專利名稱：一種生物源人工小口徑血管及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)領(lǐng)域，涉及一種人工小口徑血管的交聯(lián)制備方法。
背景技術(shù)：
心血管病和外周血管病具有很高的發(fā)病率、致殘率和致死率[I]，2003年世界衛(wèi)生組織報告，全世界每年約有1670萬人死于心血管病，占總死亡人數(shù)的1/3 [2]。初步統(tǒng)計，我國每年大約有260萬人死于心血管病，每12秒鐘，就有一人死于該病，每15秒鐘，就有一人因該病喪失工作能力。我國心血管病發(fā)病人數(shù)每年都在上升，所引起的死亡已經(jīng)占到疾病死亡人數(shù)的44%左右[3],這其中以小血管病變更為常見。治療嚴重小血管病變的常用辦法是，取自身大隱靜脈(saphenous vein)、乳房動脈(internal artery)和放射狀動脈(radial artery)移植,做搭橋(bypass)手術(shù),但約有10%的患者沒有健康可供移植的自身小血管。因此小血管病變的修復(fù)便需要人工小血管替代。而常用的人工合成材料滌綸 (Dacron)和聚四氟乙烯(ePTFE)制成的小血管，常因彈性差、不柔順、嚴重血栓、動脈瘤和感染等造成修復(fù)失敗[4，5]。小于6mm直徑的小血管僅6個月后血栓率就超過40% [6]。所以人們將修復(fù)的希望寄托于新型生物材料的應(yīng)用和組織工程構(gòu)建。我國是人口大國，隨著老齡化的增長，發(fā)病率將進一步增高，小直徑人工血管的需求將是一個很大的市場。面對需求，有必要加大研究力度，逐步促成我國在這個市場中擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品。血管由內(nèi)到外分為三層結(jié)構(gòu)內(nèi)膜層(intima)，中膜(media)和外膜(adventitia)。內(nèi)膜是一層排列緊密的內(nèi)皮細胞層構(gòu)成，內(nèi)皮細胞層通過多糖性細胞間質(zhì)與很薄的內(nèi)膜下層黏結(jié)。內(nèi)膜下層是結(jié)締組織，由多條環(huán)狀彈性蛋白帶以及膠原蛋白相互交織而成。中膜由多層平滑肌細胞和結(jié)締組織細胞組成，細胞層間是環(huán)行排列的很厚的彈性蛋白纖維和多糖基質(zhì)。外膜由結(jié)締組織細胞和神經(jīng)細胞組成。結(jié)締組織富含相互交織的膠原蛋白和彈性蛋白。血管所處的環(huán)境為內(nèi)膜與血液接觸，外膜與體液接觸。從病理生理學(xué)角度，血管內(nèi)皮損傷后，細胞外基質(zhì)或人工支架暴露于血液，引起血小板聚集，形成血栓。隨著時間的推移，血管平滑肌細胞遷移、增殖并分泌沉積大量胞外基質(zhì)，導(dǎo)致內(nèi)膜增生，使血管狹窄，進一步促進局部血栓，引起受血部位的器官如大腦、心肌和肢體末端出現(xiàn)缺血損傷癥狀。小血管修復(fù)后再狹窄，也主要是由于內(nèi)膜增生和血小板聚集二者共同作用引起[7]。理想的小口徑人工血管應(yīng)該具有以下性能[6，8，9] (1)生物相容性，包括不引起血栓，無免疫原性，抗感染；(2)具有連續(xù)、不活化的內(nèi)皮層，該內(nèi)皮層有應(yīng)激修復(fù)能力，但不會引起炎癥、鈣化、肥大性增生、纖維囊形成等，利于長久抗血栓；(3)能夠在體內(nèi)局部環(huán)境的作用下進行重塑(remodeling)，最終成為自體血管的一部分，并與自體血管沒有明顯區(qū)別；(4)具備適當(dāng)?shù)臋C械性能，包括生理環(huán)境下適當(dāng)?shù)目估鞆姸?，彈性摸量，可彎曲能力，耐血流長期剪切作用，不形成動脈瘤，尤其要能耐受極端血壓沖擊；(5)具備適當(dāng)?shù)臐B透能力，保證水分和溶解于水的物質(zhì)，甚至一些細胞可以透過；(6)具備生理活性，如血管收縮/舒張反應(yīng)，以維持正常血壓；(7)便于臨床處理和縫合。顯然，用于制備大血管的dacron和ePTFE材料不可能滿足上述要求。