD基因敲除株的基礎(chǔ)上，敲除aroC基因，以進(jìn)一步降低敲除株的毒力，增加敲除株的安全性。aroC基因敲除技術(shù)路線同yncD基因，只是所用引物序列不同，其序列分別為SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:11-12。首先設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其序列如SEQIDNO:7-10所示，分別擴(kuò)增aroC基因上游和下游各750bp片段，由于兩對(duì)引物中的內(nèi)側(cè)引物(序列SEQIDNO:8和SEQIDNO:9)有21個(gè)堿基的重疊，故可以采用2個(gè)外側(cè)引物(序列SEQIDNO:7和SEQIDNO:10)，兩端設(shè)計(jì)了ApaⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)，對(duì)前述PCR產(chǎn)物進(jìn)行交疊PCR，獲得去除了aroC基因的序列。將PCR產(chǎn)物連接到T載體上，再經(jīng)ApaⅠ和SacⅠ雙酶切后，連接到同樣雙酶切并去磷酸化的敲除載體pYG4，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌S17-1/λpir，卡那霉素平板上篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切、PCR測(cè)序鑒定。將載體通過電轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)移到受體菌中，采用卡那平板(含有卡那霉素100μg/ml)進(jìn)行篩選。將獲得的整合體細(xì)菌在無選擇培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于含有5％蔗糖的LB平板進(jìn)行第2次篩選，對(duì)獲得的重組菌株進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定(SEQIDNO:11和SEQIDNO:12)，篩選敲除株。本發(fā)明采用的自殺載體是pYG4，載體包含以下成分：來源于R6K質(zhì)粒的π蛋白依賴性復(fù)制起點(diǎn)oriR6K，使質(zhì)粒只能在表達(dá)π蛋白的菌株中復(fù)制，對(duì)于其它菌株(包括沙門菌)則是自殺性的?？敲顾乜剐云危糜谡蜻x擇。反向選擇標(biāo)志為sacB基因，是來自于枯草芽孢桿菌的果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因，表達(dá)該蛋白的革蘭陰性菌在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),會(huì)將蔗糖分解為對(duì)細(xì)菌有毒的產(chǎn)物,從而殺死表達(dá)該蛋白的細(xì)菌，因此可以用于反向選擇。由于敲除后不會(huì)加入抗性片段，因此適用于疫苗株的突變操作，采用同一載體也可以多次累加敲除。本發(fā)明中采用同源重組方式對(duì)甲型副傷寒沙門菌的yncD基因和aroC基因進(jìn)行敲除，從而獲得yncD-aroC雙基因敲除的甲型副傷寒沙門菌減毒疫苗株。相比yncD單基因敲除株，雙基因敲除株由于毒力有了進(jìn)一步降低，同時(shí)最大程度的避免了單基因敲除株的毒力回復(fù)突變，因此具有更佳的安全性，免疫效果測(cè)定也證明本發(fā)明所構(gòu)建的疫苗株具有很好的免疫原性，對(duì)接種過疫苗株的小鼠具有良好的保護(hù)效果附圖說明圖1為aroC基因敲除的過程示意圖；(yncD和aroC兩者敲出過程相同，只是所使用的引物序列不同，圖中所標(biāo)注p1,p2,p3,p4是代表所敲基因的上下游序列引物)圖2為野生株、yncD突變株、yncD-aroC雙突變株生長(zhǎng)曲線；圖3為yncD基因序列進(jìn)行相似度比對(duì)。具體實(shí)施方式試劑材料：一.試驗(yàn)中所用試劑除DNA連接酶和試劑盒外，均為takara公司產(chǎn)品；LB培養(yǎng)基：液體：氯化鈉1％，胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％；固體：氯化鈉1％，胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，瓊脂糖1.4％，121℃高壓蒸汽滅菌；а-MEM培養(yǎng)基：根據(jù)需要，分別加入終濃度10uM的FeSO4和FeCl3；DNA連接酶promega公司產(chǎn)品膠回收試劑盒omega公司產(chǎn)品質(zhì)粒提取試劑盒omega公司產(chǎn)品引物制作和DNA片段測(cè)序由上海英俊公司完成卡那霉素培養(yǎng)基即在普通LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入終濃度100ug/ml的卡那霉素；氨芐青霉素培養(yǎng)基：即在普通LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入終濃度100ug/ml的氨芐青霉素。