背景技術(shù)：

臨床上，上頜骨和下頜骨中的骨吸收發(fā)生在齒列損失后。部分無(wú)齒影響40％的成年人群，并且估計(jì)在未來(lái)15年將增加到超過(guò)2億人（factsandfigures.2012,americancollegeofprosthodontics）。在此情況下，骨吸收導(dǎo)致牙槽嵴在寬度和高度上減小，在牙齒損失后的第一年期間發(fā)生骨寬度減少50％，其中三分之二發(fā)生在最初的3個(gè)月（schropp，l.等，intjperiodonticsrestorativedent，2003.23(4)：第313-23頁(yè)）。這樣的結(jié)果是，在用牙植入物恢復(fù)患者齒列之前，需要單獨(dú)的手術(shù)來(lái)替換這種損失的骨結(jié)構(gòu)。有各種外科手術(shù)可用于移植高度和寬度上的缺損牙槽嵴。為此，將骨移植物，通常是同種異體移植骨粉/顆?；驂K放置在空隙空間中，以提供用于靶向骨再生的骨傳導(dǎo)性/骨誘導(dǎo)性信號(hào)。許多這些手術(shù)利用導(dǎo)向骨再生（gbr）膜將骨移植物以及軟組織保持在適當(dāng)位置。迄今為止，尚未開(kāi)發(fā)用于大缺損的牙槽嵴骨移植的“理想”gbr膜（bottino，m.c.等，dentmater，2012.28(7)：第703-21頁(yè);dimitriou，r.等，bmcmed，2012.10：第81頁(yè)）。

用作牙齒拔除中的膜屏障的目前的生物材料通常難以處理，快速降解，并且不提供增強(qiáng)的傷口再生，其對(duì)于在骨移植物上的組織完全和及時(shí)閉合是至關(guān)重要的。迫切需要一種能夠支持骨生長(zhǎng)、促進(jìn)骨和軟組織愈合并抑制感染的生物可降解材料。這種材料可用于治療影響骨和軟組織的損傷、病癥和失調(diào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

如本文所述，本發(fā)明的特征在于生物可降解屏障材料和使用這些材料促進(jìn)骨和軟組織生長(zhǎng)和愈合的體外和體內(nèi)方法。

一方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含：

a）生物可降解聚合物；和

b）蜂蜜。

在某些實(shí)施方案中，所述組合物另外包含c）填料。

在某些實(shí)施方案中，所述生物可降解聚合物包含蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白是明膠。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白是膠原蛋白。

在某些實(shí)施方案中，所述生物可降解聚合物包含聚(乳酸)。

在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于100重量份的生物可降解聚合物例如明膠，蜂蜜的存在量為約1重量份至約300重量份。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于100重量份的生物可降解聚合物例如明膠，蜂蜜的存在量為約1重量份至約100重量份，約1重量份至約50重量份，約1重量份至約15重量份，或特別是約5重量份至約10重量份。

在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于100重量份的生物可降解聚合物，填料的存在量為1-300重量份。優(yōu)選地，填料的存在量為約1-100重量份，5-50重量份，或特別是10-20重量份。

在某些實(shí)施方案中，填料包括納米填料、微細(xì)填料或其混合物。納米填料的納米級(jí)的平均直徑范圍為約1nm至約999nm，或小于約1μm。在某些實(shí)施方案中，納米填料適當(dāng)?shù)鼐哂行∮诩s990nm，小于約900nm，小于約800nm，小于約700nm，小于約600nm，小于約500nm，小于約400nm，小于約300nm，小于約200nm，或小于約100nm的平均直徑。在某些實(shí)施方案中，納米填料適當(dāng)?shù)鼐哂屑s1-100nm，約10-80nm，約25-75nm，或特別是約50nm的平均直徑。微細(xì)填料是微米尺寸的填料，其具有至少約1μm的微米級(jí)的平均直徑。微細(xì)填料適宜地具有約小于約10μm，小于約9μm，小于約8μm，小于約7μm，小于約6μm，小于約5μm，小于約4μm，小于約3μm，小于約2μm，或特別是約1-2μm的平均直徑。

在某些實(shí)施方案中，所述填料包含幾丁質(zhì)晶須。在某些實(shí)施方案中，所述填料包含羥基磷灰石。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于100重量份的生物可降解聚合物，填料（例如幾丁質(zhì)晶須）的存在量為約15重量份。在某些實(shí)施方案中，幾丁質(zhì)晶須具有約25-75nm的平均直徑，或特別是約50nm的平均直徑。在某些實(shí)施方案中，幾丁質(zhì)晶須的平均長(zhǎng)度為約200-400nm，約250-300nm，或特別是約280nm。

在某些實(shí)施方案中，所述組合物還包含至少一種或多種額外的填料或至少一種或多種治療劑，例如抗生素。在某些實(shí)施方案中，所述治療劑是治療有效量的蜂蜜。在具體實(shí)施方案中，所述組合物還包含相對(duì)于100重量份生物可降解聚合物范圍為約50重量份至約300重量份，或約100重量份至約200重量份的抗菌有效量的蜂蜜。在具體實(shí)施方案中，所述組合物還包含有效量的蜂蜜，用于刺激或增強(qiáng)再生（細(xì)胞增殖和遷移），其范圍為約10重量份至約100重量份，約20重量份至約70重量份，或特別是約50重量份，相對(duì)于100重量份的生物可降解聚合物。用于治療用途的蜂蜜與上述蜂蜜相同或不同。

另一方面，本發(fā)明提供了一種膜，包括：

a）生物可降解聚合物;

b）蜂蜜。

在某些實(shí)施方案中，所述膜可額外包含填料。

另一方面，多層膜包含至少兩層本發(fā)明的膜。

在某些實(shí)施方案中，所述多層膜包含2-4層本發(fā)明的膜。在某些實(shí)施方案中，所述多層膜包括四層膜。在某些實(shí)施方案中，所述至少兩層是交聯(lián)的。在某些實(shí)施方案中，所述至少兩層與1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、京尼平、戊二醛或其混合物交聯(lián)。

另一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明組合物（即，包含生物可降解聚合物和蜂蜜的組合物）的方法。該組合物可另外包含填料。該方法包括：通過(guò)將生物可降解聚合物和蜂蜜與溶劑結(jié)合來(lái)形成組合物。

優(yōu)選地，該方法包括：

a）將填料分散在溶劑中以形成分散體；和

b）將生物可降解聚合物和蜂蜜與所述分散體結(jié)合以形成組合物。

在某些實(shí)施方案中，所述溶劑是2,2,2-三氟乙醇，1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（hfp）或9:1的乙酸:水。在某些實(shí)施方案中，在用于形成和加工組合物、纖維和/或膜的條件下所述溶劑不會(huì)使蜂蜜顯著溶解。

另一方面，本發(fā)明提供了一種纖維，包括：

a）生物可降解聚合物；和

b）蜂蜜。

所述纖維還可以包含填料。

在優(yōu)選的方面，所述“纖維”可以包括納米纖維、微纖維或納米微纖維。所述纖維可以形成為束，而不限于包含所述納米纖維、微纖維、納米微纖維或其混合物的數(shù)量或其總厚度。在某些實(shí)施方案中，納米纖維具有范圍為約1nm至約950nm的納米級(jí)的平均直徑或厚度。優(yōu)選地，納米纖維適當(dāng)?shù)鼐哂行∮诩s100nm的平均直徑或厚度。微纖維具有范圍為約1μm至約950μm的微米級(jí)的平均直徑或厚度。優(yōu)選地，微纖維適當(dāng)?shù)鼐哂屑s小于約10μm的平均直徑或厚度。此外，納米微纖維適宜地具有范圍為約100nm至約10μm的平均直徑或厚度。