近年來，研究人員采用新型生物材料支架結(jié)合組織工程學(xué)的原理、方法、技術(shù)構(gòu)建組織工程小口徑人工血管(Tissue engineering blood vessel, TEBV),發(fā)展了多種構(gòu)建方法。這些方法主要分為4類(1)合成高分子支架；(2)細胞薄膜的“組織自組裝”方法；(3)水凝膠和生物聚合物支架；(4)脫細胞組織支架。這4類方法分別都取得了可喜進展[5]。 生物可降解高分子材料，如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸、聚羥基鏈烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)、聚_4_輕基丁酸酯、聚己酸內(nèi)酯-共-聚乳酸和聚乙二醇等，作為組織工程支架材料，可以很快成型為各種形狀，可以保證所需的力學(xué)強度，可以在成型后種植細胞，植入體內(nèi)后材料可被降解吸收，其降解吸收速率可依據(jù)利 于體內(nèi)重塑的要求，調(diào)整化學(xué)組成而調(diào)控。但其彈性和柔順度難以與正常血管匹配，沒有在體外構(gòu)建成熟的組織工程血管,植入體內(nèi)后支架材料的降解速度難以與細胞新形成的胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)速度相匹配,容易引起血栓等嚴重問題。高分子材料支架復(fù)合以患者自身細胞，體外構(gòu)建成熟的血管，已有一些臨床應(yīng)用成功的病例[10]。不過，這些病例植入的都是替代低血壓(20 30mmHg)肺循環(huán)的血管,其構(gòu)建時間長,不能隨時取用。Niklason等在體外加脈沖壓力動態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建，力學(xué)強度有很大提高，但植入后仍有材料引起的炎癥反應(yīng)。這類方法值得借鑒之處在于，支架復(fù)合細胞后，利用力學(xué)刺激環(huán)境提高人工血管的力學(xué)性能，促進其重塑與成熟。細胞薄膜的“組織自組裝”方法是，將血管平滑肌細胞(SMC)培養(yǎng)于培養(yǎng)皿，加抗壞血酸，促其分泌大量膠原蛋白形成薄膜，將形成的薄膜用多孔小管卷成血管結(jié)構(gòu)，再將內(nèi)表面培養(yǎng)一層內(nèi)皮細胞，再在外面包裹一層成纖維細胞薄膜，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，最后形成血管典型的3層結(jié)構(gòu)。這樣構(gòu)建的血管其力學(xué)強度可支持相當(dāng)于大隱靜脈的血壓(1680mmHg)。但其管壁中缺少彈性蛋白，柔順度雖然較ePTFE好，但比正常小血管差很多，容易引起內(nèi)膜增生性再狹窄[5]。這類方法值得借鑒之處在于，充分利用細胞本身的合成作用，以及利用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)方法促進血管結(jié)構(gòu)形成。生物聚合物或水凝膠支架由I型膠原蛋白和纖溶蛋白構(gòu)成，加上內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞即構(gòu)建成“生物人工動脈血管”(bioartificial artery, BAA)。I型膠原蛋白是人體含量最高、最常見的蛋白，也是細胞主要的天然支架材料。纖溶蛋白能夠促進組織修復(fù)。將二者復(fù)合，加上細胞并壓緊后，通過旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)可大量擴增細胞，促使纖溶蛋白形成圍繞血管壁排列結(jié)構(gòu)，并可誘導(dǎo)平滑肌細胞也圍繞血管壁緊密排列，形成更近似于正常血管中膜的結(jié)構(gòu)，提高了力學(xué)強度，同時也促進細胞更容易實現(xiàn)對血管的重塑。遺憾的是，這樣的血管也沒有彈性蛋白形成，僅靠細胞規(guī)則排列還不能實現(xiàn)較高的力學(xué)強度，僅能承受很低的血壓(約300mmHg)。目前這種血管還在做各種交聯(lián)處理和添加彈性蛋白，以提高力學(xué)強度[5]。