二.所用主要儀器：凝膠成像儀:Bio-rad-T2a電轉(zhuǎn)儀：Bio-radgene-pluserII分光光度計(jì)：Bio-radsmartspeec3000電泳儀：：Bio-rad72BR5008PCR儀：：Bio-rad580B5502水?。荷虾Ｉ睭H-2A金屬?。汉贾莶┤誄HB-A4-HH搖床：zhichengZHWY-100B恒溫?fù)u床離心機(jī)：ThermoLEGENDMicro21實(shí)施例1甲型副傷寒沙門菌yncD敲除株的構(gòu)建參見圖1，采用交疊PCR方式獲得拼接在一起的yncD基因上下游序列(中間去掉yncD基因序列，同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化)，連接到pYG4(pYG4質(zhì)粒的構(gòu)建過程請(qǐng)參考“第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)”，2009年12月，第31卷第23期第2299-2301頁(yè)。pYG4質(zhì)粒序列見CN102172399B的發(fā)明專利所述。)中構(gòu)建成敲除載體pYG4－△yncD，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌S17-1/λpir中復(fù)制，進(jìn)行酶切、PCR及測(cè)序鑒定。(1)交疊PCR：根據(jù)yncD基因上下游序列分別制作兩組PCR引物Dk1和Dk2、Dk3和Dk4(SEQIDNO:1-4，其中，Dk2和Dk3有一段互補(bǔ)序列，Dk1和Dk4內(nèi)分別含有限制性內(nèi)切酶Ndel和EcooR1酶切位點(diǎn))。然后分別做PCR。yncD基因序列如SEQIDNO:14所示。PCR方法如下反應(yīng)條件：將兩組PCR產(chǎn)物跑凝膠電泳后做膠回收，標(biāo)記為pcr1和pcr2。由于Dk2和Dk3有部分互補(bǔ)序列，所以，再用pcr1和pcr2為模板做交疊PCR，方法如下：反應(yīng)條件：(2)將所得PCR產(chǎn)物電泳做膠回收，標(biāo)記為pcr3。用pcr3和PYG4分別做雙酶切條件：37℃水浴過夜。將兩個(gè)酶切產(chǎn)物跑凝膠電泳后膠回收，分別標(biāo)記為L(zhǎng)1和L2。用L1和L2做連接反應(yīng)構(gòu)建敲除載體，記為pYG4－△yncD，條件如下：反應(yīng)條件：16℃金屬浴過夜。(3)將pYG4－△yncD電轉(zhuǎn)入大腸埃希菌S17-1/λpir中復(fù)制、擴(kuò)增、提取質(zhì)粒(卡那霉素抗性)，進(jìn)行酶切、PCR及測(cè)序鑒定。反應(yīng)條件：37℃水浴過夜②PCR體系：電轉(zhuǎn)條件：應(yīng)在冰上進(jìn)行，0.1cm電轉(zhuǎn)杯，1.8KV，25uf，200毆。③送英駿公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序獲得的序列與網(wǎng)上公布的相應(yīng)序列對(duì)比。參見圖1第二步，將經(jīng)測(cè)序鑒定的敲除載體通過電轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)移到甲型副傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物保藏中心)，該野生株不能在含有卡那霉素的平板上生長(zhǎng)，同時(shí)載體pYG4無法在甲型副傷寒沙門菌中復(fù)制，因此只有當(dāng)載體整合到野生株的染色體上，該菌株才能在抗性平板上生長(zhǎng)，挑選單菌落進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定。鑒定正確后菌株記為整合株。(2)挑選單菌落做PCR鑒定，并同時(shí)送測(cè)序：PCR體系：參見圖1，為了進(jìn)一步獲得敲除株，將鑒定后的整合菌株置于無抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)后篩選發(fā)生染色體內(nèi)同源重組的突變株，由于sacB片段的反向選擇作用，可用含有5％蔗糖的平板進(jìn)行篩選，帶有sacB片段的整合株無法在該平板上生長(zhǎng)，而長(zhǎng)出來的菌落都是發(fā)生了染色體內(nèi)重組，從而去掉了載體序列(包括sacB片段)的重組菌株。重組有兩種情況，其中50％的可能性產(chǎn)生敲除株，可通過PCR方式篩選鑒定獲得敲除株。所得凝膠電泳條帶可與野生株相比較，DNA大小差別正好等于yncD大小。