另一方面，本發(fā)明提供一種制備纖維的方法，所述纖維包含生物可降解聚合物和蜂蜜。所述纖維可以另外包含填料。該方法包括：

通過(guò)使生物可降解聚合物和蜂蜜與溶劑結(jié)合來(lái)形成組合物；和

靜電紡絲所述組合物以形成纖維。

優(yōu)選地，該方法包括：

a）將填料分散在溶劑中以形成分散體;

b）使生物可降解聚合物和蜂蜜與所述分散體結(jié)合以形成組合物；和

c）靜電紡絲所述組合物以形成纖維。

另一方面，本發(fā)明提供一種制備膜的方法，所述膜包含生物可降解聚合物和蜂蜜。所述膜可以另外包含填料。該方法包括：

通過(guò)使生物可降解聚合物和蜂蜜與溶劑結(jié)合來(lái)形成組合物；和

靜電紡絲所述組合物以形成纖維，從而形成膜。

優(yōu)選地，該方法包括：

a）將填料分散在溶劑中以形成分散體;

b）使生物可降解聚合物和蜂蜜與所述分散體結(jié)合以形成組合物；和

c）靜電紡絲所述組合物以形成纖維，從而形成膜。

另一方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的膜的方法，所述方法包括：

a）將填料分散在溶劑中以形成分散體;

b）使生物可降解聚合物和蜂蜜與所述分散體結(jié)合;

c）從分散體中除去溶劑以形成海綿；和

d）壓縮海綿以形成膜。

在某些實(shí)施方案中，壓縮步驟包括在至少3000磅的壓力下壓縮海綿。

在某些實(shí)施方案中，所述膜被進(jìn)一步加工以形成塊、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或壓縮膜。

另一方面，本發(fā)明提供了一種多層膜，其包含：

a）生物可降解聚合物；和

b）蜂蜜。

所述多層膜還可以包含填料。

另一方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明多層膜的方法，該方法包括：

通過(guò)使生物可降解聚合物和蜂蜜與溶劑結(jié)合來(lái)形成組合物;

靜電紡絲所述組合物以形成纖維;

收集纖維以形成至少兩個(gè)非織造網(wǎng)眼膜；和

將所述至少兩個(gè)非織造網(wǎng)眼膜貼在一起以形成多層膜。

優(yōu)選地，該方法包括：

a）將填料分散在溶劑中以形成分散體;

b）使生物可降解聚合物和蜂蜜與所述分散體結(jié)合;

c）靜電紡絲所述組合物以形成纖維;

d）收集所述纖維以形成至少兩個(gè)非織造網(wǎng)眼膜；和

e）將所述至少兩個(gè)非織造網(wǎng)眼膜貼在一起以形成所述多層膜。

所述多層膜可以被壓縮或可以不被壓縮。

另一方面，本發(fā)明提供一種促進(jìn)骨再生的方法，所述方法包括使骨表面與本發(fā)明組合物、纖維、壓縮膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。

另一方面，本發(fā)明提供一種促進(jìn)骨缺損愈合的方法，所述方法包括使骨缺損與本發(fā)明組合物、纖維、壓縮膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。

另一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防骨缺損感染的方法，所述方法包括使骨缺損與本發(fā)明組合物、纖維、壓縮膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。

另一方面，本發(fā)明提供一種促進(jìn)受損組織中的軟組織愈合的方法，該方法包括使受損組織與本發(fā)明組合物、纖維、壓縮膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。

另一方面，本發(fā)明提供一種促進(jìn)組織中巨噬細(xì)胞響應(yīng)的方法，該方法包括使組織與本發(fā)明組合物、纖維、壓縮膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。

定義

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義。以下參考文獻(xiàn)向技術(shù)人員提供本發(fā)明中使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般定義：singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology（第2版，1994）；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology（walker編，1988）;theglossaryofgenetics，第5版，r.rieger等（編），springerverlag（1991）；和hale&marham,theharpercollinsdictionaryofbiology(1991)。如本文所用，除非另有說(shuō)明，以下術(shù)語(yǔ)具有下文給出的含義。

“試劑”是指任何小分子化學(xué)化合物、抗體、核酸分子、或多肽、或其片段。

“改善”是指減少、抑制、減弱、減小、控制或穩(wěn)定疾病的發(fā)展或進(jìn)展。

“改變”是指通過(guò)諸如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)已知方法檢測(cè)的變化（增加或減少）。如本文所用，改變包括10％、25％、40％、50％或更大的變化。

“軟組織疾病或損傷”是指破壞一種或多種軟組織的正常功能或連接性的任何疾病、失調(diào)或創(chuàng)傷。

在本公開(kāi)中，“包括”、“包含”、“含有”和“具有”等可以具有美國(guó)專(zhuān)利法賦予它們的含義，并且可以指“包括”、“包含”等?！盎旧嫌?..組成”或“基本上組成”同樣具有美國(guó)專(zhuān)利法中賦予的含義，并且該術(shù)語(yǔ)是開(kāi)放式的，允許存在比所記載的更多的存在，只要所記載的基本或新穎特征不會(huì)因比所記載的更多的存在而改變，而是排除現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)施方案。

“疾病”是指損害或干擾包括骨在內(nèi)的細(xì)胞、組織或器官的正常功能的任何病癥或失調(diào)。

“有效量”或“治療有效量”是指相對(duì)于未經(jīng)治療的受試者提供所需效果或解除疾病癥狀所需的本發(fā)明組合物的量。用于實(shí)施本發(fā)明供治療性治療疾病的細(xì)胞組合物的有效量根據(jù)施用方式、受試者的年齡、體重和一般健康狀況而變化。最終，主治醫(yī)師或獸醫(yī)將決定適當(dāng)?shù)牧亢蛣┝糠桨?。這種量被稱(chēng)為“治療有效”量?！耙浦病笔侵冈隗w內(nèi)細(xì)胞接觸和并入現(xiàn)有的目標(biāo)組織（例如骨或軟組織）的方法。

“增強(qiáng)骨愈合”是指相對(duì)于對(duì)照條件增加骨生長(zhǎng)或愈合的程度。優(yōu)選增加至少2倍，2.5倍，3倍或更多。

“微米級(jí)”是指100nm和999μm之間的尺寸。微米級(jí)的顆粒在尺寸上比納米管大。

如本文所用，“獲得”如在“獲得試劑”中包括合成、購(gòu)買(mǎi)或以其他方式獲取所述試劑。

“參考”是指標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諚l件。

“受試者”是指哺乳動(dòng)物，包括但不限于人或非人哺乳動(dòng)物如牛、馬、犬、羊或貓科動(dòng)物。

這里提供的范圍被理解為在該范圍內(nèi)的所有值的簡(jiǎn)寫(xiě)。例如，1至50的范圍被理解為包括以下的任何數(shù)字、數(shù)字組合或子范圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”（treat）、“治療”（treating）、“治療”（treatment）等是指減少或改善與之相關(guān)的失調(diào)和/或癥狀。應(yīng)當(dāng)理解，盡管不排除，治療疾病或病癥不要求完全消除與其相關(guān)的失調(diào)、病癥或癥狀。

除非具體說(shuō)明或從上下文中顯而易見(jiàn)，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“或”被理解為包含性的。除非具體說(shuō)明或從上下文中顯而易見(jiàn)，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“一”、“一個(gè)”和“所述”被理解為單數(shù)或復(fù)數(shù)。

除非具體說(shuō)明或從上下文中顯而易見(jiàn)，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”應(yīng)理解為在本領(lǐng)域的正常耐受范圍內(nèi)，例如在平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)?！凹s”可以理解為在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％內(nèi)。除非從上下文中明顯的，否則本文中提供的所有數(shù)值均被術(shù)語(yǔ)“約”修飾。

在本文的變量的任何定義中記載化學(xué)基團(tuán)的列表包括該變量作為任何單個(gè)組或列出的組的組合的定義。本文的變量或方面的實(shí)施方式的記載包括作為任何單個(gè)實(shí)施方式或與任何其它實(shí)施方式或其部分組合的實(shí)施方式。

本文提供的任何組合物或方法可以與本文提供的任何其它組合物和方法中的一種或多種組合。

附圖說(shuō)明

圖1顯示非壓縮和壓縮的靜電紡絲明膠+15％cw+蜂蜜支架（非交聯(lián)）的sem圖像。刻度條和放大倍數(shù)分別為10μm和2kx。

圖2顯示了使用來(lái)自圖1的sem圖像的fibraquant^tm自動(dòng)纖維直徑分析。上述直方圖顯示纖維尺寸分布以及平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（微米）。