該類方法值得借鑒之處在于充分利用細胞的天然支架材料I型膠原蛋白和彈性蛋白以及重塑促進因子纖溶蛋白。但上述方法也還存在問題，無法實現(xiàn)臨床應(yīng)用。綜合起來，目前各類TEBV構(gòu)建方法還存在以下幾大關(guān)鍵問題需要解決[5] =(I)TEBV必須具有有充足細胞來源的內(nèi)皮細胞襯里，確保其沒有血栓誘導(dǎo)因子；(2)TEBV必須具有適當(dāng)?shù)臋C械性能，包括與自體血管相匹配的彈性和拉伸強度；(3)TEBV必須具有體內(nèi)重塑的能力；(4)不能隨時供應(yīng)臨床。而要同時解決這些問題，現(xiàn)有方法還過于復(fù)雜，且周期較長種子細胞來源有限需要培養(yǎng)擴增，構(gòu)建后需要體外脈動培養(yǎng)。
脫細胞組織完全由天然胞外基質(zhì)組成，基質(zhì)中含有膠原蛋白、彈性蛋白和纖溶蛋白等，在機械性能方面和生物相容性方面具有極大的優(yōu)勢，可以直接植入體內(nèi)，原位由宿主細胞再細胞化。脫細胞組織來源廣泛，可以是脫細胞血管，可以是小腸黏膜下層(smallintestinal submucosa, SIS)等。一般采用去垢劑、酶、酶抑制劑和緩沖液，以及核酸酶等去除細胞而得到。如果是脫細胞血管，則可基本保持人工血管所要求的結(jié)構(gòu)和組成。然而，脫細胞過程也會帶來一些負面影響，如降低了拉伸強度、柔順度和去除了糖蛋白引起的大幅度收縮等，此外異種組織還容易引起感染和血栓，也抑制再細胞化。SIS雖然能消除一些缺陷，但血栓問題始終難以解決[5]。這些研究提示如果能夠完全脫細胞，提高脫細胞組織材料的拉伸強度，保持柔順度，保持適當(dāng)?shù)膹椥?，抑制鈣化，抑制血小板聚集以防血栓形成，那么所制成的血管將較為理想。采用交聯(lián)劑對脫細胞血管組織進行處理是改善其力學(xué)和生物學(xué)性能的有效方法。常規(guī)動物組織常用戊二醛交聯(lián)，但戊二醛具有一定的毒性，而且其交聯(lián)的組織長期植入體內(nèi)會發(fā)生鈣化[12]。原花青素(procyanidins,PC)是由2-4個兒茶素((+) catechin)和/或表兒茶素((-) epycatechin)為單體聚合而成[11]的多種聚合物的混合體。PC最初是由地中海沿岸·的海岸松(Pinus maritina)樹皮中提取而來，現(xiàn)已可從葡萄、山楂、可可和蘋果等水果中大量提取，是干紅葡萄酒的重要成分，沒有任何毒性。PC與蛋白質(zhì)脯氨酸殘基有高親和力，可結(jié)合蛋白質(zhì)分子表面0H、C00-、NH等，并形成氫鍵交聯(lián)。近年來的研究[13，14]發(fā)現(xiàn)其可用來交聯(lián)蛋白質(zhì)制備生物材料，交聯(lián)的材料不僅具有優(yōu)良的力學(xué)性能和穩(wěn)定性，還能抑制鈣化。國內(nèi)也有用PC交聯(lián)脫細胞心臟瓣膜制備人工生物瓣膜的專利(CN200510110957. 2)，但心臟瓣膜的結(jié)構(gòu)較簡單，僅有外層的內(nèi)皮細胞和內(nèi)部的間質(zhì)細胞，遠不如血管壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜。瓣膜細胞外基質(zhì)的離心面為膠原蛋白，近心面為彈性蛋白[Frederick J. Schoen,I Robert J. Levy. Tissue heart valves Current challenges and future researchperspectives. J Biomed Mater Res, 47,439-465,1999. ], 二者不相互交叉排列，也不同于血管中的膠原蛋白和彈性蛋白的排列方式。人工生物瓣膜要求高度柔順，而血管要求適當(dāng)機械性能，以使管腔不致塌陷。心臟瓣膜所處環(huán)境為上下兩面均與血液接觸，不同于血管僅內(nèi)膜與血液接觸，而外膜與體液接觸。人工生物瓣膜對體內(nèi)細胞能否黏附?jīng)]有要求，而人工血管內(nèi)膜細胞黏附實現(xiàn)再細胞化，將能進一步保證人工血管的長期抗血栓性能。