本發(fā)明涉及琥珀酸酯(琥珀酸鹽，succinate)前藥用于治療線粒體相關(guān)病癥，特別是與呼吸鏈的復(fù)合體I相關(guān)的病癥的應(yīng)用。特別是，本發(fā)明涉及琥珀酸酯前藥用于治療乳酸性酸中毒的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：由藥物誘導(dǎo)的線粒體毒性可以是所期望的治療效果的一部分(例如由癌癥藥物誘導(dǎo)的線粒體毒性)，但在大多數(shù)情況下，由藥物誘導(dǎo)的線粒體毒性是不需要的效果。線粒體毒性可以顯著增加糖酵解以補(bǔ)償線粒體ATP形成的細(xì)胞損失(通過氧化磷酸化)。這可能導(dǎo)致增加的乳酸(乳酸鹽，lactate)血漿水平，如果過多的話，其會(huì)導(dǎo)致乳酸性酸中毒，其可能是致命的。A型乳酸性酸中毒主要與組織缺氧關(guān)聯(lián)，而B型有氧乳酸性酸中毒則與藥物、毒素或全身性疾病如肝病、糖尿病、癌癥和先天性代謝缺陷(例如線粒體基因缺陷)關(guān)聯(lián)。許多已知的藥物不利地影響線粒體呼吸(例如抗精神病藥、局部麻醉劑和抗糖尿病藥物)，因此，有必要確定或開發(fā)這樣的方式，其可以用來規(guī)避或減輕由應(yīng)用這樣的藥物所誘導(dǎo)的消極的線粒體作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療乳酸性酸中毒和線粒體相關(guān)的藥物誘導(dǎo)的副作用的琥珀酸酯前藥。特別地，琥珀酸酯前藥用于預(yù)防或治療在復(fù)合體I處或在復(fù)合體I的上游、或以其他方式表達(dá)的線粒體相關(guān)的藥物誘導(dǎo)的副作用，本發(fā)明提供了琥珀酸酯前藥，其用于預(yù)防或治療藥物誘導(dǎo)的復(fù)合體I的直接抑制或任何藥物誘導(dǎo)的效應(yīng)，其限制將NADH供應(yīng)到復(fù)合體I(如但不限于，對(duì)克雷布斯循環(huán)、糖酵解、β-氧化、丙酮酸代謝以及甚至影響葡萄糖或其他底物的運(yùn)輸或水平的藥物的影響)。通過使用在WO2014053617中描述的方法可以確認(rèn)與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用，并且iii)與在復(fù)合體I的有氧代謝上游中的缺陷、抑制或功能障礙，線粒體的缺陷、功能障礙或功能失調(diào)相關(guān)的副作用。如上所述，在用可能具有線粒體相關(guān)的副作用的藥物加以治療的患者中經(jīng)常觀測(cè)到增加的乳酸血漿水平。本發(fā)明是基于這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其表明，在有關(guān)二甲雙胍中毒的濃度下，二甲雙胍(用于2型糖尿病的一線治療并且其已與乳酸性酸中毒關(guān)聯(lián)，作為罕見的副作用)以時(shí)間和劑量依賴性方式抑制在復(fù)合體I處的人類外周血細(xì)胞的線粒體功能。隨著時(shí)間的推移，二甲雙胍進(jìn)一步引起乳酸生產(chǎn)的顯著增加(通過完整血小板)。在二甲雙胍暴露的完整血小板中，琥珀酸酯前藥的使用顯著減少乳酸生產(chǎn)。外源性施用的琥珀酸酯(底物本身)并不降低二甲雙胍誘導(dǎo)的乳酸的生產(chǎn)。在另一項(xiàng)研究中，在魚藤酮抑制的血小板中(即，其中復(fù)合體I的功能受損的一種病況)，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)觀測(cè)到乳酸的生產(chǎn)。琥珀酸酯前藥(但不是琥珀酸酯)的使用減弱了完整的人類血小板中的魚藤酮誘導(dǎo)的乳酸生產(chǎn)。在人成纖維細(xì)胞和人心臟肌肉纖維中重復(fù)呼吸計(jì)量法實(shí)驗(yàn)(Respirometricexperiments)，并且證實(shí)了在血細(xì)胞中看到的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明提供了琥珀酸酯前藥，其用于預(yù)防或治療乳酸性酸中毒。然而，因?yàn)楸疚闹袌?bào)告的結(jié)果是基于乳酸性酸中毒，其與復(fù)合體I的直接抑制相關(guān)或與在復(fù)合體I處或在復(fù)合體I的上游的缺陷關(guān)聯(lián)，所以設(shè)想了琥珀酸酯前藥適用于預(yù)防或治療在復(fù)合體I處或在復(fù)合體I的上游的線粒體相關(guān)的藥物誘導(dǎo)的副作用。琥珀酸酯前藥還會(huì)抵消擾亂在復(fù)合體I的上游的代謝的藥物效應(yīng)(復(fù)合體I的間接抑制，其會(huì)涵蓋任何藥物效應(yīng)，其限制將NADH供應(yīng)到復(fù)合體I，例如對(duì)克雷布斯循環(huán)、糖酵解、β-氧化、丙酮酸代謝以及甚至藥物的影響，其會(huì)影響葡萄糖或其他底物的水平)。設(shè)想了琥珀酸酯前藥還可以用于工業(yè)應(yīng)用，例如體外減少或抑制乳酸的形成。實(shí)例包括在細(xì)胞培養(yǎng)中、在器官保存等中的應(yīng)用。琥珀酸酯前藥設(shè)想了根據(jù)本發(fā)明可以使用任何琥珀酸酯前藥，只要它可以滲透通過細(xì)胞膜或以其他方式通過胞質(zhì)膜進(jìn)入。與術(shù)語“受保護(hù)的琥珀酸酯”同義地使用術(shù)語“琥珀酸酯前藥”。在本上下文中，琥珀酸酯前藥是琥珀酸的衍生物，在給予以后體內(nèi)或在施用以后體外，通過水解、酶促降解或以其他方式，其可以釋放琥珀酸酯(或琥珀酸)。前部分用來改變琥珀酸酯的特性：從不可滲透通過胞質(zhì)膜到可滲透通過胞質(zhì)膜，或用來產(chǎn)生以其他方式可用于線粒體的琥珀酸酯。通常，前藥的前部分被認(rèn)為是治療上惰性部分。然而，在本上下文中，前部分可以是惰性的，或它可以具有一定活性，只要它是所期望的活性或?qū)颊卟粫?huì)產(chǎn)生任何傷害的活性。特別感興趣的是根據(jù)式A的受保護(hù)的琥珀酸酯：其中R1和R2是相同或不同的并且選自式(B)并且其中藥物誘導(dǎo)的線粒體副作用是直接或間接的復(fù)合體I抑制以及其中R3選自H，或可選取代的C1-C3烷基如例如甲基、乙基、丙基或異丙基以及其中R5是–OC(＝O)Ra，其中Ra是甲基或式(C)在一個(gè)具體方面，R1和R2是相同或不同的并且選自式(II)，其中R3是H或甲基并且Ra是甲基或式(C)。受保護(hù)的琥珀酸酯用于治療或預(yù)防藥物誘導(dǎo)的線粒體相關(guān)的副作用。特別是，它們用于治療或預(yù)防直接或間接的藥物誘導(dǎo)的復(fù)合體I線粒體相關(guān)的副作用。特別是，它們用于治療或預(yù)防乳酸性酸中毒，如由藥物誘導(dǎo)的乳酸性酸中毒。本發(fā)明還涉及受保護(hù)的琥珀酸酯和可能誘導(dǎo)線粒體相關(guān)的副作用的藥物的結(jié)合，特別是通過藥物的復(fù)合體I的直接或間接的損傷所引起的副作用。這樣的組合可以用作線粒體相關(guān)的副作用的預(yù)防性預(yù)防，或在出現(xiàn)副作用的情況下，用于緩解和/或治療線粒體l相關(guān)的副作用。設(shè)想了如下所述的琥珀酸酯前藥會(huì)有效地治療或預(yù)防藥物誘導(dǎo)的副作用，特別是與復(fù)合體I的直接或間接抑制相關(guān)的副作用。在以下項(xiàng)目清單中給出根據(jù)本發(fā)明使用的化合物的實(shí)例：1.式(I)的受保護(hù)的琥珀酸酯其中R1是H、藥用鹽、可選取代的烷基或式(II)的基團(tuán)，并且R2獨(dú)立地是根據(jù)式(II)的基團(tuán)，其中式(II)是其中R3是H、可選取代的C1-C3烷基，或通過式COO(CR’R”)O的基團(tuán)與R5連接在一起以形成環(huán)，其中R’和R”獨(dú)立地是H、可選取代的C1-C3烷基，或連接在一起以形成環(huán)；R4是H；R5是OCORa、OCOORb、OCONRcRd、SO2Re、OPO(ORf)(ORg)、CONRcRd或通過式COO(CR’R”)O的基團(tuán)連接于R3以形成環(huán)，其中R’和R”獨(dú)立地是H、可選取代的C1-C3烷基，或連接在一起以形成環(huán)；其中Ra是甲基、乙基、CH(CH3)2或C(CH3)3或環(huán)烷基；Rb是甲基、乙基、CH(CH3)2或C(CH3)3或環(huán)烷基；Rc和Rd獨(dú)立地是H、甲基或乙基或連接在一起以形成環(huán)，其可以含有一個(gè)或多個(gè)另外的雜原子；Re是可選取代的烷基；并且Rf和Rg獨(dú)立地是H、甲基、乙基或連接在一起以形成環(huán)。2.根據(jù)項(xiàng)目1的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中R1是C1-C3烷基或式(II)的基團(tuán)并且R2獨(dú)立地是根據(jù)式(II)的基團(tuán)，其中式(II)是其中R3是H、C1-C3烷基，或通過式COO(CR’R”)O的基團(tuán)與R5連接在一起以形成環(huán)，其中R’和R”獨(dú)立地是可選取代的C1-C3烷基；R4是H；R5是OCORa、OCOORb、或CONRcRd其中Ra是甲基、乙基或tBu；Rb是甲基、乙基或tBu；Rc和Rd獨(dú)立地是甲基或乙基。3.根據(jù)項(xiàng)目1-2的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中R3是甲基或乙基。4.根據(jù)項(xiàng)目1-2的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中R3是H。5.根據(jù)項(xiàng)目1-2的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中R1是甲基。6.根據(jù)項(xiàng)目1-2的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中R5是可選取代的甲基或乙基酯。7.項(xiàng)目1-2的受保護(hù)的琥珀酸酯，由式IV表示其中每個(gè)R7獨(dú)立地是H、甲基或乙基并且每個(gè)R6獨(dú)立地是H或甲基。8.項(xiàng)目1-2的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中Rc和Rd是甲基或乙基。9.根據(jù)項(xiàng)目1-2的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中R’和R”獨(dú)立地是甲基或乙基。10.根據(jù)項(xiàng)目1-2的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中R3和R5通過式COO(CR’R”)O的基團(tuán)連接在一起以形成式(V)的環(huán)其中R4是H并且R’和R”獨(dú)立地是H、可選取代的C1-C3烷基，或連接在一起以形成環(huán)。11.根據(jù)式(Va)的項(xiàng)目11的受保護(hù)的琥珀酸酯12.式(XIII)的受保護(hù)的琥珀酸酯其中每個(gè)R7獨(dú)立地是H、甲基或乙基，并且R6獨(dú)立地是H或甲基，并且R8是H、甲基或根據(jù)式(XIV)的部分其中R7獨(dú)立地是H、甲基或乙基并且R6獨(dú)立地是H或甲基。13.式(XV)的受保護(hù)的二琥珀酸酯其中每個(gè)R7獨(dú)立地是H、甲基或乙基并且每個(gè)R6獨(dú)立地是H或甲基。14.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中化合物選自化合物號(hào)3、5、8、10、13、14、16、17或18。15.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的受保護(hù)的琥珀酸酯，其中化合物選自化合物號(hào)3、5、13、14、17或18。16.如在項(xiàng)目1-15中任一項(xiàng)所定義的受保護(hù)的琥珀酸酯，用于刺激線粒體能量生產(chǎn)。在以下清單A中給出另一類的琥珀酸酯類似物：1A.根據(jù)本發(fā)明的化合物由式(I)給出或其藥用鹽，其中在A和B之間的虛線鍵表示可選鍵以形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)，并且其中Z選自–CH2-CH2-或>CH(CH3)，A選自-SR、-OR和NHR，并且R是B選自-O-R’、-NHR”、-SR”’或-OH；并且R’選自以下式(II)至(IX)：R’、R”和R”’獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自以下式(IV-VIII)：R1和R3獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、O-?；-烷基、N-酰基、N-烷基、X?；H2X烷基、CH2X-酰基、F、CH2COOH、CH2CO2烷基，X選自O(shè)、NH、NR6、S，R2選自Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、C(O)CH3、C(O)CH2C(O)CH3、C(O)CH2CH(OH)CH3，p是整數(shù)并且是1或2R6選自H、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、乙?；Ⅴ；?、丙?；⒈郊柞；?、或式(II)、或式(VIII)X5選自–H、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、-COOH、-C(＝O)XR6、CONR1R3或是式X7選自R1、-NR1R3，R9選自H、Me、Et或O2CCH2CH2COXR8R10選自O(shè)?；H烷基、NH酰基、或O2CCH2CH2COX6R8X6選自O(shè)、NR8、NR6R8，其中R6和R8獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、烷基、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、乙酰基、?；?、丙?；?、苯甲?；?、或式(II)、或式(VIII)，R11和R12獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、乙?；⒈；?、苯甲?；?、-CH2X烷基、-CH2X?；?，其中X是O、NR6或S，Rc和Rd獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自CH2X烷基、CH2X?；?，其中X＝O、NR6或S，R13、R14和R15獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-?；?、N-烷基、X酰基、CH2X烷基；R13和R14或R13和R15上的取代基可以橋接以形成環(huán)體系，Rf、Rg和Rh獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自X?；?、-CH2X烷基、-CH2X-?；蚏9，烷基選自Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基，?；x自甲酰基、乙酰基、丙酰基、異丙酰基、丁?；⑹宥□；⑽祯；?、苯甲酰基，酰基和/或烷基可以是可選取代的，并且當(dāng)存在在A和B之間的虛線鍵時(shí)，根據(jù)式(I)的化合物是其中X4選自–COOH、-C(＝O)XR6、2A.根據(jù)項(xiàng)目1A的化合物，具有式(IA)或其藥用鹽，其中Z是–CH2-CH2-，A選自-SR、-OR和NHR，并且R是B選自-O-R’、-NHR”、-SR”’或-OH；并且R’、R”和R”’獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自以下式之一：R1和R3獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、Me、Et、丙基、O-Me、O-Et、O-丙基，X選自O(shè)、NH、S，p是整數(shù)并且是1，R6選自H、Me、Et，X5選自-H、Me、Et、-COOH、-C(＝O)XR6、CONR1R3X7選自R1、-NR1R3，R13、R14和R15獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、-COOH、O-?；?、O-烷基、N-?；?、N-烷基、X?；?、CH2X烷基，其中烷基和?；侨缭诒疚闹星懊嫠x的。3A.根據(jù)項(xiàng)目1A或2A的化合物，具有式(IA)或其藥用鹽，其中Z是–CH2-CH2-，A選自-SR、-OR和NHR，并且R是B選自-O-R’、-NHR”、-SR”’或-OH；并且R’、R”和R”’獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自以下式之一：R1和R3獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、Me、Et、丙基、O-Me、O-Et、O-丙基，X選自O(shè)、NH、S，p是整數(shù)并且是1，R6選自H、Me、Et，X5選自-H、Me、Et、-COOH、-C(＝O)OR6、CONR1R3，X7選自R1、-NR1R3，R13、R14和R15獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、Me、Et、-COOH。4A.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中Z是-CH2CH2-并且A是-SR。5A.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中Z是-CH2CH2-，A是-SR，并且B是OH或SR”’。6A.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中Z是-CH2CH2-，A是-SR，B是OH或SR”’，其中R”’是7A.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中Z是-CH2CH2-，A是SR并且B是OH。8A.根據(jù)項(xiàng)目1A-6A中任一項(xiàng)的化合物，其中Z是-CH2CH2-，A是SR，B是OH或SR”’，其中R”’是9A.根據(jù)項(xiàng)目1A-3A中任一項(xiàng)的化合物，其中Z是-CH2CH2-，A是NR，B是OH并且R是并且X是S。10A.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中R和/或R”’是并且p＝1以及X5是–H使得式(VII)是11A.根據(jù)項(xiàng)目1A-9A中任一項(xiàng)的化合物，其中R和/或R”’是并且p＝1以及X5是COXR6使得式(VII)是12A.根據(jù)項(xiàng)目1A-9A中任一項(xiàng)的化合物，其中R和/或R”’是并且p＝1以及X5是CONR1R3使得式(VII)是13A.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中化合物選自：其他合適的化合物見以下清單(B)1.根據(jù)式(I)的化合物或其藥用鹽，其中虛線鍵表示在A和B之間的可選鍵以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且其中Z選自–CH2-CH2-ak>CH(CH3)，A和B獨(dú)立地是不同或相同的并且選自-OR、-O-R’、-NHR”、-SR”’或–OH，A和B都不是–OH，其中R是R’選自以下式(II)、(V)或(IX)：R’、R”和R”’獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自以下式(VII-VIII)：R1和R3獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、O-?