獲得的重組菌株進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定，引物Dk5、Dk6(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)分別為Dk1和Dk4(SEQIDNO:1和SEQIDNO:4)外圍引物：所得凝膠電泳條帶可與野生株相比較，DNA大小差別正好等于yncD大小。實(shí)施例2甲型副傷寒沙門菌yncD-aroC敲除株的構(gòu)建aroC基因敲除與yncD基因基因敲除方法相同。采用交疊PCR方式獲得拼接在一起的aroC基因上下游序列(中間去掉aroC基因序列，同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化)，連接到pYG4中構(gòu)建成敲除載體pYG4－△aroC，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌S17-1/λpir中復(fù)制，進(jìn)行酶切、PCR及測(cè)序鑒定。(1)交疊PCR：根據(jù)aroC基因上下序列分別制作兩組PCR引物Ck1和Ck2、Ck3和Ck4(SEQIDNO:7-10，其中，Ck2和Ck3有一段互補(bǔ)序列，Ck1和Ck4內(nèi)分別含有限制性內(nèi)切酶Apa1和sac1酶切位點(diǎn))。然后分別做PCR。aroC基因序列如SEQIDNO:13所示。PCR方法如下：將兩組PCR產(chǎn)物跑凝膠電泳后做膠回收，標(biāo)記為pcr1和pcr2.。由于Ck2和Ck3有部分互補(bǔ)序列，所以，再用pcr1和pcr2為模板做交疊PCR，方法如下：(2)將所得PCR產(chǎn)物電泳做膠回收，標(biāo)記為pcr3。用pcr3和PYG4分別做雙酶切條件：37℃水浴過夜將兩個(gè)酶切產(chǎn)物跑凝膠電泳后膠回收，分別標(biāo)記為L(zhǎng)1和L2。用L1和L2做連接反應(yīng)構(gòu)建敲除載體，記為pYG4－△aroC，條件如下：反應(yīng)條件：16℃金屬浴過夜。(3)將pYG4－△aroC電轉(zhuǎn)入大腸埃希菌S17-1/λpir中復(fù)制、擴(kuò)增、提取質(zhì)粒(卡那霉素抗性)，進(jìn)行酶切、PCR及測(cè)序鑒定。反應(yīng)條件：37℃水浴過夜③電轉(zhuǎn)條件：應(yīng)在冰上進(jìn)行，0.1cm電轉(zhuǎn)杯，1.8KV，25uf，200毆。(3)將經(jīng)鑒定的敲除載體通過電轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)移到甲型副傷寒沙門菌yncD敲除株(選擇對(duì)卡那霉素敏感的菌株)，該yncD敲除株不能在含有卡那霉素的平板上生長(zhǎng)，同時(shí)載體pYG4無法在該yncD敲除株中復(fù)制，因此只有當(dāng)載體整合到y(tǒng)ncD敲除株的染色體上，該菌株才能在抗性平板上生長(zhǎng)，挑選單菌落進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定。鑒定正確后，菌株記為整合株。①將鑒定后的pYG4－△aroC質(zhì)粒點(diǎn)轉(zhuǎn)入yncD敲除株，用含卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選。培養(yǎng)條件：37℃過夜②挑選單菌落做PCR鑒定，并同時(shí)送測(cè)序：PCR體系：③為了進(jìn)一步獲得yncD-aroC敲除株，將鑒定后的整合菌株置于無抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)后篩選發(fā)生染色體內(nèi)同源重組的突變株，由于sacB片段的反向選擇作用，可用含有5％蔗糖的平板進(jìn)行篩選，帶有sacB片段的整合株無法在該平板上生長(zhǎng)，而長(zhǎng)出來的菌落都是發(fā)生了染色體內(nèi)重組，從而去掉了載體序列(包括sacB片段)的重組菌株。④重組有兩種情況，其中50％的可能性產(chǎn)生敲除株，可通過PCR方式篩選鑒定獲得敲除株。所得凝膠電泳條帶可與野生株相比較，DNA大小差別正好等于aroC大小。⑤獲得的重組菌株進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定，引物Ck5、Ck6(SEQIDNO:11和SEQIDNO:12)分別為Ck1和Ck4(SEQIDNO:7和SEQIDNO:10)外圍引物：所得凝膠電泳條帶可與野生株相比較，DNA大小差別正好等于aroC大小。實(shí)施例3yncD敲除株、yncD-aroC雙敲除株與野生株生物學(xué)性狀的比較以LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)yncD敲除株、yncD-aroC雙敲除株(疫苗株)與野生株，繪制生長(zhǎng)曲線，比較三者在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)性狀的差異。