本發(fā)明采用PC交聯(lián)脫細胞動物如牛、豬等的小口徑血管材料，包括頸動脈或隱靜脈脫細胞小口徑血管材料，制備性能要求不同于瓣膜的新型人工小口徑血管，用作臨床所需的小口徑血管替代品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于提供一種抗張強度高，細胞相容性好、血液相容性優(yōu)良，抗血栓、抗鈣化和低免疫原性的人工生物小口徑血管。本發(fā)明旨在采用純天然的、日常食物中存在的、無毒的并具有一定生理保護功效的、全新交聯(lián)劑，交聯(lián)脫細胞哺乳動物頸動脈和隱靜脈血管材料，或其它來源材料(如來源于豬的小口徑血管)，制備人工生物小口徑血管，以滿足臨床上病人對小口徑血管移植物的需求。本發(fā)明通過上述全新交聯(lián)劑對哺乳動物頸動脈或隱靜脈脫細胞小口徑血管的交聯(lián)而實現(xiàn)。與常規(guī)戊二醛交聯(lián)結(jié)果相比，本發(fā)明制備的小口徑血管材料不僅能降低所交聯(lián)小口徑血管的毒性，而且可保持小口徑血管的天然形態(tài)、柔軟性，提高小口徑血管的力學(xué)強度和穩(wěn)定性，有良好的血管細胞相容性、血液相容性，低免疫原性，并有較強的抗血栓性能和抑制小口徑血管鈣化的潛能。與PC交聯(lián)脫細胞心臟瓣膜相比，由于血管壁中膠原蛋白和彈性蛋白交織排列，PC有更多機會將膠原蛋白和彈性蛋白分子同時交聯(lián)，穩(wěn)定或提高血管管腔結(jié)構(gòu)，不致塌陷。本發(fā)明提供一種人工小口徑血管的制備方法，所述方法包括D-Hanks使用原花青素作為交聯(lián)劑對脫細胞的哺乳動物小口徑血管材料進行交聯(lián)處理的步驟。在一具體實施例中，所述方法包括以下步驟(I)獲得哺乳動物小口徑血管材料；(2)對所述小口徑血管材料進行脫細胞處理，獲得仍保存血管形狀的天然胞外基 質(zhì)；和(3)使用原花青素交聯(lián)所述天然胞外基質(zhì)。在一具體實施例中，所述哺乳動物小口徑血管材料來自新鮮的哺乳動物頸動脈和隱靜脈血管。在一具體實施例中，所述脫細胞處理包括(a)將清洗后的血管浸泡在D-Hanks溶液中；(b)用含有O. 20 O. 30%的胰蛋白酶的D-Hanks溶液灌流，然后浸泡在該D-Hanks溶液中，30 40°C下消化；(c)灌流4°C以下的D-Hanks溶液終止消化，清洗；(d)將步驟(C)所得血管浸入包含triton X-100、脫氧膽酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉溶液的D-Hanks混合溶液中，持續(xù)溫和搖動，以脫去血管表面和內(nèi)部的細胞；(e)將步驟(d)所得血管依次浸泡在用D-Hanks液配制的核糖核酸酶溶液和用D-Hanks液配制的脫氧核糖核酸酶溶液中，或者浸泡在含有核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的混合溶液中，以除去小口徑血管內(nèi)部細胞殘余的細胞核成分；和(f)清洗步驟(e)所得血管，從而實現(xiàn)脫細胞處理。在一具體實施例中，所述脫細胞處理前還包括用I 6°C的D-Hanks溶液清洗清除了脂肪和雜質(zhì)的血管。在一具體實施例中，所述交聯(lián)通過以每厘米血管長度I IOmL含O. I 10mg/mL原花青素的D-Hanks溶液浸泡脫細胞的哺乳動物小口徑血管材料而實現(xiàn)。在一具體實施例中，所述原花青素的濃度為2. 5 5mg/mL，以每厘米血管長度3 5mL的量使用該含花青素的D-Hanks溶液。在一具體實施例中，交聯(lián)條件為4 40°C下60 360rpm搖動交聯(lián)I 96小時。在一具體實施例中，交聯(lián)條件為30 40°C，搖動轉(zhuǎn)速為120 180rpm，交聯(lián)時間為24 72小時。在一具體實施例中，所述步驟(C)中的D-Hanks混合溶液為含有O. 3 O. 6%triton Χ-100、0· 3 O. 6%脫氧膽酸鈉和O. 01 O. 05%乙二胺四乙酸二鈉的D-Hanks溶液。在一具體實施例中，所述步驟(d)中的核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的濃度分別為 10 30 μ g/mL 和 100 300 μ g/mL。