；?、O-烷基、N-?；?、N-烷基、X?；?、CH2X烷基、CH2CH2CH2OC(＝O)CH2CH2COX6R8或X選自O(shè)、NH、NR6、S，R2選自Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、C(O)CH3、C(O)CH2C(O)CH3、C(O)CH2CH(OH)CH3，p是整數(shù)并且是1或2，R6選自H、烷基、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、乙?；Ⅴ；?、丙?；?、苯甲?；⒒蚴?II)、或式(VIII)X5選自-H、-COOH、-C(＝O)XR6、CONR1R3或以下式之一R9選自H、Me、Et或O2CCH2CH2COXR8，R10選自O(shè)?；?、NH烷基、NH?；?、或O2CCH2CH2COX6R8，X6是O或NR8，并且R8選自H、烷基、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、乙?；?、酰基、丙?；?、苯甲?；?、或式(II)、或式(VIII)，R11和R12獨(dú)立地是相同或不同的并且選自H、烷基、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、乙?；Ⅴ；⒈；⒈郊柞；?、?；?CH2X烷基、-CH2X?；?，其中X選自O(shè)、NR6或S，R13、R14和R15獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、-COOH、O-?；?、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X?；H2X烷基Rc和Rd獨(dú)立地是CH2X烷基、CH2X?；?，其中X＝O、NR6或S，并且烷基是例如H、Me、Et、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基，并且?；抢缂柞；?、乙酰基、丙?；?、異丙?；?、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、苯甲?；?。Rf、Rg和Rh獨(dú)立地選自X?；?、-CH2X烷基、-CH2X-?；蚏9，烷基選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、異戊基、己基、異己基、庚基、辛基、壬基或癸基，并且?；x自甲酰基、乙?；?、丙?；?、丁?；?、戊酰基、苯甲?；?，R20和R21獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自H、低級(jí)烷基，即C1-C4烷基，或R20和R21可以一起形成C4-C7環(huán)烷基或芳族基團(tuán)，其兩者可以可選地被鹵素、羥基或低級(jí)烷基取代，或R20和R21可以是或CH2X-?；?、F、CH2COOH、CH2CO2烷基，并且當(dāng)在A和B之間存在環(huán)鍵時(shí)，上述化合物是或并且?；屯榛梢允强蛇x取代的。2B.根據(jù)項(xiàng)目1B的化合物，其中Z選自–CH2-CH2-或>CH(CH3)，A選自-O-R，其中R是B選自-O-R’、-NHR”、-SR”’或-OH，其中R’選自上述式(II)、(V)或(IX)，R’、R”和R”’獨(dú)立地是不同的或相同的并且選自上述式(VII)或(VIII)。3B.根據(jù)項(xiàng)目1B或2B的化合物，其中Z是-CH2CH2-并且A是–OR。4B.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中A是–OR，并且B選自-OR’、-NHR”、-SR”’或-OH，并且R’、R’、R”和R”’是如上文所描述的。5B.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中A選自-O-R，其中R是并且R1或R3是CH2CH2CH2OC(＝O)CH2CH2COX6R8，并且B是–OR’或-OH。6B.根據(jù)項(xiàng)目1B-4B中任一項(xiàng)的化合物，其中A是–OR，并且B是–OH或–OR’，并且其中R’選自如上述所定義的式(VII)或式(VIII)。7B.根據(jù)項(xiàng)目1B-4B中任一項(xiàng)的化合物，其中A選自-O-R，其中R是并且R1或R3是并且B是–OR’或–OH。8B.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中Z是-CH2CH2-。9B.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中Z是-CH2CH2-，A是–OR并且B是–OH。10B.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中A是–OR并且R是式(II)：11B.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中式(VII)是12B.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中在式(IX)中的Rf、Rg、Rh的至少一種是–H或烷基，其中烷基是如本文所定義。13B.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的化合物，其中A是–OR并且R1或R3是或者R1或R3是CH2CH2CH2OC(＝O)CH2CH2COX6R8。定義冠詞“一”和“一個(gè)“在本文中用來指一個(gè)或一個(gè)以上的(即至少一個(gè))物品的語法對(duì)象。以舉例的方式，“類似物”是指一個(gè)類似物或一個(gè)以上的類似物。術(shù)語“琥珀酸酯前藥”在本文中用來指這樣的物質(zhì)，其i)可以釋放琥珀酸或琥珀酸酯，例如通過水解或酶促降解，或ii)可以被轉(zhuǎn)化成琥珀酸酯，例如通過酶。術(shù)語“受保護(hù)的琥珀酸酯”和“琥珀酸酯的前體”與術(shù)語“琥珀酸酯前藥”是同義詞。如本文所說明的，細(xì)胞可滲透的琥珀酸酯前藥是優(yōu)選的。如在本文中所使用的，術(shù)語“生物利用率”是指在給予以后在生物活性的部位藥物或其他物質(zhì)被吸收或變?yōu)榭捎玫某潭然蛩俾?。這種性能取決于許多因素，包括化合物的溶解度，在腸道中的吸收速率，蛋白結(jié)合的程度和代謝等。在本文中描述了將是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的針對(duì)生物利用率的各種測(cè)試(還見Trepanieretal,1998,Gallant-Haidneretal,2000)。如在本文中所使用的，關(guān)于呼吸鏈的復(fù)合體I使用的術(shù)語“損傷”、“抑制”、“缺陷”旨在表示，給定藥物對(duì)復(fù)合體I或?qū)υ趶?fù)合體I的上游的線粒體代謝具有負(fù)面影響，其可以涵蓋任何藥物效應(yīng)，其限制NADH供應(yīng)到復(fù)合體I，例如對(duì)克雷布斯循環(huán)、糖酵解、β-氧化、丙酮酸代謝和甚至藥物的影響，該藥物影響葡萄糖或其他復(fù)合體I相關(guān)底物的運(yùn)輸或水平)。如本文所描述的，在受試者中過量的乳酸往往是對(duì)包括復(fù)合體I的有氧呼吸的負(fù)面影響的指示。如在本文中所使用的，相對(duì)于呼吸鏈的復(fù)合體I的功能使用的術(shù)語“副作用”可以是與乳酸性酸中毒相關(guān)的副作用，或它可以是與特應(yīng)性藥物器官毒性相關(guān)的副作用，例如肝毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性、腎毒性和肌肉毒性，包括但不限于，例如眼肌麻痹、肌病、感音神經(jīng)性聽力損傷、癲癇、中風(fēng)、中風(fēng)樣事件、共濟(jì)失調(diào)、上瞼下垂、認(rèn)知障礙、意識(shí)狀態(tài)改變、神經(jīng)病性疼痛、多神經(jīng)病、神經(jīng)性胃腸道問題(胃食管反流、便秘、腸假性梗阻)、近端腎小管功能障礙、心臟傳導(dǎo)缺陷(心傳導(dǎo)阻滯)、心肌病、低血糖癥、糖異生缺陷、非酒精性肝衰竭、視神經(jīng)病變、視力喪失、糖尿病和胰腺外分泌衰竭、疲勞、呼吸問題(包括間歇性缺氧)。如在本文中所使用的，在廣義上理解相對(duì)于術(shù)語“副作用”的術(shù)語“藥物誘導(dǎo)的”。因此，它不僅包括藥物，而且包括可能導(dǎo)致乳酸的不需要的存在的其他物質(zhì)。實(shí)例是除草劑、毒蘑菇、漿果等。琥珀酸酯前藥的藥用鹽包括形成自藥用無機(jī)或有機(jī)酸或堿的常規(guī)鹽以及季銨酸加成鹽。適宜的酸式鹽的更具體的實(shí)例包括以下酸的鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、棕櫚酸、丙二酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羥萘甲酸、氫碘酸、蘋果酸、硬脂酸、單寧酸等。其他酸如草酸，雖然本身不是藥用的，在獲得本發(fā)明的化合物和它們的藥用鹽中，可以用于制備可用作中間物的鹽。適宜的堿式鹽的更具體的實(shí)例包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋁鹽、鈣鹽、鋅鹽、N,N'-二芐基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、膽堿鹽、二乙醇胺鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽和普魯卡因鹽。如在本文中所使用的，術(shù)語“烷基”是指僅由sp3碳原子組成的、用氫原子完全飽和的任何直鏈或支鏈，如例如針對(duì)直鏈烷基的–CnH2n+1，其中n可以是在1至10的范圍內(nèi)，如例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、異戊基、己基、異己基、庚基、辛基、壬基或癸基。如在本文中所使用的烷基可進(jìn)一步被取代。如在本文中所使用的，術(shù)語“環(huán)烷基”是指通式為–CnH2n-1的環(huán)狀/環(huán)結(jié)構(gòu)的碳鏈，其中n是在3-10之間，如例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基、雙環(huán)[3.2.1]辛基、螺[4,5]癸基、降蒎烷基、降冰片基、降蒈烷基、金剛烷基等。如在本文中所使用的，術(shù)語“烯烴”是指由碳和氫原子組成的直鏈或支鏈，其中通過雙鍵來連接至少兩個(gè)碳原子，如例如C2-10鏈烯基不飽和烴鏈，其具有兩個(gè)至十個(gè)碳原子和至少一個(gè)雙鍵。C2-6鏈烯基包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、異丙烯基、正丁烯基、正戊烯基、正己烯基等。在本上下文中，術(shù)語"C1-10烷氧基"是指單獨(dú)使用或組合使用的基團(tuán)-O-C-1-6烷基，其中C1-10烷基是如上述所定義。線性烷氧基的實(shí)例是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基和已氧基。分支烷氧基的實(shí)例是異丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、異戊氧基和異已氧基。環(huán)狀烷氧基的實(shí)例是環(huán)丙氧基、環(huán)丁氧基、環(huán)戊氧基和環(huán)己氧基。如在本文中所使用的，術(shù)語"C3-7雜環(huán)烷基"表示完全飽和的雜環(huán)的自由基，如在環(huán)中含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的環(huán)烴，其中上述雜原子獨(dú)立地選自氮、氧和硫。雜環(huán)的實(shí)例包括但不限于吡咯烷(1-吡咯烷、2-吡咯烷、3-吡咯烷、4-吡咯烷、5-吡咯烷)、吡唑烷(1-吡唑烷、2-吡唑烷、3-吡唑烷、4-吡唑烷、5-吡唑烷)、咪唑烷(1-咪唑烷、2-咪唑烷、3-咪唑烷、4-咪唑烷、5-咪唑烷)、噻唑烷(2-噻唑烷、3-噻唑烷、4-噻唑烷、5-噻唑烷)、哌啶(1-哌啶、2-哌啶、3-哌啶、4-哌啶、5-哌啶、6-哌啶)、哌嗪(1-哌嗪、2-哌嗪、3-哌嗪、4-哌嗪、5-哌嗪、6-哌嗪)、嗎啉(2-嗎啉、3-嗎啉、4-嗎啉、5-嗎啉、6-嗎啉)、硫代嗎啉(2-硫代嗎啉、3-硫代嗎啉、4-硫代嗎啉、5-硫代嗎啉、6-硫代嗎啉)、1,2-氧雜四氫噻吩(1,2-oxathiolane)(3-(1,2-氧雜四氫噻吩)、4-(1,2-氧雜四氫噻吩)、5-(1,2-氧雜四氫噻吩))、1,3-二氧戊環(huán)(2-(1,3-二氧戊環(huán))、3-(1,3-二氧戊環(huán))、4-(1,3-二氧戊環(huán)))、四氫吡喃(2-四氫吡喃、3-四氫吡喃、4-四氫吡喃、5-四氫吡喃、6-四氫吡喃)、六氫噠嗪(hexahydropyradizine)，(1-(六氫噠嗪)、2-(六氫噠嗪)、3-(六氫噠嗪)、4-(六氫噠嗪)、5-(六氫噠嗪)、6-(六氫噠嗪))。如在本文中所使用的，術(shù)語"C1-10烷基-C3-10環(huán)烷基"是指通過如上述所定義的具有指定數(shù)目的碳原子的烷基所連接的如上述所定義的環(huán)烷基。如在本文中所使用的，術(shù)語"C1-10烷基-C3-7雜環(huán)烷基"是指通過如上述所定義的具有指定數(shù)目的碳原子的烷基所連接的如上述所定義的雜環(huán)烷基。如在本文中所使用的，術(shù)語"芳基"旨在包括碳環(huán)芳族環(huán)體系。芳基還旨在包括以下列舉的碳環(huán)體系的部分氫化衍生物。如在本文中所使用的，術(shù)語"雜芳基"包括含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的雜環(huán)不飽和環(huán)體系，其中上述雜原子選自氮、氧和硫，如呋喃基、噻吩基、吡咯基，并且還旨在包括以下列舉的雜環(huán)體系的部分氫化衍生物。如在本文中所使用的，術(shù)語"芳基"和"雜芳基"是指這樣的芳基，其可以是可選未取代的或單、二或三取代的，或雜芳基，其可以是可選未取代的或單、二或三取代的。"芳基"和"雜芳基"的實(shí)例包括但不限于苯基、聯(lián)苯基、茚基、萘基(1-萘基、2-萘基)、N-羥基四唑基、N-羥基三唑基、N-羥基咪唑基、蒽基(1-蒽基、2-蒽基、3-蒽基)、菲基、芴基、并環(huán)戊二烯基(pentalenyl)、薁基(azulenyl)、亞聯(lián)苯基、苯硫基(1-噻吩基、2-噻吩基)、呋喃基(furyl)(1-呋喃基、2-呋喃基)、呋喃基(furanyl)、苯硫基、異噁唑基、異噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、吡喃基、噠嗪基、吡嗪基、1,2,3-三嗪基、1,2,4-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、四唑基、噻二嗪基、吲哚基、異吲哚基、苯并呋喃基、苯并苯硫基(硫雜茚基)、吲哚基、噁二唑基、異噁唑基、喹唑啉基、芴基、呫噸基、異茚滿基、二苯甲基、吖啶基、苯并異惡唑基、嘌呤基、喹唑啉基、喹嗪基、喹啉基、異喹啉基、喹喔啉基、二氮雜萘基、蝶啶基、氮雜基、二氮雜基、吡咯基(2-吡咯基)、吡唑基(3-吡唑基)、5-噻吩-2-基-2H-吡唑-3-基、咪唑基(1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基)、三唑基(1,2,3-三唑-1-基、1,2,3-三唑-2-基、1,2,3-三唑-4-基、1,2,4-三唑-3-基)、噁唑基(2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、噻唑基(2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、吡啶基(2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、嘧啶基(2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基)、吡嗪基、噠嗪基(3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基)、異喹啉基(1-異喹啉基、3-異喹啉基、4-異喹啉基、5-異喹啉基、6-異喹啉基、7-異喹啉基、8-異喹啉基)、喹啉基(2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、苯并[b]呋喃基(2-苯并[b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、2,3-二氫-苯并[b]呋喃基(2-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、3-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、4-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、5-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、6-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基)、7-(2,3-二氫-苯并[b]呋喃基))、苯并[b]苯硫基(2-苯并[b]苯硫基、3-苯并[b]苯硫基、4-苯并[b]苯硫基、5-苯并[b]苯硫基、6-苯并[b]苯硫基、7-苯并[b]苯硫基)、2,3-二氫-苯并[b]苯硫基(2-(2,3-二氫-苯并[b]苯硫基)、3-(2,3-二氫-苯并[b]苯硫基)、4-(2,3-二氫-苯并[b]苯硫基)、5-(2,3-二氫-苯并[b]苯硫基)、6-(2,3-二氫-苯并[b]苯硫基)、7-(2,3-二氫-苯并[b]苯硫基))、吲哚基(1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、吲唑基(1-吲唑基、2-吲唑基、3-吲唑基、4-吲唑基、5-吲唑基、6-吲唑基、7-吲唑基)、苯并咪唑基(1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基、6-苯并咪唑基、7-苯并咪唑基、8-苯并咪唑基)、苯并噁唑基(1-苯并噁唑基、2-苯并噁唑基)、苯并噻唑基(1-苯并噻唑基、2-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、6-苯并噻唑基、7-苯并噻唑基)、咔唑基(1-咔唑基、2-咔唑基、3-咔唑基、4-咔唑基)。部分氫化的衍生物的非限制性實(shí)例是1,2,3,4-四氫萘基、1,4-二氫萘基、吡咯啉基、吡唑啉基、二氫吲哚基、噁唑烷基、噁唑啉基、氧雜吖庚因基(oxazepinyl)等。如在本文中所使用的，術(shù)語“?；笔侵隔驶CC(＝O)R，其中R基團(tuán)是任何上述定義的基團(tuán)。具體實(shí)例是甲?；?、乙?；⒈；?、丁酰基、戊酰基、苯甲?；取Ｒ韵率境鍪纠曰衔?，作為編號(hào)1-18。