基于3d生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，利用高分子材料和人新生皮膚成纖維細(xì)胞柱交替打印出血管形狀，經(jīng)過融合后，去除上述高分子材料，構(gòu)造出組織工程血管；向血管中灌注晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞，在生物反應(yīng)器內(nèi)經(jīng)過7天的體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，獲得分化的組織工程血管，所述高分子材料為普朗尼克F127、聚N-異丙基丙烯酰胺、甲基纖維素或阮藻酸鈉的一種。本發(fā)明的方法獲得的血管生物相容性好，有較強(qiáng)的力學(xué)性能，較好的抗血栓形成和抗血小板粘附的作用，可用于受損或病變血管的修復(fù)和替換。
【專利說明】基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)，特別明涉及用于治療脈管疾病的組織工程血管，即采用3D打印的方式，制備出去支架化的組織工程血管，應(yīng)用于修復(fù)或替換受損或病變的原生血管。

【背景技術(shù)】
[0002]血管替換是治療脈管疾病的有效方法之一。常用的替換血管分為自體血管、異體血管和組織工程血管。人類自體血管來源有限，異體血管又存在免疫排斥，從而組織工程血管構(gòu)建的研宄變得尤為重要。
[0003]組織工程血管構(gòu)建的基本途徑是，采用與血管相似的天然或人工合成材料構(gòu)建支架，在支架上種植種子細(xì)胞并培養(yǎng)，最終形成結(jié)構(gòu)、功能與自體血管相似的組織。
[0004]目前常使用的組織工程血管有滌綸人造血管，聚氨酯材料人造血管、真絲人造血管等高分子材料人工血管。由于這一系列高分子材料人造血管都存在著生物兼容性差、使用年限短、遠(yuǎn)期通暢率差，容易造成疾病復(fù)發(fā)等問題。近年來，隨著組織工程的發(fā)展，人們開始通過3D生物打印技術(shù)探索制造新型人工血管，3D生物打印技術(shù)是以高分子生物材料、細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等成分作為打印墨汁而進(jìn)行活體打印的新技術(shù)。其優(yōu)勢(shì)就在于精確可控的三維打印細(xì)胞及生物材料的使用，并且可根據(jù)病人病變血管的形狀及大小個(gè)性化的定制打印人工血管。
[0005]目前3D生物打印技術(shù)在打印血管時(shí)所采用的方式是在培養(yǎng)器皿中層層堆積生物墨汁細(xì)胞，然后通過后續(xù)的生物培養(yǎng)得到所需要的人工血管。其血管成型的具體方法有兩種:第一種是垂直堆積，第二種是平行堆積成型，這兩種方法同樣受到血管桿的機(jī)械性能影響，獲得的人工血管細(xì)胞分布雜亂，不容易精確控制。同時(shí)，這兩種血管打印成型方法都存在成型速度慢、效率低，打印出的成品結(jié)構(gòu)不理想，無法形成完整的生物血管等問題。
[0006]目前的組織工程血管是以水凝膠為支架材料為支架，在培養(yǎng)器皿中層層堆積生物墨汁細(xì)胞，然后通過后續(xù)的生物培養(yǎng)得到所需要的人工血管。這種方式存在以下缺點(diǎn):水凝膠為支架材料存在機(jī)械強(qiáng)度不足，細(xì)胞密度低，替換血管的細(xì)胞相容性和組織相容性低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，以克服以水凝膠為支架材料的機(jī)械強(qiáng)度不足，從而使得到的組織工程血管獲得較高的細(xì)胞密度，同時(shí)提高了替換血管的細(xì)胞相容性和組織相容性。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]一種基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，利用高分子材料和人新生皮膚成纖維細(xì)胞柱交替打印出血管形狀，經(jīng)過融合后，去除上述高分子材料，構(gòu)造出組織工程血管；向血管中灌注晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞，在生物反應(yīng)器內(nèi)經(jīng)過7天的體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，獲得分化的組織工程血管，所述高分子材料為普朗尼克F127、聚N-異丙基丙烯酰胺、甲基纖維素或阮藻酸鈉的一種。