在一具體實施例中，所述方法還包括交聯(lián)后處理，所述后處理是將交聯(lián)后的完全脫細胞的小口徑血管浸入D-Hanks溶液中I 40天。本發(fā)明包括采用本發(fā)明方法制備得到的人工小口徑血管。在一具體實施例中，本發(fā)明的人工小口徑血管含有原花青素和哺乳動物小口徑血管天然胞外基質(zhì)。在一具體實施例中，本發(fā)明的人工小口徑血管含有原花青素和哺乳動物小口徑血管脫細胞處理后的產(chǎn)物。在一具體實施例中，本發(fā)明的人工小口徑血管含有經(jīng)原花青素交聯(lián)處理的哺乳動物小口徑血管天然胞外基質(zhì)。在一具體實施例中，本發(fā)明在經(jīng)原花青素交聯(lián)處理后的人工小口徑血管中，每厘米長含有約3 15mg原花青素。 在其它實施例中，本發(fā)明在經(jīng)原花青素交聯(lián)處理后的人工小口徑血管中，每厘米長含有約3 8mg原花青素。。在一具體實施例中，所述哺乳動物小口徑血管脫細胞處理后的產(chǎn)物為所述天然胞外基質(zhì)。在一具體實施例中，所述天然胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、彈性蛋白和纖溶蛋白等組成。在一具體實施例中，所述血管還包括內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞。在一具體實施例中，所述哺乳動物選自牛、豬、羊、兔和狗。在一具體實施例中，所述哺乳動物小口徑血管選自哺乳動物的頸動脈和隱靜脈血管。本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物含有本發(fā)明的人工小口徑血管和用于保存該血管的溶液。


圖I顯示，小牛小口徑血管中的細胞成分經(jīng)脫細胞處理之后細胞已全部去除干凈，相對于正常致密的血管壁(圖1B)，脫細胞血管壁變地疏松而富有空隙(圖ID中的箭頭)，同時血管壁中也無正常壁中的細胞核物質(zhì)(圖IB中的箭頭)。圖2為本發(fā)明的小血管形態(tài)照片?？梢钥闯?，新鮮血管呈正常的圓柱狀，經(jīng)脫細胞處理后，顏色變白，變軟。經(jīng)戊二醛(GA)和本發(fā)明所使用的原花青素交聯(lián)后都稍變硬，而且隨著原花青素交聯(lián)濃度的增大，硬度有增大趨勢。血管呈不同的顏色變化戊二醛交聯(lián)后血管呈淡黃色，而PC交聯(lián)后血管呈棕紅色。原花青素在濃度為2. 5mg/mL和5mg/mL時交聯(lián)效果較好。圖3為本發(fā)明所交聯(lián)的脫細胞血管樣品力學(xué)性能的測試結(jié)果。圖3A顯示新鮮血管的最大抗拉強度為I. 84MPa，而經(jīng)脫細胞和交聯(lián)處理后最大抗拉強度顯著增大至2 5倍，而經(jīng)各個濃度原花青素交聯(lián)后的最大抗拉強度更大。圖3B顯示新鮮血管的彈性模量為
I.96MPa，而經(jīng)脫細胞和交聯(lián)處理后的彈性模量為顯著增大至IOMPa左右，而經(jīng)各個濃度原花青素交聯(lián)后的彈性模量更大。說明本發(fā)明原花青素交聯(lián)處理的脫細胞小口徑血管具有較高的力學(xué)性能。
圖4A顯示，脫細胞未交聯(lián)組(對照)膠原酶降解快速，Ih降解80%多，24h降解近98% ;而本發(fā)明原花青素交聯(lián)組降解速度慢；經(jīng)膠原酶降解4h后，各個實驗組血管降解幾乎達到最大值，與24h時間點的降解率并沒有明顯的差異。因此，選取4h時間點做更精確的降解檢測。圖4B顯示，經(jīng)膠原酶體外降解4h后，原花青素能有效的抗體外酶降解，與戍二醒的抗降解能力相當(dāng)。圖5A為本發(fā)明交聯(lián)制備的小血管中原花青素的交聯(lián)穩(wěn)定性。從中可以看出交聯(lián)血管浸泡于D-Hanks溶液中初期有小部分未交聯(lián)的原花青素釋放快速,前4天基本釋放完畢，30天之后檢測不到各個交聯(lián)濃度血管原花青素的釋放。