本發(fā)明涉及一種齊墩果酸型皂苷脂微乳及其制備方法，同時涉及其在治療腫瘤相關疾病方面的應用，屬生物醫(yī)藥領域。
技術背景
惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的一種嚴重疾病，從天然產(chǎn)物中尋找有效的抗腫瘤藥物及其先導物是一種行之有效的方法。齊墩果酸型皂苷(苷元上含有28-羧基或13，28-內酯)是一類在植物中廣泛分布的三萜皂苷類成分，例如毛茛科白頭翁屬和銀蓮花屬、敗醬科、黃連花屬、遠志科等多種傳統(tǒng)中藥中均含有該類成分或其前體化合物。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)該類成分普遍具有抗腫瘤(參見：一種具有抗腫瘤作用的三萜皂苷類化合物，專利申請?zhí)朇N201210073605.4)以及抗炎、殺蟲等藥理活性，但口服生物利用度低、刺激性強，同時具有溶血性、難以采用常規(guī)靜脈注射劑給藥，因而成為進一步新藥研發(fā)的難點。
脂微乳(脂質乳劑)，又稱亞微乳，是指將脂溶性強的藥物溶于油中作為油相，輔以磷脂等乳化劑，經(jīng)乳化制得的粒徑在100～1000nm的微粒給藥系統(tǒng)，可靜脈注射或口服使用。梅興國等(三萜皂苷及其衍生物的脂微球制劑及其制備方法，專利申請?zhí)朇N200510117289.6)以七葉樹皂苷為活性成分，加以藥學上可接受的注射或口服用油、乳化劑、水相等制備成脂微乳制劑，可避免該藥物刺激性。金向群等(銀蓮花素A的提取方法及其脂微球制劑的制備方法，專利申請?zhí)朇N200910066605.X)以銀蓮花素A為活性成分，試制成可供靜脈注射的脂微球制劑，可避免該皂苷的溶血性。吳春福等(擬人參皂苷F11磷脂復合物及制備方法和用途，專利申請?zhí)朇N201310027916.1)試制擬人參皂苷F11的磷脂復合物及其速釋微丸，使藥物脂溶性增加，對細胞膜的通透性增加，從而提高擬人參皂苷F11的生物利用度。何軍等(一種人參皂苷Rh1自微乳組合物及其制備方法和用途，專利申請?zhí)朇N201210136790.7)公開了一種含人參皂苷Rh1的自微乳組合物，可增加藥物在胃腸道中的分散性和穩(wěn)定性，顯著提高該難溶性藥物的生物利用度，適用于制備微乳、固體膠囊等口服制劑。上述研究表明，皂苷脂微乳制劑具有降低溶血性和刺激性、提高生物利用度等優(yōu)勢。
發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸型皂苷溶血性較強，已有脂微乳的常規(guī)配方難以完全消除其溶血性。經(jīng)進一步探索研究，發(fā)現(xiàn)通過適當增大乳化劑磷脂用量，可完全消除其溶血性或刺激性，可作為靜脈注射劑或者口服制劑使用。通過優(yōu)化配方，最終成功制備出可供注射或口服使用的該類成分脂微乳制劑，從而完成了本發(fā)明。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種齊墩果酸型皂苷脂微乳制劑，及其制備方法和用途。
本發(fā)明所述齊墩果酸型皂苷為至少一種如式(I)或(II)所示的三萜皂苷類化合物：
其藥學上可接受的鹽，其水合物，或其藥物前體，特征在于其中：R任選自H、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖基中的2-4個。任選地，齊墩果酸苷元上除3位和28位外，其余位置上可有-OH、酯基等取代基修飾。
本發(fā)明所述齊墩果酸型皂苷及其前體皂苷廣泛存在于高等植物中，例如毛茛科白頭翁屬和銀蓮花屬、敗醬科、遠志科、毛茛科等植物，其制備方法可參考已知文獻從植物中分離或通過合成方法進行，例如參考楊世林等《天然產(chǎn)物化學研究》(北京：科學出版社，2010)、王黎明《齊墩果酸型三糖皂苷的制備、合成及抗腫瘤構效關系研究》(蘇州大學碩士研究生論文，2013)等進行制備。