圖3a-3b顯示了壓縮的靜電紡絲膜的單軸拉伸試驗(yàn)結(jié)果：a.斷裂應(yīng)變，b.彈性模量。

圖4顯示了示例性可成形的水合10％蜂蜜壓縮膜。

圖5顯示了細(xì)胞化（hdf）壓縮的靜電紡絲膜的dapi圖像?？潭葪l和放大倍數(shù)分別為200μm和10x。

圖6顯示非壓縮和壓縮明膠+10％cw+30mg/ml蜂蜜海綿的一般大體外觀的dinolite圖像。

圖7a示出了各種尺寸的示例性膜（海綿）顆粒。

圖7b示出了特定包裝在空隙（齒窩）中的示例性海綿。

圖7c示出當(dāng)顆粒被包裝在空隙中時(shí)被壓縮的凍干膜覆蓋的顆粒的示例性用途。

圖7d顯示用手壓縮的示例性干燥凍干海綿。

圖7e示出了水合時(shí)的示例性溶脹回到原始尺寸。

圖8顯示了用于支架壓縮的carver液壓?jiǎn)卧?/p>

圖9示意性地示出了示例性機(jī)械測(cè)試方法。

圖10顯示了非壓縮和壓縮的明膠+cw+mh膜的sem圖像，其包括分別為200μm和100x的刻度條和放大倍數(shù)。

圖11顯示了包括明膠+cw+mh降解結(jié)果（bca測(cè)定）的圖，如累積平均釋放測(cè)量所示；和圖11b顯示了包括明膠+cw+mh降解結(jié)果（bca測(cè)定）的圖，如累積百分比釋放測(cè)量所示。

圖12顯示了細(xì)胞化（hdf）的壓縮明膠+cw+mh膜的dapi圖像?？潭葪l和放大倍數(shù)分別為100μm和10x。

圖13顯示了示例性可成形的水合膜。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的特征在于包含蜂蜜的基于生物可降解聚合物的材料或基質(zhì)（例如纖維或膜）以及使用這種組合物來(lái)改善損傷或病癥（例如，與牙科手術(shù)相關(guān)的骨損傷或創(chuàng)傷）的體外和體內(nèi)方法。

本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：包含蜂蜜的生物可降解膜可以支持和促進(jìn)骨和組織的生長(zhǎng)和再生。此外，所述生物可降解膜包括抗菌有效量的蜂蜜，從而提供抗感染的抗菌屏障并促進(jìn)傷口愈合的無(wú)菌環(huán)境。

支架

一般而言，本發(fā)明的材料包括生物可降解聚合物和蜂蜜（例如，抗菌、殺菌和/或傷口愈合量的蜂蜜）。優(yōu)選地，所述材料可另外包含填料。

各種生物可降解聚合物是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的生物可降解聚合物包括蛋白（如明膠和膠原蛋白），衍生自天然存在的單體的聚合物（如聚(乳酸(pla))）和衍生自合成單體的聚合物（如聚二氧環(huán)己酮(pdo)）。期望生物可降解材料將在不到一年的時(shí)間內(nèi)降解，更優(yōu)選不到六個(gè)月。一般來(lái)說(shuō)，生物可相容的并且可以成形或形成為纖維和膜的任何生物可降解聚合物可用于本發(fā)明材料中。也可使用生物可降解聚合物的共聚物或混合物/共混物（多組分）。

其他生物可相容的聚合物，其中一些是生物可降解的，包括，例如這種聚合物，其包括但不限于以下：聚(氨基甲酸酯)、聚(硅氧烷)或硅酮、聚(乙烯)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(乙烯醇)，聚(丙烯酸)，聚丙烯酰胺，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(乙二醇)、聚(甲基丙烯酸)，聚乳酸(pla)，聚乙醇酸(pga)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)，尼龍，聚酰胺，聚酐，聚(乙烯-共-乙烯醇)(evoh)、聚己內(nèi)酯、聚(乙酸乙烯酯)(pva)，聚乙烯基氫氧化物、聚(環(huán)氧乙烷)(peo)和聚原酸酯或可被開(kāi)發(fā)的生物可相容的任何其它類(lèi)似的合成聚合物。一些優(yōu)選的合成基質(zhì)材料包括pla、pga、pla和pga的共聚物、聚己內(nèi)酯、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、(evoh)、pva和peo。另見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,374,774（其通過(guò)引用并入本文）。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“填料”是指向聚合物纖維、長(zhǎng)絲或膜提供結(jié)構(gòu)增強(qiáng)或剛性的有機(jī)或無(wú)機(jī)生物可相容材料。填料可以是結(jié)晶體、纖維或顆粒?；蛘?，填料適當(dāng)?shù)鼐哂邪簟⒗w維、球體、橢圓體、多面體晶體等的形狀，然而，填料的形狀不特別限于此。該填料的納米級(jí)（納米填料）平均直徑在約1nm至約950nm的范圍內(nèi)。納米填料適當(dāng)?shù)鼐哂屑s1-100nm，約10-80nm，約25-75nm，或特別是約50nm的平均直徑?；蛘?，填料具有大于至少約100nm的微米級(jí)（微填料）的平均直徑。微填料適宜地具有約小于約10μm，小于約9μm，小于約8μm，小于約7μm，小于約6μm，小于約5μm，小于約4μm，小于約3μm，小于約2μm，或特別小于約1μm的平均直徑。例如，所述填料是納米結(jié)晶體或纖維材料，其平均直徑或厚度小于約100nm，且有利地可以具有小于約500nm的平均長(zhǎng)度。有利地，納米填料可以具有靜電荷，當(dāng)植入或施加到傷口部位時(shí)，其可以粘附或吸引生長(zhǎng)因子。適用于本發(fā)明材料的納米填料材料的實(shí)例包括幾丁質(zhì)晶須和羥基磷灰石納米晶體。也可以沒(méi)有限制地使用包含納米填料和微填料的填料的混合物。

本發(fā)明的材料還包括蜂蜜?？梢允褂萌魏晤?lèi)型的蜂蜜。蜂蜜類(lèi)型的實(shí)例包括麥盧卡蜂蜜、薄子木屬（leptospermum）蜂蜜或蕎麥蜂蜜。也可以使用不同蜂蜜的混合物。例如，麥盧卡蜂蜜是umf評(píng)級(jí)在10以上的活性或治療性麥盧卡蜂蜜。蜂蜜以有效抑制細(xì)菌（例如病原菌）的生長(zhǎng)或擴(kuò)散的量存在于本發(fā)明的組合物和材料中。示例性細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌（s.aureus）（包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)）、牙齦卟啉單胞菌（p.gingivalis）、表皮葡萄球菌（s.epidermidis）、屎腸球菌（enterococcusfaecium）、大腸桿菌（e.coli）、銅綠假單胞菌（p.aeruginosa）、陰溝腸桿菌（e.cloacae）和產(chǎn)酸克雷伯菌（klebsiellaoxytoca）。此外，蕎麥蜂蜜可以以愈合有效量包含在內(nèi)。

所使用的蜂蜜的量部分取決于待用本發(fā)明的組合物處理的傷口或損傷的性質(zhì)；待抑制的細(xì)菌的類(lèi)型；蜂蜜的濃度；以及所用的特定蜂蜜的抗菌性質(zhì)。蜂蜜的抗菌、抗微生物和殺菌性質(zhì)取決于各種因素，包括甲基乙二醛（mgo）的濃度、獨(dú)特麥盧卡因子（umf）、蜂蜜中其它酚類(lèi)化合物的存在、傷口ph值、蜂蜜的ph以及由蜂蜜施加的滲透壓。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能夠選擇用于本發(fā)明組合物的蜂蜜的合適類(lèi)型和量。在某些實(shí)施方案中，基于生物可降解聚合物的重量，蜂蜜的量為1重量份至15重量份（1-15重量％）。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括100重量份的生物可降解聚合物和約1重量份至約15重量份的蜂蜜。所述組合物可以另外包含10-20重量份的填料。如本文所述，也可以存在其它化合物或試劑。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包含治療有效量的蜂蜜。例如，將抗菌有效量的蜂蜜加入到組合物中，其相對(duì)于100重量份的生物可降解聚合物，范圍為約50重量份至約300重量份，或約100重量份至約200重量份。此外，向組合物中加入額外量的蜂蜜以刺激或增強(qiáng)再生（細(xì)胞增殖和遷移），相對(duì)于100重量份的生物可降解聚合物，其范圍為約10重量份至約100重量份，約20重量份至約70重量份，或特別是約50重量份。

制備組合物的方法

包含生物可降解聚合物、填料和蜂蜜的組合物可以通過(guò)任何合適的方法制備，其中一些是本領(lǐng)域已知的。一般而言，填料可以懸浮或分散在溶劑（其基本上不會(huì)溶解填料）中以形成分散體或懸浮液；然后將生物可降解聚合物和蜂蜜與所述分散體或懸浮液混合以形成本發(fā)明的組合物。在某些實(shí)施方案中，向組合物中另外加入治療有效量的蜂蜜用于抗菌作用或增強(qiáng)再生。在某些實(shí)施方案中，所述溶劑是2,2,2-三氟乙醇、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（hfp）或9:1的乙酸:水。所用溶劑的量應(yīng)該被最小化以促進(jìn)將所述組合物靜電紡絲或其它加工成為纖維和膜。