由圖5B、5C可以看出隨著時間的延長，累積釋放量及釋放率均增大，前3d增大速度最快，之后平緩增長，最后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。從釋放率圖5C可以看出，30d后各個交聯(lián)濃度的釋放率(相當(dāng)于原始交聯(lián)溶液中的PC量)分別為24%、20%、25%、27%、27%，基本趨于穩(wěn)定一致。這些結(jié)果說明原花青素能夠穩(wěn)定地存在于被交聯(lián)的血管中，同時也說明原花青素能夠穩(wěn)定地交聯(lián)脫細胞血管材料。圖6為脫細胞血管樣品浸泡于SBF中IOd后，脫細胞未交聯(lián)組(control)及·6. 25mg/mL GA交聯(lián)組分別生長了致密的一層羥基磷灰石，說明在該位點發(fā)生了鈣化。而經(jīng)各個濃度原花青素交聯(lián)的脫細胞血管亦有零星的沉積位點，EDS顯示Ca/P均在I. 36
I.57之間，并且隨著交聯(lián)濃度的增大，沉積位點逐漸減少。該結(jié)果表明，原花青素交聯(lián)有明顯的抗鈣化作用，并且隨著濃度的增大，抗鈣化能力逐漸加強。原花青素在濃度大于5mg/mL時抗鈣化效果較理想。圖7為采用脫細胞血管支架表面種植細胞試驗來檢測交聯(lián)血管的生物相容性。圖7中可以看出，細胞接種2天后，脫細胞未交聯(lián)對照(control)組血管表面細胞生長、伸展較好，形成連續(xù)的細胞單層，細胞形態(tài)呈鵝卵石狀。GA交聯(lián)血管支架表面并沒有細胞貼附生長，可見一些細胞碎片，說明GA具有很強的細胞毒性，而不同濃度原花青素交聯(lián)的血管支架表面細胞也生長貼附良好，細胞形態(tài)良好，隨著交聯(lián)濃度的增大，形成的細胞單層不連續(xù)，而高濃度lOmg/mL交聯(lián)組血管表面貼附細胞略少。說明原花青素交聯(lián)血管支架對細胞的生長沒有明顯的毒性。圖8顯示脫去細胞的小牛小口徑血管(隱靜脈)HE染色照片。圖9A為各種交聯(lián)樣品與抗凝血孵育60min后3000rpm離心5min后的照片?？梢钥闯觯栃詫φ杖咳苎?溶血率100% )，脫細胞未交聯(lián)，GA交聯(lián)，2. 5mg/mL原花青素交聯(lián)組均沒有溶血現(xiàn)象。圖9B為根據(jù)測定的上清OD值，結(jié)果計算得出脫細胞未交聯(lián)血管(control組,η = 3)的溶血率為0. 49%，而GA和2. 5mg/mL原花青素交聯(lián)血管的溶血率均稍有下降，分別為0. 25%,0. 35%，溶血率都遠低于ISO 10993-4 :2002規(guī)定的血液相容性標準最大溶血率5 %。因此，原花青素同戊二醛相當(dāng)，無溶血現(xiàn)象。圖10A為血管內(nèi)表面血小板粘附的掃描電鏡照片，可以看出，脫細胞未交聯(lián)組(control組)表面粘附較多血小板，呈顆粒狀，但并未完全覆蓋血管表面，仍可見血管纖維結(jié)構(gòu)；6. 25mg/mL戍二醒交聯(lián)組血管表面血小板粘附致密,完全覆蓋住血管表面；而2. 5mg/mL原花青素交聯(lián)的血管表面粘附少量血小板，血管纖維狀結(jié)構(gòu)清晰可見。圖10B顯示粘附前后血小板溶液血小板計數(shù)(η = 3)定量分析結(jié)果，表明脫細胞未交聯(lián)組血小板粘附率為9. 10%，戊二醛交聯(lián)組血小板粘附率顯著增大，為21. 55%，而原花青素交聯(lián)組血小板粘附率顯著下降，為2. 94%，與脫細胞未交聯(lián)組有顯著性差異，與戊二醛交聯(lián)組有極顯著性差異?？梢?，原花青素能明顯的抑制血小板粘附，從而抑制血栓形成。圖11為本發(fā)明的原花青素交聯(lián)制備的脫細胞小口徑血管的免疫原性測試結(jié)果。人單核細胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)處理48h后可分化為巨噬細胞,經(jīng)D-Hanks洗去未貼壁巨噬細胞后，得到的細胞為巨噬細胞。巨噬細胞處理16h后通過掃描電鏡觀察細胞的貼壁狀況，巨噬細胞黏附越多則免疫原性越強。從圖IlA可以看出脫細胞未交聯(lián)血管(Control組)與2. 5mg/mL原花青素交聯(lián)血管表面都有巨噬細胞貼附，形態(tài)良好；而戊二醛交聯(lián)組細胞也有貼附，但細胞呈不規(guī)則形態(tài)，這進一步說明戊二醛具有細胞毒性。圖IlB的細胞個數(shù)統(tǒng)計可以看出，三組血管間無差異，對巨噬細胞的吸附效果基本一致，相對于Control組，原花青素交聯(lián)不會引起強免疫原性。