在本文中的清單中給出其他示例性化合物：已知引起復(fù)合體I缺陷、功能障礙或損傷和/或已知具有乳酸性酸中毒作為副作用的藥物是：鎮(zhèn)痛藥，包括對(duì)乙酰氨基酚、辣椒素抗心絞痛藥，包括胺碘酮、哌克昔林抗生素，包括利奈唑胺、曲伐沙星、慶大霉素抗癌藥物，包括醌類，包括絲裂霉素C、阿霉素抗驚厥藥物，包括丙戊酸抗糖尿病藥物，包括二甲雙胍、苯乙雙胍、丁基雙胍、曲格列酮和羅格列酮、吡格列酮抗乙型肝炎，包括非阿尿苷抗組胺藥抗帕金森病，包括托卡朋抗精神病藥：利培酮抗精神分裂癥：佐替平、氯氮平抗菌劑：季銨化合物(QAC)抗結(jié)核藥，包括異煙肼貝特類，包括氯貝特、環(huán)丙貝特、辛伐他汀催眠藥，包括丙泊酚免疫抑制疾病-改進(jìn)抗風(fēng)濕藥物(DMARD)：來氟米特局部麻醉劑，包括布比卡因、雙氯芬酸、吲哚美辛、和利多卡因肌肉松弛藥，包括丹曲林精神安定藥，包括抗精神病精神安定藥如氯丙嗪、氟非那嗪和氟哌啶醇NRTI(核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)，包括依法韋侖、替諾福韋、恩曲他濱、齊多夫定、拉米夫定、利匹韋林、阿巴卡韋、二脫氧肌苷NSAID，包括尼美舒利、甲芬那酸、舒林酸巴比妥酸已知具有乳酸性酸中毒作為副作用的其他藥物，包括β2-激動(dòng)劑、腎上腺素、茶堿。酒精和可卡因也可能導(dǎo)致乳酸性酸中毒。此外，設(shè)想了琥珀酸酯前藥還可以有效地治療或預(yù)防乳酸性酸中毒，即使它不與復(fù)合體I缺陷相關(guān)。藥物和琥珀酸酯前藥的組合本發(fā)明還涉及藥物和琥珀酸酯前藥的組合，用于治療和/或預(yù)防藥物誘導(dǎo)的副作用，其選自乳酸性酸中毒和與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用，其中i)藥物用于治療藥物所適應(yīng)的疾病，并且ii)琥珀酸酯前藥用于預(yù)防或減輕由藥物誘導(dǎo)或可誘導(dǎo)的副作用，其中副作用選自乳酸性酸中毒和與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用。這樣的藥物與任何琥珀酸酯前藥的任何組合是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，基于本文的披露內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明的要旨是琥珀酸酯前藥避免或減少本文描述的副作用的有價(jià)值性能的發(fā)現(xiàn)。因此，根據(jù)本公開內(nèi)容，連同具有或潛在具有本文描述的副作用的任何藥物一起，能夠進(jìn)入細(xì)胞以及遞送琥珀酸酯和可能的其他活性部分的琥珀酸酯前藥的潛在用途是顯而易見的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及i)包含藥物和琥珀酸酯前藥的組合物，其中藥物具有潛在的藥物誘導(dǎo)的副作用，其選自乳酸性酸中毒和與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用，ii)如在上文i)下描述的組合物，其中琥珀酸酯前藥用于預(yù)防或減輕由藥物誘導(dǎo)或可誘導(dǎo)的副作用，其中上述副作用選自乳酸性酸中毒和與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用。上述組合物可以具有兩個(gè)獨(dú)立的包的形式：第一包，含有藥物或包含藥物的組合物，以及第二包，含有琥珀酸酯前藥或包含琥珀酸酯前藥的組合物。上述組合物還可以是包含藥物和琥珀酸酯前藥的單一組合物。在組合物包含兩個(gè)獨(dú)立的包的情況下，可以通過不同的給予途徑來給予藥物和琥珀酸酯前藥(例如，藥物是通過口服給予而琥珀酸酯前藥是通過腸胃道外或粘膜給予)和/或可以基本上同時(shí)給予它們或可以在琥珀酸酯前藥以前給予藥物(反之亦然)?？梢酝ㄟ^任何常規(guī)方法來給予琥珀酸酯前藥、其組合或組合物，例如但不限于胃腸道外、口服地、局部(包括頰部、舌下或透皮)、經(jīng)由醫(yī)療裝置(例如支架)、通過吸入或通過注射(皮下或肌內(nèi))。治療可以包括單劑量或在一段時(shí)間內(nèi)的多劑量。盡管有可能單獨(dú)給予本發(fā)明的化合物，但優(yōu)選的是，作為連同一種或多種可接受的載體一起的藥物制劑，來提供它。在相容與本發(fā)明的化合物并且對(duì)其接受者沒有害處的意義上，載體必須是“可接受的”。下文更詳細(xì)地描述適宜的載體的實(shí)例?？梢砸詥挝粍┝啃问絹矸奖愕靥峁┎⑶铱梢酝ㄟ^在制藥領(lǐng)域中眾所周知的任何方法來制備組合物。這樣的方法包括以下步驟：將活性組分(琥珀酸酯前藥以及，可選的如本文所描述的藥物)和載體結(jié)合，載體構(gòu)成一種或多種輔助組分。通常，通過均勻且緊密地將活性組分和液體載體或細(xì)分的固體載體或兩者結(jié)合來制備制劑，然后，如果有必要，使產(chǎn)物成形。通常將靜脈內(nèi)、口服地或通過任何胃腸道外途徑，以包含活性組分的藥物制劑的形式，可選地以無毒的有機(jī)或無機(jī)酸、或堿、加成鹽的形式，以藥用劑型，來給予琥珀酸酯前藥、其組合或組合物。取決于待治療的病癥和患者、以及給予途徑，可以以不同的劑量來給予組合物。適用于注射用的本發(fā)明的藥物組合物包括無菌水溶液或分散體。此外，組合物可以具有無菌粉末的形式，用于上述無菌可注射溶液或分散體的臨時(shí)制備。在所有情況下，最終可注射的形式必須是無菌的并且必須是有效的流體以易于注射。藥物組合物在制造和儲(chǔ)存的條件下必須是穩(wěn)定的，因此，優(yōu)選地應(yīng)加以保存以防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)、植物油、以及它們的適宜的混合物。例如，可以口服地、頰部或舌下地，以片劑、膠囊劑、珠粒(ovules)、酏劑、溶液劑或懸浮劑的形式來給予本發(fā)明的化合物，其可以含有增香劑或著色劑，用于立即釋放、延遲釋放或控制釋放的應(yīng)用。適用于口服的本發(fā)明的化合物的溶液劑或懸浮劑還可以含有賦形劑例如N,N-二甲基乙酰胺，分散劑例如聚山梨酯80，表面活性劑以及增溶劑例如聚乙二醇、Phosal50PG(其由磷脂酰膽堿、大豆脂肪酸、乙醇、甘油單酯/甘油二酯、丙二醇和抗壞血酸棕櫚酸酯組成)。上述片劑可以含有賦形劑如微晶纖維素、乳糖(例如，乳糖一水合物或無水乳糖)、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸、丁基化羥基甲苯(E321)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、羥丙甲纖維素，崩解劑如淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、和某些復(fù)合硅酸鹽，以及造粒粘結(jié)劑如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、聚乙二醇8000、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。另外，可以包括潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉。羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸酯也可用作賦形劑。然而，此物質(zhì)并不涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，因?yàn)樗坪鮾H在高于體溫的溫度下才釋放琥珀酸酯。類似類型的固體組合物還可以用作在明膠膠囊中的填料。在這方面，優(yōu)選的賦形劑包括乳糖(lactose)、淀粉、纖維素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。對(duì)于含水混懸劑和/或酏劑，本發(fā)明的化合物可以與各種甜味劑或增香劑、著色物質(zhì)或染料組合，與乳化劑和/或懸浮劑組合以及與稀釋劑如水、乙醇、丙二醇和甘油組合、以及它們的組合?？梢酝ㄟ^壓制或模制、可選地連同一種或多種助劑來制作片劑?？梢酝ㄟ^在合適的機(jī)器中壓縮自由流動(dòng)形式如粉末或顆粒的活性組分，其可選地與以下各項(xiàng)混合來制備壓制片劑：粘合劑(例如，聚維酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如，淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑?？梢酝ㄟ^在合適的機(jī)器中模制濕潤(rùn)的粉狀化合物和惰性液體稀釋劑的混合物來制作模制片劑。片劑可以可選地進(jìn)行包覆或刻上刻痕，并且可以配制片劑以提供其中的活性組分的緩慢或受控釋放，其中利用，例如，不同比例的羥丙基甲基纖維素以提供所期望的釋放曲線。適用于口服給予的根據(jù)本發(fā)明的制劑可制成離散的單位如膠囊劑、扁囊劑或片劑，各自含有預(yù)定量的活性組分；制成粉末或顆粒；制成在水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮液；或制成水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。還可以將活性組分制成大丸劑、沖劑或糊劑。適用于在口腔中局部給予的制劑包括錠劑，其包含在增香基質(zhì)中的活性組分，上述基質(zhì)通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠；軟錠劑，其包含在惰性基質(zhì)中的活性組分，上述基質(zhì)是如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠；以及漱口劑，其包含在適宜的液體載體中的活性組分。應(yīng)當(dāng)理解的是，除上述特別提到的組分之外，考慮到所考慮的制劑的類型，本發(fā)明的制劑還可以包括在本領(lǐng)域中的其他常規(guī)試劑，例如，那些適用于口服的制劑可以包括增香劑?？梢詫⑦m用于局部給予的藥物組合物配制為軟膏劑、乳膏劑、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、浸漬敷料、噴霧劑、氣霧劑或油、透皮裝置、撲粉等。可以通過常規(guī)方法來制備含有活性劑的這些組合物。因此，它們還可以包含相容的常規(guī)載體和添加劑，如防腐劑、用來幫助藥物滲透的溶劑、在乳膏劑或軟膏劑中的軟化劑、以及用于洗劑的乙醇或油醇。這樣的載體的存在量可以為組合物的約1％，高達(dá)約98％。更通常地，它們將形成組合物的高達(dá)約80％。僅作為說明，通過混合足量的親水性材料和水來制備乳膏劑或軟膏劑，按重量計(jì)，其含有約5-10％的化合物，以足量來產(chǎn)生具有所期望的稠度的乳膏劑或軟膏劑。適用于透皮給予的藥物組合物可以呈現(xiàn)為離散貼劑，其旨在長(zhǎng)時(shí)間保持與接受者的表皮緊密接觸。例如，活性劑可以通過離子導(dǎo)入從貼劑遞送。為了應(yīng)用于外部組織，例如口腔和皮膚，優(yōu)選作為外用軟膏劑或乳膏劑來施用組合物。當(dāng)配制在軟膏劑中時(shí)，可以借助于石蠟或水可混溶的軟膏基質(zhì)來使用活性劑。可替換地，可以借助于水包油膏基或油包水基質(zhì)，將活性劑配制在乳膏劑中。對(duì)于胃腸道外給予，利用活性組分和無菌媒介物(vehicle)，例如但不限于水、醇、多元醇、甘油和植物油(其中水是優(yōu)選的)，來制備流體單位劑型。取決于使使用的賦形劑和濃度，可以將活性組分懸浮或溶解在賦形劑中。在制備溶液劑時(shí)，可以將活性組分溶解于注射用水并在填入適宜的小瓶或安瓿并密封以前加以過濾滅菌。上述組合物可以含有添加劑如粘度調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等。有利地，可以將藥劑如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑溶解于媒介物中。為了提高穩(wěn)定性，可以在填入小瓶以后冷凍組合物，然后在真空下除去水。然后將干燥的冷凍干燥粉末密封在小瓶中并且可以提供注射用水的伴隨小瓶以在使用前重構(gòu)液體。以和溶液劑基本上相同的方式來制備腸胃道外混懸劑，不同之處在于，將活性組分懸浮在媒介物中而不是加以溶解并且不可能通過過濾來完成滅菌?？梢栽趹腋≡跓o菌媒介物中以前，通過暴露于環(huán)氧乙烷來滅菌活性組分。有利地，在組合物中包括表面活性劑或潤(rùn)濕劑以促進(jìn)活性組分的均勻分布。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，將由待治療的病癥的性質(zhì)和程度，給予的形式、途徑和部位，以及待治療的特定受試者的年齡和狀況來確定本發(fā)明的化合物的單個(gè)劑量的最佳量和間隔，并且醫(yī)師將最終確定待使用的適當(dāng)劑量?？梢宰们榻?jīng)常重復(fù)此劑量。如果副作用發(fā)展，則可以改變或降低劑量的量和/或頻率(根據(jù)正常臨床實(shí)踐)。試劑盒本發(fā)明還提供了試劑盒，包括i)第一容器，它包含藥物，其具有潛在的藥物誘導(dǎo)的副作用，其選自乳酸性酸中毒和與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用，并且ii)第二容器，它包含琥珀酸酯前藥，其具有用于預(yù)防或減輕由藥物誘導(dǎo)或可誘導(dǎo)的副作用的潛力，其中上述副作用選自乳酸性酸中毒和與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用。用于治療/預(yù)防的方法本發(fā)明還涉及用于治療遭受藥物誘導(dǎo)的副作用的受試者的方法，其中上述副作用選自乳酸性酸中毒和與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用，上述方法包括將有效量的琥珀酸酯前藥給予受試者，并且涉及用于在受試者中預(yù)防或減輕藥物誘導(dǎo)的副作用的方法，其中上述副作用選自乳酸性酸中毒和與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用，其中上述受試者患有用藥物加以治療的疾病，其中上述藥物潛在地誘導(dǎo)副作用，其選自乳酸性酸中毒和與復(fù)合體I缺陷、抑制或功能障礙相關(guān)的副作用，上述方法包括在用所述藥物加以治療以前、期間或以后，將有效量的琥珀酸酯前藥給予上述受試者。針對(duì)本發(fā)明的一個(gè)方面所描述的細(xì)節(jié)及詳情(已作必要的修正)適用于本發(fā)明的所有其他方面。在下文中，通過使用藥物二甲雙胍和本文中的實(shí)施例來說明本發(fā)明。它并非意在以任何方式來限制本發(fā)明。二甲雙胍二甲雙胍是屬于雙胍類的抗糖尿病藥物。它是用于2型糖尿病的一線治療，在USA，其占約90％的糖尿病病例(Golanetal.,2012，Prottietal.,2012b)?？固悄虿」πб驯粴w因于：降低肝葡萄糖生產(chǎn)，通過在外周組織中增加的葡萄糖攝取來增加胰島素的生物效應(yīng)以及降低在腸中葡萄糖的攝取，但是尚未完全闡明作用的確切機(jī)制(Kirpichnikovetal.,2002，Golanetal.,2012)。盡管它的相對(duì)于其他抗糖尿病藥物的優(yōu)點(diǎn)，它已與乳酸性酸中毒(LA)作為副作用的罕見病例相關(guān)(Golanetal.,2012)。LA被定義為增加的陰離子間隙，高于5mM的動(dòng)脈血乳酸水平以及pH≤7.35(Lalau,2010)。雖然仍然沒有完全披露二甲雙胍相關(guān)LA的確切的發(fā)病機(jī)制，但已提出糖原異生作用的抑制和導(dǎo)致的糖原異生作用的前體的累積，如丙氨酸、丙酮酸和乳酸(Salpeteretal.,2010)。然而，其他人提出藥物干擾線粒體功能是關(guān)鍵因素：對(duì)于主要治療性、葡萄糖降低效應(yīng)(Owenetal.,2000，El-Mir,2000)以及對(duì)于二甲雙胍相關(guān)LA的發(fā)展(Prottietal.,2012b，Dykensetal.,2008，Brunmairetal.,2004)。由于線粒體抑制，細(xì)胞將部分地從有氧代謝移動(dòng)到無氧代謝，從而促進(jìn)糖酵解并導(dǎo)致升高的乳酸水平(Owenetal.,2000)。在大多數(shù)國(guó)家中，由于LA的高發(fā)生率(4病例/10000治療-年)，已經(jīng)從市場(chǎng)上撤回苯乙雙胍，另一種和二甲雙胍相同藥物類別的抗糖尿病藥。相比之下，對(duì)于二甲雙胍的LA的發(fā)生率是對(duì)于苯乙雙胍的發(fā)生率的約十分之一，因此它被認(rèn)為是比較安全的治療劑(Sogameetal.,2009，Salpeteretal.,2010)?？吹蕉纂p胍相關(guān)LA的大都是這樣的患者，其具有影響心血管系統(tǒng)、肝或腎的另外的誘因性病況。在這些病況下，藥物從身體內(nèi)的清除率會(huì)受損，如果不及時(shí)發(fā)現(xiàn)，其會(huì)導(dǎo)致二甲雙胍的不斷上升的血液濃度(Lalau,2010，Kirpichnikovetal.,2002)。因?yàn)橛捎?型糖尿病的增加的患病率(Prottietal.,2012b)使得二甲雙胍的使用預(yù)計(jì)會(huì)上升，所以對(duì)于二甲雙胍誘導(dǎo)的線粒體毒性和LA的研究成為當(dāng)前和緊迫的問題。對(duì)于二甲雙胍的線粒體毒性的研究報(bào)告了不一致的結(jié)果。Kaneetal.(2010)沒有在來自大鼠的骨骼肌中檢測(cè)由體內(nèi)二甲雙胍引起的基礎(chǔ)呼吸和最大呼吸能力的抑制并且Larsenetal.(2012)也沒有在經(jīng)二甲雙胍治療的2型糖尿病患者的肌肉活檢中檢測(cè)由體內(nèi)二甲雙胍引起的基礎(chǔ)呼吸和最大呼吸能力的抑制。相比之下，其他人已描述了在動(dòng)物組織中二甲雙胍和苯乙雙胍對(duì)線粒體的毒性效應(yīng)以及它與LA的關(guān)聯(lián)(Owenetal.,2000，Brunmairetal.,2004，Carvalhoetal.,2008，El-Mir,2000,Dykensetal.，2008,Kaneetal.,2010)。關(guān)于人類組織的數(shù)據(jù)是稀少的，特別是離體的或體內(nèi)的。關(guān)于二甲雙胍和LA的大多數(shù)人類數(shù)據(jù)是基于回顧性研究，這是由于難以獲得人類組織樣品。然而，Prottietal.(2010)報(bào)告了在患有雙胍相關(guān)的LA的患者中降低的全身耗氧量以及Prottietal.(2012b)和Larsenetal.(2012)均描述了分別在人骨骼肌和血小板中，響應(yīng)于≤10mM的二甲雙胍暴露，體外線粒體功能障礙。Prottietal.(2012b)進(jìn)一步報(bào)告了，在人類血小板中，響應(yīng)于1mM的二甲雙胍暴露，增加的乳酸釋放Prottietal.(2012b)。雖然在治療條件下并在此濃度下沒有發(fā)現(xiàn)二甲雙胍，但它已經(jīng)表明，在中毒期間在血液中接近這些水平，并且已知的是，相比于血漿，在胃腸道、腎臟、肝臟、唾液腺、肺、脾、肌肉中累積7至10倍(Grahametal.,2011，Bailey,1992，SchulzandSchmoldt,2003，Al-Abrietal.,2013，Prottietal.,2012b，Scheen,1996)。在本文報(bào)告的研究中，目的是利用高分辨率的呼吸計(jì)量法來評(píng)價(jià)在人血細(xì)胞中二甲雙胍和苯乙雙胍的線粒體毒性。包括苯乙雙胍以比較兩種類似結(jié)構(gòu)的藥物的活性以及研究在線粒體毒性和LA的發(fā)生率(在人患者中描述的)之間的關(guān)系。為了研究膜通透性和這些雙胍類藥物的毒性的具體目標(biāo)，采用了用于測(cè)試藥物毒性的模型，其中利用完整的和通透的血細(xì)胞，并順序添加呼吸復(fù)合體特異性底物和抑制劑。附圖說明圖1在通透的人類外周血單核細(xì)胞(PBMC)和血小板中，二甲雙胍對(duì)線粒體呼吸的影響。(a)通過順序添加指定的呼吸復(fù)合體特異性底物和抑制劑所評(píng)價(jià)的經(jīng)二甲雙胍治療的(1mM，黑色跡線)或經(jīng)媒介物治療的(H2O，灰色跡線)通透的PBMC的同時(shí)測(cè)得的O2消耗量的代表性跡線。跡線的穩(wěn)定期、起因于腔的再氧合和復(fù)合體IV底物給予的干擾已被省略(虛線)。