纖維和膜的制備方法

包含生物可降解聚合物、填料和抗菌有效量的蜂蜜的組合物可用于通過(guò)任何合適的方法制備纖維和膜，其中一些是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)靜電紡絲形成纖維或膜。靜電紡絲是已知的技術(shù)（參見(jiàn)例如li等人，biomaterials.2005年10月;26(30):5999-6008.）并且靜電紡絲設(shè)備可以商購(gòu)。例如，包含例如生物可降解聚合物的帶電溶液通過(guò)小開(kāi)口或噴嘴（通常是針或移液管吸頭）進(jìn)料。由于其電荷，將溶液作為噴射流拽向接地的收集板（例如，金屬篩、板或旋轉(zhuǎn)的心軸，通常在5-30cm外）。在噴射流運(yùn)行期間，所述溶劑逐漸蒸發(fā)，并且?guī)щ娎w維留在接地靶上積聚。纖維上的電荷最終消散到周?chē)沫h(huán)境中。如果允許靶相對(duì)于噴嘴位置移動(dòng)，則可以實(shí)現(xiàn)特定的纖維取向（排列成一線或隨機(jī)）。

本發(fā)明的組合物可被制成靜電紡絲的纖維組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)膜的方法，所述方法包括：

a）將填料分散在溶劑中以形成分散體;

b）使生物可降解聚合物和蜂蜜與所述分散體結(jié)合以形成組合物；和

c）靜電紡絲所述組合物以形成纖維，從而形成包含生物可降解聚合物、填料和抗菌有效量的蜂蜜的膜。

在某些實(shí)施方案中，將填料加入到組合物中，使得步驟a）可以省略，并且生物可降解聚合物和蜂蜜可與溶劑結(jié)合以形成組合物。

該方法可進(jìn)一步包括在靜電紡絲之前向組合物中加入至少一種另外的填料、至少一種治療劑或治療有效量的蜂蜜。靜電紡絲的膜可以形成為多個(gè)層。例如，所述組合物可以在一個(gè)層或其它層的頂部另外靜電紡絲，以產(chǎn)生多層靜電紡絲的膜。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從包含生物可降解聚合物、填料和抗菌有效量的蜂蜜的分散體中除去溶劑以形成海綿?？梢酝ㄟ^(guò)蒸發(fā)或凍干（冷凍干燥）除去溶劑。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)膜的方法，所述方法包括：

a）將填料分散在溶劑中以形成分散體；

b）使生物可降解聚合物和蜂蜜與所述分散體結(jié)合；

c）從所述分散體中除去溶劑以形成海綿；和

d）壓縮所述海綿以形成包含生物可降解聚合物、填料和抗菌有效量的蜂蜜的膜。

在某些實(shí)施方案中，將所述填料加入到組合物中，使得步驟a）可以省略，并且生物可降解聚合物和蜂蜜可與溶劑結(jié)合以形成組合物。

該方法可以進(jìn)一步包括向所述組合物中加入至少一種另外的填料、至少一種治療劑或治療有效量的蜂蜜。

從上下文可以理解，術(shù)語(yǔ)“膜”在本文中用于指壓縮靜電紡絲墊/膜或壓縮海綿之后的產(chǎn)品，如本文所述。因此，本文中的“膜”包括壓縮纖維和壓縮海綿兩者（除非另外從上下文中清楚）。

在壓縮之前可以將海綿凍干。

在某些實(shí)施方案中，取決于骨移植應(yīng)用，海綿（凍干或非凍干的）可以在壓縮之前例如基于其應(yīng)用以塊或顆?；蚰ニ樾问竭M(jìn)行適當(dāng)?shù)募庸ぁ?/p>

或者，取決于骨移植應(yīng)用，壓縮的海綿、纖維或膜可以在壓縮后以塊或顆?；蚰ニ樾问竭m當(dāng)?shù)丶庸ぁ?/p>

或者，所述海綿不被壓縮，或者以較小的壓力或基本較小的壓力，例如用手壓縮，僅為了產(chǎn)生溶脹勢(shì)（圖7d-7e）。

可以通過(guò)將至少兩個(gè)膜貼在一起來(lái)形成多層膜。

在某些實(shí)施方案中，通過(guò)壓縮多個(gè)層的海綿形成多層膜。在具體實(shí)施方案中，所述多層膜由多個(gè)凍干海綿通過(guò)壓縮其多層而形成。多層膜可以被壓縮或不被壓縮。例如，可以通過(guò)壓縮多個(gè)層的通過(guò)本文所述的任何方法形成的膜來(lái)形成多層膜。一般而言，在4,000-24,000磅壓力下的兩個(gè)表面（例如不銹鋼板或塊，例如在液壓機(jī)中）之間的2-10個(gè)膜（更優(yōu)選2-4個(gè)膜）的壓縮通常將導(dǎo)致膜的壓接以形成多層膜。

或者，可以使用多種溶劑形成多層膜。在某些實(shí)施方案中，使用具有不同密度的至少兩種或更多種溶劑來(lái)溶解填料并結(jié)合其它組分（例如生物可降解聚合物和蜂蜜）。例如，將由組合物和不同溶劑制成的溶液合并，并且基于溶劑的密度，所述合并的溶液可以形成不同的層。除去溶劑后，可以制備多層海綿和多層膜。所述多層膜可以被壓縮或不被壓縮。

該膜可以使用交聯(lián)試劑進(jìn)行交聯(lián)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有至少兩個(gè)層的多層膜，其中所述至少兩個(gè)層是交聯(lián)的，例如以穩(wěn)定多層膜結(jié)構(gòu)。示例性交聯(lián)試劑包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺（或其它碳二亞胺）、京尼平或戊二醛?？梢詫⒛そ肴軇┤缫掖贾械慕宦?lián)劑（例如20-40mm）的溶液中。當(dāng)發(fā)生所需量的交聯(lián)時(shí)，該膜可以從溶液中移除并在使用前沖洗。

用于本發(fā)明治療方法的膜應(yīng)具有足夠的剛性以支持周?chē)能浗M織，在其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（tg）下可延展，但是在冷卻時(shí)恢復(fù)剛性（即保持原位形成的形狀），并且是生物可相容的，在于它將促進(jìn)骨整合并且不會(huì)對(duì)周?chē)浗M織產(chǎn)生不利影響。所述膜應(yīng)該在6-9個(gè)月內(nèi)吸收，因?yàn)樵谙骂M骨和上頜骨移植手術(shù)中同種異體移植骨需要大約6個(gè)月才能固結(jié)成新骨。本發(fā)明的膜是柔性的，在加熱時(shí)可成形，在冷卻時(shí)保持其形狀，在降解過(guò)程中呈較小酸性，并且纖維結(jié)構(gòu)將調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞（mac）響應(yīng)并相對(duì)于炎癥的（m1mac表型），允許骨和組織再生（m2mac表型）。

本發(fā)明的膜的尺寸和厚度可以根據(jù)預(yù)期用途而變化?？蓪⒛ぜ彸伤璩叽?，或可將海綿澆鑄成所需尺寸，然后壓縮成所需的密度和厚度。例如，屏障膜的厚度通常在0.1-0.4mm之間，因此海綿可被適當(dāng)?shù)貕嚎s至約0.1-0.4mm的厚度。

所述膜可以具有任何形狀（圓形、正方形、矩形、不規(guī)則）。在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的膜具有1至20mm的寬度和1至20mm的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，膜的厚度小于1mm，厚度小于0.5mm，厚度小于0.3mm或厚度小于100微米。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膜具有至少90％、100％、110％或120％的斷裂應(yīng)變。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膜具有至少約5mpa，或10、15、20或25mpa的彈性模量。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膜具有至少約0.26n的最大壓縮載荷。