具體實施方式
本發(fā)明包括制備人工小口徑血管的方法，該方法包括使用原花青素作為交聯(lián)劑對脫細胞的哺乳動物小口徑血管材料進行交聯(lián)處理的步驟。在一具體實施例中，本發(fā)明的制備方法主要包括脫細胞處理和交聯(lián)處理步驟。在一具體實施例中，本發(fā)明的制備方法包括(I)獲得哺乳動物小口徑血管材料；(2)對所述小口徑血管材料進行脫細胞處理，獲得仍保存血管形狀的天然胞外基質(zhì)；和(3)使用原花青素交聯(lián)所述天然胞外基質(zhì)。本文中，小口徑血管指哺乳動物中內(nèi)徑小于等于6mm的血管。本發(fā)明主要采用哺乳動物(優(yōu)選較大型哺乳動物，例如豬、牛、兔、羊和狗等)的小口徑血管制備本發(fā)明的人工小口徑血管。優(yōu)選的，使用牛或豬的主動脈；更優(yōu)選地，使用牛或豬的頸動脈和隱靜脈。例如，可取出生48小時左右、體重50±10公斤重、新宰殺的牛頸動脈和隱靜脈血管?；蛘?，可取宰殺4小時以內(nèi)、體重90±30公斤重的豬頸動脈和隱靜脈血管。剪取的哺乳動物的小口徑血管材料，可放入I 6°C的平衡鹽緩沖液D-Hanks液中。用于本發(fā)明的D-Hanks溶液的配方如下
權(quán)利要求
1.一種人工小口徑血管，其特征在于，所述人工小口徑血管含有經(jīng)原花青素交聯(lián)處理的哺乳動物小口徑血管天然胞外基質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的人工小口徑血管，其特征在于，所述血管還包括內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞。
3.如權(quán)利要求I 2中任一項所述的人工小口徑血管，其特征在于，所述哺乳動物選自牛、豬、羊、兔和狗。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項所述的人工小口徑血管，其特征在于，所述哺乳動物小口徑血管選自哺乳動物的頸動脈和隱靜脈血管。
5.如權(quán)利要求I 4中任一項所述的人工小口徑血管，其特征在于，每厘米所述人工小口徑血管含有3 15mg原花青素。
6.如權(quán)利要求I 5中任一項所述的人工小口徑血管，其特征在于，所述人工小口徑血管的最大抗張強度在4 IlMPa的范圍之內(nèi)。
7.一種組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求I 6任一項所述的人工小口徑血管和用于保存該血管的溶液。
8.權(quán)利要求I所述的人工小口徑血管的制備方法，其特征在于，所述方法包括使用D-Hanks液溶解的原花青素作為交聯(lián)劑對脫細胞的哺乳動物小口徑血管材料進行交聯(lián)處理的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)獲得哺乳動物小口徑血管材料； (2)對所述小口徑血管材料進行脫細胞處理，獲得仍保存血管形狀的天然胞外基質(zhì)；和 (3)使用原花青素交聯(lián)所述天然胞外基質(zhì)。
10.如權(quán)利要求8 9中任一項所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物小口徑血管材料來自新鮮的哺乳動物頸動脈和隱靜脈血管。