在跡線下方的框示出在給定底物、復(fù)合體I(CI)、復(fù)合體II(CII)或兩者(CI+II)的氧化期間，用于呼吸的呼吸復(fù)合體，并且在方案的指示部分處的呼吸狀態(tài)。示出在三種不同的呼吸狀態(tài)和底物組合下對(duì)于PBMC(b)和血小板(c)的呼吸頻率，其相對(duì)于對(duì)照(H2O)和指示濃度的二甲雙胍:氧化磷酸化能力，其得到復(fù)合體I底物(OXPHOSCI)、在質(zhì)子載體FCCP的滴定以后通過電子傳遞體系(ETSCII)的復(fù)合體II依賴性最大流量、和復(fù)合體IV(CIV)能力的支持。數(shù)值被描述為平均值±SEM。*＝P<0.05，**＝P<0.01以及***＝P<0.001，其中利用單向ANOVA并借助于HolmSidak的多重比較方法，n＝5。OXPHOS＝氧化磷酸化。ETS＝電子傳遞體系。ROX＝剩余氧濃度。圖2在通透的人類血小板中，在得到復(fù)合體I連接底物(OXPHOSCI)的支持的氧化磷酸化期間，由二甲雙胍和苯乙雙胍對(duì)線粒體呼吸能力呈現(xiàn)的毒性的劑量反應(yīng)比較。呼吸率表示為平均值±SEM以及應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)非線性曲線擬合以獲得對(duì)于二甲雙胍和苯乙雙胍的半最大抑制濃度(IC50)值。*＝P<0.05。**＝P<0.01以及***＝P<0.001，與對(duì)照相比，其中利用單向ANOVA并借助于HolmSidak的多重比較方法，n＝5。圖3在完整的人類血小板中，二甲雙胍對(duì)線粒體呼吸的時(shí)間和劑量依賴性影響。(a)在指示濃度的二甲雙胍或媒介物(H2O)的60分鐘孵育期間，監(jiān)測(cè)血小板的常規(guī)呼吸，即，借助于它們的內(nèi)源性底物供應(yīng)和ATP需求的細(xì)胞的呼吸，其接著是(b)誘導(dǎo)的最大呼吸能力，其中通過質(zhì)子載體FCCP的滴定以確定通過完整細(xì)胞的電子傳遞體系(ETS)的最大流量。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM，n＝5。*＝P<0.05，**＝P<0.01以及***＝P<0.001，其中利用單向ANOVA(b)和雙向ANOVA(a)，并借助于Holm-Sidak的事后檢驗(yàn)。圖4在完整的人類血小板的懸浮液中二甲雙胍和苯乙雙胍對(duì)乳酸生產(chǎn)和pH的影響。在含有葡萄糖(10mM)的磷酸鹽緩沖鹽水中，連同二甲雙胍(10mM,1mM)、苯乙雙胍(0.5mM)、復(fù)合體I抑制劑魚藤酮(2μM)、或媒介物(DMSO，對(duì)照)一起，孵育血小板8小時(shí)。(a)每2小時(shí)確定乳酸水平(n＝5)，并且(b)每4小時(shí)測(cè)量pH(n＝4)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*＝P<0.05，**＝P<0.01以及***＝P<0.001，其中利用雙向ANOVA，并借助于Holm-Sidak的事后檢驗(yàn)。圖5在含有10mM葡萄糖的PBS中孵育人完整凝血細(xì)胞(200·106/ml)。(A)用琥珀酸酯或NV118(化合物3)，通過每30分鐘連續(xù)添加250μM，來處理用10mM二甲雙胍孵育的細(xì)胞。在時(shí)間0小時(shí)、在添加NV118之前，僅用二甲雙胍或媒介物來孵育細(xì)胞1小時(shí)以建立相同的初始乳酸水平(數(shù)據(jù)未示出)。每30分鐘，取樣分析乳酸濃度。(B)借助于非線性擬合回歸來計(jì)算乳酸生產(chǎn)并計(jì)算時(shí)間乳酸曲線的95％置信區(qū)間。用二甲雙胍孵育的細(xì)胞具有比對(duì)照顯著更高的乳酸生產(chǎn)，并且琥珀酸酯添加并不改變這種情況。當(dāng)將NV118加入用二甲雙胍孵育的細(xì)胞時(shí)，則顯著降低乳酸生產(chǎn)。(C)通過重復(fù)添加NV118，可以類似地減弱由魚藤酮誘導(dǎo)的乳酸生產(chǎn)。圖6在含有10mM葡萄糖的PBS中孵育人完整凝血細(xì)胞(200·106/ml)。(A)在每30分鐘連續(xù)添加250μM的情況下，用琥珀酸酯或NV189(化合物5)來處理用10mM二甲雙胍孵育的細(xì)胞。在時(shí)間0小時(shí)、在添加NV189之前，僅用二甲雙胍或媒介物來孵育細(xì)胞1小時(shí)以建立相同的初始乳酸水平(數(shù)據(jù)未示出)。每30分鐘取樣分析乳酸濃度。(B)借助于非線性擬合回歸來計(jì)算乳酸生產(chǎn)并計(jì)算時(shí)間乳酸曲線的95％置信區(qū)間。用二甲雙胍孵育的細(xì)胞具有比對(duì)照顯著更高的乳酸生產(chǎn)，并且琥珀酸酯添加并不改變這種情況。當(dāng)將NV189加入用二甲雙胍孵育的細(xì)胞時(shí)，則顯著降低乳酸生產(chǎn)。(C)通過重復(fù)添加NV189，可以類似地減弱由魚藤酮誘導(dǎo)的乳酸生產(chǎn)。當(dāng)還添加抗霉素時(shí)，通過抗霉素對(duì)復(fù)合體III的抑制效應(yīng)，消除了NV189對(duì)復(fù)合體2的影響。圖7在含有10mM葡萄糖的PBS中孵育人完整凝血細(xì)胞(200·106/ml)。(A)通過每30分鐘連續(xù)添加250μM，用琥珀酸酯或NV241(化合物15)來處理用10mM二甲雙胍孵育的細(xì)胞。在時(shí)間0小時(shí)、在添加NV241之前，僅用二甲雙胍或媒介物來孵育細(xì)胞1小時(shí)以建立相同的初始乳酸水平(數(shù)據(jù)未示出)。每30分鐘，取樣并分析乳酸濃度。(B)借助于非線性擬合回歸來計(jì)算乳酸生產(chǎn)并計(jì)算時(shí)間乳酸曲線的95％置信區(qū)間。用二甲雙胍孵育的細(xì)胞具有比對(duì)照顯著更高的乳酸生產(chǎn)，并且琥珀酸酯添加并不改變這種情況。當(dāng)將NV241加入用二甲雙胍孵育的細(xì)胞時(shí)，則顯著降低乳酸生產(chǎn)。(C)通過重復(fù)添加NV241，可以類似地減弱由魚藤酮誘導(dǎo)的乳酸生產(chǎn)。圖8在含有10mM葡萄糖的PBS中孵育凝血細(xì)胞(200·106/ml)，并且每30分鐘采樣分析乳酸濃度。(A)在3小時(shí)孵育期間，監(jiān)測(cè)用魚藤酮(2μM)或它的媒介物加以處理的細(xì)胞：隨著時(shí)間的推移，在介質(zhì)中乳酸濃度的變化。此外，監(jiān)測(cè)用魚藤酮以及NV189孵育的細(xì)胞以及用魚藤酮、NV189和復(fù)合體III抑制劑抗霉素(1μg/mL)孵育的細(xì)胞。在時(shí)間0小時(shí)、在添加NV189之前，僅用魚藤酮或媒介物來孵育細(xì)胞1小時(shí)以建立相同的初始乳酸水平(數(shù)據(jù)未示出)。魚藤酮增加細(xì)胞的乳酸生產(chǎn)，但通過用NV189的共孵育(通過每30分鐘連續(xù)添加250μM)，這被帶回正常(同樣的曲線斜率)。當(dāng)還存在抗霉素時(shí)，NV189不能對(duì)復(fù)合體II水平起作用，并且乳酸生產(chǎn)被再次增加到和僅存在魚藤酮時(shí)的相同水平。(B)通過用10mM濃度的二甲雙胍的孵育，可以誘導(dǎo)和魚藤酮一樣的乳酸生產(chǎn)的相似速率。圖9在豬急性代謝危機(jī)模型中的乳酸累積。在上述動(dòng)物模型中，通過呼吸復(fù)合體I抑制劑魚藤酮的輸注來抑制線粒體功能。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到糖酵解時(shí)，在體內(nèi)累積乳酸。針對(duì)經(jīng)魚藤酮和媒介物處理的動(dòng)物，在指定輸注速率下，顯示平均動(dòng)脈乳酸濃度。在經(jīng)魚藤酮處理的動(dòng)物中評(píng)價(jià)藥物候選物以及乳酸累積的降低的速率表明線粒體ATP生產(chǎn)的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)材料和方法除非另有說明，用于評(píng)價(jià)人PBMC和血小板的呼吸功能的方法是根據(jù)etal.(2013a，2013b)?；瘜W(xué)品和材料LymphoprepTM購買自Axis-ShieldPoCAS(Oslo,Norway)。所有其余化學(xué)品獲自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。樣品獲取和制備經(jīng)瑞典隆德大學(xué)區(qū)域倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審查委員會(huì)許可證號(hào)2013/181)來進(jìn)行上述研究。在獲得書面知情同意書以后，根據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)程序，將來自18位健康成人(11位男性和7位女性)的靜脈血抽取在K2EDTA管(BDBrandTube，具有EDTA二鉀，BD,Plymouth,UK)中。對(duì)于血小板分離，在500g和室溫(RT)下離心(Multifuge1S-RHeraeus,ThermoFisherScientifics,Waltham,USA)全血10分鐘。將富含血小板的血漿收集到15mLfalcon管，然后在4600g和RT下離心8分鐘。將得到的沉積物再懸浮在1-2mL的供者自身血漿中。利用Ficol梯度離心法(Boyum,1968)來分離PBMC。用等體積的生理鹽水來洗滌在分離血小板以后剩下的血液并在3mL的LymphoprepTM上分層。在800g和RT(室溫)下離心30分鐘以后，收集PBMC層并用生理鹽水加以洗滌。在250g和RT下離心10分鐘以后，將PBMC的沉淀物再懸浮于兩份的生理鹽水和一份的供者自身血漿。利用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(SwelabAlfa,BouleMedicalAB,Stockholm,Sweden)進(jìn)行針對(duì)PBMC和血小板的細(xì)胞計(jì)數(shù)。I.用于評(píng)價(jià)在完整細(xì)胞中的線粒體能量生產(chǎn)功能的增強(qiáng)和抑制的測(cè)定高分辨率呼吸計(jì)量法–A–一般方法在37℃的恒定溫度下，用高分辨率測(cè)氧描記器(Oxygraph-2k,OroborosInstruments,Innsbruck,Austria)來進(jìn)行線粒體呼吸的測(cè)量。在足以產(chǎn)生在介質(zhì)中≥10pmolO2s-1mL-1的氧耗量的濃度下，將分離的人類血小板、白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人心臟肌肉纖維或含有活線粒體的其他細(xì)胞類型懸浮在2mL玻璃腔(容器，chamber)中。高分辨率的呼吸計(jì)量法–B(用于乳酸研究)利用高分辨率測(cè)氧描記器(Oxygraph-2k,OroborosInstruments,Innsbruck,Austria)來進(jìn)行實(shí)時(shí)呼吸測(cè)量。在測(cè)量過程中實(shí)驗(yàn)條件如下：37℃，2mL有效腔體積和750rpm攪拌速度。將O2的腔濃度保持在200-50μM之間，并在實(shí)驗(yàn)中，視情況而定，對(duì)腔進(jìn)行再氧合(etal.,2013a)。對(duì)于數(shù)據(jù)記錄，使用DatLab軟件版本4和5(OroborosInstruments,Innsbruck,Austria)。根據(jù)制造商的說明進(jìn)行設(shè)置、日常校準(zhǔn)和儀器背景校正。如在相應(yīng)部分指出的，在含有0.5mMEGTA、3mMMgCl2、60mMK-乳糖酸鹽、20mM?；撬?、10mMKH2PO4、20mMHEPES、110mM蔗糖和1g/L牛血清白蛋白(MiR05)的緩沖液或含有葡萄糖(5mM)和EGTA(5mM)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中進(jìn)行呼吸測(cè)量。針對(duì)兩種介質(zhì)的氧溶解度系數(shù)(0.92)來校正呼吸值(PestaandGnaiger,2012)。在含有10mM葡萄糖的PBS中確定完整的人類血小板的乳酸生產(chǎn)。在200×106個(gè)細(xì)胞/mL的血小板濃度下或在5×106個(gè)細(xì)胞/mL的PBMC濃度下進(jìn)行所有測(cè)量?；衔锏纳飳W(xué)評(píng)價(jià)(不用于乳酸研究)采用了在完整細(xì)胞中的四種典型的評(píng)價(jià)方案。(1)在具有抑制的呼吸復(fù)合體I的細(xì)胞中測(cè)定線粒體能量產(chǎn)生功能的增強(qiáng)將細(xì)胞放入含有110mM蔗糖、20mMHEPES、20mM牛磺酸、60mMK-乳糖酸鹽、3mMMgCl2、10mMKH2PO4、0.5mMEGTA、1g/lBSA的緩沖液(pH7.1)中。在建立具有內(nèi)源性底物的基線呼吸以后，用2μM魚藤酮來抑制復(fù)合體I。在10μM至10mM最終濃度的范圍內(nèi)，滴定溶解在DMSO中的化合物。隨后，用毛地黃皂苷(1mg/1*106plt)來通透細(xì)胞膜以允許細(xì)胞外釋放的能量底物或細(xì)胞不可滲透的能量底物的進(jìn)入。在穩(wěn)定呼吸以后，添加10mM琥珀酸酯作為參比物以使復(fù)合體I的下游能夠呼吸。在呼吸被穩(wěn)定以后，通過添加最終濃度為1μg/mL的抗霉素來終止實(shí)驗(yàn)并測(cè)量任何剩余的非線粒體氧耗量。在描述的方案中呼吸率的增加緊密耦合于通過氧化磷酸化的ATP合成，除非細(xì)胞被解偶聯(lián)(即，質(zhì)子泄漏而沒有ATP的產(chǎn)生)。在方案3中通過添加ATP合成酶抑制劑寡霉素(1-2μgmL-1)來測(cè)試解偶聯(lián)，其中解偶聯(lián)的程度對(duì)應(yīng)于在寡霉素添加以后的呼吸頻率。(2)在完整細(xì)胞中測(cè)定線粒體能量產(chǎn)生功能的增強(qiáng)和抑制在第二方案中，使用如上所述的相同緩沖液。在建立基礎(chǔ)呼吸以后，以2nM的濃度，添加線粒體解偶聯(lián)劑FCCP以增加代謝需求。在幾個(gè)步驟中，從10μM至10mM最終濃度，滴定溶解在DMSO中的化合物以評(píng)價(jià)呼吸的增強(qiáng)和/或抑制的濃度范圍。通過添加2μM魚藤酮來終止實(shí)驗(yàn)以抑制復(fù)合體I，從而揭示在上述呼吸復(fù)合體和1μg/mL的復(fù)合體III抑制劑抗霉素的下游的剩余的底物利用，進(jìn)而測(cè)量非線粒體氧耗量。(3)測(cè)定以評(píng)價(jià)在完整細(xì)胞中的解偶聯(lián)在第三方案中，使用如上所述的相同緩沖液。在建立基礎(chǔ)呼吸以后，添加1mM的溶解在DMSO中的化合物。隨后，添加ATP合成酶抑制劑寡霉素。呼吸的減少是耦合到ATP合成的氧耗量的多少的度量。沒有減少或僅輕微的減少表明，上述化合物正誘導(dǎo)在線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子泄漏。然后滴定解偶聯(lián)劑FCCP以誘導(dǎo)最大解偶聯(lián)呼吸。然后添加魚藤酮(2μM)以抑制復(fù)合體I，從而揭示上述呼吸復(fù)合體的下游的剩余的底物利用。通過添加1μg/mL的復(fù)合體III抑制劑抗霉素來終止實(shí)驗(yàn)以測(cè)量非線粒體氧耗量。(4)在人血漿中在具有抑制的呼吸復(fù)合體I的細(xì)胞中測(cè)定線粒體能量產(chǎn)生功能的增強(qiáng)在來自相同供體的血漿中孵育完整人血細(xì)胞。在建立具有內(nèi)源性底物的基線呼吸以后，用2μM魚藤酮來抑制復(fù)合體I。在10μM至10mM最終濃度的范圍內(nèi)，滴定溶解在DMSO中的化合物。通過添加最終濃度為1μg/mL的抗霉素來終止實(shí)驗(yàn)并測(cè)量任何剩余的非線粒體氧耗量。在呼吸測(cè)定中所期望的化合物的性能在描述的方案中在完整細(xì)胞中，理想的化合物在低濃度下刺激呼吸而沒有對(duì)在方案1中在通透以后琥珀酸酯刺激的呼吸或在方案2中的內(nèi)源性呼吸具有抑制效應(yīng)。在最大刺激效應(yīng)和抑制之間的濃度范圍應(yīng)應(yīng)當(dāng)盡可能寬。在用在復(fù)合體III處或在復(fù)合體III的下游處的線粒體毒素抑制呼吸以后，呼吸應(yīng)當(dāng)被終止。請(qǐng)參照?qǐng)D1和下面的清單?；衔锏乃谕男阅?；·在低藥物濃度下達(dá)到的最大值?！大幅度(substantially)大于a′·a接近b′·c接近c(diǎn)′·d接近d′在測(cè)定中，不可透過細(xì)胞膜的化合物被確定為：·a接近a′當(dāng)如下條件時(shí)，確定由藥物候選物誘導(dǎo)的非線粒體氧耗量·d大于d′時(shí)。II.在暴露于線粒體復(fù)合體I抑制劑的細(xì)胞中測(cè)定乳酸累積的預(yù)防在含有10mM葡萄糖并含有復(fù)合體I抑制藥物二甲雙胍(10mM)、苯乙雙胍(0.5mM)或魚藤酮(2μM)的磷酸鹽緩沖鹽水中孵育完整的人類血小板、白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、或含有活線粒體的其他細(xì)胞類型8小時(shí)。通過這些化合物的氧化磷酸化所引起的線粒體ATP生產(chǎn)的抑制會(huì)增加通過糖酵解的乳酸累積。利用乳酸ProTM2血液乳酸測(cè)試儀(Arkray,AlereAB,Sweden)或類似類型的測(cè)量，每30分鐘確定乳酸水平。在37℃下進(jìn)行孵育。在開始時(shí)，在孵育的4和8小時(shí)以后(或更頻繁地)，利用標(biāo)準(zhǔn)pH計(jì)例如PHM210(Radiometer,Copenhagen,Denmark)來測(cè)量pH。從開始或在30-60分鐘以后，在10μM–5mM的濃度下，將藥物候選物加入測(cè)定。相對(duì)于僅使用化合物媒介物，通常為DMSO，的平行實(shí)驗(yàn)，來比較乳酸累積的預(yù)防。為了評(píng)價(jià)藥物候選物的特異性，還連同呼吸的下游抑制劑如復(fù)合體III抑制劑抗霉素(1μg/mL)一起進(jìn)行測(cè)試，其應(yīng)摧毀藥物候選物的效應(yīng)并恢復(fù)乳酸的生產(chǎn)。因此，抗霉素的使用還控制藥物候選物對(duì)在測(cè)定中使用的細(xì)胞的乳酸生產(chǎn)能力的不適當(dāng)?shù)挠绊?圖5、6和7)。在細(xì)胞乳酸累積測(cè)定中所期望的化合物的性能(1)理想的化合物防止由復(fù)合體I抑制所誘導(dǎo)的乳酸累積，即，乳酸累積接近和在非復(fù)合體I抑制的細(xì)胞中的乳酸累積相似的速率。(2)下游呼吸抑制劑如抗霉素摧毀對(duì)乳酸累積的預(yù)防。III.在豬的急性代謝危機(jī)模型中測(cè)定乳酸累積和能量抑制的預(yù)防將以起因于在復(fù)合體I處的線粒體功能障礙的代謝危機(jī)的概念體內(nèi)模型的證據(jù)來測(cè)試先導(dǎo)藥物候選物。上述模型模擬在具有線粒體復(fù)合體I中的基因突變的孩子或用臨床上使用的藥物如二甲雙胍(當(dāng)累積在細(xì)胞和組織中時(shí)，其抑制復(fù)合體I)加以治療和用藥過量的患者中出現(xiàn)的嚴(yán)重病癥。雌性當(dāng)?shù)仄贩N豬用于上述研究。它們被麻醉，采取手術(shù)治療，其中放置導(dǎo)管用于輸注和監(jiān)視活性。通過在3小時(shí)期間以0.25mg/kg/小時(shí)、接著在1小時(shí)期間以0.5mg/kg/小時(shí)的速率輸注線粒體復(fù)合體I抑制劑魚藤酮來誘導(dǎo)代謝危機(jī)(媒介物，由25％NMP/4％聚山梨酯80/71％水組成)。通過放置在股動(dòng)脈中的導(dǎo)管來連續(xù)測(cè)量心血管參數(shù)如動(dòng)脈血壓。