相關申請的交叉引用本申請要求2014年9月12日提交的美國臨時申請?zhí)?2/049,692和2015年3月25日提交的美國臨時申請?zhí)?2/138,258的優(yōu)先權，這些美國臨時申請中的每一件以引用的方式整體并入本文。本公開大體上涉及一種細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，特別是涉及一種用于神經(jīng)元細胞的三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)促進結構特征和功能特征這兩者，所述特征模擬了體內神經(jīng)纖維的那些特征，包括細胞髓鞘形成和復合動作電位的傳播。
背景技術：
：為了桌面評估來復制生理機能的功能方面對于外周神經(jīng)元組織來說特別具有挑戰(zhàn)性，其中經(jīng)過長距離的生物電傳導是最相關的生理學結果之一。出于這個原因，外周神經(jīng)的三維組織模型落后于上皮組織、代謝組織、以及腫瘤組織的模型，其中可溶性分析物用作適當?shù)牧慷?。電生理學技術的應用近來已經(jīng)經(jīng)由多電極陣列技術而可能用于篩查環(huán)境毒素以及用于疾病建模和治療測試。這一應用對于外周神經(jīng)系統(tǒng)(pns)應用和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)應用這兩者的研究來說是開創(chuàng)性的，但是培養(yǎng)物的解離性質不能復制群體水平環(huán)境和對于外周組織來說關鍵的量度。相反，研究外周神經(jīng)病變和神經(jīng)保護的臨床方法包括神經(jīng)傳導測試，所述神經(jīng)傳導測試是經(jīng)由使用皮膚活檢的形態(tài)測定分析來測量復合動作電位(cap)和神經(jīng)纖維密度(nfd)而實現(xiàn)的。技術實現(xiàn)要素：本公開解決了對制備和使用三維水凝膠系統(tǒng)的需求，所述系統(tǒng)允許對模擬臨床神經(jīng)傳導的神經(jīng)組織和nfd的體外生理學測量。本公開涉及一種在包含固體基質的培養(yǎng)容器中產生一個或多個神經(jīng)元細胞的三維培養(yǎng)物的方法，所述方法包括：(a)使一個或多個分離的施旺細胞(schwanncell)和/或少突膠質細胞與所述固體基質接觸，所述基質包含至少一個外表面、至少一個內表面以及至少一個內室，所述內室是由所述至少一個內表面所限定的并且可從所述固體基質外部的點經(jīng)由至少一個開口進入；(b)將一個或多個分離的神經(jīng)元細胞或包含神經(jīng)元細胞的組織外植體接種到所述至少一個內室中；(c)將細胞培養(yǎng)基施用到所述培養(yǎng)容器中，其中細胞培養(yǎng)基的體積足以覆蓋所述至少一個內室；其中所述內表面的至少一部分包含第一細胞不可穿透聚合物和第一細胞可穿透聚合物。在一些實施方案中，在步驟(a)之前，將包含所述第一細胞不可穿透聚合物和所述第一細胞可穿透聚合物的溶液放入所述培養(yǎng)容器中并且誘導所述第一細胞不可穿透聚合物和所述第一細胞可穿透聚合物物理粘附或化學鍵合到所述內表面的至少一部分上。在一些實施方案中，所述固體基質包含具有預定形狀的基底，所述預定形狀限定了所述外表面和所述內表面的形狀。在一些實施方案中，所述基底包含二氧化硅、塑料、陶瓷、或金屬中的一種或組合，并且其中所述基底呈圓柱體的形狀或呈基本上類似于圓柱體的形狀，以使得所述第一細胞不可穿透聚合物和第一細胞可穿透聚合物包被所述基底的內表面并且限定圓柱形或基本上圓柱形的內室或隔室；并且其中所述開口被定位于所述圓柱體的一端處。在一些實施方案中，所述基底包含足以允許蛋白質、營養(yǎng)物質、以及氧氣在所述細胞培養(yǎng)基存在下擴散穿過所述固體基質的尺寸和形狀的一個或多個孔隙。在一些實施方案中，誘導所述第一細胞不可穿透聚合物和所述第一可穿透聚合物交聯(lián)到所述固體基質上的步驟包括使所述溶液暴露于紫外光或可見光。在一些實施方案中，所述第一細胞不可穿透聚合物是以所述溶液的體積計不超過約20重量％的濃度的聚乙二醇(peg)。在一些實施方案中，所述第一細胞可穿透聚合物具有以所述溶液的體積計約0.1重量％至約3.0重量％的濃度。在一些實施方案中，所述方法還包括以下步驟：使所述培養(yǎng)容器暴露于37℃和不超過約5.0％的水平的二氧化碳，持續(xù)足以允許軸突在所述內室中生長的一段時間。在一些實施方案中，所述固體基質的至少一部分是圓柱形的或基本上圓柱形的以使得所述固體基質的內表面的至少一部分限定圓柱形或基本上圓柱形的內室，向所述內室中接種所述一個或多個施旺細胞并且接種所述一個或多個神經(jīng)元。在一些實施方案中，步驟(c)包括接種選自以下各項中的一種或組合的組織外植體：分離的背根神經(jīng)節(jié)、脊髓外植體、視網(wǎng)膜外植體、以及皮層外植體。在一些實施方案中，步驟(c)包括接種選自以下各項中的一種或組合的神經(jīng)元細胞的懸浮液：運動神經(jīng)元、皮層神經(jīng)元、脊髓神經(jīng)元、外周神經(jīng)元。在一些實施方案中，所述固體基質包含與所述第一細胞不可穿透聚合物和所述第一細胞可穿透聚合物的混合物交聯(lián)的塑料基底；并且其中所述塑料基底包含具有不大于約1微米的直徑的多個孔隙。在一些實施方案中，所述方法還包括以下步驟：形成固體基質并且將所述固體基質定位于培養(yǎng)容器中。在一些實施方案中，所述形成固體基質的步驟包括通過光刻使包含所述第一細胞不可穿透聚合物和所述第一細胞可穿透聚合物的溶液固化。在一些實施方案中，所述方法還包括以下步驟：在步驟(c)之后使所述神經(jīng)元細胞生長神經(jīng)突和/或軸突，持續(xù)約1天至約1年的一段時間。在一些實施方案中，所述方法還包括以下步驟：在步驟(a)之前從樣品中分離一個或多個施旺細胞和/或一個或多個少突膠質細胞。