[0010]具體步驟如下:
[0011]步驟a、細(xì)胞處理:
[0012](al)從培養(yǎng)箱中取出裝有人新生皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)皿，用磷酸鹽緩沖液清洗后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞；
[0013](a2)處理后的細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液，置于組織培養(yǎng)瓶中；
[0014](a3)培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上培養(yǎng)，使受損細(xì)胞恢復(fù)附著能力，離心把細(xì)胞分離出來；
[0015](a4)利用3D打印機(jī)將細(xì)胞柱擠出在特制的、無粘著力的聚四氟乙烯或瓊脂糖基上，過夜培養(yǎng)，使細(xì)胞柱成熟；
[0016]步驟b、高分子材料處理:
[0017]選擇液態(tài)的上述高分子材料，當(dāng)高分子材料吸入打印頭上的微量吸液管時(shí)，浸入磷酸鹽緩沖液中，使得材料固化，可獲得連續(xù)擠出的條狀高分子材料；
[0018]步驟c、3D血管打印:
[0019]3D打印機(jī)含有兩個(gè)打印頭，一個(gè)擠出條狀高分子材料，另一個(gè)擠出人新生皮膚成纖維細(xì)胞柱，打印前編寫打印程序，輸入電腦；
[0020](Cl)裝載:將附有微量吸液管的打印頭A伸入裝有液體高分子材料的小瓶中，將高分子材料吸入吸液管中；
[0021](c2)擠出:將交聯(lián)后的高分子材料擠出在一個(gè)培養(yǎng)皿中；
[0022](c3)當(dāng)需要細(xì)胞打印時(shí)，將成熟的細(xì)胞柱吸入微量吸液管，裝在打印頭B上，打印方法同高分子材料；
[0023](c4)打印完成后，經(jīng)過2-4天的融合過程，去除高分子材料，獲得血管結(jié)構(gòu)；步驟d、內(nèi)皮細(xì)胞灌注:
[0024](dl)利用動(dòng)脈鞘插入，從患有脈管疾病的病患中獲取50mL的外周血，借助流式細(xì)胞儀，從外周血中提取分離晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞；
[0025](d2)將分離出的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞注入之前獲得的血管內(nèi)腔，旋轉(zhuǎn)；
[0026](d3)對(duì)步驟(d2)得到的血管在生物反應(yīng)器進(jìn)行為期7天的體外培養(yǎng)。
[0027]步驟(a3)中，培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上在體積濃度為5%的CO2環(huán)境、37°C下培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速3500rpm下離心分離。
[0028]所述高分子材料為普朗尼克F127、聚N-異丙基丙烯酰胺或甲基纖維素時(shí)，在步驟(Cl)裝載的步驟后還有交聯(lián)的步驟:將裝載有液體高分子材料的吸液管浸入裝有磷酸鹽緩沖液的小瓶中，使高分子材料快速交聯(lián)。
[0029]步驟(c5)中，采用改變溫度的方式去除普朗尼克F127、聚N-異丙基丙烯酰胺或甲基纖維素。
[0030]步驟(c5)中，采用螯合的方式去除阮藻酸鈉。
[0031]采用離子螯合的方式去除阮藻酸鈉的步驟為:將質(zhì)量濃度為2% Wt明膠煮沸，加ANaCl使其質(zhì)量濃度為0.9% wt、加入CaCl2使其摩爾質(zhì)量濃度為lOmmol/L，煮沸2分鐘后，放置冰箱中8h后，將上述混合物事先涂覆在裝載打印物的培養(yǎng)皿上；在阮藻酸鈉中摻入乙二胺四乙酸，擠出在鋪有上述混合物的培養(yǎng)皿上；乙二胺四乙酸和Ca2+發(fā)生螯合作用，阮藻酸鈉降解。
[0032]步驟(d2)中，細(xì)胞濃度為5x10s個(gè)/mL。
[0033]步驟(d2)中，旋轉(zhuǎn)的條件是:溫度37°C，轉(zhuǎn)速lOrph，旋轉(zhuǎn)30min。
[0034]步驟(d3)中，體外培養(yǎng)的條件是:施以6.8dynes/cm2的壁面剪切應(yīng)力，37°C恒溫。
[0035]本發(fā)明的有益效果是:
[0036]本發(fā)明的方法獲得的血管生物相容性好，有較強(qiáng)的力學(xué)性能，較好的抗血栓形成和抗血小板粘附的作用，可用于受損或病變血管的修復(fù)和替換。