具體地，該類化合物可選自：3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃阿拉伯糖齊墩果酸，3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-[4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)]-β-D-吡喃阿拉伯糖齊墩果酸，3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齊墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷，3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齊墩果酸，3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齊墩果酸，3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-11α，12α-環(huán)氧齊墩果烷-28，13β-交酯，及其藥學上可接受的鹽。
本發(fā)明所述齊墩果酸型皂苷脂微乳制劑配方包括以下質量百分比的各組分：齊墩果酸型皂苷0.05～5％，油相5～20％，乳化劑1.0～5.0％，助乳化劑0.4～1.6％，穩(wěn)定劑0.02～0.12％，等滲劑1.0～3.0％。所述配方輔料可根據(jù)產(chǎn)品劑型選用相應藥用規(guī)格。
所述油相為常規(guī)藥用輔料，例如：大豆油、鴉膽子油、莪術油、薏苡油、芝麻油、橄欖油、玉米油、紫蘇子油、蘇合香油、魚肝油、長鏈脂肪酸甘油三酯、碳原子數(shù)為8～10的中鏈 脂肪酸甘油三酯中的任意一種或者二種以上的混合物。
所述乳化劑選用磷脂，可為卵磷脂、大豆磷脂、腦磷脂中的一種或者幾種。其中優(yōu)選蛋黃卵磷脂。所述乳化劑質量百分比不低于1.0％，優(yōu)選范圍1.5～5.0％。
所述助乳化劑可選自：硬脂酸、硬脂酸鈉、硬脂酸鉀、油酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十六烷基硫酸化蓖麻油、泊洛沙姆188、單硬脂酸甘油酯、單甘油脂肪酸酯、三甘油脂肪酸酯、聚甘油硬脂酸酯、蔗糖單月桂酸酯、脂肪酸山梨酯、阿拉伯膠、西黃芪膠、明膠、杏樹膠、氫氧化鎂、氫氧化鋁、二氧化硅、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羧丙基纖維素、海藻酸鈉、瓊脂、果膠、蜂蠟中的任意一種或者幾種。其中優(yōu)選泊洛沙姆188。
所述穩(wěn)定劑為：油酸、油酸鈉、膽甾醇、磷脂酸中的任意一種或者二種以上的混合物。其中優(yōu)選油酸。
所述等滲劑為：甘油、甘露醇、葡萄糖、木糖醇、麥芽糖、任意一種或二種以上的混合物。其中優(yōu)選甘油。
本發(fā)明所述齊墩果酸型皂苷脂微乳的制備方法包括以下步驟：
(1)油相的制備：將處方量的齊墩果酸型皂苷、乳化劑完全溶解于適量的無水乙醇中，減壓蒸餾除去乙醇，再加入長鏈脂肪酸甘油三酯和碳原子數(shù)為8～10的中鏈脂肪酸甘油三酯的混合油相；
(2)水相的制備：將處方量的助乳化劑、穩(wěn)定劑、等滲劑分散于適量水中，攪拌使溶解；
(3)初乳的制備：將油相(1)緩慢加入水相(2)中，采用高速剪切攪拌，加入適量水使達到處方量，得到初乳；
(4)脂微乳的制備：用堿調節(jié)初乳(3)pH至7.5-8.5，轉移至高壓均質機中進行均質6-12次，得到脂微乳；
(5)分裝：根據(jù)具體劑型需要，在適宜潔凈級別環(huán)境下，將脂微乳(4)分裝，高壓濕熱滅菌，制備為靜脈注射液；或者將脂微乳(4)加入凍干保護劑后均質混勻，分裝、凍干、沖氮、密封，制備成凍干粉針劑；或者將脂微乳(4)分裝，高壓濕熱滅菌，制備為口服液。
本發(fā)明在研究中發(fā)現(xiàn)，該類齊墩果酸型皂苷溶血性、刺激性較強，常規(guī)的脂微乳配方難以完全消除其溶血性等不良反應。經(jīng)進一步探索研究，意外發(fā)現(xiàn)通過適當增大乳化劑磷脂用量，可完全消除其溶血性或刺激性，因而可以作為靜脈注射劑或者口服制劑使用。通過優(yōu)化配方，最終成功制備出可供注射或口服使用的該類成分脂微乳制劑，從而完成了本發(fā)明。