在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(b)之前從一種或多種哺乳動物分離背根神經(jīng)節(jié)(drg)。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器不含海綿。在一些實施方案中，所述固體基質包含不大于約15％的peg和約0.05％至約1.00％的選自以下各項的自組裝肽中的一種或組合：rad16-i、rad16-ii、eak16-i、eak16-ii、以及deak16。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器包含約1個至約1200個孔，可以向所述孔中相繼或同時進行步驟(a)-步驟(c)。在一些實施方案中，所述基質的至少一部分是以圓柱體或矩形棱柱體的形狀形成的，所述圓柱體或矩形棱柱體包含由所述內表面限定并且可通過一個或多個開口進入的內室。在一些實施方案中，所述固體基質聚合物不含peg。在一些實施方案中，所述細胞培養(yǎng)基包含約5皮克/毫升至約20皮克/毫升的濃度的神經(jīng)生長因子(ngf)和/或約0.001％重量/體積至約0.01％重量/體積的范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述方法還包括將至少一個刺激電極定位在所述一個或多個神經(jīng)元細胞或組織外植體的細胞體處或附近并且將至少一個記錄電極定位在軸突的最遠離所述細胞體的點處或附近，以使得當在所述刺激電極中引入電流時，所述記錄電極能夠接收對應于能夠在所述記錄電極處被測量的一個或多個電生理學量度的信號。在一些實施方案中，所述一個或多個電生理學量度是以下各項中的一個或組合：電傳導速度、動作電位、與沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖通過相關的波的振幅、沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖的寬度、所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖的潛伏期、以及所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖的包絡。本公開還涉及一種組合物，所述組合物包含：(i)培養(yǎng)容器；水凝膠基體，所述水凝膠基體至少包含第一細胞不可穿透聚合物和第一細胞可穿透聚合物；以及一個或多個分離的施旺細胞和/或一個或多個少突膠質細胞；以及一個或多個組織外植體或其碎片；或(ii)培養(yǎng)容器；水凝膠基體，所述水凝膠基體至少包含第一細胞不可穿透聚合物和第一細胞可穿透聚合物；以及一個或多個分離的施旺細胞和/或一個或多個少突膠質細胞；以及包含一個或多個神經(jīng)元細胞的細胞懸浮液。在一些實施方案中，所述組合物還包含固體基質，所述水凝膠基體交聯(lián)到所述固體基質上，所述固體基質包含具有約1微米至約5微米的直徑的孔隙的至少一個主要為塑料的表面。在一些實施方案中，所述組合物還包含固體基質，所述水凝膠基體交聯(lián)到所述固體基質上，所述固體基質包含至少一個外表面和至少一個內表面以及至少一個內室，所述內室是由所述至少一個內表面所限定的并且可從所述固體基質外部的點經(jīng)由至少一個開口進入的。在一些實施方案中，所述組合物還包含細胞培養(yǎng)基和/或腦脊髓液。在一些實施方案中，所述組織外植體或其碎片是以下各項中的一種或組合：drg外植體、視網(wǎng)膜組織外植體、皮層外植體、脊髓外植體、以及外周神經(jīng)外植體。在一些實施方案中，所述組合物還包含具有連續(xù)的外表面和內表面的固體基質，所述固體基質包含呈圓柱形或基本上圓柱形的形狀的至少一部分以及至少一個中空內部，所述中空內部在它的邊緣處由所述內表面的至少一部分限定，所述內表面包含具有約0.1微米至約1.0微米的直徑的一個或多個孔隙，其中所述固體基質的中空內部是可從所述固體基質外部的點經(jīng)由至少一個開口進入的；其中所述中空內部部分包含接近所述開口的第一部分和遠離所述開口的至少第二部分；其中所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或所述一個或多個組織外植體被定位在所述中空內部的第一部分處或附近并且與所述水凝膠基體進行物理接觸，并且其中所述至少一個中空內部的第二部分與所述第一部分處于流體連通以使得軸突能夠從所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或所述一個或多個組織外植體生長到所述中空內部的第二內部部分中。在一些實施方案中，所述組合物不含海綿。在一些實施方案中，所述至少一種細胞不可穿透聚合物包含不大于約15％的peg并且所述至少一種細胞可穿透聚合物包含約0.05％至約1.00％的選自以下各項的自組裝肽中的一種或組合：rad16-i、rad16-ii、eak16-i、eak16-ii、以及deak16。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器包含96個、192個、384個或更多個內室，其中一個或多個分離的施旺細胞和/或一個或多個少突膠質細胞足夠接近所述一個或多個分離的組織外植體和/或所述一個或多個神經(jīng)元細胞以使得所述施旺細胞或所述少突膠質細胞沉積髓磷脂以使軸突從所述組織外植體和/或神經(jīng)元細胞生長。在一些實施方案中，所述固體基質不含peg。在一些實施方案中，所述基質的至少一部分是以圓柱體或矩形棱柱體的形狀形成的，所述圓柱體或矩形棱柱體包含由所述內表面限定的并且可通過一個或多個開口進入的空間。在一些實施方案中，所述組合物還包含細胞培養(yǎng)基，所述細胞培養(yǎng)基包含約5皮克/毫升至約20皮克/毫升的濃度的神經(jīng)生長因子(ngf)和/或約0.001％重量/體積至約0.01％重量/體積的范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述一個或多個神經(jīng)元細胞包含選自包括以下各項的組的至少一種細胞：膠質細胞、胚胎細胞、間充質干細胞、以及衍生自誘導多能干細胞的細胞。