[0037]本發(fā)明構(gòu)建的組織工程血管是去支架的，不僅克服了以水凝膠為支架材料的機(jī)械強(qiáng)度不足，也獲得了較高的細(xì)胞密度，同時(shí)，一定程度上提高了替換血管的細(xì)胞相容性和組織相容性。
[0038]采用螯合或改變溫度的方式去除基底材料，過程簡單易操作，且能夠制備并獲得分枝狀血管。
[0039]在替換血管內(nèi)層涂覆內(nèi)皮細(xì)胞，能夠提高血管的通透性。
[0040]內(nèi)皮細(xì)胞的選擇:從外周血中獲取內(nèi)皮細(xì)胞，操作簡單，痛苦小；
[0041]內(nèi)皮祖細(xì)胞分為早期內(nèi)皮祖細(xì)胞(Early-outgrowth EPCs)和晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(Late-outgrowth EPCs)，本專利選取晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞，該種細(xì)胞雖數(shù)量稀少但增殖能力強(qiáng)(因而僅需少量外周血即可獲得大量Late-outgrowth EPCs，減少了供體的痛苦)，粘附能力強(qiáng)，具有典型的內(nèi)皮細(xì)胞功能，能夠在注入體內(nèi)直接整合到血管內(nèi)皮，參與血管生成，被成為“真正的”內(nèi)皮祖細(xì)胞；
[0042]選擇的細(xì)胞來源于患有脈管疾病的病人，有文獻(xiàn)證明，取自于病患體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞能夠表現(xiàn)出和取自非病患體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞相同的功能，同時(shí)避免了異體細(xì)胞導(dǎo)致的免疫原性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1是本發(fā)明的打印方式的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0044]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0045]實(shí)施例1
[0046]細(xì)胞處理:
[0047]I)從培養(yǎng)箱中取出裝有人新生皮膚成纖維細(xì)胞(hNDFs)的培養(yǎng)皿，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞；
[0048]2)處理后的細(xì)胞重懸于4mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于1mL的組織培養(yǎng)瓶中；
[0049]3)培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上在體積濃度為5%的CO2環(huán)境、37 °C下培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速3500rpm下離心分離；
[0050]4)利用3D打印機(jī)將細(xì)胞柱擠出在特制的、無粘著力的聚四氟乙烯或瓊脂糖基上，過夜培養(yǎng)，使細(xì)胞柱成熟。
[0051]普朗尼克F127(PF127)處理:
[0052]采用20% -30% W/W的PF127，其中，W/W為:溶質(zhì)質(zhì)量百分濃度(w/w)=溶質(zhì)質(zhì)量/溶液質(zhì)量
[0053]選擇溫度在4_5°C的液態(tài)普朗尼克F127，當(dāng)材料吸入打印頭上的微量吸液管時(shí)，浸入常溫下的PBS中，使得材料固化，可獲得連續(xù)擠出的條狀的普朗尼克F127。
[0054]3D血管打印:
[0055]3D打印機(jī)含有兩個(gè)打印頭，一個(gè)擠出條狀的普朗尼克F127，另一個(gè)擠出人新生皮膚成纖維細(xì)胞柱，打印前編寫打印程序，輸入電腦；
[0056]I)裝載:將附有微量吸液管的打印頭A伸入裝有液體普朗尼克F127的小瓶中，將普朗尼克F127吸入吸液管中；
[0057]2)交聯(lián):將裝載有液體普朗尼克F127的吸液管浸入裝有常溫磷酸鹽緩沖液的小瓶中，使普朗尼克F127快速交聯(lián)；
[0058]3)擠出:將交聯(lián)后的普朗尼克F127擠出在一個(gè)培養(yǎng)皿中；