通過熱稀釋法，每15分鐘測(cè)量和記錄心輸出量(CO)，并且每15分鐘記錄肺動(dòng)脈壓(PA，收縮壓和舒張壓)、中心靜脈壓(CVP)、和SvO2，以及每30分鐘，記錄來自Swan-Ganz導(dǎo)管的肺動(dòng)脈楔壓(PCWP)。例如借助于QuarkRMRICUoption(Cosmed,Rome,Italy)設(shè)備來進(jìn)行間接量熱法。在收集自股動(dòng)脈和Swan-Ganz導(dǎo)管的動(dòng)脈和靜脈血中確定血?dú)夂碗娊赓|(zhì)并借助于ABL725血?dú)夥治鰞x(RadiometerMedicalAps,Denmark)加以分析。分析包括pH、BE、血紅蛋白、HCO3、pO2、pCO2、K+、Na+、葡萄糖和乳酸(圖9)。數(shù)據(jù)分析利用GraphPadPRISM軟件(GraphPad軟件版本6.03,LaJolla,California,USA)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有呼吸、乳酸和pH數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。比率被繪制為單個(gè)值和平均值。單向ANOVA用于三個(gè)或更多組(藥物的濃度)的單因素比較以及雙向混合模型ANOVA用于三個(gè)或更多組的兩因素比較(時(shí)間和藥物的濃度/治療)。根據(jù)Holm-Sidak來進(jìn)行用來補(bǔ)償多重比較的事后檢驗(yàn)。相關(guān)性表示為r2和P值。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)非線性曲線擬合來計(jì)算半最大抑制濃度(IC50)值。對(duì)于P<0.05，結(jié)果被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著的。在代謝危機(jī)的概念體內(nèi)模型的證據(jù)中，所期望的化合物的性能在患有由復(fù)合體I抑制誘導(dǎo)的代謝危機(jī)的豬中，理想的化合物應(yīng)減少乳酸累積和pH值降低。在復(fù)合體I抑制以后的能量消耗減少應(yīng)減弱。如通過血液和血流動(dòng)力學(xué)分析所測(cè)量的，上述化合物不應(yīng)誘導(dǎo)任何明顯的負(fù)面影響。代謝組學(xué)方法通過標(biāo)準(zhǔn)方法來收集白細(xì)胞或血小板并懸浮于MiR05，一種緩沖液，其含有110mM蔗糖、20mMHEPES、20mM?；撬?、60mMK-乳糖酸鹽、3mMMgCl2、10mMKH2PO4、0.5mMEGTA、1g/lBSA，并且有或沒有5mM葡萄糖(pH7.1)。在37℃的恒定溫度下，借助于在高分辨率測(cè)氧描記器(Oxygraph-2k,OroborosInstruments,Innsbruck,Austria)中的攪拌來孵育樣品。在10分鐘以后，添加在DMSO中的魚藤酮(2μM)并持續(xù)孵育。在另外5分鐘以后，添加在DMSO中的測(cè)試化合物，可選地以后具有另外的測(cè)試化合物和另一時(shí)期的孵育。在孵育期間，實(shí)時(shí)測(cè)量O2消耗量。在孵育的最后，通過離心來收集細(xì)胞并在5％甘露醇溶液中洗滌，然后提取到甲醇中。添加含有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的水溶液，然后通過在具有過濾器的適宜的離心管中的離心來處理得到的溶液。在CE-MS分析以前，在真空下干燥得到的濾液以通過Ooga等(2011)和Ohashi等(2008)的方法來量化各種初級(jí)代謝產(chǎn)物。特別是，針對(duì)本發(fā)明的化合物的影響，評(píng)價(jià)在TCA循環(huán)和糖酵解中的代謝產(chǎn)物水平。Oogaetal,Metabolomicanatomyofananimalmodelrevealinghomeostaticimbalancesindyslipidaemia,MolecularBiosystems,2011,7,1217-1223Ohashietal,MolecularBiosystems,2008,4,135-147實(shí)施例二甲雙胍研究在二甲雙胍研究中，使用以下化合物(以及在圖中其被稱為)如在WO2014/053857中所描述的來制備化合物。在實(shí)施例1-2中報(bào)告的研究的目的在外周血單核細(xì)胞和血小板中，通過特異性線粒體復(fù)合體I抑制，二甲雙胍誘導(dǎo)乳酸生產(chǎn)二甲雙胍是廣泛使用的與乳酸性酸中毒的罕見副作用關(guān)聯(lián)的抗糖尿病藥物，已提出其與藥物誘導(dǎo)的線粒體功能障礙關(guān)聯(lián)。利用呼吸計(jì)法，在實(shí)施例1-2中報(bào)告的研究的目的是，相對(duì)于苯乙雙胍的線粒體毒性，評(píng)價(jià)二甲雙胍對(duì)人血細(xì)胞的線粒體毒性，其中上述苯乙雙胍是由于乳酸性酸中毒的高發(fā)生率在大多數(shù)國(guó)家中撤消的雙胍類似物。在實(shí)施例3中報(bào)告的研究的目的上述目的是研究琥珀酸酯前藥減輕或規(guī)避二甲雙胍和苯乙雙胍的不希望的作用的能力。實(shí)施例1A在通透的人類血小板中二甲雙胍和苯乙雙胍對(duì)線粒體呼吸的影響為了研究雙胍毒性的具體目標(biāo)，利用血細(xì)胞的毛地黃皂苷通透并在MiR05介質(zhì)中順序添加呼吸復(fù)合體特異性底物和抑制劑來實(shí)施方案。在穩(wěn)定常規(guī)呼吸，即借助于它們的內(nèi)源性底物供應(yīng)和ATP需求的細(xì)胞的呼吸以后，添加二甲雙胍、苯乙雙胍或其他媒介物(雙去離子水)。施用廣泛的濃度范圍的藥物：0.1、0.5、1、和10mM的二甲雙胍以及25、100和500μM的苯乙雙胍。在37℃下在用藥物孵育10分鐘以后，在先前確定的最優(yōu)毛地黃皂苷濃度(1μg10-6血小板)下，用毛地黃皂苷來通透血小板以誘導(dǎo)最大細(xì)胞膜通透而沒有破壞線粒體功能并允許測(cè)量最大呼吸能力(etal.(2013a)。為了評(píng)價(jià)復(fù)合體I依賴性氧化磷酸化能力(OXPHOSCI)，首先，順序添加NADH連接底物丙酮酸鹽和蘋果酸鹽(5mM)，然后是ADP(1mM)以及最后是另外的復(fù)合體I底物谷氨酸鹽(5mM)。隨后，給予FADH2連接的底物琥珀酸酯(10mM)以確定趨同的復(fù)合體I和II依賴性O(shè)XPHOS能力(OXPHOSCI+II)。通過添加ATP合成酶抑制劑寡霉素(1μgmL-1)來評(píng)價(jià)LEAKI+II狀態(tài)，這是一種呼吸狀態(tài)，其中氧耗量補(bǔ)償質(zhì)子穿過線粒體膜的回流(Gnaiger,2008)。通過用質(zhì)子載體羰基-氰化物對(duì)(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)的隨后滴定來評(píng)價(jià)由通過復(fù)合體I和II(ETSCI+II)的趨同輸入所支持的最大解偶聯(lián)呼吸電子傳遞體系能力。復(fù)合體I抑制劑魚藤酮(2μM)的加入揭示了復(fù)合體II依賴的最大解偶聯(lián)呼吸(ETSCII)。然后給予復(fù)合體III抑制劑抗霉素(1μgmL-1)以揭示殘余氧耗量(ROX)。最后，添加人工復(fù)合體IV底物N,N,N’,N’-四甲基-對(duì)苯二胺二鹽酸鹽(TMPD,0.5mM)并給予復(fù)合體IV抑制劑疊氮化鈉(10mM)以分別測(cè)量復(fù)合體Ⅳ活性和化學(xué)背景。通過從TMPD值減去疊氮化鈉值來計(jì)算復(fù)合體IV活性。除復(fù)合體IV活性之外，在穩(wěn)態(tài)下測(cè)量所有呼吸狀態(tài)并校正ROX。在ROX確定以后并且不在穩(wěn)態(tài)下來測(cè)量復(fù)合體IV活性。在OXPHOSCI+II期間，在媒介物、100mM二甲雙胍或500μM苯乙雙胍的存在下，通過添加細(xì)胞色素c(8μM)來檢查線粒體外膜的完整性。實(shí)施例1B結(jié)果在通透的人PBMC和血小板中，利用復(fù)合體I底物的呼吸被二甲雙胍劑量依賴性地抑制(圖1)。與在10mM下具有幾乎完全抑制的對(duì)照相比，OXPHOSCI能力隨著二甲雙胍的增加濃度而降低(-81.47％，P<0.001，在PBMC中，并且-92.04％，P<0.001，在血小板中)，從而導(dǎo)致對(duì)于PBMC的0.45mM的IC50以及對(duì)于血小板的1.2mM的IC50。類似于OXPHOSCI，二甲雙胍降低了利用復(fù)合體I和復(fù)合體II連接的底物，OXPHOSCI+II和ETSCI+II，的呼吸能力，如由經(jīng)媒介物處理的和經(jīng)1mM二甲雙胍處理的通透的PBMC的同時(shí)測(cè)得的氧氣消耗量的代表性跡線所說明的(圖1a)。相比之下，與對(duì)照相比，在任一細(xì)胞類型中，在二甲雙胍的存在下，ETSCII能力和復(fù)合體IV活性沒有顯著改變(圖1b、圖1c)以及LEAKI+II呼吸(其中氧耗量補(bǔ)償質(zhì)子穿過線粒體膜的回流量的呼吸狀態(tài)，傳統(tǒng)上表示在分離的線粒體中的狀態(tài)4，數(shù)據(jù)未示出)也沒有顯著改變。在分別通過洗滌和通透細(xì)胞來細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)去除藥物以后，由二甲雙胍誘導(dǎo)的復(fù)合體I的線粒體抑制似乎不是可逆的。雖然通過除去會(huì)減弱復(fù)合體I抑制的損傷的嚴(yán)重性(可能歸因于藥物較短的暴露時(shí)間)，但血小板沒有恢復(fù)與對(duì)照可比的常規(guī)和最大線粒體功能(數(shù)據(jù)未示出)。苯乙雙胍同樣抑制OXPHOSCI(圖2)、OXPHOSCI+II和ETSCI+II，但不抑制ETSCII或?qū)?fù)合體IV特異性的呼吸(數(shù)據(jù)未示出)。與二甲雙胍相比，在通透血小板中，苯乙雙胍顯示OXPHOSCI的20倍更有效的抑制(IC50分別為0.058mM和1.2mM)(圖2)。在給予細(xì)胞色素c以后，二甲雙胍和苯乙雙胍并不誘導(dǎo)增加的呼吸，因此沒有破壞線粒體外膜的完整性。在MiR05介質(zhì)中常規(guī)呼吸的穩(wěn)定以后，添加媒介物(雙去離子水)或1、10和100mM二甲雙胍。在添加ATP合成酶抑制劑寡霉素(1μgmL-1)以前，在37℃下，進(jìn)行常規(guī)呼吸60分鐘以評(píng)價(jià)LEAK呼吸。通過FCCP的滴定來達(dá)到由內(nèi)源性底物(ETS)支持的最大解偶聯(lián)呼吸電子傳遞體系能力。通過復(fù)合體I抑制劑魚藤酮(2μM)、復(fù)合體III抑制劑抗霉素(1μgmL-1)和復(fù)合體IV抑制劑疊氮化鈉(10mM)來順序阻斷呼吸以評(píng)價(jià)ROX，其用來校正所有呼吸值。在另外的實(shí)驗(yàn)中，在分離血小板和分析呼吸之前，在K2EDTA管中用不同的二甲雙胍濃度(0.1、0.5和1mM)來孵育全血18小時(shí)。結(jié)果在完整的人類血小板中，二甲雙胍以劑量和時(shí)間依賴性方式降低常規(guī)呼吸(圖3a)。當(dāng)暴露于二甲雙胍或媒介物時(shí)，血小板呈現(xiàn)常規(guī)呼吸隨著時(shí)間的推移的連續(xù)下降。在60分鐘以后，與在添加以后的第一次測(cè)量相比，在對(duì)照中常規(guī)呼吸減少–14.1％(P<0.05)，在1mM二甲雙胍下減少-17.27％(P<0.01)，在10mM二甲雙胍下減少-28.61％(P<0.001)，并且在100mM二甲雙胍下減少-81.78％(P<0.001)。與已暴露15分鐘以后的對(duì)照相比，在100mM下的二甲雙胍顯著降低常規(guī)呼吸(-39.77％，P<0.01)。在60分鐘孵育以后，10mM(-23.86％，P<0.05)和100mM(-56.86％，P<0.001)二甲雙胍顯著抑制血小板的最大解偶聯(lián)呼吸(質(zhì)子載體滴定的ETS能力)(圖3b)。二甲雙胍孵育沒有顯著改變?cè)谕暾?xì)胞中的LEAK呼吸(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)在1mM的二甲雙胍濃度下孵育全血18小時(shí)時(shí)，完整的人類血小板的常規(guī)呼吸減少30.49％(P<0.05)。實(shí)施例2二甲雙胍和苯乙雙胍對(duì)完整的人類血小板的乳酸生產(chǎn)和pH的影響用二甲雙胍(1mM,10mM)、苯乙雙胍(0.5mM)、魚藤酮(2μM)、或用于魚藤酮的媒介物(DMSO)孵育血小板8小時(shí)。利用LactateProTM2血液乳酸測(cè)試儀(Arkray,AlereAB,Sweden)(Tanneretal.,2010)每2小時(shí)(n＝5)確定乳酸水平。在37℃下并在750rpm的攪拌速度下進(jìn)行孵育，并利用PHM210標(biāo)準(zhǔn)pH計(jì)(Radiometer,Copenhagen,Denmark)在開始時(shí)、在孵育的4小時(shí)以后和8小時(shí)以后(n＝4)測(cè)量pH。結(jié)果響應(yīng)于在人類血小板中用二甲雙胍和苯乙雙胍進(jìn)行的孵育，乳酸生產(chǎn)以時(shí)間和劑量依賴性方式增加(圖4a)。與對(duì)照相比，經(jīng)8小時(shí)的處理，經(jīng)二甲雙胍(1和10mM)、苯乙雙胍(0.5mM)、和魚藤酮(2μM)處理的血小板均產(chǎn)生顯著更多的乳酸。在1mM二甲雙胍下，經(jīng)8小時(shí)，乳酸從0.30±0.1增加至3.34±0.2以及在10mM二甲雙胍下，乳酸從0.22±0.1增加至5.76±0.7mM。在兩組中，對(duì)于1mM和10mM二甲雙胍，相應(yīng)的pH值從7.4±0.01分別下降至7.16±0.03和7.00±0.04。經(jīng)苯乙雙胍處理的血小板(0.5mM)產(chǎn)生和經(jīng)10mM二甲雙胍處理的樣品類似水平的乳酸。對(duì)于所有治療組，乳酸增加的水平與pH的降低相關(guān)。在經(jīng)二甲雙胍處理的完整血小板中增加的乳酸水平還與在經(jīng)二甲雙胍處理的通透血小板中看到的降低的絕對(duì)OXPHOSCI呼吸值相關(guān)(r2＝0.60，P<0.001)。有限的一組實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，在暴露于10mM二甲雙胍以后，完整PBMC還顯示增加的乳酸釋放(數(shù)據(jù)未示出)。來自實(shí)施例1-2的結(jié)果的討論這項(xiàng)研究表明，在人類血小板和PBMC中，在有關(guān)二甲雙胍中毒的臨床條件的濃度下，二甲雙胍對(duì)對(duì)于復(fù)合體I具有特異性的線粒體的不可逆毒性效應(yīng)。在血小板中，我們進(jìn)一步表明在降低的復(fù)合體I呼吸和增加的乳酸生產(chǎn)之間的相關(guān)性。在完整細(xì)胞中，我們針對(duì)二甲雙胍所觀測(cè)到的線粒體毒性隨著時(shí)間的推移而發(fā)展。苯乙雙胍，一種在大多數(shù)國(guó)家中由于LA的高發(fā)生率現(xiàn)已撤消的結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物，在低得多的濃度下，通過復(fù)合體I特異性作用，在血小板中誘導(dǎo)乳酸釋放和pH下降。在本研究中，利用采用高分辨率的呼吸計(jì)量法的模型來評(píng)價(jià)人類血小板的整合線粒體功能，我們已經(jīng)證明，二甲雙胍和苯乙雙胍的線粒體毒性均是專門針對(duì)呼吸復(fù)合體I以及在PBMC中也存在類似的特異性抑制。對(duì)于二甲雙胍，與通透血小板相比，通透的PBMC的復(fù)合體I呼吸是2.6倍更加敏感的。然而，由于二甲雙胍的時(shí)間依賴性毒性(見下文)，IC50可能是低估的并且如果在較長(zhǎng)暴露時(shí)間以后確定則可能更低。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了二甲雙胍的線粒體毒性并不限于特定組織(如先前由其他人所說明的)，而是在亞細(xì)胞水平上的一般化的效應(yīng)(Kaneetal.,2010，Larsenetal.,2012，Owenetal.,2000，Dykensetal.,2008，Brunmairetal.,2004，Prottietal.,2012a)。在本研究中或在利用分離的牛線粒體的Dykensetal.(2008)的較早的研究中并沒有證實(shí)由(Prottietal.,2012a，Prottietal.,2012b)報(bào)告的在血小板中二甲雙胍誘導(dǎo)的復(fù)合體IV抑制。而且，二甲雙胍和苯乙雙胍并不通過線粒體內(nèi)或外膜的任何非特異性通透性改變來誘導(dǎo)呼吸抑制，因?yàn)闆]有證據(jù)表明在藥物的存在下在細(xì)胞色素c添加以后解偶聯(lián)或刺激反應(yīng)的。高分辨率的呼吸計(jì)量法是高靈敏度的方法并且允許在皮摩爾范圍內(nèi)的O2測(cè)量。當(dāng)應(yīng)用于離體人血細(xì)胞時(shí)，它允許評(píng)價(jià)在完整細(xì)胞中在完全整合狀態(tài)下的呼吸，并允許在通透細(xì)胞中外源性供應(yīng)和控制底物到完整線粒體。這是與酶促光度法測(cè)定相反，其主要是用于例如由Dykensetal.(2008)和Owenetal.(2000)進(jìn)行的對(duì)二甲雙胍的線粒體毒性的研究。這些測(cè)定測(cè)量單一復(fù)合體的獨(dú)立的、非整合功能，因而，是較少生理性的，其可能有助于在我們的研究之間的結(jié)果的差異。本研究的結(jié)果表明了在8-18小時(shí)以后在中毒相關(guān)的濃度下已經(jīng)出現(xiàn)由二甲雙胍引起的在完整血小板懸浮液中的顯著的呼吸抑制、乳酸增加和pH值降低。線粒體呼吸的時(shí)間依賴性抑制連同在胞外緩沖液的交換和通過細(xì)胞的通透稀釋可溶性二甲雙胍的細(xì)胞內(nèi)含量指向逆轉(zhuǎn)的缺乏指向線粒體內(nèi)累積，在藥物誘導(dǎo)的線粒體功能障礙相關(guān)LA的發(fā)展中，線粒體內(nèi)累積是關(guān)鍵因素，如已由其他人(Chanetal.,2005,Lalau,2010)提出的。先前已顯示苯乙雙胍的線粒體毒性，例如對(duì)HepG2細(xì)胞、肝癌細(xì)胞系、以及大鼠和奶牛的分離的線粒體(Dykensetal.,2008)。在這里，還利用人血細(xì)胞，我們已經(jīng)證明了特異性線粒體毒性。與二甲雙胍相比，苯乙雙胍具有對(duì)人類血小板的更強(qiáng)的線粒體毒性效力(IC50分別為1.2mM和0.058mM)。苯乙雙胍和二甲雙胍顯示在臨床劑量方面10至15倍差異(Scheen,1996,DavidsonandPeters,1997,KwongandBrubacher,1998,Sogameetal.,2009)以及在治療性血漿濃度方面顯示3至10倍差異(Regenthaletal.,1999,SchulzandSchmoldt,2003)。在本研究中，我們觀測(cè)到在苯乙雙胍和二甲雙胍之間在抑制復(fù)合體I的潛力方面的20倍差異。如果轉(zhuǎn)換到患者，相對(duì)于臨床劑量，在線粒體毒性方面的這種差異可能潛在地解釋苯乙雙胍的文件證明的苯乙雙胍相關(guān)LA的更高發(fā)生率。二甲雙胍的標(biāo)準(zhǔn)治療性血漿濃度是在0.6至6.0μM的范圍內(nèi)而毒性濃度是在60μM和1mM之間(SchulzandSchmoldt,2003,Prottietal.,2012b)。在非自愿二甲雙胍中毒的病例報(bào)告中，報(bào)告了在血液透析之前，超過2mM的二甲雙胍的血清水平(Al-Abrietal.,2013)。組織分布研究已經(jīng)進(jìn)一步證明，在穩(wěn)態(tài)下，二甲雙胍濃度在血漿/血清中比在其他器官中更低。