治療和預(yù)防應(yīng)用

本發(fā)明提供了可用于改善與骨或軟組織疾病或損傷相關(guān)的病癥的材料的現(xiàn)成供應(yīng)。將本發(fā)明的組合物和材料（例如，直接或間接地）施用于損傷或患病的組織或器官，其中它們移植并與靶組織（例如骨、肌肉、齒齦、牙齦、粘膜、皮膚）建立功能性連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的膜增強(qiáng)了骨愈合。用于修復(fù)受損組織或器官的方法可以在體外、體內(nèi)或離體進(jìn)行。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述膜用于牙科應(yīng)用，例如在下頜骨和上頜骨移植手術(shù)中。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供促進(jìn)骨再生的方法，該方法包括使骨表面與本發(fā)明的組合物、纖維、壓縮膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。在某些實(shí)施方案中，該方法是在骨外科手術(shù)之后促進(jìn)骨再生的方法，所述骨外科手術(shù)包括牙槽嵴保存、牙槽嵴增高、竇移植或骨移植。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供促進(jìn)骨缺損愈合的方法，所述方法包括使骨缺損與本發(fā)明的組合物、纖維、壓縮膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種預(yù)防骨缺損感染的方法，所述方法包括使骨缺損與本發(fā)明的組合物、纖維、膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種促進(jìn)受損組織中的軟組織愈合的方法，所述方法包括使所述受損組織與本發(fā)明的組合物、纖維、膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。

在上述方面的某些實(shí)施方案中，該方法是在骨外科手術(shù)后促進(jìn)骨再生的方法，所述骨外科手術(shù)包括牙槽嵴保存、牙槽嵴增高、竇移植或骨移植。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了促進(jìn)組織中的巨噬細(xì)胞響應(yīng)的方法，所述方法包括使所述組織與本發(fā)明的組合物、纖維、膜、顆粒、溶脹膜、非壓縮膜或多層膜（壓縮或非壓縮的）接觸。

施用

本發(fā)明的組合物、纖維和膜可以直接提供給目標(biāo)組織或器官（例如通過(guò)直接施用于骨或組織表面，或通過(guò)手術(shù)植入）。膜可用于覆蓋、包圍、填充或以其它方式接觸骨或組織缺損、傷口、皮膚/傷口愈合、牙齦萎縮或手術(shù)部位。

如果需要，可以在施用組合物、纖維或膜之前、期間或之后提供膨脹和分化劑，以增加、維持或增強(qiáng)體內(nèi)細(xì)胞的產(chǎn)生或分化，所述細(xì)胞包括來(lái)自受試者骨的骨細(xì)胞或來(lái)自任何類(lèi)型的骨移植材料/移植體，即同種異體、異種異體、異體或基因產(chǎn)生的骨的骨細(xì)胞。本發(fā)明的組合物包括藥物組合物。當(dāng)施用本發(fā)明的治療組合物或材料（例如藥物組合物）時(shí)，其通常將以單位劑型配制。另外的治療劑可以在制造過(guò)程中施加到纖維上或并入纖維中。

制劑

本發(fā)明的組合物、纖維、膜或多層膜可以方便地作為無(wú)菌制劑提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物以液體、液體懸浮液、凝膠、粘性組合物或固體組合物提供。液體、凝膠和粘性組合物在某種程度上更方便施用，特別是通過(guò)注射。粘性組合物可以在適當(dāng)?shù)恼扯确秶鷥?nèi)配制，以便提供與特定組織更長(zhǎng)的接觸時(shí)間。液體或粘性組合物可以包含載體，其可以是含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）和其適合的混合物的溶劑或分散介質(zhì)。

無(wú)菌可注射溶液可以根據(jù)需要通過(guò)并入細(xì)胞（例如胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)元祖細(xì)胞、分化神經(jīng)元）來(lái)制備。這樣的組合物可以與合適的載體、稀釋劑或賦形劑如無(wú)菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖等混合。根據(jù)施用途徑和所需制劑，組合物可以含有輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑、分散劑或乳化劑（例如甲基纖維素）、ph緩沖劑、膠凝劑或粘度增強(qiáng)添加劑、防腐劑、調(diào)味劑、顏料等?？梢詤⒖纪ㄟ^(guò)引用并入本文的標(biāo)準(zhǔn)文本例如“remington’spharmaceuticalscience”，第17版，1985，用以制備合適的制劑，無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。

可以加入增強(qiáng)組合物的穩(wěn)定性和無(wú)菌性的各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩沖劑?？梢酝ㄟ^(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等來(lái)確保微生物活動(dòng)的預(yù)防。所述組合物可以是等滲的，即它們可以具有與血液和淚液相同的滲透壓。本發(fā)明組合物的期望等滲性可以使用氯化鈉或其它藥學(xué)上可接受的試劑如右旋糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇或其它無(wú)機(jī)或有機(jī)溶質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選氯化鈉特別用于含有鈉離子的緩沖液。

如果需要，組合物的粘度可以使用藥學(xué)上可接受的增稠劑保持在選定的水平。甲基纖維素是優(yōu)選的，因?yàn)樗菀浊医?jīng)濟(jì)地可用并且易于使用。其它合適的增稠劑包括，例如，黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆等。此外，銀鹽可用作增稠劑。另見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,367,094；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,173,151；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,998,498（其通過(guò)引用并入本文）?？梢约尤脬y鹽以進(jìn)一步提高組合物的抗菌作用。增稠劑的優(yōu)選濃度將取決于所選擇的試劑。重要的是使用將達(dá)到所選粘度的量。顯然，合適的載體和其它添加劑的選擇將取決于確切的施用途徑和具體劑型的性質(zhì)，例如液體劑型（例如，組合物是否配制成溶液、懸浮液、凝膠或另一種液體形式，例如隨時(shí)間釋放形式或液體填充形式）。

可以將甘油或類(lèi)似組分加入到混合物中以改善纖維和膜的柔性。

可以與本發(fā)明的組合物、纖維、膜或多層膜一起遞送的示例性試劑包括但不限于抗生素（包括例如抗菌銀鹽）、止痛劑、抗凝劑、免疫抑制劑、治療物質(zhì)，其選自麻醉藥、安眠藥、鎮(zhèn)靜劑、睡眠誘導(dǎo)劑、抗精神病藥、抗抑郁藥、抗過(guò)敏藥、抗心絞痛藥、抗關(guān)節(jié)炎藥、抗哮喘藥、抗糖尿病藥、止瀉藥、抗驚厥藥、抗痛風(fēng)藥物、抗組織胺藥、止癢藥、催吐藥、止吐藥、抗痙攣劑、食欲抑制劑、神經(jīng)活性物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)激動(dòng)劑、拮抗劑、受體阻滯劑、再攝取調(diào)節(jié)劑、β-腎上腺素能阻滯劑、鈣通道阻滯劑、disulfarim、肌肉松弛劑、止痛劑、退熱藥、興奮劑、抗膽堿酯酶劑、擬副交感神經(jīng)藥物、激素、抗血栓藥、溶栓劑、免疫球蛋白、激素激動(dòng)劑、激素拮抗劑、維生素、抗腫瘤藥、抗酸劑、消化劑、輕瀉劑、瀉藥、防腐劑、利尿劑、消毒劑、殺真菌劑、殺外寄生蟲(chóng)藥、抗寄生蟲(chóng)藥、重金屬、重金屬拮抗劑、螯合劑、生物堿、鹽、離子、自體活性物質(zhì)、洋地黃、強(qiáng)心苷、抗心律失常藥、抗高血壓藥、血管擴(kuò)張劑、血管收縮藥、抗毒蕈堿藥、神經(jīng)節(jié)刺激劑、神經(jīng)節(jié)阻滯劑、神經(jīng)肌肉阻滯劑、腎上腺素能神經(jīng)抑制劑、抗氧化劑、抗炎藥、傷口護(hù)理產(chǎn)品、抗腫瘤劑、抗血管生成劑、抗原劑、傷口愈合劑、植物提取物、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、免疫球蛋白、潤(rùn)膚劑、保濕劑、抗排斥藥物、殺精劑、調(diào)理劑、抗菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、鎮(zhèn)定劑、降膽固醇藥、鎮(zhèn)咳藥、組胺-阻斷藥物和單胺氧化酶抑制劑。其它試劑包括蛋白，例如以下的任一種或多種：活化素a，腎上腺髓質(zhì)素，酸性fgf，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，血管生成素，促血管生成素-1，促血管生成素-2，促血管生成素-3，促血管生成素-4，血管增生抑制素，促血管素，血管緊張素-2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白1、2或3，鈣粘蛋白，膠原蛋白，集落刺激因子（csf），內(nèi)皮細(xì)胞衍生的生長(zhǎng)因子，內(nèi)皮糖蛋白，內(nèi)皮素，內(nèi)皮抑制素，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，內(nèi)皮細(xì)胞活力維持因子，ephrin，促紅細(xì)胞生成素，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，人生長(zhǎng)激素，tnf-α，tgf-β，血小板衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（pd-ecgf），血小板衍生的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（pdgf），胰島素樣生長(zhǎng)因子-1或-2（igf），白介素(il)-1或8，fgf-5，纖連蛋白，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（gm-csf），血管細(xì)胞增殖的心源性抑制劑，ifn-γ，ifn-γ，整合素受體，lif，平滑肌瘤衍生的生長(zhǎng)因子，mcp-1，巨噬細(xì)胞衍生的生長(zhǎng)因子，單核細(xì)胞衍生的生長(zhǎng)因子，mmp2，mmp3，mmp9，神經(jīng)纖毛蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（neurothelin），一氧化氮供體，一氧化氮合酶（nos），干細(xì)胞因子（scf），vegf-a，vegf-b，vegf-c，vegf-d，vegf-e，vegf和vegf164。可以與本發(fā)明的細(xì)胞一起遞送的其它試劑包括以下的一種或多種：lif，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bmp），視黃酸，反式視黃酸，地塞米松，胰島素，吲哚美辛，纖連蛋白和/或10％胎牛血清，或其衍生物。其它試劑包括小寡核苷酸，例如包括治療靶的至少一部分序列的sidna或sirna。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，組合物的聚合物組分應(yīng)選擇為化學(xué)惰性的，并且不會(huì)影響本發(fā)明所述的細(xì)胞的活力或功效。這對(duì)于化學(xué)和制藥原則的技術(shù)人員將不會(huì)有任何問(wèn)題，或者通過(guò)參考標(biāo)準(zhǔn)文本或通過(guò)本公開(kāi)和本文引用的文獻(xiàn)的簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)（不涉及不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)）容易地避免問(wèn)題。