[0059]4)當(dāng)需要細(xì)胞打印時(shí)，將成熟的細(xì)胞柱吸入微量吸液管，裝在打印頭B上，打印方法同普朗尼克F127 ；
[0060]5)打印完成后，經(jīng)過2-4天的融合過程，通過改變溫度去除普朗尼克F127，獲得血管結(jié)構(gòu)。
[0061]打印過程如圖1所示，X代表細(xì)胞柱，其他代表普朗尼克F127柱。
[0062]內(nèi)皮細(xì)胞灌注:
[0063]I)利用動(dòng)脈鞘插入，從患有脈管疾病的病患中獲取50mL的外周血，借助流式細(xì)胞儀，從外周血中提取分離晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞；
[0064]2)將分離出的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞注入之前獲得的血管內(nèi)腔，細(xì)胞濃度為5x10s個(gè)/mL，37°C下 1rph 旋轉(zhuǎn) 30min ；
[0065]3)對(duì)上一步得到的血管在生物反應(yīng)器進(jìn)行為期7天的體外培養(yǎng):施以6.Sdynes/cm2的壁面剪切應(yīng)力，37 °C恒溫。
[0066]本實(shí)施例得到的組織工程血管(TEBVs)內(nèi)徑0.81mm，壁厚0.35mm，平均爆破壓力1770±420mmHg，CAD EPCs 的附著率大于 90%。
[0067]實(shí)施例2
[0068]細(xì)胞處理:
[0069]I)從培養(yǎng)箱中取出裝有人新生皮膚成纖維細(xì)胞(hNDFs)的培養(yǎng)皿，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞；
[0070]2)處理后的細(xì)胞重懸于4mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于1mL的組織培養(yǎng)瓶中；
[0071]3)培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上在體積濃度為5%的CO2環(huán)境、37 °C下培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速3500rpm下離心分離；
[0072]4)利用3D打印機(jī)將細(xì)胞柱擠出在特制的、無粘著力的聚四氟乙烯或瓊脂糖基上，過夜培養(yǎng)，使細(xì)胞柱成熟；
[0073]聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)處理:
[0074]選擇液態(tài)聚N-異丙基丙烯酰胺，當(dāng)材料吸入打印頭上的微量吸液管時(shí)，浸入PBS中，使得材料固化，可獲得連續(xù)擠出的條狀聚N-異丙基丙烯酰胺；
[0075]3D血管打印:
[0076]3D打印機(jī)含有兩個(gè)打印頭，一個(gè)擠出條狀聚N-異丙基丙烯酰胺，另一個(gè)擠出人新生皮膚成纖維細(xì)胞柱，打印前編寫打印程序，輸入電腦；
[0077]I)裝載:將附有微量吸液管的打印頭A伸入裝有液體聚N-異丙基丙烯酰胺的小瓶中，將聚N-異丙基丙烯酰胺吸入吸液管中；
[0078]2)交聯(lián):將裝載有液體聚N-異丙基丙烯酰胺的吸液管浸入裝有33°C的磷酸鹽緩沖液的小瓶中，使聚N-異丙基丙烯酰胺發(fā)生細(xì)微形變，利于后續(xù)擠出步驟；
[0079]3)擠出:將交聯(lián)后的聚N-異丙基丙烯酰胺柱擠出在一個(gè)培養(yǎng)皿中；
[0080]4)當(dāng)需要細(xì)胞打印時(shí)，將成熟的細(xì)胞柱吸入微量吸液管，裝在打印頭B上，打印方法同聚N-異丙基丙烯酰胺；
[0081]5)打印完成后，經(jīng)過2-4天的融合過程，通過改變溫度去除聚N-異丙基丙烯酰胺，獲得血管結(jié)構(gòu)；
[0082]內(nèi)皮細(xì)胞灌注:
[0083]I)利用動(dòng)脈鞘插入，從患有脈管疾病的病患中獲取50mL的外周血，借助流式細(xì)胞儀，從外周血中提取分離晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞；
[0084]2)將分離出的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞注入之前獲得的血管內(nèi)腔，細(xì)胞濃度為5x10s個(gè)/mL，37°C下 1rph 旋轉(zhuǎn) 30min ；
[0085]3)對(duì)上一步得到的血管在生物反應(yīng)器進(jìn)行為期7天的體外培養(yǎng):施以6.Sdynes/cm2的壁面剪切應(yīng)力，37 °C恒溫。