在一些實施方案中，所述組合物還包含一個或多個干細胞或多能細胞。在一些實施方案中，所述一個或多個神經(jīng)元細胞包含源自于所述哺乳動物的外周神經(jīng)系統(tǒng)的原代哺乳動物細胞。在一些實施方案中，所述水凝膠基體包含至少1％的聚乙二醇(peg)。在一些實施方案中，所述神經(jīng)元細胞和/或組織外植體在培養(yǎng)中不少于3天、30天、90天或365天。在一些實施方案中，所述固體基質的至少一部分是圓柱形的或基本上圓柱形的以使得所述固體基質的內表面的至少一部分限定圓柱形或基本上圓柱形的中空內室，其中所述一個或多個施旺細胞和所述一個或多個神經(jīng)元接觸。在一些實施方案中，所述一個或多個組織外植體包含一個或多個drg，所述drg具有約100微米至約500微米寬的和約0.11微米至約10000微米長的軸突生長。在一些實施方案中，所述組合物還包含至少兩個電極，所述電極與電化學電池和電壓計可操作地連通，其中第一刺激電極被定位在所述組織外植體的細胞體處或附近并且第二記錄電極被定位在軸突的遠端處或附近以使得所述電極沿著所述組織外植體中的至少一個細胞的膜的距離形成電壓差。本公開還涉及一種評估來自一個或多個神經(jīng)元細胞的響應的方法，所述方法包括：在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)一個或多個神經(jīng)元細胞；將一種或多種刺激引入所述一個或多個神經(jīng)元細胞中；以及測量所述一個或多個神經(jīng)元細胞對所述一種或多種刺激的一種或多種響應。在一些實施方案中，所述一個或多個神經(jīng)元細胞包含感覺外周神經(jīng)元。在一些實施方案中，所述一個或多個神經(jīng)元細胞包含選自以下各項的細胞中的至少一種或組合：脊髓運動神經(jīng)元、交感神經(jīng)元、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)神經(jīng)元。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器包含與具有預定形狀的固體基質交聯(lián)的水凝膠基體，并且其中所述水凝膠基體包含至少一種細胞不可穿透聚合物和至少一種細胞可穿透聚合物。在一些實施方案中，所述水凝膠基體包含選自以下各項的化合物中的一種或組合：puramatrix、甲基丙烯酸酯化透明質酸、瓊脂糖、甲基丙烯酸酯化肝素、以及甲基丙烯酸酯化葡聚糖。在一些實施方案中，所述一種或多種刺激包括電流并且所述一種或多種響應包括電生理學量度。在一些實施方案中，通過光學記錄技術來測量所述響應。在一些實施方案中，所述一種或多種刺激包括以下各項中的一種或組合：一種或多種光遺傳學執(zhí)行子(actuator)、一種或多種籠鎖神經(jīng)遞質、一種或多種紅外激光、或一種或多種光門控離子通道。在一些實施方案中，所述測量的步驟包括監(jiān)測電壓敏感性染料、鈣染料的移動、或使用無標記光子成像。在一些實施方案中，所述一個或多個神經(jīng)元細胞包含分離的原代神經(jīng)節(jié)組織。在一些實施方案中，所述固體基質的至少一部分是通過光刻而被微圖案化的并且包含外表面、內表面、以及由所述至少一個內表面所限定的至少一個內室；其中所述方法還包括將所述一個或多個神經(jīng)元細胞接種到所述微圖案化的固體基質中以使得所述一個或多個神經(jīng)元細胞的生長局限于由所述至少一個內室所限定的特定幾何形狀。在一些實施方案中，所述內室將細胞體與軸突突起分開在不同的位置。在一些實施方案中，所述內室的形狀允許在所述室內不同的位置處探查待檢測和使用的形態(tài)測定或電生理學量度中的任一個。通常，例如，所述固體基質的內室或內部隔室或所述水凝膠基體(如果不使用固體基質的話)允許所述基體或基質內的一個或多個位置使細胞體和軸突突起在不同的位置定位。在一些實施方案中，所述一個或多個神經(jīng)元細胞源自于原代人類組織或人類干細胞。在一些實施方案中，所述一個或多個神經(jīng)元細胞是原代哺乳動物神經(jīng)元。在一些實施方案中，所述至少一個神經(jīng)元細胞包含分離的drg或其碎片；并且誘導來自所述一個或多個神經(jīng)元細胞的刺激包括將刺激電極放置在所述drg或其碎片的細胞體處或附近并且將記錄電極放置在最遠離所述細胞體的軸突突起處或附近。在一些實施方案中，所述一種或多種刺激包括電刺激或化學刺激。在一些實施方案中，所述一種或多種刺激包括使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或所述一個或多個組織外植體與至少一種藥理活性化合物接觸。本公開還涉及一種評價試劑的毒性的方法，所述方法包括：(a)在本文所公開的組合物中的任一種中培養(yǎng)一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體；(b)使至少一種試劑暴露于所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體；(c)測量和/或觀測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化；以及(d)使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化與所述試劑的毒性相關聯(lián)，以使得如果所述形態(tài)測定變化指示細胞活力降低，那么將所述試劑表征為具有毒性，并且如果所述形態(tài)測定變化指示細胞活力不變或提高，那么將所述試劑表征為無毒的。