參見圖2，yncD單基因敲除株生長(zhǎng)較野生株緩慢，進(jìn)入對(duì)數(shù)期以及穩(wěn)定期的時(shí)間均較野生株延遲4小時(shí)左右，但經(jīng)過16小時(shí)培養(yǎng)后可以達(dá)到與野生株基本相同的菌液濃度；雙基因敲除株生長(zhǎng)速率減低更為明顯，其進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)間較野生株延遲近8小時(shí)，進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間較野生株則延遲近12小時(shí)，并且其最終的菌液濃度A600值也較野生株明顯減低。實(shí)施例4疫苗株與野生株毒力的比較采用評(píng)價(jià)沙門菌毒力通常使用的粘蛋白增毒小鼠模型。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生株和疫苗株細(xì)菌經(jīng)PBS洗后重懸，懸液中加入終濃度10％的豬胃粘蛋白，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置5個(gè)濃度梯度組，每組3只BALB/c小鼠。細(xì)菌懸液注射至小鼠腹腔，注射后觀察72小時(shí)內(nèi)小鼠死亡情況，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算半數(shù)致死量LD50。實(shí)施例4疫苗株與野生株毒力的比較采用評(píng)價(jià)沙門菌毒力通常使用的粘蛋白增毒小鼠模型。分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌經(jīng)PBS洗后重懸，懸液中加入終濃度10％的豬胃粘蛋白，設(shè)置5個(gè)梯度，分別為2.5×102,2.5×103,2.5×104,2.5×105,2.5×106CFU，每組3只BALB/c小鼠，并設(shè)3只PBS空白對(duì)照小鼠。將細(xì)菌懸液注射至小鼠腹腔，注射后觀察72小時(shí)內(nèi)小鼠死亡情況，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算半數(shù)致死量LD50。結(jié)果見表1，疫苗株的毒力發(fā)生顯著性降低。其毒力降低的原因：一是yncD編碼外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，突變后對(duì)于靶物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，而導(dǎo)致其在基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力下降，雖然目前尚未確認(rèn)其轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)，但以上實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)其功能的重要性及其與致病性的密切關(guān)系。二是由于aroC基因和細(xì)菌合成芳香族氨基酸有關(guān)，該基因敲除后細(xì)菌的芳香族氨基酸合成收到影響，造成細(xì)菌的生長(zhǎng)進(jìn)一步受到影響。表1.甲型副傷寒沙門菌LD50菌株描述接種途徑LD50YGC101野生株腹腔注射7.9×101YGC102疫苗株腹腔注射3.33×106實(shí)施例5疫苗株免疫效果收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期野生株細(xì)菌經(jīng)PBS洗滌重懸，懸液中加入終濃度10％的豬胃粘蛋白，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置3個(gè)濃度梯度組，分別為2.5×104,2.5×105,2.5×106CFU，每組3只經(jīng)疫苗株免疫30天的BALB/c小鼠，對(duì)照組3只小鼠注射劑量為2.5×103CFU。細(xì)菌懸液注射至小鼠腹腔，注射后觀察72小時(shí)內(nèi)小鼠死亡情況。如表2所示，經(jīng)過疫苗株的免疫接種以后，BALB/c小鼠對(duì)野生株的毒力攻擊耐受有了很大的提高，證明疫苗株的免疫接種對(duì)小鼠有良好的免疫保護(hù)效果。表2甲型副傷寒沙門菌疫苗株免疫效果實(shí)施例6yncD基因在沙門菌中的相似度分析對(duì)已測(cè)序的沙門菌的yncD基因序列，并進(jìn)行相似度比對(duì)。結(jié)果參見圖3。分析表明，yncD基因序列在沙門菌中有高度的保守性，相似度大于98％，高度的保守性表明其基因功能在不同沙門菌的血清型中是一致的。