[0086]本實(shí)施例得到的組織工程血管(TEBVs)內(nèi)徑1.5mm，壁厚0.25mm，平均爆破壓力3680±750mmHg，CAD EPCs 的附著率大于 85%。
[0087]實(shí)施例3
[0088]細(xì)胞處理:
[0089]I)從培養(yǎng)箱中取出裝有人新生皮膚成纖維細(xì)胞(hNDFs)的培養(yǎng)皿，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞；
[0090]2)處理后的細(xì)胞重懸于4mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于1mL的組織培養(yǎng)瓶中；
[0091]3)培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上在體積濃度為5%的CO2環(huán)境、37 °C下培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速3500rpm下離心分離；
[0092]4)利用3D打印機(jī)將細(xì)胞柱擠出在特制的、無粘著力的聚四氟乙烯或瓊脂糖基上，過夜培養(yǎng)，使細(xì)胞柱成熟；
[0093]甲基纖維素(MC)處理:
[0094]甲基纖維素(MC)的含量為12% -16%，加入PBS，構(gòu)成MC-water-salt系統(tǒng)。
[0095]選擇上述的液態(tài)甲基纖維素，當(dāng)材料吸入打印頭上的微量吸液管時(shí)，浸入32°C以上的PBS中，使得材料固化，可獲得連續(xù)擠出的條狀甲基纖維素；
[0096]3D血管打印:
[0097]3D打印機(jī)含有兩個(gè)打印頭，一個(gè)擠出條狀甲基纖維素，另一個(gè)擠出人新生皮膚成纖維細(xì)胞柱，打印前編寫打印程序，輸入電腦；
[0098]I)裝載:將附有微量吸液管的打印頭A伸入裝有液體甲基纖維素的小瓶中，將甲基纖維素吸入吸液管中；
[0099]2)交聯(lián):將裝載有液體甲基纖維素的吸液管浸入裝有32°C以上的磷酸鹽緩沖液的小瓶中，使甲基纖維素快速交聯(lián)；
[0100]3)擠出:將交聯(lián)后的甲基纖維素?cái)D出在一個(gè)培養(yǎng)皿中；
[0101]4)當(dāng)需要細(xì)胞打印時(shí)，將成熟的細(xì)胞柱吸入微量吸液管，裝在打印頭B上，打印方法同甲基纖維素；
[0102]5)打印完成后，經(jīng)過2-4天的融合過程，通過改變溫度去除甲基纖維素，獲得血管結(jié)構(gòu)；
[0103]內(nèi)皮細(xì)胞灌注:
[0104]I)利用動(dòng)脈鞘插入，從患有脈管疾病的病患中獲取50mL的外周血，借助流式細(xì)胞儀，從外周血中提取分離晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞；
[0105]2)將分離出的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞注入之前獲得的血管內(nèi)腔，細(xì)胞濃度為5x10s個(gè)/mL，37°C下 1rph 旋轉(zhuǎn) 30min ；
[0106]3)對(duì)上一步得到的血管在生物反應(yīng)器進(jìn)行為期7天的體外培養(yǎng):施以6.Sdynes/cm2的壁面剪切應(yīng)力，37 °C恒溫。
[0107]本實(shí)施例得到的組織工程血管(TEBVs)內(nèi)徑4.5mm，壁厚0.42mm，平均爆破壓力3468±525mmHg，CAD EPCs 的附著率大于 85%。
[0108]實(shí)施例4
[0109]細(xì)胞處理:
[0110]I)從培養(yǎng)箱中取出裝有人新生皮膚成纖維細(xì)胞(hNDFs)的培養(yǎng)皿，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞；
[0111]2)處理后的細(xì)胞重懸于4mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于1mL的組織培養(yǎng)瓶中；
[0112]3)培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上在體積濃度為5%的CO2環(huán)境、37°C下培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速3500rpm下離心分離；