已經(jīng)表明，相比于血漿水平，它以7至10倍更高濃度累積在胃腸道中，并在腎、肝、唾液腺、肺、脾和肌肉中具有較少但仍然顯著較高的量(Grahametal.,2011,Bailey,1992,Scheen,1996)。在其中二甲雙胍的清除率受損如影響心血管系統(tǒng)、肝或腎的誘因性病況的情況下，最終可以達(dá)到毒性水平。因此，在本研究中看到的二甲雙胍的毒性濃度(1mM)與在二甲雙胍中毒患者的血液中發(fā)現(xiàn)的濃度可比。雖然二甲雙胍對(duì)是血細(xì)胞有毒的，如在本研究中所顯示的，但不可能的是，血小板和PBMC是對(duì)LA的發(fā)展的主要貢獻(xiàn)者。因?yàn)槎纂p胍累積在其他器官中并且另外地這些器官是代謝上更為活性的，所以增加的乳酸生產(chǎn)可能首先在其他組織中被看到。因此，我們的結(jié)果加強(qiáng)了其他人已提出的設(shè)想(Brunmairetal.,2004,Prottietal.,2012b,Dykensetal.,2008)，全身性線粒體抑制是二甲雙胍誘導(dǎo)的LA的原因。基于先前的研究和本發(fā)現(xiàn)，有趣的是猜測(cè)以下可能性：二甲雙胍的抗糖尿病功效可能與有氧呼吸的抑制相關(guān)。在經(jīng)二甲雙胍治療的糖尿病患者中，在肝臟中降低的葡萄糖水平以及在小腸中降低的葡萄糖到血液的攝取(Kirpichnikovetal.,2002)可能是由于部分復(fù)合體I抑制。復(fù)合體I抑制引起ATP的降低的生產(chǎn)、增加的AMP量、酶AMP活化蛋白激酶(AMPK)的激活、和通過增加的糖酵解的加速的葡萄糖周轉(zhuǎn)，從而試圖補(bǔ)償減少的ATP產(chǎn)生(Brunmairetal.,2004,Owenetal.,2000)。到目前為止，用于二甲雙胍相關(guān)LA的治療措施包括血液透析和血液過濾以除去毒素，校正酸中毒以及增加腎血流量(Lalau,2010)。實(shí)施例3用細(xì)胞可滲透的琥珀酸酯前藥來干擾二甲雙胍誘導(dǎo)的乳酸生產(chǎn)的增加在含有10mM葡萄糖的PBS中，在完整的人類血小板中，用新開發(fā)和合成的細(xì)胞可滲透的琥珀酸酯前藥來干涉二甲雙胍誘導(dǎo)的乳酸生產(chǎn)的增加。將血小板暴露于單獨(dú)的魚藤酮(2μM)、魚藤酮(2μM)和抗霉素(1μg/mL，僅對(duì)于用NV189處理的細(xì)胞)、或10mM二甲雙胍，然后在60分鐘以后，每30分鐘，以250μM的濃度，添加媒介物(dmso，對(duì)照)、細(xì)胞可滲透的琥珀酸酯前藥(NV118、NV189和NV241)、或琥珀酸酯。自實(shí)驗(yàn)的開始，以30分鐘的間隔，測(cè)量乳酸水平。另外，在首次添加媒介物(dmso，對(duì)照)、不同的細(xì)胞可滲透的琥珀酸酯前藥(NV118、NV189、NV241)或琥珀酸酯之前以及在實(shí)驗(yàn)的最后，測(cè)量pH。借助于具有乳酸-時(shí)間曲線斜率的95％置信區(qū)間(CI)的非線性擬合來計(jì)算乳酸生產(chǎn)的速率(圖5、6、7和8)。與實(shí)施例3相關(guān)的結(jié)果是基于本文描述的測(cè)定通過添加細(xì)胞可滲透的琥珀酸酯前藥減弱在凝血細(xì)胞中起因于魚藤酮和二甲雙胍孵育的乳酸生產(chǎn)在用2μM魚藤酮孵育的凝血細(xì)胞中乳酸生產(chǎn)的速率是0.86mmol乳酸(200·106trc·h)-1(95％置信區(qū)間[CI]0.76-0,96)，其被以下各項(xiàng)減弱：NV118(0.25mmol[95％CI0.18-0.33])、NV189(0.42mmol[95％CI0.34-0.51])和NV241(0.34mmol[95％CI0.17-0.52])，其并不顯著不同于不接受魚藤酮的細(xì)胞(0.35[95％CI0.14-0.55])(圖5、6和7)。用除魚藤酮和NV189之外的抗霉素加以孵育的細(xì)胞具有與經(jīng)魚藤酮處理的細(xì)胞可比的乳酸生產(chǎn)(0.89mmol[0.81-0.97])，表明細(xì)胞可滲透的琥珀酸酯前藥的特異性線粒體效應(yīng)(圖6)。相比于在經(jīng)媒介物(水)處理的細(xì)胞中的0.22mmol(95％CI0.14-0.30)，用10mM二甲雙胍孵育的細(xì)胞以0.86mmol乳酸(200·109trc·h)-1(95％CI0.69-1.04)的速率產(chǎn)生乳酸(圖8)。用三種琥珀酸酯前藥的任何一種進(jìn)行的共孵育會(huì)減弱二甲雙胍效應(yīng)，從而導(dǎo)致對(duì)于NV118為0.43mmol生產(chǎn)(95％CI0.33-0.54)(圖5)、對(duì)于NV189為0.55mmol(95％CI0.44-0.65)(圖6)、以及對(duì)于NV241為0.43mmol(95％CI0.31-0-54)(圖7)。實(shí)施例4生物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)在下表中給出的化合物進(jìn)行在標(biāo)題I下提及的測(cè)定(1)-(4)。進(jìn)行測(cè)定以評(píng)價(jià)在完整細(xì)胞中線粒體能量產(chǎn)生功能的增強(qiáng)和抑制。在以下表中示出結(jié)果，其表明所有測(cè)試的化合物具有適宜的性能。重要的是，所有化合物顯示如從篩選方案1和4所看到的對(duì)CII相關(guān)的呼吸的特異性作用，以及如在測(cè)定2中看到的收斂效應(yīng)，其中CI底物是可用的。來自篩選方案1-4的結(jié)果化合物NV收斂的(常規(guī))收斂的(FCCP)CII(血漿)CII解偶聯(lián)毒性01-193(++)+(+)++5mM01-188++++++++(+)5mM01-185(+)+++(+)2mM01-205+++++++(+)5mM01-114++++++++(+)10mM01-041+++++++(+)5mM01-108++++(+)(++)+10mM01-150++++(+)++(+)2mM01-134++(+)(+)(+)(+)10mM圖例：收斂的(常規(guī))–在篩選測(cè)定3中描述的條件下，由化合物誘導(dǎo)的線粒體氧耗量的增加；收斂的(FCCP)–在篩選測(cè)定2中描述的條件(解偶聯(lián)條件)下，由化合物誘導(dǎo)的線粒體氧耗量的增加；收斂的(血漿)–在含有在人血漿中孵育的抑制的復(fù)合體I的細(xì)胞中由化合物誘導(dǎo)的線粒體氧耗量的增加，如在篩選測(cè)定4中描述的；CII–在含有抑制的復(fù)合體I的細(xì)胞中，由化合物誘導(dǎo)的線粒體氧耗量的增加，如在篩選測(cè)定1中描述的；解偶聯(lián)–在添加寡霉素以后的氧耗量水平，如在篩選測(cè)定3中描述的。在每個(gè)參數(shù)中的響應(yīng)被分級(jí)為+、++或+++(以效力的增加的順序)。括號(hào)[()]表明中間效果，即(+++)是在++和+++之間。毒性–在化合物滴定期間的最低濃度，在其下看到氧耗量的降低，如在篩選測(cè)定2中描述的。琥珀酸酯前藥/受保護(hù)的琥珀酸酯的制備本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以以已知的方式、以各種方式來制備本發(fā)明的受保護(hù)的琥珀酸酯。以下路線僅用來說明一些方法，其可以用于式(I)的化合物的合成。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于制備式(I)的化合物的方法，該方法包括使琥珀酸和式(VI)的化合物反應(yīng)其中Hal表示鹵素(例如F、Cl、Br或I)并且R3、R4和R5是如在式(I)中所定義的?？梢栽谌軇┤缍燃淄?、丙酮、乙腈或N,N-二甲基甲酰胺中并借助于適宜的堿如三乙胺、二異丙基乙胺或碳酸銫，在例如-10℃至80℃的溫度下，特別是在室溫下，方便地進(jìn)行琥珀酸和式(VI)的化合物的反應(yīng)?？梢越柚诳蛇x的添加劑如碘化鈉或四烷基鹵化銨(例如四丁基碘化銨)來進(jìn)行上述反應(yīng)。對(duì)于其中R1和R2是式(II)的不同基團(tuán)的式(I)的化合物，可以通過在上文概述的條件下使式(VII)的基團(tuán)其中PG1是保護(hù)基如叔丁基、芐基或4-甲氧基芐基，與式(VI)的基團(tuán)在如上所列出的條件下反應(yīng)，接著是在適當(dāng)?shù)臈l件下(如在溶劑如二氯甲烷中的三氟乙酸或鹽酸)或通過氫化(芳基)的保護(hù)基團(tuán)的脫保護(hù)，接著是在上文概述的條件下將獲得的具有式(VI)的不同基團(tuán)的化合物與脫保護(hù)的羧酸酯反應(yīng)，來制備式(I)的化合物。對(duì)于其中R1是可選取代的烷基并且R2是式(II)的基團(tuán)的式(I)的化合物，可以通過在上文概述的條件下使式(VIII)的基團(tuán)與式(VI)的基團(tuán)反應(yīng)來制備式(I)的化合物。可以在上文概述的條件下，通過式(IX)的基團(tuán)與式(VI)的基團(tuán)的反應(yīng)來方便地制備受保護(hù)的二琥珀酸酯化合物?？梢酝ㄟ^式(VII)的化合物與二氯甲烷在適宜的溶劑如二氯甲烷中并借助于適宜的添加劑如四丁基硫酸氫的反應(yīng)來方便地制備式(IX)的化合物?？梢酝ㄟ^在溶劑如二氯甲烷中用酸如三氟乙酸或鹽酸的處理來隨后水解得到的雙酯以提供式(IX)的化合物。式(VII)和(VIII)的化合物是市售的或可以通過文獻(xiàn)方法如那些在JournalofOrganicChemistry,72(19),7253-7259；2007中概述的方法加以方便地制備。以下式(VI)的化合物是市售的或可以通過文獻(xiàn)方法如那些在JournaloftheAmericanChemicalSociety,43,660-7；1921或Journalofmedicinalchemistry(1992),35(4),687-94中概述的方法加以方便地制備。制備實(shí)施例為了說明用于制備受保護(hù)的琥珀酸酯的方法，給出以下制備實(shí)施例，其中，除非另有說明：(i)當(dāng)給出時(shí)，用BrukerAvance300(300MHz)或BrukerAvance400(400MHz)來記錄1HNMR譜。氯仿-d(CDCl3；δH7.27ppm)、二甲亞砜-d6(d6-DMSO；δH2.50ppm)或甲醇-d4(CD3OD；δH3.31ppm)，或四甲基硅烷的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物(TMS；δH0.00ppm)的中央峰用作參考。(ii)根據(jù)分析性HPLC，用AgilentMSD(+ve和–ve電霧化)或FisonsInstrumentVGPlatform來記錄質(zhì)譜。在給定m/z值的情況下，通常僅報(bào)告指示母體質(zhì)量的離子，并且引述的質(zhì)量離子是正和負(fù)質(zhì)量離子：[M+H]+或[M-H]-；(iii)實(shí)施例的標(biāo)題和副標(biāo)題化合物以及制備物是用AutoNom命名的。(iv)除非另有說明，起始材料是市售的。所有溶劑和商業(yè)試劑具有實(shí)驗(yàn)室等級(jí)并按來樣使用。在環(huán)境溫度下，即在16至28℃的范圍內(nèi)，并且，在適當(dāng)情況下，在惰性氣體如氮?dú)獾臍夥障逻M(jìn)行所有操作。(v)使用以下縮略語：實(shí)施例1：琥珀酸二(2,2-二甲基-丙酰氧基甲基)酯將琥珀酸(1.2g，10mmol)和新戊酸氯甲酯(5.8mL，40mmol)加入丙酮(4mL)，然后在冰中冷卻混合物。分批添加三乙胺(3.3mL，24mmol)并在室溫下攪拌溶液過夜。濃縮混合物，然后在水和乙酸乙酯之間加以分配。用水然后用碳酸氫鈉溶液來洗滌乙酸乙酯溶液。用脫色炭來處理它，經(jīng)碳酸鉀干燥，然后濃縮至油。通過MPLC色譜(堿性氧化鋁，10％乙酸乙酯/90％環(huán)已烷)的純化提供0.18g琥珀酸二(2,2-二甲基-丙酰氧基甲基)酯，作為油。1HNMR(CDCl3,ppm)δ1.23(s,18H),2.71(s,4H),5.77(s,4H).實(shí)施例2：琥珀酸2,2-二甲基-丙酰氧基甲酯甲酯將琥珀酸甲酯(1.3g，10mmol)和新戊酸氯甲酯(2.9mL，20mmol)加入丙酮(2mL)，然后在冰中冷卻混合物。分批添加三乙胺(2.0mL，14mmol)并在室溫下攪拌溶液過夜。濃縮混合物，然后在水和乙酸乙酯之間加以分配。用水然后用碳酸氫鈉溶液來洗滌乙酸乙酯溶液，經(jīng)碳酸鉀干燥并濃縮以得到2.4g琥珀酸2,2-二甲基-丙酰氧基甲酯甲酯，作為油。1HNMR(CDCl3,ppm)δ1.23(s,9H),2.68(m,4H),3.71(s,3H),5.78(s,2H).實(shí)施例3：琥珀酸二乙酰氧基甲酯將琥珀酸(58.6g，0.496摩爾)加入二氯甲烷(2L)并將混合物冷卻至0℃。在20分鐘期間添加二異丙基乙胺(201mL，1.154摩爾)，接著在30分鐘添加乙酸溴甲酯(159.4g，1.042摩爾)，然后在氮?dú)鈿夥障聰嚢枞芤哼^夜。將溶液冷卻至0℃，然后用1L冷1％鹽酸、0.6％鹽酸和水(x3)依次洗滌。用脫色炭來處理溶液，用硫酸鎂干燥并濃縮至油，其結(jié)晶自乙醚(200mL)/異己烷(10mL)以提供92g琥珀酸二乙酰氧基甲酯，作為白色固體。1HNMR(CDCl3,ppm)δ2.13(s,6H),2.72(s,4H),5.76(s,4H).另外8g純物質(zhì)獲自上述液體的濃縮。實(shí)施例4：琥珀酸乙酰氧基甲基酯甲酯將琥珀酸甲酯(2.0g，15.1mmol)溶解于乙腈(200mL)并添加乙酸溴甲酯(1.65mL，16.8mmol)。在冷水中冷卻溶液并添加二異丙基乙胺(3.16mL，18.2mmol)。允許溶液升溫并在室溫下攪拌70分鐘。將溶液倒入冰/水(400mL)并用乙酸乙酯提取。用水、1％鹽酸、碳酸氫鈉溶液和鹽水來洗滌上述乙酸乙酯溶液。它用硫酸鎂加以干燥并濃縮至油。通過MPLC(SiO2，異己烷→20％乙酸乙酯/80％異己烷)純化產(chǎn)生0.91g琥珀酸乙酰氧基甲基酯甲酯。1HNMR(CDCl3,ppm)δ2.13(s,3H),2.69(m,4H),3.71(s,3H),5.77(s,2H).實(shí)施例5：琥珀酸二(1-乙酰氧基-乙基)酯將琥珀酸(58.6g，0.496摩爾)加入二氯甲烷(2L)并將混合物冷卻至0℃。在20分鐘期間添加二異丙基乙胺(201mL，1.154摩爾)，接著在30分鐘期間添加乙酸-1-溴乙酯(159.4g，1.042摩爾)，然后在氮?dú)鈿夥障聰嚢枞芤哼^夜。將溶液冷卻至0℃，然后依次用冷(1.5L量)水、1％鹽酸(兩次)、碳酸氫鈉溶液和水加以洗滌。用硫酸鎂來干燥溶液并濃縮至油，其結(jié)晶自叔丁基甲基醚以提供41g琥珀酸二乙酰氧基甲酯，作為白色固體。1HNMR(CDCl3,ppm)δ1.48(d,J＝5.4Hz,6H),2.07(s,6H),2.66(m,4H),6.87(q,J＝5.5Hz,1H).實(shí)施例6：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯甲酯將琥珀酸甲酯(2.46g，18.6mmol)溶解于乙腈(350mL)并將溶液冷卻至-5℃。添加乙酸1-溴乙酯(3.3g，19.8mmol)，然后添加二異丙基乙胺(4.0mL，23.3mmol)。允許溶液升溫并在室溫下攪拌3天。冷卻溶液并在冷水和乙酸乙酯之間加以分配。用1％鹽酸、碳酸氫鈉溶液，然后兩次用水來洗滌上述乙酸乙酯溶液。用硫酸鎂來干燥溶液并濃縮至油。通過MPLC(SiO2，異己烷→10％乙酸乙酯/90％異己烷)純化產(chǎn)生1.9g琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯甲酯，作為油。1HNMR(CDCl3,ppm)δ1.48(d,J＝5.3Hz,3H),2.07(s,3H),2.65(m,4H),3.70(s,3H),6.86(q,J＝5.3Hz,1H).實(shí)施例7：琥珀酸二(1-乙酰氧基-丙基)酯將琥珀酸(2.0g，16.9mmol)溶解于乙腈(350mL)并將溶液冷卻至-5℃。添加乙酸1-溴丙酯(6.7g，37.0mmol)，然后添加二異丙基乙胺(7.3mL，41.9mmol)。在室溫下攪拌溶液3天。冷卻溶液并在冷水和乙酸乙酯之間加以分配。用冷1％鹽酸、碳酸氫鈉溶液，然后用水，來洗滌上述乙酸乙酯溶液。它用硫酸鎂加以干燥并濃縮至油。通過MPLC(SiO2，異己烷→10％乙酸乙酯/90％異己烷)純化產(chǎn)生0.85g琥珀酸二(1-乙酰氧基-丙基)酯，作為油。1HNMR(CDCl3,ppm)δ0.97(t,J＝7.6Hz,6H),1.81(m,4H),2.09(s,6H),2.68(m,4H),6.77(t,J＝5.6Hz,2H).實(shí)施例8：琥珀酸二(1-丙酰氧基-乙基)酯將琥珀酸(2.0g，37.0mmol)溶解于乙腈(350mL)并將溶液冷卻至-5℃。添加丙酸-1-溴乙酯(6.7g，37.0mmol)，然后添加二異丙基乙胺(7.3mL，41.9mmol)。允許溶液升溫并在室溫下攪拌過夜。冷卻溶液并在冷水和乙酸乙酯之間加以分配。用冷1％鹽酸、碳酸氫鈉溶液，然后兩次用水，來洗滌上述乙酸乙酯溶液。它用硫酸鎂加以干燥并濃縮至油。通過MPLC(SiO2，異己烷→10％乙酸乙酯/90％異己烷)純化產(chǎn)生3.1g琥珀酸二(1-丙酰氧基-乙基)酯，作為油。1HNMR(CDCl3,ppm)δ1.15(t,J＝7.5Hz,6H),1.49(d,J＝5.4Hz,6H),2.36(q,J＝7.6Hz,4H),2.66(m,4H),6.90(t,J＝5.4Hz,2H).實(shí)施例9：1,3,5,7-四氧雜-環(huán)十一烷-8,11-二酮將丙酰溴(8mL，89mmol)溶解于二氯甲烷(20mL)并將溶液冷卻至-5℃。添加氯化鋅(35mg，0.26mmol)，接著在30分鐘期間分批添加三氧雜環(huán)己烷(2.67g，29.7mmol)。在0℃下攪拌溶液1小時(shí)，然后在室溫下攪拌另外1小時(shí)。用冷水洗滌溶液三次，用硫酸鎂加以干燥，然后濃縮至油。將來自此反應(yīng)的粗產(chǎn)物(7.0g)加入琥珀酸(2.34g，19.8mmol)和二異丙基乙胺(8.3mL，43.7mmol)在冷卻至-5℃的二氯甲烷(350mL)中的混合物。在室溫下攪拌溶液過夜，然后用冷1％鹽酸、碳酸氫鈉溶液，接著三次用水，加以洗滌。它用硫酸鎂加以干燥并濃縮至油。用乙醚進(jìn)行研制以提供0.24g的1,3,5,7-四氧雜-環(huán)十一烷-8,11-二酮，作為白色固體。1HNMR(CDCl3,ppm)δ2.66(s,4H),5.00(s,2H),5.43(s,4H)。實(shí)施例10：琥珀酸乙酰氧基甲酯二乙基氨基甲酰甲酯i)2-氯-N,N-二乙基-乙酰胺在二氯甲烷(30mL)中稀釋二乙胺(10.0mL，97mmol)和三乙胺(13.5mL，97mmol)，將溶液冷卻至0℃，并在10分鐘期間添加在DCM(10ml)中的氯乙酰氯(7.7mL，97mmol)，然后允許溶液升溫到室溫并在氮?dú)鈿夥障聰嚢柽^夜。用水(2x10mL)洗滌溶液。合并有機(jī)物并真空除去揮發(fā)物。通過硅膠色譜法并借助于連續(xù)梯度的1:0至1:1的異己烷/乙酸乙酯，來純化殘余物以提供標(biāo)題化合物(12.3g)，作為透明油。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.11(t,J＝7.1Hz,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,3H),3.35(quint,J＝6.9Hz,4H),4.03(s,2H).LCMS(m/z)150.1–152.1[M+H]+.ii)琥珀酸叔丁基酯二乙基氨基甲酰甲酯將2-氯-N,N-二乙基-乙酰胺(實(shí)施例10，步驟(i)，1.71g，11.48mmol)、琥珀酸單叔丁基酯(2.00g，11.48mmol)、碳酸銫(2.67g，13.78mmol)、和碘化鈉(171mg，1.14mmol)懸浮在DMF(20mL)中，然后在氮?dú)鈿夥蘸?0℃下攪拌懸浮液3小時(shí)。