劑量

本發(fā)明的組合物、纖維或膜可以以有效提供傷口愈合或其它性質(zhì)的量施用或植入。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膜提供了有效防止病原細(xì)菌滲入傷口部位的屏障。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明方法中施用的本發(fā)明的組合物、纖維或膜的量。當(dāng)然，對(duì)于向動(dòng)物或人施用的任何組合物，并且對(duì)于任何特定的施用方法，因此優(yōu)選確定：毒性，例如通過(guò)在合適的動(dòng)物模型例如，嚙齒動(dòng)物如小鼠中測(cè)定致死量（ld）和ld50；和組合物的劑量，其中的組分濃度和施用組合物的時(shí)間，其引起適當(dāng)?shù)捻憫?yīng)。從本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)、本公開(kāi)和本文引用的文獻(xiàn)，這種確定不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。而且，無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)即可確定連續(xù)施用的時(shí)間。

遞送方式

本發(fā)明的組合物（例如，包含細(xì)胞的支架）可以直接提供給目標(biāo)組織或器官，例如由于損傷或疾病而損壞的組織（例如通過(guò)施用進(jìn)入中樞或周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中）。組合物可以通過(guò)各種施用途徑施用于有其需要的受試者。一般來(lái)說(shuō)，施用方法可以使用醫(yī)學(xué)上可接受的任何施用模式來(lái)實(shí)施，意指產(chǎn)生有效水平的活性化合物而不引起臨床上不可接受的不利影響的任何模式。這些施用方式包括手術(shù)移植或注射（例如，肌內(nèi)、心臟內(nèi)、眼內(nèi)、腦室內(nèi)）。

試劑盒

本發(fā)明的組合物、纖維、膜或多層膜可以與試劑盒中的另外的試劑一起提供。該試劑盒可以包括制備材料（如膜）、治療方案、試劑和設(shè)備（試管、反應(yīng)容器、針、注射器等）的說(shuō)明書(shū)。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中提供的說(shuō)明書(shū)可以以標(biāo)簽或單獨(dú)插入物的形式指示合適的操作參數(shù)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物、纖維、膜或多層膜可用于治療或預(yù)防骨或軟組織的損傷或疾病。本發(fā)明提供了治療這樣的損傷或疾病和/或其癥狀的組合物和方法，所述損傷或疾病和/或其癥狀的特征在于細(xì)胞的損失或組織結(jié)構(gòu)、功能或活性的損失。本發(fā)明的方法包括將治療有效量的本文所述的組合物、纖維、膜或多層膜施用于受試者（例如哺乳動(dòng)物，例如人）。因此，一個(gè)實(shí)施方案是治療患有或易患特征在于細(xì)胞損失或組織結(jié)構(gòu)、功能或活性損失的疾病、病癥或失調(diào)的受試者的方法。該方法包括在使得疾病、病癥或失調(diào)或其癥狀被治療的條件下，向哺乳動(dòng)物施用足以治療特征在于本文的細(xì)胞損失或組織結(jié)構(gòu)、功能或活性損失的疾病、病癥或失調(diào)或其癥狀的治療量的步驟。

本文的方法包括向受試者（包括鑒定為需要這種治療的受試者）施用有效量的本文所述的組合物、纖維、膜或多層膜以產(chǎn)生這種效果。鑒定需要這種治療的受試者可以是受試者或醫(yī)療保健專(zhuān)業(yè)人員的判斷，并且可以是主觀的（例如意見(jiàn)）或客觀的（例如通過(guò)測(cè)試或診斷方法可測(cè)量）。

本發(fā)明的治療方法（其包括預(yù)防性治療）通常包括向有其需要的受試者（例如動(dòng)物，人），包括哺乳動(dòng)物，特別是人施用治療有效量的本文組合物，例如本文所述的組合物、纖維、膜或多層膜。這種治療將適當(dāng)?shù)厥┯糜诨加?、具有、易患疾病、病癥或其癥狀或有患所述疾病、病癥或其癥狀的風(fēng)險(xiǎn)的受試者，特別是人?？梢酝ㄟ^(guò)診斷測(cè)試或受試者或醫(yī)療保健提供者的意見(jiàn)（例如遺傳測(cè)試、酶或蛋白標(biāo)記、標(biāo)記（如本文定義）、家族史等）的任何客觀或主觀判斷來(lái)確定那些受試者的“患病風(fēng)險(xiǎn)”。

提出以下實(shí)施例以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的測(cè)定、篩選和治療方法的完整公開(kāi)和描述，并且不旨在限制發(fā)明人認(rèn)為是他們的發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1.纖維和膜的制備

本研究的目的是設(shè)計(jì)具有抗細(xì)菌和再生性質(zhì)的膜，其在6-12周內(nèi)降解，允許保留移植物，同時(shí)促進(jìn)上覆組織的更快速閉合。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，制造了靜電紡絲明膠+幾丁質(zhì)晶須（cw）+蜂蜜膜并隨后壓縮。壓縮膜具有增加的可操作性，較少孔隙，并保持非壓縮纖維直徑。這種應(yīng)用需要較少的孔隙支架來(lái)提供用于組織閉合的引導(dǎo)再生。此外，據(jù)記錄，較大的纖維和添加蜂蜜（天然抗微生物）可以獨(dú)立地增強(qiáng)促再生響應(yīng)。幾丁質(zhì)晶須（cw）是一種新興的新型填料，其已證明能增強(qiáng)合成和天然聚合物結(jié)構(gòu)。良好的生物可相容性和生物可降解性也使其成為最有希望的填料之一。

在一些實(shí)驗(yàn)中，將明膠溶于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（hfp）或9:1的乙酸:去離子（di）水中，并用medihoney?或manukagard?（0-50重量％）靜電紡絲。使用hfp或乙酸:di水作為溶劑進(jìn)行靜電紡絲，分別產(chǎn)生具有微米級(jí)和納米級(jí)纖維的支架。使用液壓機(jī)將膜（與25mm1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺交聯(lián)和非交聯(lián)）壓縮（一層或多個(gè)層）。壓縮膜具有增加的可操作性，較少孔隙，并保持非壓縮纖維直徑。這種應(yīng)用需要較少的孔隙支架來(lái)提供用于組織閉合的引導(dǎo)再生。此外，據(jù)記錄，較大的纖維和添加蜂蜜（天然抗微生物）可以獨(dú)立地增強(qiáng)促再生響應(yīng)。本研究將進(jìn)一步分析接種在復(fù)合膜上的人真皮成纖維細(xì)胞的再生響應(yīng)。