體外抗腫瘤活性試驗表明，本發(fā)明所述齊墩果酸型皂苷脂微乳制劑對A549人非小細胞肺癌細胞、SMMC-7721人肝癌細胞、SGC-7901人胃腺癌細胞等3種人腫瘤細胞株有明顯的抑制作用，其作用與原料藥相近，具備抗腫瘤作用。
本發(fā)明內容是通過系統(tǒng)研究和大量創(chuàng)造性實驗完成的，以下述具體實施例進行說明。
具體實施例
本發(fā)明所述的齊墩果酸型皂苷脂微乳是按以下實施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本領域的技術人員能夠掌握和運用的技術手段。但以下實施例不得理解為任何意義上的對本領域發(fā)明權利要求的限制。
實施例1：PSH-1脂微乳注射劑的制備
以下實施例分別選用敗醬皂苷原料藥，其中PSH-1為齊墩果酸-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷，PSH-2為齊墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-O-βD-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷，PSH-3為齊墩果酸-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃阿拉伯糖苷，PSH-4為3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-11α，12α-環(huán)氧齊墩果烷-28，13β-交酯。
選用脂微乳注射劑處方為：PSH-1皂苷10mg，長鏈脂肪酸甘油三酯5.0g，碳原子數(shù)為8～10的中鏈脂肪酸甘油三酯5.0g，蛋黃卵磷脂E80 2.4g，泊洛沙姆188 0.8g，油酸0.02g，注射用甘油2.5g，加注射用水至100mL。
所述PSH-1脂微乳注射劑的制備方法包括以下步驟：
(1)油相的制備：將處方量的齊墩果酸型皂苷、注射用乳化劑蛋黃卵磷脂E80完全溶解于適量的無水乙醇中，減壓蒸餾除去乙醇，再加入長鏈脂肪酸甘油三酯和碳原子數(shù)為8～10的中鏈脂肪酸甘油三酯的混合油相，攪拌混勻。
(2)水相的制備：將注射用泊洛沙姆188、油酸、甘油分散于適量水中，攪拌使其完全溶解。
(3)初乳的制備：將(1)緩慢加入高速組織搗碎機的水相(2)中，攪拌，加入適量水使達到處方量，得到初乳。
(4)脂微乳的制備：用0.2mol·L-1的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至8.0調，轉移至高壓均質機中，在800bar壓強的條件下均質8～10次，即得脂微乳。
(5)分裝：在無菌環(huán)境下，將脂微乳(4)分裝，高壓濕熱滅菌，即得PSH-1脂微乳注射劑。
對PSH-1脂微乳注射劑進行如下制劑指標的檢測，結果均符合脂微乳注射劑規(guī)定：
(1)離心穩(wěn)定性常數(shù)(Ke)：取適量PSH-1脂微乳于離心管中，4000rpm離心15分鐘，取下層10uL于10mL的離心管中，在500nm處利用紫外分光光度計測定吸光度值，Ke＝(A0-A)/A0(其中，A0為離心前乳劑的吸光度，A為離心后乳劑的吸光度)。一般亞微乳的 Ke小于1，測定PSH-1脂微乳Ke值為0.77。
(2)粒徑及其分布：取5uL的PSH-1脂微乳，加入10mL的離心管中，用水稀釋至刻度，采用NICOMP380ZLS型粒度測定儀測定粒徑。測定PSH-1脂微乳平均粒徑為193.3nm，多分散指數(shù)PI為0.066。
(3)動電勢電位(zeta值)：動電勢電位較低，可使乳滴間有較大的斥力，有利于乳劑的穩(wěn)定。取適量PSH-1脂微乳經(jīng)適當稀釋后，采用NICOMP380ZLS型zeta電位測定zeta值。測得PSH-1脂微乳zeta值為-28.3。
(4)溶血性實驗：將制備的PSH-1脂微乳進行溶血性試驗(中國藥典二部XI L溶血與凝聚檢查法)，測定PSH-1脂微乳溶血試驗為陰性。用生理鹽水制備的PSH-1注射液對照品在0.4μg·mL-1時即發(fā)生溶血。
實施例2：PSH-1脂微乳注射劑的配方考察優(yōu)化