本公開還涉及一種評價第一試劑與第二試劑相比的相對毒性程度的方法，所述方法包括：(a)在本文所公開的組合物中的任一種中培養(yǎng)一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體；(b)使第一試劑和第二試劑在依次或并行的時間段內(如果在同一組細胞上，那么依次；或如果在第二組細胞上，例如在多重化系統(tǒng)中，那么并行)暴露于所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體；(c)測量和/或觀測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化；以及(d)使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化與所述第一試劑的毒性相關聯(lián)；以及(e)使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化與所述第二試劑的毒性相關聯(lián)；以及(f)比較所述第一試劑和所述第二試劑的毒性；以及(g)將所述第一試劑或所述第二試劑表征為與所述第二試劑相比更具毒性或不太具毒性。在一些實施方案中，當將所述第一試劑或所述第二試劑表征為與所述第二試劑相比更具毒性或不太具毒性時，如果與所述第二化合物相比，所述由所述第一試劑誘導的形態(tài)測定變化更嚴重并且指示細胞活力降低到更大的程度，那么所述第一試劑比所述第二試劑更具毒性；并且，如果與所述第二化合物相比，所述由所述第一試劑誘導的形態(tài)測定變化不太嚴重和/或指示細胞活力提高，則所述第二試劑比所述第一試劑更具毒性。在其中觀測和/或測量電生理學量度的實施方案中可以應用相同的表征。在一些實施方案中，通過用一個或一系列劑量或量的試劑重復本文提供的步驟中的任何一個或多個來確定毒性程度。本領域技術人員不是比較或對比兩種不同試劑之間相對的毒性，而是可以通過這種方式添加不同劑量的相同試劑以表征所述試劑在何時以及在什么劑量下可能對一個或多個神經(jīng)元變得具有毒性。本公開還涉及一種評價試劑的毒性的方法，所述方法包括：(a)在本文所公開的組合物中的任一種中培養(yǎng)一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體；(b)使至少一種試劑暴露于所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體；(c)測量和/或觀測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個電生理學量度；以及(d)使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個電生理學量度與所述試劑的毒性相關聯(lián)，以使得如果所述電生理學量度指示細胞活力降低，那么將所述試劑表征為具有毒性，并且如果所述電生理學量度指示細胞活力不變或提高，那么將所述試劑表征為無毒的；其中步驟(c)任選地包括和/或觀測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化；并且其中步驟(d)任選地包括使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化與所述試劑的毒性相關聯(lián)，以使得如果所述形態(tài)測定變化指示細胞活力降低，那么將所述試劑表征為具有毒性，并且如果所述形態(tài)測定變化指示細胞活力不變或提高，那么將所述試劑表征為無毒的。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括小化合物。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括至少一種環(huán)境污染物或工業(yè)污染物。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的小化合物中的一種或組合：化學治療劑、鎮(zhèn)痛劑、心血管調節(jié)劑、膽固醇水平調節(jié)劑、神經(jīng)保護劑、神經(jīng)調節(jié)劑、免疫調節(jié)劑、抗炎劑、以及抗微生物藥物，如細菌抗生素。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括治療有效量的抗體，如臨床相關單克隆抗體，如泰斯布里(tysabri)。在一些實施方案中，所述一個或多個電生理學量度是以下各項中的一個或組合：電傳導速度、動作電位、與沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖通過相關的波的振幅、沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖的寬度、所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖的潛伏期、以及所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖的包絡。在一些實施方案中，所述一個或多個電生理學量度包括跨組織外植體的復合動作電位。本公開還涉及測量一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個軸突的髓鞘形成或脫髓鞘的量或程度的方法，所述方法包括：(a)將一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體在足以使至少一個軸突生長的時間內和條件下培養(yǎng)在本文所公開的組合物中的任一種中；(b)測量和/或觀測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化；以及(c)使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化與所述神經(jīng)元細胞或組織外植體的髓鞘形成的定量變化或定性變化相關聯(lián)。