材料和方法

根據(jù)dufresne的方法進(jìn)行輕微的修改（ji，y-l等人，carbohydratepolymers，87,2133-2319，2012）來(lái)制備cw。通過(guò)超聲波將所需量的cw（15重量％的明膠）再分散在2,2,2-三氟乙醇（tfe）中。將明膠（b型）加入到140mg/ml的cw溶液中。然后將medihoney?（100％活性薄子木屬蜂蜜）加入明膠+cw溶液（0、5重量%、10重量％的明膠）。將溶液混合并在37℃下孵育過(guò)夜以確保所有組分的完全溶解/混合。將溶液裝入5ml注射器并使用以下參數(shù)靜電紡絲：5ml/hr，+22kv和5英寸氣隙距離。在1英寸（直徑）旋轉(zhuǎn)的接地不銹鋼心軸上收集纖維。

將支架壓縮以產(chǎn)生具有改善的機(jī)械完整性，同時(shí)保持纖維狀納米結(jié)構(gòu)的多層膜。使用金屬壓板在液壓機(jī)上以4500磅壓縮30秒來(lái)壓縮4層相同的支架。使用掃描電子顯微鏡（sem）在+20kv處對(duì)每個(gè)支架（0、5重量％、10重量％蜂蜜）的非壓縮和壓縮樣品進(jìn)行成像，以觀察纖維直徑和一般孔隙率。通過(guò)使用fibraquant?1.3軟件（nanoscaffoldtechnologies，llc）計(jì)算平均纖維直徑和標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)一步分析所有非交聯(lián)支架類(lèi)型的壓縮和非壓縮纖維直徑。

所有4層膜的交聯(lián)通過(guò)將每個(gè)膜放置在含有乙醇中的40mm1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)(edc)的培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中在室溫下保持21小時(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)。完成后，將膜浸入乙醇中，并將6mm圓片沖壓并用于細(xì)胞研究。

使用狗骨打孔器（最窄點(diǎn)為2.71mm寬，長(zhǎng)度為18.63mm）進(jìn)行機(jī)械測(cè)試。對(duì)具有100n載荷細(xì)胞的狗骨樣品（n=3）進(jìn)行單軸拉伸試驗(yàn)，延伸速率為1mm/s，并且?jiàn)A具之間的起始距離為7.7mm。由應(yīng)力-應(yīng)變輸出計(jì)算彈性模量和斷裂應(yīng)變。

在干燥和水合（0.9％nacl，30分鐘）條件下，口腔外科醫(yī)生對(duì)膜的臨床適應(yīng)性/成形性進(jìn)行評(píng)分。使用collaplug?膠原蛋白膜（zimmerdental）作為對(duì)照，因?yàn)槟壳八茄啦坩毡４媸中g(shù)的膜屏障標(biāo)準(zhǔn)之一。

細(xì)胞活力（dapi）

在通過(guò)30分鐘乙醇浸泡的交聯(lián)，然后三次10分鐘pbs洗滌之后，將6mm沖孔的壓縮膜直接滅菌。在96孔板中將人真皮成纖維細(xì)胞（hdf）以5,000個(gè)細(xì)胞/孔接種在支架沖孔（n=3）上。研究在7天內(nèi)完成，時(shí)間點(diǎn)為1、3和7天。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)基變化。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，細(xì)胞化支架固定在10％緩沖的福爾馬林中。然后進(jìn)行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）細(xì)胞核染色。使用olympus熒光顯微鏡對(duì)支架進(jìn)行成像，以使活細(xì)胞可視化。

結(jié)果、討論和結(jié)論

非壓縮和壓縮的靜電紡絲明膠+15％cw+蜂蜜支架（非交聯(lián)）的sem圖像在圖1中顯示。纖維尺寸分布如圖2所示。圖3顯示了斷裂應(yīng)變（3a）和彈性模量（3b）測(cè)量。

適應(yīng)性/成形性

表1顯示了具有不同量蜂蜜的干燥和水合膜的臨床適應(yīng)性的評(píng)估。最佳膜（濕）：0％和10％蜂蜜。最差膜（濕）：collaplug對(duì)照（不保持形狀，難以適應(yīng)）。臨床意義：壓縮膜在使用前需水合?？梢酝ㄟ^(guò)壓縮更少或更多的層來(lái)調(diào)整成形性（圖4）。

表1.口腔外科醫(yī)生評(píng)分（頂部）的干燥（d）和水合（濕，w）壓縮膜和collaplug對(duì)照的臨床適應(yīng)性

靜電紡絲和壓縮

圖5顯示了壓縮的靜電紡絲膜的圖像。在保持纖維結(jié)構(gòu)和尺寸的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了壓縮。注意到在壓縮后一些纖維熔接，其最有可能取決于蜂蜜的結(jié)晶狀態(tài)。更多脫水的支架（在干燥器中）將導(dǎo)致結(jié)晶更多的蜂蜜結(jié)構(gòu)，并且最終在壓縮時(shí)形成更少的非熔接纖維。

機(jī)械測(cè)試

所有支架在90-120％應(yīng)變之間失?。o(wú)顯著性差異）。含有10％蜂蜜的支架與0％蜂蜜相比具有顯著更高的模量值。首先這是意想不到的，因?yàn)閺闹庇^上講，更多的蜂蜜會(huì)導(dǎo)致支架較少的剛性。推測(cè)是因?yàn)橹苯訌囊掖贾羞M(jìn)行機(jī)械測(cè)試，蜂蜜處于脫水（結(jié)晶更多）狀態(tài)，這導(dǎo)致模量增加。未來(lái)的工作將包括甘油和用pbs水合的樣品的分析，這將最有可能誘導(dǎo)較少結(jié)晶的蜂蜜結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致較不堅(jiān)硬的支架。

細(xì)胞活力

對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在每個(gè)支架的表面上可見(jiàn)活細(xì)胞（hdf）。從目視來(lái)看，很難確定任何差異。然而，未來(lái)的研究將分析細(xì)胞增殖和細(xì)胞分泌的再生標(biāo)記和細(xì)胞外基質(zhì)。

實(shí)施例2.制備海綿

使用在去離子水中的30mg/ml明膠溶液制造海綿，并加熱至37℃，以確保所有明膠都在溶液中。將10％cw（幾丁質(zhì)晶須）加入到明膠溶液中并進(jìn)行超聲處理。然后將0-30mg/ml蜂蜜加入到明膠+cw溶液中。蜂蜜進(jìn)入溶液后，將25mm1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)(edc)加入到該明膠+cw+蜂蜜溶液中，立即轉(zhuǎn)移到圓柱形模具中，在-80℃下冷凍，并凍干。使用液壓機(jī)將干海綿以4500磅壓縮30秒。

圖6顯示非壓縮和壓縮明膠+10％cw+30mg/ml蜂蜜海綿的一般大體外觀的dinolite圖像。非壓縮：5.5毫米厚度；壓縮：0.3mm厚度。

海綿可以任何尺寸（取決于模具）制造并隨后壓縮。

通過(guò)附加步驟，與形成凍干膜類(lèi)似，形成顆粒（圖7a-7b）。所述顆?？膳c凍干膜組合使用，如圖7c所示。復(fù)合溶液冷凍后，冷凍的材料可以被磨碎（例如使用攪拌機(jī)）以形成類(lèi)似于“碎冰”的東西。然后將該碎冰凍干過(guò)夜以形成顆粒。由于顆粒旨在用于骨再生，因此填料（例如羥基磷灰石）的濃度將增加（例如至50％或更多）以增強(qiáng)骨傳導(dǎo)性。顆粒的開(kāi)發(fā)和細(xì)化可以由優(yōu)化制造過(guò)程來(lái)獲得相當(dāng)一致的粒度組成。這可以通過(guò)控制冷凍復(fù)合物的共混來(lái)實(shí)現(xiàn)碎冰或通過(guò)將較大的凍干顆粒（在液氮中）低溫粉碎成更小顆粒而實(shí)現(xiàn)?？梢允褂煤Y子或等效技術(shù)根據(jù)尺寸過(guò)濾粒度，以獲得均勻/限定的粒度。為了優(yōu)化粒度，可以進(jìn)行多種實(shí)現(xiàn)粒度的方法（凍干“碎冰”相對(duì)低溫粉碎較大（mm尺寸的）顆粒）。優(yōu)選地，顆粒的尺寸或平均直徑在約100μm至約10mm，或特別是約1mm至約5mm的范圍內(nèi)。