參考實施例1配方及其制法，對制備敗醬皂苷PSH-1脂微乳注射劑過程中油相、蛋黃卵磷脂、泊洛沙姆188、油酸等輔料用量及載藥量的配方進行考察優(yōu)化。
(1)油相用量的考察
采用長鏈脂肪酸甘油三酯和碳原子數(shù)為8～10的中鏈脂肪酸甘油三酯的混合油相(體積比為1∶1)，混合油相的總質量為處方質量的5％-20％之間進行考察，以離心穩(wěn)定性常數(shù)和粒徑為指標，結果表明：油相在5％-20％均可制備脂微乳，其中優(yōu)選比例為10％時離心穩(wěn)定性常數(shù)和粒徑較小。
(2)蛋黃卵磷脂用量考察
選用蛋黃卵磷脂作為乳化劑，研究發(fā)現(xiàn)蛋黃卵磷脂的用量和PSH-1脂微乳溶血性直接相關。首先考察藥物濃度在100μg·mL-1時蛋黃卵磷脂用量對PSH-1脂微乳的影響。結果見表。
表1 蛋黃卵磷脂用量對PSH-1脂微乳注射劑(100μg·mL-1)的影響(n＝3，)
由以上結果可知，對該乳劑，當?shù)包S卵磷脂用量在1.2g時具有溶血性，在1.5g及以上時不溶血。因此確定蛋黃卵磷脂用量范圍1.5-3.0％。
(3)泊洛沙姆188用量的考察
選用泊洛沙姆188助乳化劑，用量為處方質量的0.4％-1.6％之間進行考察，實驗結果表明該范圍內泊洛沙姆188均有助于產(chǎn)品穩(wěn)定性，優(yōu)選其用量為0.8％。
(4)油酸用量的考察
選用油酸穩(wěn)定劑，考察油酸在0.02、0.04、0.08、0.12％范圍內效果，結果表明油酸在該范圍內均有助于產(chǎn)品穩(wěn)定性，優(yōu)選其用量為0.04％。
(5)載藥量的考察
由于蛋黃磷脂用量對PSH-1脂微乳注射劑溶血性有顯著影響。因此，固定蛋黃磷脂2.5％，其他輔料采用上述優(yōu)化配方，按實施例1進行制備，考察PSH-1載藥量。結果見表2。
表2 蛋黃磷脂(2.5％)對PSH-1脂微乳注射劑載藥量的影響(n＝3，)
從表中可以看出，載藥量在150μg·mL-1及以下時，PSH-1脂微乳注射劑無溶血性，在200μg·mL-1之間時具有溶血性。實驗研究中發(fā)現(xiàn)，增大蛋黃磷脂用量，可相對增加配方中載藥量，這與該類皂苷的具體種類、原料溶血性有關，一般蛋黃磷脂均需大于1.5％；對于脂微乳注射劑，蛋黃磷脂以小于5％為宜。
實施例3：PSH-1脂微乳注射劑(凍干)的制備
參照實施例1配方和工藝制備PSH-1脂微乳(4)，再加入適量的凍干保護劑后均質混勻，分裝、凍干、沖氮、密封，即得到PSH-1脂微乳注射劑(凍干)。
凍干保護劑的考察：選用葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、甘露醇、乳糖、氯化鈉及其中任意一種或二元混合物(質量比1∶1)作為凍干保護劑，固定凍干保護劑濃度為8、10、15％進行試制，實驗結果表明二元凍干劑效果較好，進一步篩選結果見表3。結果表明，當選用適宜比例的二元凍干劑粒徑均較穩(wěn)定，容易復溶，其中甘露醇-蔗糖(10、15％)較優(yōu)。
表3 PSH-1脂微乳注射劑二元凍干保護劑的篩選
實施例4：PSH-1脂微乳(口服)的制備
PSH-1脂微乳(口服)選用相應口服級別的藥用輔料，參照實施例1配方和工藝制備PSH-1脂微乳(4)，分裝，高壓濕熱滅菌，即得PSH-1脂微乳(口服)制劑。
實施例5：其他敗醬皂苷脂微乳注射劑的制備
分別選用PSH-2、PSH-3、PSH-4原料10mg，其余參照實施例1配方和工藝制備，分別制得PSH-2、PSH-3、PSH-4脂微乳注射劑。
選用敗醬總皂苷原料30mg，其中主要含有PSH-1(54％)、PSH-2(37％)，其余參照實施例1配方和工藝制備，即得敗醬總皂苷脂微乳注射劑。
實施例7：體外抗腫瘤試驗
采用體外MTT抗腫瘤試驗，測試本發(fā)明所述實施例1和4制備的脂微乳注射劑的抗腫瘤作用，結果表明所制備的PSH-1～PSH-4脂微乳注射劑、PSH-3脂微乳注射劑、敗醬總皂苷脂微乳注射劑對A549人非小細胞肺癌細胞、SMMC-7721人肝癌細胞、SGC-7901人胃腺癌細胞等3種人腫瘤細胞株均具有體外細胞毒作用，其給藥48h的IC50值范圍在5-20μM，與相應原料藥相近。