本公開還涉及一種測量一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個軸突的髓鞘形成或脫髓鞘的方法，所述方法包括：(a)將一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體在足以使至少一個軸突生長的時間內和條件下培養(yǎng)在本文所公開的組合物中的任一種中；(b)測量和/或觀測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個電生理學量度；以及(c)使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個電生理學量度與所述神經(jīng)元細胞或組織外植體的髓鞘形成的定量變化或定性變化相關聯(lián)；其中步驟(b)任選地包括和/或觀測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化；并且其中步驟(c)任選地包括使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化與所述神經(jīng)元細胞或組織外植體的髓鞘形成的定量變化或定性變化相關聯(lián)。本公開還涉及一種測量一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個軸突的髓鞘形成或脫髓鞘的方法，所述方法包括：(a)將一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體在足以使至少一個軸突生長的時間內和條件下培養(yǎng)在本文所公開的組合物中的任一種中；以及(b)檢測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個軸突上髓鞘形成的量。在一些實施方案中，所述檢測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個軸突上髓鞘形成的量的步驟包括使所述細胞暴露于結合髓磷脂的抗體。在一些實施方案中，所述方法還包括(i)在步驟(a)和(b)之后使一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體暴露于至少一種試劑；(ii)測量和/或觀測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個電生理學量度、測量和/或觀測所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一種或多種形態(tài)測定變化、和/或檢測來自所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的髓磷脂的定量；(iii)計算在存在和不存在所述試劑的情況下來自所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或所述一個或多個組織外植體的測量結果、觀測結果和/或髓磷脂的定量的變化；以及(iv)使來自所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或所述一個或多個組織外植體的測量結果、觀測結果和/或髓磷脂的定量的變化與所述試劑的存在或不存在相關聯(lián)。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括至少一種環(huán)境污染物或工業(yè)污染物。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的小化合物中的一種或組合：化學治療劑、鎮(zhèn)痛劑、心血管調節(jié)劑、膽固醇水平調節(jié)劑、神經(jīng)保護劑、神經(jīng)調節(jié)劑、免疫調節(jié)劑、抗炎劑、以及抗微生物藥物。在一些實施方案中，所述一個或多個電生理學量度是以下各項中的一個或組合：電傳導速度、動作電位、與沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖通過相關的波的振幅、沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖的寬度、所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖的潛伏期、以及所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞的膜的電脈沖的包絡。在一些實施方案中，其中所述一個或多個電生理學量度包括跨組織外植體的復合動作電位。本公開還涉及一種測量一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體的一個或多個軸突的髓鞘形成或脫髓鞘的方法，所述方法包括：(a)將一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體在足以使至少一個軸突生長的時間內和條件下培養(yǎng)在本文所公開的組合物中的任一種中；以及(b)在所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體中誘導復合動作電位；(c)測量所述復合動作電位；以及(d)基于所述復合動作電位對所述一個或多個神經(jīng)元細胞的髓鞘形成的水平進行定量。在一些實施方案中，所述方法還包括使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或一個或多個組織外植體暴露于試劑。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括至少一種環(huán)境污染物或工業(yè)污染物。