將懸浮液冷卻至室溫，用乙酸乙酯(40mL)稀釋并用水(3x10mL)洗滌。合并有機(jī)物并真空除去揮發(fā)物。通過硅膠色譜法并借助于1:0至0:1的異己烷/乙酸乙酯的連續(xù)梯度來純化殘余物以提供標(biāo)題化合物(3.29g)，作為透明油。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.13(t,J＝7.1Hz,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,3H),1.44(s,9H),2.55-2.77(m,4H),3.24(q,J＝7.1Hz,2H),3.38(q,J＝7.1Hz,2H),4.73(s,2H).LCMS(m/z)288.1[M+H],Tr＝2.07分鐘。iii)琥珀酸單二乙基氨基甲酰甲酯將琥珀酸叔丁基酯二乙基氨基甲酰甲酯(實(shí)施例10，步驟(ii)，3.29g，11.48mmol)溶解于DCM(15mL)，將溶液冷卻至0℃，然后添加三氟乙酸(5mL)。允許溶液升溫到室溫并在氮?dú)鈿夥障聰嚢柽^夜。真空除去揮發(fā)物，然后和甲苯(3x20mL)一起共沸殘余物以提供標(biāo)題化合物(3.19g)，作為透明油。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.16(t,J＝7.1Hz,3H),1.26(t,J＝7.1Hz,3H),2.65-2.85(m,4H),3.30(q,J＝7.1Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,2H),4.79(s,2H),10.43(br,1H).LCMS(m/z)232.1[M+H]+,230.1[M-H]-.實(shí)施例10：琥珀酸乙酰氧基甲酯二乙基氨基甲酰甲酯將琥珀酸單二乙基氨基甲酰甲酯(實(shí)施例10，步驟(iii)，850mg，3.68mmol)、乙酸溴甲酯(671mg，4.42mmol)、碳酸銫(1.78g，9.20mmol)懸浮在DMF(10mL)中，然后在氮?dú)鈿夥蘸?0℃下攪拌懸浮液2小時(shí)。將懸浮液冷卻至室溫，用乙酸乙酯(30mL)稀釋并用水(3x5mL)洗滌。合并有機(jī)物并真空除去揮發(fā)物。通過硅膠色譜法并借助于1:0至0:1的異己烷/乙酸乙酯的連續(xù)梯度來純化殘余物以提供標(biāo)題化合物(334mg)，作為白色固體。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.14(t,J＝7.1Hz,3H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H),2.12(s,3H),2.67-2.87(m,4H),3.25(q,J＝7.1Hz,2H),3.39(q,J＝7.1Hz,2H),4.75(s,2H),5.76(s,2H).LCMS(m/z)304.0[M+H]+.實(shí)施例11：琥珀酸二乙基氨基甲酰甲酯1-乙氧基羰氧基乙酯將琥珀酸單二乙基氨基甲酰甲酯(500mg，2.16mmol)、碳酸1-氯-乙酯乙酯(395mg，2.60mmol)、碳酸銫(625mg，3.24mmol)、碘化鈉(32mg，0.21mmol)懸浮于DMF(10mL)，然后在氮?dú)鈿夥蘸?0℃下攪拌懸浮液3小時(shí)。將懸浮液冷卻至室溫，用乙酸乙酯(30mL)稀釋并用水(3x5mL)洗滌。合并有機(jī)物并真空除去揮發(fā)物。通過硅膠色譜法并借助于1:0至0:1的異己烷/乙酸乙酯的連續(xù)梯度來純化殘余物以提供標(biāo)題化合物(585mg)，作為透明油。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.14(t,J＝7.1Hz,3H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H),1.53(d,J＝5.5Hz3H),2.67-2.87(m,4H),3.25(q,J＝7.1Hz,2H),3.39(q,J＝7.1Hz,2H),4.22(q,J＝7.1Hz,2H),4.74(d,J＝8.03Hz,2H),6.77(q,J＝5.5Hz,1H).LCMS(m/z)348.0[M+H]+.實(shí)施例12：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯二乙基氨基甲酰甲酯將琥珀酸單二乙基氨基甲酰甲酯(500mg，2.16mmol)、乙酸1-溴-乙酯(434mg，2.60mmol)、碳酸銫(625mg，3.24mmol)懸浮于DMF(10mL)并在氮?dú)鈿夥蘸?0℃下攪拌懸浮液2小時(shí)。將懸浮液冷卻至室溫，用乙酸乙酯(30mL)稀釋并用水(3x5mL)洗滌。合并有機(jī)物并真空除去揮發(fā)物。通過硅膠色譜法并借助于1:0至0:1的異己烷/乙酸乙酯的連續(xù)梯度來純化殘余物以提供標(biāo)題化合物(352mg)，作為透明油。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.14(t,J＝7.1Hz,3H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H),1.48(d,J＝5.5Hz,3H),2.07(s,3H),2.66-2.85(m,4H),3.25(q,J＝7.1Hz,2H),3.39(q,J＝7.1Hz,2H),4.74(d,J＝5.1Hz,2H),6.87(q,J＝5.5Hz,1H).LCMS(m/z)318.1[M+H]+.實(shí)施例13：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯乙酰氧基甲酯i)琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯叔丁基酯將琥珀酸單叔丁基酯(2.0g，11.48mmol)、乙酸1-溴-乙酯(1.9g，11.48mmol)、碳酸銫(2.6g，13.41mmol)懸浮于DMF(20mL)，然后在氮?dú)鈿夥蘸?0℃下攪拌懸浮液2小時(shí)。將懸浮液冷卻至室溫，用乙酸乙酯(50mL)稀釋并用水(3x10mL)洗滌。合并有機(jī)物并真空除去揮發(fā)物。通過硅膠色譜法并借助于1:0至0:1的異己烷/乙酸乙酯的連續(xù)梯度來純化殘余物以提供標(biāo)題化合物(2.21g)，作為透明油。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.45(s,9H),1.48(d,J＝5.5Hz,3H),2.07(s,3H),2.50-2.65(m,4H),6.88(q,J＝5.5Hz,1H).ii)琥珀酸單(1-乙酰氧基-乙基)酯將琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯叔丁基酯(實(shí)施例13，步驟(i)，2.21g，8.49mmol)溶解于DCM(10mL)，將溶液冷卻至0℃并添加三氟乙酸(2mL)。允許溶液升溫至室溫并在氮?dú)鈿夥障聰嚢?小時(shí)。真空除去揮發(fā)物，連同甲苯(3x20mL)一起來共沸殘余物以提供標(biāo)題化合物(1.52g)，作為透明油。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.40(d,J＝5.5Hz,3H),2.03(s,3H),2.40-2.60(m,4H),6.73(q,J＝5.5Hz,1H),10-14(br,1H).實(shí)施例13：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯乙酰氧基甲酯將琥珀酸單(1-乙酰氧基-乙基)酯(實(shí)施例13，步驟(ii)，500mg，2.45mmol)、乙酸溴甲酯(450mg，2.93mmol)、碳酸銫(712mg，3.67mmol)懸浮于DMF(10mL)并在氮?dú)鈿夥蘸?0℃下攪拌懸浮液3小時(shí)。將懸浮液冷卻至室溫，用乙酸乙酯(30mL)稀釋并用水(3x5mL)洗滌。合并有機(jī)物并真空除去揮發(fā)物。通過硅膠色譜法并借助于1:0至0:1的異己烷/乙酸乙酯的連續(xù)梯度來純化殘余物以提供標(biāo)題化合物(267mg)，作為透明油。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.49(d,J＝5.5Hz,3H),2.08(s,3H),2.13(s,3H),2.60-2.77(m,4H),5.76(s,2H),6.87(q,J＝5.5Hz,1H).LCMS(m/z)377.0[M+H]+.實(shí)施例14：琥珀酸二(2,2-二甲基-5-氧代-[1,3]二氧戊環(huán)-4-基)酯在氮?dú)鈿夥障潞驮诒≈欣鋮s的情況下，向在乙腈中的琥珀酸(2.36g，20mmol)和二異丙基乙胺(8.1mL，46.5mmol)添加5-溴-2,2-二甲基-[1,3]二氧戊環(huán)-4-酮(8.27g，42.4mmol)。允許混合物經(jīng)18小時(shí)升溫至室溫。在冰浴中再冷卻溶液，用乙酸乙酯稀釋，然后用1MHCl、水、碳酸氫鈉水溶液和水加以洗滌。經(jīng)硫酸鎂來干燥有機(jī)相并濃縮以提供標(biāo)題化合物(3.4g)，作為白色固體。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.15(m,12H),2.41(m,4),5.77(m,2H).實(shí)施例15：琥珀酸二(甲氧基-甲氧基羰基-甲基)酯通過根據(jù)實(shí)施例14的方法來制備標(biāo)題化合物。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ2.83(4H,m),3.47(6Hs),3.59(6H,s),5.97(2H,s).實(shí)施例16：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯1-乙氧基羰氧基-乙酯將琥珀酸單(1-乙酰氧基-乙基)酯(實(shí)施例13，步驟(ii)，1g，4.90mmol)、碳酸1-氯乙基乙酯(895mg，5.88mmol)、碳酸銫(1.4g，7.35mmol)和碘化鈉(73mg，0.49mmol)溶解于DMF(15mL)并加熱混合物至80℃持續(xù)3小時(shí)。允許混合物冷卻至室溫，然后在水和乙酸乙酯之間加以分配。經(jīng)硫酸鎂來干燥有機(jī)層并濃縮以提供粗殘余物，其是通過硅膠色譜法并借助于1:0至0:1的異己烷/乙酸乙酯的連續(xù)梯度加以純化以提供標(biāo)題化合物(118mg)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.31(t,J＝7.1Hz,3H),1.46(d,J＝5.4Hz,3H),1.51(d,J＝5.4Hz,3H),2.06(s,3H),2.56-2.74(m,4H),4.21(q,J＝7.1Hz,2H),6.76(q,J＝5.4Hz,1H),6.85(q,J＝5.4Hz,1H).實(shí)施例17：琥珀酸3-(1-乙酰氧基-乙氧基羰基)-丙酰氧基甲基酯1-乙酰氧基-乙酯i)琥珀酸3-叔丁氧基羰基-丙酰氧基甲基酯叔丁基酯向琥珀酸叔丁酯(8.7g，50mmol)添加氫氧化鈉水溶液(50mL，2M)，然后攪拌混合物10分鐘。添加硫酸氫四丁基銨(17g)并攪拌混合物另外30分鐘。用二氯甲烷(4x100mL)來提取溶液并經(jīng)硫酸鎂來干燥合并的提取物。然后在40℃下加熱二氯甲烷溶液5天。允許溶液冷卻至室溫，并用硫酸(1M)、水和碳酸氫鈉溶液，接著用水，加以洗滌。然后干燥有機(jī)相并濃縮以提供標(biāo)題化合物，作為粗產(chǎn)物(5.7g)。1HNMR(CDCl3,ppm)δ1.45(s,18H),2.53-2.67(m,8H),5.79(m,2H).ii)琥珀酸單(3-羧基-丙酰氧基甲基)酯將琥珀酸3-叔丁氧基羰基-丙酰氧基甲基酯叔丁基酯(1.8g，5mmol)溶解于二氯甲烷(27mL)，然后在氮?dú)庀吕鋮s混合物至-78℃。添加三氟乙酸(0.77mL，10mmol)并允許混合物升溫至4℃，其后將它保持在4℃下18小時(shí)。蒸發(fā)混合物并連同甲苯一起加以共沸。分析顯示不完全反應(yīng)，所以使粗混合物經(jīng)受相同的反應(yīng)條件另外4天。蒸發(fā)混合物并連同甲苯一起加以共沸，然后，作為粗產(chǎn)物(1.3g)，用于以下步驟。1HNMR(CDCl3,ppm)δ2.52-2.64(m,8H),5.71(s,2H).實(shí)施例17：琥珀酸3-(1-乙酰氧基-乙氧基羰基)-丙酰氧基甲基酯1-乙酰氧基-乙酯通過實(shí)施例6的方法并利用琥珀酸單(3-羧基-丙酰氧基甲基)酯(實(shí)施例17ii，1.3g)和乙酸1-溴乙酯(1.8g)來制備標(biāo)題化合物以在純化以后提供240mg產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3,ppm)δ1.50(d,6H),2.09(s,6H),2.60-2.75(m,8H),5.78(s,2H),6.90(q,2H).實(shí)施例18：琥珀酸3-乙酰氧基甲氧基羰基-丙酰氧基甲基酯乙酰氧基甲酯通過實(shí)施例6的方法并利用琥珀酸單(3-羧基-丙酰氧基甲基)酯(實(shí)施例17ii，1.0g，4.0mmol)和1-乙酸溴甲酯(1.3g，8.5mmol)來制備標(biāo)題化合物以在純化后提供1.4g產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3,ppm)δ2.15(s,6H),2.73(s,8H),5.72-5.82(m,6H).實(shí)施例19將琥珀酰氯(0.1mol)和三乙胺(0.4mol)溶解于DCM并添加半胱氨酸。在室溫下攪拌反應(yīng)。將反應(yīng)加入含水稀鹽酸，然后用水和鹽水加以洗滌。經(jīng)硫酸鎂來干燥有機(jī)層并在真空下減少。通過硅膠色譜法來純化目標(biāo)化合物。實(shí)施例20：S,S-二(2-丙酰胺基乙基)丁烷二(硫代酸酯)(NV038,01-038)的合成向鹽酸半胱胺(5.0g，44mmol)在CH3OH(50mL)中的溶液加入Et3N(4.4g，44mmol)，接著加入(Boc)2O(10.5g，48.4mmol)，然后在室溫下攪拌混合物1小時(shí)。真空濃縮反應(yīng)混合物。將獲得的殘余物溶解于CH2Cl2，用2MHCl水溶液和鹽水洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)以產(chǎn)生2-巰基乙基氨基甲酸叔丁酯，作為無色油，其用于下一步驟而沒有進(jìn)一步的純化。將2-巰基乙基氨基甲酸叔丁酯(9.8g，55.0mmol)和Et3N(5.6g，55.0mmol)溶解于CH2Cl2(100mL)，將混合物冷卻至0℃，逐滴添加琥珀酰氯(2.1g，13.8mmol)。然后在室溫下攪拌混合物2小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物并通過柱色譜(石油醚/EtOAc＝1/10至1/1)來純化殘余物。獲得S,S-二(2-(叔丁氧基羰基氨基)乙基)丁烷二(硫代酸酯)，作為白色固體。在室溫下攪拌S,S-二(2-(叔丁氧基羰基氨基)乙基)丁烷二(硫代酸酯)(2.0g，4.58mmol)和TFA(10mL)在CH2Cl2(10mL)中的混合物4小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物以產(chǎn)生S,S-二(2-氨基乙基)丁烷二(硫代酸酯)，作為黃色油，其用于下一步驟而沒有進(jìn)一步的純化。將S,S-二(2-氨基乙基)丁烷二(硫代酸酯)(1.1g，4.58mmol)和Et3N(1.4g，13.74mmol)溶解于CH2Cl2(15mL)，將混合物冷卻至0℃，滴加丙酰氯(0.9g，10.07mmol)。然后在室溫下攪拌混合物3小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物并通過制備性TLC(CH2Cl2/MeOH＝15/1)來純化殘余物。獲得S,S-二(2-丙酰胺基乙基)丁烷二(硫代酸酯)，作為白色固體。實(shí)施例21：(R)-4-(2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧代丁酸(NV-041,01-041)的合成向L-半胱氨酸(2.00g，16.5mmol)在THF/H2O(8mL/2mL)中的混合物添加NaOAc(2.70g，33.0mmol)。在室溫下攪拌混合物20分鐘。在逐滴添加丙酸酐(2.30g，17.6mmol)以前，將反應(yīng)冷卻至5℃。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后加熱至回流4小時(shí)。冷卻反應(yīng)混合物并通過添加4NHCl來酸化至pH5。在減壓下蒸發(fā)得到的溶液以除去THF。通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生1.00g的(R)-3-巰基-2-丙酰胺基丙酸，作為無色油。在回流下加熱(R)-3-巰基-2-丙酰胺基丙酸(1.00g，5.65mmol)、琥珀酸酐(565mg，5.65mmol)和Et3N(572mg，5.65mmol)的10mL的THF中的溶液過夜。濃縮反應(yīng)混合物并通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生(R)-4-(2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧代丁酸，作為無色油。實(shí)施例22步驟1將三乙胺(0.24mol)加入N-乙酰基半胱胺(0.2mol)在DCM中的溶液。逐滴添加4-氯-4-氧代丁酸(0.1mol)，并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物。將混合物加入含水稀鹽酸并用乙酸乙酯提取，然后用水和鹽水加以洗滌。經(jīng)硫酸鎂來干燥有機(jī)層并在真空下減少。步驟2將步驟3的產(chǎn)物(0.1mol)、乙酸-1-溴乙酯(0.1mol)和碳酸銫(0.12mol)懸浮于DMF并在惰性氣氛和60℃下攪拌。允許懸浮液冷卻至室溫并添加乙酸乙酯，然后依次用含水稀鹽酸和水加以洗滌。經(jīng)硫酸鎂來干燥有機(jī)物并在真空下減少。通過柱色譜來純化殘余物。實(shí)施例23步驟1將三乙胺(0.24mol)加入N-乙酰基半胱胺(0.2mol)在DCM中的溶液。逐滴添加4-氯-4-氧代丁酸(0.1mol)，然后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物。將混合物加入含水稀鹽酸并用乙酸乙酯提取，然后用水和鹽水加以洗滌。經(jīng)硫酸鎂來干燥有機(jī)層并在真空下減少。步驟2在二氯甲烷中稀釋二甲胺(0.1mol)和三乙胺(0.1mol)，將溶液冷卻至0℃并添加在DCM中的2-氯丙酰氯(0.1mol)，然后允許溶液升溫至室溫并在惰性氣氛下保持?jǐn)嚢?。用水洗滌溶液。合并有機(jī)物并真空除去揮發(fā)物。通過硅膠色譜法來純化殘余物。步驟3將2-氯-N,N-二甲基-丙酰胺(0.1mol)、步驟1的產(chǎn)物(0.1mol)、碳酸銫(0.1mol)、和碘化鈉(0.01mol)懸浮于DMF，并在惰性氣氛和80℃下攪拌懸浮液。將懸浮液冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋并用水洗滌。在真空下減少有機(jī)物。通過硅膠色譜法來純化殘余物以產(chǎn)生目標(biāo)化合物。實(shí)施例24：4-氧代-4-(2-丙酰胺基乙硫基)丁酸(NV114,01-114)的合成將丙酸酐(11.7g，89.7mmol)和含水KOH(8M，以保持pH＝8)逐滴添加入鹽酸半胱胺(3.40g，30.0mmol)在24mL水中的攪拌溶液。通過添加2NHCl來中和混合物并在室溫下攪拌1小時(shí)。