這種組合物的干燥和水合的壓縮膜應(yīng)在使用前水合（圖7e），并且可以用剪刀容易地切割/依尺寸定制并且具有很好的可操作性。在水合時(shí)，膜變得更加柔性，并且可以在植入時(shí)容易地在手術(shù)部位內(nèi)操縱。一旦開(kāi)始水合，單獨(dú)的可操作性是對(duì)現(xiàn)有膜如collaplug?的顯著改善。甚至在水合幾天之后，目前的天然生物可降解膜如bio-gide?開(kāi)始喪失其機(jī)械完整性。

實(shí)施例3.用于骨移植應(yīng)用的壓縮膜

此外，優(yōu)異的生物可相容性和生物可降解性也使其成為最有希望的填料之一。這些壓縮膜結(jié)合了膜狀材料與生物活性表面的優(yōu)點(diǎn)，以進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞響應(yīng)和引導(dǎo)的組織再生（gtr）。明膠+cw+mh膜表現(xiàn)出增強(qiáng)的生物可相容性和生物可降解性，這表明它們作為當(dāng)前臨床產(chǎn)品的替代品的用途。

方法和材料

支架制造

使用30mg/ml明膠溶液制造支架。將10％cw（明膠的重量％）分散在di水中，并以2％的幅度使用微尖端進(jìn)行超聲處理30秒。然后通過(guò)在37℃下溫育1小時(shí)，將明膠和0、5%或25％mh（明膠的重量％）溶解在cw溶液中。獲得均勻溶液后，加入40mm1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺）edc交聯(lián)劑，短暫混合，立即轉(zhuǎn)移到小培養(yǎng)皿中，在-80℃下冷凍過(guò)夜，并凍干。然后將凍干的海綿切成4mm厚的切片，并使用液壓機(jī)（圖8）以4500磅壓縮30秒，以產(chǎn)生最終的膜（厚度在300-400μm之間）。

降解

通過(guò)在14天內(nèi)定量每個(gè)6mm支架的蛋白釋放經(jīng)釋放動(dòng)力學(xué)來(lái)研究支架降解。將支架在37℃下在1xpbs中孵育，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)替換pbs。在1、4、7、11和14天后，使用piercebca蛋白測(cè)定法分析釋放物的總蛋白。明膠和mh不可區(qū)分，并且都有助于定量累積平均濃度結(jié)果。為說(shuō)明這一點(diǎn)，通過(guò)使用完全降解的非交聯(lián)支架作為總初始蛋白含量計(jì)算累積百分比釋放量：％釋放=(釋放)/(總初始含量)*100。

細(xì)胞粘附

將每個(gè)支架類(lèi)型的6mm圓片裝載到96孔板中。將目前的臨床膜geistlichbio-gide?（膠原蛋白）和klsmartinresorb-x（聚乳酸，pla膜）沖壓并用作臨床對(duì)照。在細(xì)胞接種之前，將所有膜滅菌（30分鐘乙醇和三次10分鐘pbs洗滌）。將20,000個(gè)人真皮成纖維細(xì)胞（hdf）接種在膜上并培養(yǎng)14天。1、7和14天后，移除培養(yǎng)基并冷凍，同時(shí)將細(xì)胞化的膜固定在10％福爾馬林中。固定的支架用4’-6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）染色，其細(xì)胞接種表面經(jīng)熒光成像以顯現(xiàn)細(xì)胞附著。

機(jī)械測(cè)試

使用單軸壓板壓縮系統(tǒng)分析水合無(wú)細(xì)胞支架以確定峰值負(fù)荷。切出矩形（2.5×0.5cm）并通過(guò)錨接相距1cm的端部（圖9）將其固定在拱形位置。將上壓板下降到支架表面，并使用以下參數(shù)：10mm/min測(cè)試速度和250個(gè)樣品/秒數(shù)據(jù)采集速率。壓縮是連續(xù)的，直到頂板到達(dá)錨。在該接觸發(fā)生之前運(yùn)行終止，并且以牛頓（n）記錄支架施加的最大力。

臨床適應(yīng)性/成形性

水合后，所有明膠+cw+mh膜均經(jīng)口腔外科醫(yī)生在干燥和水合（0.9％nacl30分鐘）條件下進(jìn)行評(píng)分。使用klsmartin、bio-gide和collaplug?（膠原蛋白膜，zimmerdental）作為臨床對(duì)照膜。

討論與結(jié)論

海綿和壓縮

所有明膠+cw+mh支架都表現(xiàn)出相同的非壓縮（多孔）和壓縮（較少孔隙）表面結(jié)構(gòu)，在支架類(lèi)型之間沒(méi)有視覺(jué)上可辨別的差異（圖10）。與多孔膜相比，壓縮表面提供了gtr的模板，其中細(xì)胞最初在整個(gè)支架中遷移。

降解

與0％mh相比，5％mh的添加生成相似的濃度釋放曲線，兩者在14天后開(kāi)始平穩(wěn)（圖11a-11b）。+25％mh膜在14天內(nèi)表現(xiàn)出更線性的釋放曲線，表明以恒定的速率降解。1天后，0％、+5％和+25％mh分別釋放17％、17％和22％的總初始含量。14天后，0％、+5％和加25％mh分別釋放44％、34％和49％的總初始含量。累積百分比釋放曲線圖顯示有趣的曲線，表明添加5％mh降低支架的降解速率。這是沒(méi)有預(yù)期到的，因?yàn)樘砑尤魏瘟康膍h被認(rèn)為增加降解速率（在+25％mh圖中顯而易見(jiàn)）。該數(shù)據(jù)僅基于各種濃度的mh的并入提供了可定制的降解速率的見(jiàn)解。

適應(yīng)性/成形性

干燥（d）和水合（濕，w）壓縮膜和bio-gide、klsmartin和collaplug對(duì)照的臨床適應(yīng)性由口腔外科醫(yī)生評(píng)分。當(dāng)水合時(shí)，所有明膠+cw+mh膜的處理與bio-gide對(duì)照類(lèi)似，其中并入的較高百分比的mh導(dǎo)致膜撕裂增加（表2）。然而，與對(duì)照相比，干明膠+cw+mh膜具有更大的適應(yīng)性。在外科醫(yī)生的手中，壓縮膜處理與臨床膠原蛋白膜相似（圖13）。

表2.適應(yīng)性/可形成性

等級(jí)

0=不可形成，脆性或撕開(kāi)

5=可容易地形成，當(dāng)操作時(shí)保持結(jié)構(gòu)

壓縮試驗(yàn)

所有明膠+cw+mh膜施加在0.02-0.03n的范圍內(nèi)的最大的力，而bio-gide和klsmartin對(duì)照分別施加0n和0.75n。與不會(huì)保持測(cè)試拱形的bio-gide對(duì)照相比，明膠+cw+mh膜顯示改善的機(jī)械性能（表3）。由于klsmartin是一種無(wú)孔的pla膜，因此預(yù)計(jì)它的值更高。

表3.壓縮測(cè)試

細(xì)胞粘附

與0％mh和bio-gide膜相比，添加mh顯著增加了第1天的細(xì)胞附著（圖12）。klsmartin膜也附著了大量的細(xì)胞，這是由于它的2d膜表面類(lèi)似于組織培養(yǎng)塑料。klsmartin（pla）的缺點(diǎn)是其降解，所述降解導(dǎo)致酸性微環(huán)境。7天和14天后，所有明膠+cw+mh膜都覆蓋在細(xì)胞中，其中bio-gide對(duì)照中還沒(méi)有可見(jiàn)的細(xì)胞附著。熒光成像在7天和14天變得更加困難，最有可能是由于細(xì)胞在改造膜時(shí)的一些遷移。未來(lái)的研究將分析細(xì)胞增殖、活力、分泌的再生標(biāo)記和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。

其它實(shí)施方案

從前面的描述可以看出，可以對(duì)本文描述的發(fā)明作出各種變化和修改，以將其用于各種用途和條件。這些實(shí)施方案也在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

本文的變量的任何定義中記載的元素的列表包括作為列出的元素的任何單個(gè)元素或組合（或子組合）的該變量的定義。本文的實(shí)施方案的記載包括作為任何單個(gè)實(shí)施方案或與任何其它實(shí)施方案或其部分的組合的實(shí)施方案。

本說(shuō)明書(shū)中提及的所有專(zhuān)利和出版物通過(guò)引用并入本文，其程度如同每個(gè)獨(dú)立專(zhuān)利和出版物被具體和單獨(dú)地指明通過(guò)引用并入。