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的小化合物中的一種或組合：化學治療劑、鎮(zhèn)痛劑、心血管調節(jié)劑、膽固醇水平調節(jié)劑、神經(jīng)保護劑、神經(jīng)調節(jié)劑、免疫調節(jié)劑、抗炎劑、以及抗微生物藥物。在一些實施方案中，所述方法還包括測量選自以下各項中的一個或組合的除復合動作電位以外的一個或多個電生理學量度：電傳導速度、單個動作電位、與沿著一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的膜的電脈沖通過相關的波的振幅、沿著一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的膜的電脈沖的寬度、所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的膜的電脈沖的潛伏期、以及所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的膜的電脈沖的包絡。在一些實施方案中，所述方法還包括測量與所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或所述一個或多個組織外植體相關的一種或多種形態(tài)測定變化。本公開還涉及一種在包含固體基質的三維培養(yǎng)容器中誘導一個或多個神經(jīng)元細胞生長的方法，所述方法包括：(a)用所述固體基質接種一個或多個分離的施旺細胞；(b)將于懸浮液中的一個或多個分離的神經(jīng)元細胞或于外植體中的分離的神經(jīng)元細胞接種到至少一個內室中；(c)將細胞培養(yǎng)基以足以覆蓋至少所述細胞的體積引入到所述培養(yǎng)容器中；其中所述固體基質包含第一細胞不可穿透聚合物和第一細胞可穿透聚合物。在一些實施方案中，所述方法還包括將至少一個電極定位在所述固體基質的任一端或兩端處以使得所述電極可以用于刺激或記錄動作電位(ap)和/或復合動作電位(cap)，從而允許測量ap/cap傳播。在一些實施方案中，所述組合物還包括放置至少一個電極，從而提供用于電刺激的裝置，其中所述一個或多個電極被定位在所述drg神經(jīng)元的細胞體處或遠離所述細胞體處以使得所述電極形成神經(jīng)突/軸突的兩個點之間的電壓差以誘發(fā)傳播的ap/cap。本公開還涉及一種評估培養(yǎng)容器中的神經(jīng)元細胞的響應的方法，所述評估是在以下步驟之后進行的：將一種或多種刺激引入所述一個或多個神經(jīng)元細胞；以及使用局部場電位(lfp)或其它單細胞記錄方法測量所述一個或多個神經(jīng)元細胞對所述一種或多種刺激的ap或cap響應。在一些實施方案中，所述固體基質包含外表面和內表面，所述固體基質包含呈圓柱形或基本上圓柱形的形狀的至少一部分以及至少一個中空內部，所述中空內部在它的邊緣處由所述內表面的至少一部分所限定；所述內表面包含具有約0.1微米至約1.0微米的直徑的一個或多個孔隙，其中所述固體基質的中空內部是可從所述固體基質外部的點經(jīng)由至少一個開口進入的；其中所述中空內部部分包含接近所述開口的第一部分和遠離所述開口的至少第二部分；其中所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或所述一個或多個組織外植體被定位在所述中空內部的第一部分處或附近并且與所述第一細胞不可穿透聚合物或所述第一細胞可穿透聚合物中的至少一種進行物理接觸，并且其中所述至少一個中空內部的第二部分與所述第一部分處于流體連通以使得軸突能夠從所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或所述一個或多個組織外植體生長到所述中空內部的第二內部部分中。在一些實施方案中，所述方法還包括使所述一個或多個神經(jīng)元細胞與至少一種試劑接觸。在一些實施方案中，所述至少一種試劑是一個或多個干細胞或修飾的t細胞。在一些實施方案中，所述修飾的t細胞表達對癌細胞具有特異性的嵌合抗原受體。在一些實施方案中，所述細胞培養(yǎng)基包含以下各項中的一種或組合：層粘連蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、硒、bsa、fbs、抗壞血酸、i型膠原、以及iii型膠原。本公開還涉及一種檢測和/或定量神經(jīng)元細胞生長的方法，所述方法包括：(a)對一個或多個神經(jīng)元細胞進行定量；(b)在本文所公開的組合物中的任一種中培養(yǎng)所述一個或多個神經(jīng)元細胞；以及(c)在培養(yǎng)足以允許所述一個或多個細胞生長的一段時間之后計算所述組合物中神經(jīng)元細胞的數(shù)目。在一些實施方案中，步驟(c)包括在培養(yǎng)一個或多個神經(jīng)元細胞之后檢測所述一個或多個神經(jīng)元細胞的內部記錄和/或外部記錄并且使所述記錄與對應于已知或對照數(shù)目的細胞的相同記錄的測量結果相關聯(lián)。在一些實施方案中，所述方法還包括使所述一個或多個神經(jīng)元細胞與一種或多種試劑接觸。在一些實施方案中，所述方法還包括：(i)在使所述一個或多個神經(jīng)元細胞與所述一種或多種試劑接觸的步驟之前和之后測量細胞內記錄和/或細胞外記錄；以及(ii)使在使所述一個或多個神經(jīng)元細胞與所述一種或多種試劑接觸之前的記錄和在使所述一個或多個神經(jīng)元細胞與所述一種或多種試劑接觸之后的記錄的差異與細胞數(shù)的變化相關聯(lián)。本公開還涉及一種檢測或定量一個或多個神經(jīng)元細胞的軸突變性的方法，所述方法包括：(a)將一個或多個神經(jīng)元細胞接種在本文所公開的組合物中的任一種中；(b)在足以使至少一個或多個軸突從所述一個或多個神經(jīng)元細胞生長的時間段內和條件下培養(yǎng)所述一個或多個神經(jīng)元細胞；(c)對從所述神經(jīng)元細胞生長的軸突的數(shù)目或密度進行定量；(d)使所述一個或多個神經(jīng)元細胞與一種或多種試劑接觸；(e)在使所述一個或多個細胞與一種或多種試劑接觸之后對從神經(jīng)元細胞生長的軸突的數(shù)目和/或密度進行定量；以及(f)計算在存在或不存在所述試劑的情況下培養(yǎng)物中軸突的數(shù)目或密度的差異。