11.如權(quán)利要求8 10中任一項所述的方法，其特征在于，所述脫細胞處理包括 (a)將清洗后的血管浸泡在D-Hanks溶液中； (b)用含有O.20 O. 30%的胰蛋白酶的D-Hanks溶液灌流，然后浸泡在該D-Hanks溶液中，30 40°C下消化； (c)灌流4°C以下的D-Hanks溶液終止消化，清洗； (d)將步驟(c)所得血管浸入包含tritonX-100、脫氧膽酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉溶液的D-Hanks混合溶液中，持續(xù)溫和搖動，以脫去血管表面和內(nèi)部的細胞； (e)將步驟(d)所得血管依次浸泡在用D-Hanks液配制的核糖核酸酶溶液和用D-Hanks液配制的脫氧核糖核酸酶溶液中，或者浸泡在含有核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的混合溶液中，以除去小口徑血管內(nèi)部細胞殘余的細胞核成分；和 (f)清洗步驟(e)所得血管，從而實現(xiàn)脫細胞處理。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述脫細胞處理前還包括用I 6°C的D-Hanks溶液清洗清除了脂肪和雜質(zhì)的血管。
13.如權(quán)利要求8 12中任一項所述的方法，其特征在于，所述交聯(lián)通過以每厘米血管長度I IOmL含O. I 10mg/mL原花青素的D-Hanks溶液浸泡脫細胞的哺乳動物小口徑血管材料而實現(xiàn)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述原花青素的濃度為2.5 5mg/mL，以每厘米血管長度3 5mL的量使用該含花青素的D-Hanks溶液。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，交聯(lián)條件為4 40°C下60 360rpm搖動交聯(lián)I 96小時。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，交聯(lián)條件為30 40°C，搖動轉(zhuǎn)速為120 180rpm，交聯(lián)時間為24 72小時。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)中的D-Hanks混合溶液為含有O. 3 O. 6% triton X-100,0. 3 (λ 6%脫氧膽酸鈉和O. 01 O. 05%乙二胺四乙酸二鈉的D-Hanks溶液。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)中的核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的濃度分別為10 30 μ g/mL和100 300 μ g/mL。
19.如權(quán)利要求8 18中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括交聯(lián)后處理，所述后處理是將交聯(lián)后的完全脫細胞的小口徑血管浸入D-Hanks溶液中I 40天。
20.采用權(quán)利要求8 19中任一項所述方法制備得到的人工小口徑血管。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工小口徑血管及其制備方法，包括采用原花青素對血管的天然胞外基質(zhì)進行交聯(lián)的步驟。本發(fā)明的人工小口徑血管力學(xué)強度和穩(wěn)定性提高，無毒，抗體內(nèi)酶降解，抗鈣化，抗血小板黏附，免疫原性低，交聯(lián)劑和小口徑血管本身蛋白質(zhì)釋放極微。這些交聯(lián)特性使本發(fā)明的人工小口徑血管在植入體內(nèi)后，利于人體自身小口徑血管平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞的移入、增殖、覆蓋和長期抗鈣化。
文檔編號A61L27/38GK102836464SQ201110165428
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者常江, 翟萬銀, 侯永泰, 吳劍英 申請人:中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所, 上海利康瑞生物工程有限公司