用冰浴來冷卻溶液并緩慢添加固體KOH(6.00g，105mmol)。在室溫下攪拌混合物50分鐘。在用NaCl飽和并用6NHCl中和以后，用CH2Cl2(4×30mL)來提取混合物。干燥(Na2SO4)合并的CH2Cl2提取物并真空濃縮以產(chǎn)生N-(2-巰基乙基)丙酰胺，作為無色油，其用于下一步驟而沒有進(jìn)一步的純化。在回流下加熱N-(2-巰基乙基)丙酰胺(2.00g，15.0mmol)、琥珀酸酐(1.50g，15.0mmol)和Et3N(1.50g，15.0mmol)在20mL的THF中的溶液過夜。濃縮反應(yīng)混合物并通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生4-氧代-4-(2-丙酰胺基乙硫基)丁酸，作為無色油。實(shí)施例25：4-(2-乙酰氨基乙硫基)-4-氧代丁酸(NV108,01-108)的合成將乙酸酐(8.48mL，90.0mmol)和含水KOH(8M以保持pH＝8)逐滴添加入鹽酸半胱胺(3.40g，30.0mmol)在24mL水中的攪拌溶液。然后借助于添加2NHCl將pH調(diào)節(jié)為7。在室溫下攪拌混合物1小時(shí)，然后借助于冰浴來冷卻溶液。向上述溶液緩慢添加固體KOH(6.0g，105mmol)，然后在室溫下攪拌產(chǎn)生的混合物50分鐘。在用NaCl飽和并用6NHCl中和以后，用CH2Cl2(4×30mL)來提取混合物。干燥(Na2SO4)合并的CH2Cl2提取物并真空濃縮以產(chǎn)生N-(2-巰基乙基)乙酰胺，作為無色油，其用于下一步驟而沒有進(jìn)一步的純化。在回流下加熱N-(2-巰基乙基)乙酰胺(1.50g，12.7mmol)、琥珀酸酐(1.3g，12.7mmol)和Et3N(1.3g，12.7mmol)在20mL的THF中的溶液過夜。濃縮反應(yīng)混合物并通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生4-(2-乙酰氨基乙硫基)-4-氧代丁酸，作為無色油。實(shí)施例26：(R)-3-(4-((R)-2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸(NV099,01-099)的合成向N-羥基琥珀酰亞胺(3.00g，26.1mmol)和Et3N(3.20g，31.3mmol)在CH2Cl2(60mL)中的混合物逐滴添加琥珀酰氯(2.00g，13.0mmol)。在用水(60mL)稀釋以前，在室溫下攪拌混合物3小時(shí)。過濾導(dǎo)致的懸浮液，用水和CH2Cl2洗滌。收集濾餅并干燥以產(chǎn)生二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯，作為灰色固體。在室溫下攪拌N-(2-巰基乙基)丙酰胺(400mg，2.26mmol)、二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯(353mg，1.13mmol)和TEA(286mg，2.83mmol)在3.0mL的CH3CN中的混合物2小時(shí)。直接通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化清晰的反應(yīng)溶液以產(chǎn)生(R)-3-(4-((R)-2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸，作為無色油。實(shí)施例27：(R)-4-(1-羧基-2-(丙酰硫基)乙基氨基)-4-氧代丁酸(NV122,01-122)的合成向(R)-3-巰基-2-丙酰胺基丙酸(1.00g，8.25mmol)和丙酸(1.0mL)在CHCl3(10mL)中的混合物逐滴添加丙酸酐(1.13g，8.67mmol)。加熱反應(yīng)混合物至回流過夜。冷卻反應(yīng)混合物并添加琥珀酸酐(1.00g，9.99mmol)。在減壓下濃縮以前回流混合物過夜。通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生(R)-4-(1-羧基-2-(丙酰硫基)乙基氨基)-4-氧代丁酸，作為灰白色固體。實(shí)施例28：4-(1-乙酰氨基-2-甲基丙烷-2-硫基)-4-氧代丁酸(NV188,01-188)的合成向鹽酸半胱胺(2.00g，14.1mmol)在15mL水中的攪拌溶液逐滴添加乙酸酐(4.30g，42.4mmol)和含水KOH(8M以保持pH＝8)。然后通過添加2NHCl來中和混合物，并在室溫下攪拌1小時(shí)。向用冰浴冷卻的溶液緩慢添加固體KOH(2.80g，49.4mmol)并在室溫下攪拌混合物50分鐘。在用NaCl飽和并用6NHCl中和以后，用CH2Cl2來提取混合物兩次。干燥(Na2SO4)合并的CH2Cl2提取物并真空濃縮以產(chǎn)生N-(2-巰基-2-甲基丙基)乙酰胺，作為白色固體，其用于下一步驟而沒有進(jìn)一步的純化。在過夜下，加熱N-(2-巰基-2-甲基丙基)乙酰胺(400mg，2.72mmol)、琥珀酸酐(326mg，3.26mmol)和Et3N(330mg，3.26mmol)在6mL的THF中的溶液。濃縮反應(yīng)混合物并通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生4-(1-乙酰氨基-2-甲基丙烷-2-硫基)-4-氧代丁酸，作為黃色油。實(shí)施例29：S,S-二((R)-3-(二乙基氨基)-3-氧代-2-丙酰胺基丙基)丁烷二(硫代酸酯)(NV185,01-185)的合成在0℃下，向(R)-3-巰基-2-丙酰胺基丙酸(5.00g，28.0mmol)在DMF(50mL)中的溶液添加三苯基氯甲烷(8.70g，31.0mmol)。在0℃下攪拌混合物30分鐘，然后升溫至室溫過夜。用水處理混合物，然后用EtOAc提取兩次。用鹽水洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na2SO4干燥并在減壓下濃縮。通過硅膠柱色譜(CH2Cl2/MeOH＝80/1～50/1)來純化殘余物以產(chǎn)生(R)-2-丙酰胺基-3-(三苯甲硫基)丙酸，作為白色固體。在室溫下，向(R)-2-丙酰胺基-3-(三苯甲硫基)丙酸(1.7g，4.0mmol)在CH2Cl2(50mL)中的攪拌溶液添加DCC(1.7g，8.0mmol)和HOBT(0.50g，4.0mmol)。在室溫下攪拌混合物1小時(shí)，然后添加二乙胺(0.80g，8.0mmol)。在室溫下攪拌混合物過夜。用水洗滌混合物，經(jīng)Na2SO4干燥并在減壓下濃縮以產(chǎn)生粗產(chǎn)物，其通過硅膠柱色譜(EtOAc/石油醚＝1/6～1/1)加以純化以產(chǎn)生(R)-N,N-二乙基-3-巰基-2-丙酰胺基丙酰胺，作為黃色油。在0℃下，向(R)-N,N-二乙基-3-巰基-2-丙酰胺基丙酰胺(400mg，0.800mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液添加TFA(1mL)和i-Pr3SiH(253mg，1.60mmol)。將混合物升溫至室溫并攪拌2小時(shí)。在減壓下蒸發(fā)溶液。通過制備性HPLC(用H2O(0.5％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生(R)-N,N-二乙基-3-巰基-2-丙酰胺基丙酰胺，作為黃色油。在室溫下攪拌(R)-N,N-二乙基-3-巰基-2-丙酰胺基丙酰胺(150mg，0.600mmol)、Et3N(242mg，2.40mmol)和二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯(94mg，0.30mmol)在CH3CN(100mL)中的混合物過夜。在減壓下蒸發(fā)混合物。通過制備性HPLC(用H2O(0.5％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生S,S-二((R)-3-(二乙基氨基)-3-氧代-2-丙酰胺基丙基)丁烷二(硫代酸酯)(產(chǎn)率為36％)，作為黃色固體。實(shí)施例30：4-(2-(2-(二乙基氨基)-2-氧乙氧基)乙硫基)-4-氧代丁酸(NV193,01-193)的合成在0℃下，向2-溴乙酰溴(4.00g，20.0mmol)和DIPEA(2.60g，20mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液逐滴添加二乙胺(1.60g，20.0mmol)。在0℃下攪拌混合物30分鐘。在減壓下蒸發(fā)溶液以除去CH2Cl2。通過硅膠柱色譜(EtOAc/石油醚＝1/5～1/2)來純化殘余物以產(chǎn)生2-溴-N,N-二乙基乙酰胺，作為黃色油。在回流下加熱2-巰基乙醇(2.50g，32.0mmol)、三苯基氯甲烷(10.7g，38.4mmol)在100mL的THF中的溶液過夜。濃縮反應(yīng)混合物并通過硅膠柱色譜(EtOAc/石油醚＝1/5～1/1)來純化殘余物以產(chǎn)生2-(2,2,2-三苯基乙硫基)乙醇，作為白色固體。在0℃下，向2-(2,2,2-三苯基乙硫基)乙醇(3.50g，10.9mmol)在THF(30mL)中的溶液分批添加NaH(0.500g，13.0mmol，60％，在油中)。在0℃下攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)。然后逐滴添加2-溴-N,N-二乙基乙酰胺(2.1g，10.9mmol)在THF(5mL)中的溶液。經(jīng)2小時(shí)，將產(chǎn)生的混合物升溫至室溫。用水驟冷混合物并用EtOAc提取兩次。用鹽水洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na2SO4干燥并在減壓下濃縮。通過硅膠柱色譜(EtOAc/石油醚＝1/5～1/2)來純化殘余物以產(chǎn)生N,N-二乙基-2-(2-(三苯甲硫基)乙氧基)乙酰胺，作為白色固體。在0℃下，向N,N-二乙基-2-(2-(三苯甲硫基)乙氧基)乙酰胺(2.70g，6.30mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液添加TFA(2mL)和i-Pr3SiH(2.00g，12.6mmol)。將混合物升溫至室溫并攪拌2小時(shí)。在減壓下蒸發(fā)溶液以除去CH2Cl2。通過硅膠柱色譜(EtOAc/石油醚＝1/5～1/1)來純化殘余物以產(chǎn)生N,N-二乙基-2-(2-巰基乙氧基)乙酰胺，作為無色油。在回流下，攪拌N,N-二乙基-2-(2-巰基乙氧基)乙酰胺(356mg，1.90mmol)、琥珀酸酐(200mg，2.10mmol)和Et3N(300mg，2.90mmol)在10mL的THF中的溶液過夜。真空濃縮反應(yīng)混合物并通過制備性HPLC(用H2O(0.5％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生4-(2-(2-(二乙基氨基)-2-氧乙氧基)乙硫基)-4-氧代丁酸，作為無色油。實(shí)施例31：(R)-甲基3-(4-((R)-3-甲氧基-3-氧代-2-丙酰胺基丙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸酯(NV205,01-205)的合成在室溫下攪拌(R)-3-(4-((R)-2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸(300mg，0.69mmol)、CH3I(293mg，2.06mmol)和K2CO3(475mg，3.44mmol)在4.0mL的DMF中的混合物過夜。過濾反應(yīng)混合物并直接通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化濾液以產(chǎn)生(R)-甲基3-(4-((R)-3-甲氧基-3-氧代-2-丙酰胺基丙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸酯，作為灰白色固體。實(shí)施例32：NV189的合成在室溫下攪拌N-(2-巰基-2-甲基丙基)乙酰胺(400mg，2.72mmol)、二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯(339mg，1.09mmol)和Et3N(550mg，5.44mmol)在6mL的CH3CN中的混合物過夜。濃縮反應(yīng)混合物并通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生NV189，作為灰白色固體。實(shí)施例33：S,S-二(2-(2-(二乙基氨基)-2-氧乙氧基)乙基)丁烷二(硫代酸酯)(NV195,01-195)的合成向N,N-二乙基-2-(2-巰基乙氧基)乙酰胺(438mg，2.3mmol)在CH3CN(10mL)中的溶液添加二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯(374mg，1.2mmol)和Et3N(232mg，2.3mmol)。在室溫下攪拌混合物過夜。真空濃縮反應(yīng)混合物并通過制備性HPLC(用H2O(0.5％TFA)和CH3CN洗脫)來純化殘余物以產(chǎn)生S,S-二(2-(2-(二乙基氨基)-2-氧乙氧基)乙基)丁烷二(硫代酸酯)，作為無色油。實(shí)施例34：NV206的合成在室溫下攪拌(R)-3-(4-((R)-2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸(400mg，0.916mmol)、CH3I(156mg，1.1mmol)和K2CO3(190mg，1.37mmol)在4mL的DMF中的混合物6小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物并直接通過制備性HPLC(用H2O(0.05％TFA)和CH3CN洗脫)來純化濾液以產(chǎn)生NV206，作為無色膠狀物。實(shí)施例35：NV134(01-134)的合成在室溫下攪拌4-氯丁-1-醇(8.00g，73.7mmol)和PCC(23.8g，110.5mmol)在CH2Cl2(200mL)中的溶液3小時(shí)。然后用醚稀釋混合物，并通過硅藻土和中性氧化鋁的墊加以過濾。在醚中研制黑色膠。濃縮濾液以得到5.70g的4-氯丁醛，作為淺黃色液體，其用于下一步驟而沒有進(jìn)一步的純化。在-5℃和氮?dú)庀拢騔nCl2(120mg，0.9mmol)和乙酰氯(3.50g，44.1mmol)的混合物逐滴添加4-氯丁醛(4.70g，44.1mmol)在CH2Cl2(7mL)中的溶液。在-5℃下攪拌混合物1小時(shí)，然后在室溫下攪拌混合物1小時(shí)。用水稀釋混合物并用CH2Cl2提取兩次。用水洗滌合并的CH2Cl2提取物，干燥(Na2SO4)并濃縮以產(chǎn)生乙酸-1,4-二氯丁酯，作為黃色油，其用于下一步驟而沒有進(jìn)一步的純化。向乙酸1,4-二氯丁酯(1.2g，6.48mmol)和琥珀酸單芐酯(1.35g，6.48mmol)在CH3CN(15mL)中的溶液添加K2CO3(0.98g，7.08mmol)和NaI(0.09g，0.59mmol)。在75℃下攪拌產(chǎn)生的混合物過夜。用水稀釋混合物并用EtOAc提取兩次。干燥(Na2SO4)和濃縮合并的有機(jī)提取物。通過硅膠柱色譜(EtOAc/石油醚＝1/10～1/5)來純化殘余物以產(chǎn)生NV-133，作為無色油。在室溫下，在氫氣氛下(球表瓶)，攪拌NV-133(450mg，0.85mmol)和Pd/C(10％，200mg)在EtOH(20mL)中的混合物3小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物并在減壓下濃縮以產(chǎn)生NV-134，作為無色油。實(shí)施例36：4-(1-乙酰氧基-4-(1,3-二氧異吲哚啉-2-基)丁氧基)-4-氧代丁酸(NV150,01-150)的合成在-5℃和氮?dú)庀?，向ZnCl2(26.0mg，0.190mmol)和乙酰溴(1.15g，9.40mmol)的混合物逐滴添加4-氯丁醛(1.0g，9.4mmol)在CH2Cl2(1.5mL)中的溶液。在-5℃下攪拌混合物1小時(shí)，然后在室溫下攪拌混合物1小時(shí)。用水稀釋混合物并用CH2Cl2提取兩次。用水洗滌合并的CH2Cl2提取物，干燥(Na2SO4)并在減壓下濃縮以產(chǎn)生乙酸-1-溴-4-氯丁酯，作為黃色油，其用于下一步驟而沒有進(jìn)一步的純化。向乙酸1-溴-4-氯丁酯(1.3g，5.6mmol)和琥珀酸單芐酯(1.1g，5.1mmol)在CH3CN(15mL)中的溶液添加K2CO3(0.85g，6.1mmol)。在室溫下攪拌混合物過夜。用水稀釋混合物并用EtOAc提取兩次。干燥(Na2SO4)合并的有機(jī)提取物并濃縮。通過硅膠柱色譜(EtOAc/石油醚＝1/10～1/5)來純化殘余物以產(chǎn)生1-乙酰氧基-4-氯丁基芐基琥珀酸酯，作為無色油。向化合物1-乙酰氧基-4-氯丁基芐基琥珀酸酯(900mg，2.50mmol)和鄰苯鄰二甲酰亞胺(371mg，2.50mmol)在DMF(20mL)中的溶液添加K2CO3(522mg，3.80mmol)。在80℃下攪拌混合物過夜。用水稀釋混合物并用EtOAc提取兩次。干燥(Na2SO4)合并的有機(jī)提取物并濃縮。通過硅膠柱色譜(EtOAc/石油醚＝1/10～1/3)來純化殘余物以產(chǎn)生1-乙酰氧基-4-(1,3-二氧異吲哚啉-2-基)丁基芐基琥珀酸酯(550mg，產(chǎn)率為46％)，作為微黃色固體。參考文獻(xiàn)Al-Abri,S.A.,Hayashi,S.,Thoren,K.L.&Olson,K.R.2013.Metforminoverdose-inducedhypoglycemiaintheabsenceofotherantidiabeticdrugs.ClinToxicol(Phila),51,444-7.Bailey,C.J.1992.BiguanidesandNIDDM.DiabetesCare,15,755-72.Boyum,A.1968.Isolationofmononuclearcellsandgranulocytesfromhumanblood.Isolationofmonuclearcellsbyonecentrifugation,andofgranulocytesbycombiningcentrifugationandsedimentationat1g.ScandJClinLabInvestSuppl,97,77-89.Brunmair,B.,Staniek,K.,Gras,F.,Scharf,N.,Althaym,A.,Clara,R.,Roden,M.,Gnaiger,E.,Nohl,H.,Waldhausl,W.&Furnsinn,C.2004.Thiazolidinediones,likemetformin,inhibitrespiratorycomplexI:acommonmechanismcontributingtotheirantidiabeticactions？Diabetes,53,1052-9.Carvalho,C.,Correia,S.,Santos,M.S.,Seica,R.,Oliveira,C.R.&Moreira,P.I.2008.Metforminpromotesisolatedratlivermitochondriaimpairment.MolCellBiochem,308,75-83.Chan,K.,Truong,D.,Shangari,N.&O'Brien,P.J.2005.Drug-inducedmitochondrialtoxicity.ExpertOpinDrugMetabToxicol,1,655-69.Davidson,M.B.&Peters,A.L.1997.Anoverviewofmetformininthetreatmentoftype2diabetesmellitus.AmJMed,102,99-110.Dy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