在一些實施方案中，所述從神經(jīng)元細胞生長的一個或多個軸突和/或所述軸突的密度的步驟包括將所述一個或多個神經(jīng)元細胞用染料、熒光團、或標記的抗體染色。在一些實施方案中，步驟(c)、步驟(e)、和/或步驟(f)是經(jīng)由顯微鏡術或數(shù)字成像進行的。在一些實施方案中，步驟(c)和步驟(e)包括獲取來自一個或多個軸突的接近一個或多個細胞體的部分的測量結果并且獲取來自一個或多個軸突的遠離一個或多個細胞體的部分的測量結果。在一些實施方案中，在存在或不存在所述試劑的情況下培養(yǎng)物中軸突的數(shù)目或密度的差異是所述一個或多個神經(jīng)元細胞的一個或多個軸突的接近細胞體的部分與所述一個或多個神經(jīng)元細胞的軸突的遠離所述細胞體的部分之間的差異。在一些實施方案中，獲取測量結果包括測量以下各項中的任一個或組合：形態(tài)測定量度或電生理學量度，并且其中所述計算培養(yǎng)物中軸突的數(shù)目或密度的差異的步驟包括使測量結果中的任一個或組合與軸突的數(shù)目或密度相關聯(lián)。在一些實施方案中，獲取測量結果包括測量電生理學量度中的任一個或組合并且其中所述計算培養(yǎng)物中軸突的數(shù)目或密度的差異的步驟包括使電生理學量度中的任一個或組合與軸突的數(shù)目或密度相關聯(lián)。在一些實施方案中，所述方法還包括(g)使試劑的神經(jīng)變性作用與在步驟(c)和步驟(e)中所獲取的電生理學量度相關聯(lián)。本公開還涉及測量細胞內記錄或細胞外記錄的方法，所述方法包括：(a)在本文所公開的組合物中的任一種中培養(yǎng)一個或多個神經(jīng)元細胞；(b)跨越所述一個或多個神經(jīng)元細胞施加電壓電位；以及(c)從所述一個或多個神經(jīng)元細胞測量一個或多個電生理學量度。在一些實施方案中，所述一個或多個電生理學量度選自以下各項中的一個或組合：電傳導速度、細胞內動作電位、復合動作電位、與沿著一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的膜的電脈沖通過相關的波的振幅、沿著一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的膜的電脈沖的寬度、所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的膜的電脈沖的潛伏期、以及所述沿著一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體的膜的電脈沖的包絡。本公開還涉及一種測量或定量試劑的任何神經(jīng)保護作用的方法，所述方法包括：(a)在存在和不存在所述試劑的情況下將一個或多個神經(jīng)元細胞或組織外植體培養(yǎng)在本文所公開的組合物中的任一種中；(b)在存在和不存在所述試劑的情況下跨越所述一個或多個神經(jīng)元細胞或組織外植體施加電壓電位；(c)在存在和不存在所述試劑的情況下從所述一個或多個神經(jīng)元細胞或組織外植體測量一個或多個電生理學量度；以及(d)使通過所述一個或多個神經(jīng)元細胞或組織外植體的一個或多個電生理學量度的差異與所述試劑的神經(jīng)保護作用相關聯(lián)，以使得與在不存在所述試劑的情況下所測量的電生理學量度相比，在所述試劑存在下所述電生理學量度的下降指示不佳的神經(jīng)保護作用，并且與在不存在所述試劑的情況下所測量的電生理學量度相比，在所述試劑存在下所述電生理學量度沒有變化或傾斜指示所述試劑賦予神經(jīng)保護作用。本公開涉及一種測量或定量試劑的任何作用的方法，所述方法包括：(a)在存在和不存在所述試劑的情況下將一個或多個神經(jīng)元細胞或組織外植體培養(yǎng)在本文所公開的組合物中的任一種中；(b)在存在和不存在所述試劑的情況下跨越所述一個或多個神經(jīng)元細胞或組織外植體施加電壓電位；(c)在存在和不存在所述試劑的情況下從所述一個或多個神經(jīng)元細胞或組織外植體測量一個或多個電生理學量度；以及(d)使通過所述一個或多個神經(jīng)元細胞或組織外植體的一個或多個電生理學量度的差異與所述試劑的神經(jīng)調節(jié)作用相關聯(lián)，以使得與在不存在所述試劑的情況下所測量的電生理學量度相比，在所述試劑存在下所述電生理學量度變化指示神經(jīng)調節(jié)作用，并且與在不存在所述試劑的情況下所測量的電生理學量度相比，在所述試劑存在下所述電生理學量度沒有變化指示所述試劑不賦予神經(jīng)調節(jié)作用。本公開還涉及一種在體外檢測或定量軸突的髓鞘形成或脫髓鞘的方法，所述方法包括：(a)將一個或多個神經(jīng)元細胞在足以使所述一個或多個神經(jīng)元細胞生長一個或多個軸突的時間內和條件下培養(yǎng)在本文所公開的組合物中的任一種中；(b)跨越所述一個或多個神經(jīng)元細胞施加電壓電位；以及(c)測量通過所述一個或多個神經(jīng)元細胞的場電位或復合動作電位；(d)計算通過所述一個或多個神經(jīng)元細胞的傳導速度；以及(e)使所述一個或多個值或傳導速度與一個或多個軸突的髓鞘形成的量相關聯(lián)。在一些實施方案中，所述方法還包括使步驟(d)的傳導速度與已知或預定數(shù)目的有髓鞘的健康的神經(jīng)元細胞的傳導速度值相關聯(lián)。在一些實施方案中，所述方法還包括使所述一個或多個神經(jīng)元細胞暴露于試劑；其中步驟(a)-(e)是在所述試劑存在下進行的并且所述方法還包括評估由于所述試劑的存在所引起的髓鞘形成量的差異，其中將在所述試劑存在下所述細胞的傳導速度與在不存在所述試劑的情況下所述細胞的傳導速度相比較。