[0113]4)利用3D打印機(jī)將細(xì)胞柱擠出在特制的、無粘著力的聚四氟乙烯或瓊脂糖基上，過夜培養(yǎng)，使細(xì)胞柱成熟；
[0114]阮藻酸鈉處理:
[0115]選擇液態(tài)阮藻酸鈉，向其中摻入乙二胺四乙酸(EDTA)，將材料吸入打印頭上的微量吸液管，連續(xù)擠出條狀阮藻酸鈉；
[0116]3D血管打印:
[0117]3D打印機(jī)含有兩個(gè)打印頭，一個(gè)擠出條狀阮藻酸鈉，另一個(gè)擠出人新生皮膚成纖維細(xì)胞柱，打印前編寫打印程序，輸入電腦；
[0118]I)培養(yǎng)皿預(yù)處理:將質(zhì)量濃度為2% wt明膠煮沸，加入NaCl使其質(zhì)量濃度為0.9% wt、加入CaCl2使其摩爾質(zhì)量濃度為lOmmol/L，煮沸2分鐘后，放置冰箱中8h后，將上述混合物涂覆在裝載打印物的培養(yǎng)皿上；
[0119]2)裝載:將附有微量吸液管的打印頭A伸入裝有液體阮藻酸鈉的小瓶中，將阮藻酸鈉吸入吸液管中，其中，阮藻酸鈉中摻入了乙二胺四乙酸(EDTA)；
[0120]3)擠出:將交聯(lián)后的阮藻酸鈉擠出在一個(gè)培養(yǎng)皿中；
[0121]4)當(dāng)需要細(xì)胞打印時(shí)，將成熟的細(xì)胞柱吸入微量吸液管，裝在打印頭B上，打印方法同阮藻酸鈉；
[0122]5)打印完成后，經(jīng)過2-4天的融合過程，乙二胺四乙酸(EDTA)和Ca2+發(fā)生螯合作用，阮藻酸鈉溶解，獲得血管結(jié)構(gòu)；
[0123]內(nèi)皮細(xì)胞灌注:
[0124]I)利用動(dòng)脈鞘插入，從患有脈管疾病的病患中獲取50mL的外周血，借助流式細(xì)胞儀，從外周血中提取分離晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞；
[0125]2)將分離出的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞注入之前獲得的血管內(nèi)腔，細(xì)胞濃度為5x10s個(gè)/mL，37°C下 1rph 旋轉(zhuǎn) 30min ；
[0126]3)對(duì)上一步得到的血管在生物反應(yīng)器進(jìn)行為期7天的體外培養(yǎng):施以6.Sdynes/cm2的壁面剪切應(yīng)力，37 °C恒溫。
[0127]本實(shí)施例得到的組織工程血管(TEBVs)內(nèi)徑3.0mm,壁厚0.35mm，平均爆破壓力3020±600mmHg，CAD EPCs 的附著率大于 86%。
【權(quán)利要求】
1.一種基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:利用高分子材料和人新生皮膚成纖維細(xì)胞柱交替打印出血管形狀，經(jīng)過融合后，去除上述高分子材料，構(gòu)造出組織工程血管；向血管中灌注晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞，在生物反應(yīng)器內(nèi)經(jīng)過7天的體外動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，獲得分化的組織工程血管，所述高分子材料為普朗尼克F127、聚N-異丙基丙烯酰胺、甲基纖維素或阮藻酸鈉的一種。
2.如權(quán)利要求1所述的基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:具體步驟如下: 步驟a、細(xì)胞處理: (al)從培養(yǎng)箱中取出裝有人新生皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)皿，用磷酸鹽緩沖液清洗后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞； (a2)處理后的細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液，置于組織培養(yǎng)瓶中； (a3)培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上培養(yǎng)，使受損細(xì)胞恢復(fù)附著能力，離心把細(xì)胞分離出來；(a4)利用3D打印機(jī)將細(xì)胞柱擠出在特制的、無粘著力的聚四氟乙烯或瓊脂糖基上，過夜培養(yǎng)，使細(xì)胞柱成熟； 步驟b、高分子材料處理: 選擇液態(tài)的上述高分子材料，當(dāng)高分子材料吸入打印頭上的微量吸液管時(shí)，浸入磷酸鹽緩沖液中，使得材料固化，可獲得連續(xù)擠出的條狀高分子材料； 步驟c、3D血管打印: 3D打印機(jī)含有兩個(gè)打印頭，一個(gè)擠出條狀高分子材料，另一個(gè)擠出人新生皮膚成纖維細(xì)胞柱，打印前編寫打印程序，輸入電腦； (Cl)裝載:將附有微量吸液管的打印頭A伸入裝有液體高分子材料的小瓶中，將高分子材料吸入吸液管中； (c2)擠出:將交聯(lián)后的高分子材料擠出在一個(gè)培養(yǎng)皿中； (c3)當(dāng)需要細(xì)胞打印時(shí)，將成熟的細(xì)胞柱吸入微量吸液管，裝在打印頭B上，打印方法同高分子材料； (c4)打印完成后，經(jīng)過2-4天的融合過程，去除高分子材料，獲得血管結(jié)構(gòu)；步驟d、內(nèi)皮細(xì)胞灌注: (dl)利用動(dòng)脈鞘插入，從患有脈管疾病的病患中獲取50mL的外周血，借助流式細(xì)胞儀，從外周血中提取分離晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞； (d2)將分離出的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞注入之前獲得的血管內(nèi)腔，旋轉(zhuǎn)； (d3)對(duì)步驟(d2)得到的血管在生物反應(yīng)器進(jìn)行為期7天的體外培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求2所述的基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:步驟(a3)中，培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上在體積濃度為5%的CO2環(huán)境、37°C下培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速3500rpm下離心分離。
4.如權(quán)利要求2所述的基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:所述高分子材料為普朗尼克F127、聚N-異丙基丙烯酰胺或甲基纖維素時(shí)，在步驟(Cl)裝載的步驟后還有交聯(lián)的步驟:將裝載有液體高分子材料的吸液管浸入裝有磷酸鹽緩沖液的小瓶中，使高分子材料快速交聯(lián)。
5.如權(quán)利要求1或2所述的基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:步驟(c5)中，采用改變溫度的方式去除普朗尼克F127、聚N-異丙基丙烯酰胺或甲基纖維素。
6.如權(quán)利要求1或2所述的基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:步驟(c5)中，采用螯合的方式去除阮藻酸鈉。
7.如權(quán)利要求6所述的基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:采用離子螯合的方式去除阮藻酸鈉的步驟為:將質(zhì)量濃度為2% wt明膠煮沸，加入NaCl使其質(zhì)量濃度為0.9% wt、加入CaCl2使其摩爾質(zhì)量濃度為lOmmol/L，煮沸2分鐘后，放置冰箱中8h后，將上述混合物事先涂覆在裝載打印物的培養(yǎng)皿上；在阮藻酸鈉中摻入乙二胺四乙酸，擠出在鋪有上述混合物的培養(yǎng)皿上；乙二胺四乙酸和Ca2+發(fā)生螯合作用，阮藻酸鈉降解。
8.如權(quán)利要求2所述的基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:步驟(d2)中，細(xì)胞濃度為5x10s個(gè)/mL。
9.如權(quán)利要求2所述的基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:步驟(d2)中，旋轉(zhuǎn)的條件是:溫度37°C，轉(zhuǎn)速lOrph，旋轉(zhuǎn)30min。
10.如權(quán)利要求2所述的基于3D生物打印技術(shù)制備組織工程血管的方法，其特征在于:步驟(d3)中，體外培養(yǎng)的條件是:施以6.8dynes/cm2的壁面剪切應(yīng)力，37°C恒溫。
【文檔編號(hào)】A61F2/06GK104490489SQ201410723579
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】臧劍鋒, 袁方, 裴夢(mèng)婷, 戴祖明, 黃琦 申請(qǐng)人:淮安皓運(yùn)生物科技有限公司