在一些實施方案中，所述方法還包括使用顯微鏡和/或數(shù)字照相機使所述一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體成像。本公開還涉及一種培養(yǎng)干細胞或免疫細胞的方法，所述方法包括：(a)在本文所公開的組合物中的任一種中培養(yǎng)一個或多個神經(jīng)元細胞和/或組織外植體；以及(b)使分離的干細胞或免疫細胞暴露于所述組合物。本公開還涉及一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：(i)包含水凝膠的細胞培養(yǎng)容器；(ii)于懸浮液中或作為組織外植體的組分的一個或多個神經(jīng)元細胞；(iii)包括用于電流的發(fā)生器的放大器；(iv)電壓計和/或電流計；(v)至少第一刺激電極和至少第一記錄電極；其中所述放大器、電壓計和/或電流計以及電極是經(jīng)由電路彼此電連接的，其中電流從所述放大器饋送到所述至少一個刺激電極并且電流在所述記錄電極處被接收并且饋送到所述電壓計和/或電流計；其中所述刺激電極被定位在所述神經(jīng)元細胞的一個或多個細胞體處或附近，并且所述記錄電極被定位在遠離所述細胞體預定距離處，以使得跨越所述細胞培養(yǎng)容器建立電場。附圖說明圖1a-1e描繪了用動態(tài)掩模投影光刻對peg構建體進行的示例性微圖案化。圖1a描繪了數(shù)字微鏡器件(dmd)動態(tài)掩模光刻方法的示例性示意圖。圖1b描繪了六孔細胞培養(yǎng)插入物內示例性peg構建體的宏觀視圖。圖1c描繪了細胞培養(yǎng)插入物內示例性peg構建體的特寫。圖1d描繪了示例性dmd光掩模。圖1e描繪了在附著的drg周圍交聯(lián)的示例性peg構建體。圖2描繪了在示例性peg構建體內相對于所添加的pbs的體積puramatrix的穩(wěn)定性：在peg中在膠凝后的48小時之時fluosphere標記的puramatrix的熒光顯微照片的代表性圖像(白色虛線輪廓指示peg空隙)并且雙重水凝膠構建體的示意圖示出于puramatrix穩(wěn)定性相對于所添加的pbs的體積的條形圖上方(三個實驗中的每一個的n＝18，棒表示平均值的標準誤差)。圖3a-3f描繪了在雙重水凝膠構建體中示例性的drg神經(jīng)突生長和細胞遷移。圖3a描繪了在培養(yǎng)5天之后活/死染色的構建體(活細胞和細胞結構、死細胞、明視野)；圖3b和圖3c描繪了在雙重水凝膠構建體中培養(yǎng)7天的drg外植體，所述drg外植體是由β-iii微管蛋白陽性神經(jīng)突和dapi染色的核指示的。圖3d描繪了在5天之后通道內前端生長(β-iii微管蛋白)的特寫視圖。圖3e描繪了培養(yǎng)7天的drg外植體，所述drg外植體是針對map2陽性樹突和β-iii微管蛋白陽性神經(jīng)突染色的。圖3f描繪了在細胞培養(yǎng)插入物的表面處聚焦的構建體的分叉部分(β-iii微管蛋白)。圖4a-4e描繪了β-iii微管蛋白和dapi(僅4a)染色的構建體的共聚焦顯微照片。圖4a描繪了在分叉點附近生長的三維表示，示出了正視圖和側視圖這兩者以顯示厚度。內插圖像切片以說明切片之間的距離。圖4b描繪了在雙重水凝膠構建體中神經(jīng)突生長的合并z-棧投影。圖4c描繪了在沒有puramatrix的peg構建體中神經(jīng)突生長的合并z-棧投影。圖4d描繪了在沒有puramatrix的peg構建體中神經(jīng)突生長的深度編碼的z-棧投影。圖4e描繪了在雙重水凝膠構建體中神經(jīng)突生長的深度編碼的z-棧投影。在圖4b-4e中，使用標準偏差投影。圖5a-5d描繪了在體外7天之后在三維雙重水凝膠構建體中drg神經(jīng)突生長和細胞遷移的熒光顯微鏡術：被局限在填充有puramatrix的通道內的β-iii微管蛋白陽性神經(jīng)突、dapi染色的核、以及s100陽性膠質細胞；支持細胞存在于通道的末端附近，距離神經(jīng)節(jié)約1.875mm，如從含有神經(jīng)節(jié)的圓形區(qū)域的末端和直通道的起點所測量(c-d)。圖6a-6c描繪了共聚焦圖像的三維渲染。以3d示出了在通道的起點(圖6a)、中間(圖6b)、以及末端(圖6c)處的β-iii微管蛋白陽性神經(jīng)突、dapi染色的核、和s100陽性膠質細胞，其中z平面中的相應橫截面示于下方。圖7a-7d描繪了神經(jīng)培養(yǎng)物橫截面的透射電子顯微鏡術。圖7a描繪了在通道中距離神經(jīng)節(jié)約1.875mm的高密度的平行的成束的無髓鞘神經(jīng)突，其中圖7b插圖示出了放大視圖。圖7c描繪了以距離神經(jīng)節(jié)約1mm的由施旺細胞(sc)封裝的軸突(ax)為中心的焦點。圖7d描繪了在神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)的施旺細胞核(sn)；所有測量均是從直通道的起點處含有神經(jīng)節(jié)的圓形區(qū)域的末端進行的。圖8a描繪了溴酚藍染色的構建體，其中已經(jīng)放置了分別被放置在神經(jīng)節(jié)和通道中的神經(jīng)束內的記錄電極(左側)和刺激電極(右側)以進行場記錄。圖8b描繪了群體響應的示例跡線，證實了在三維神經(jīng)構建體中成功的場電位記錄和復合動作電位(cap)特征性的波形特性。圖8c描繪了在三維神經(jīng)培養(yǎng)物的神經(jīng)節(jié)中從近端位置(1.5mm)和遠端位置(2.25mm)誘發(fā)的場電位，n＝4；由虛線標記。平均跡線突出顯示了在遠端刺激時起始相延遲時間的延長。圖8d描繪了遠端刺激使得起始相延遲時間顯著延長(p＝0.02)，其中平均延遲時間從0.82ms延長到2.88ms，并且平均響應振幅降低了29.46％。刺激距離是從直通道的起點到刺激點來測量的。起始相延遲時間被測量為在刺激偽跡返回到基線與響應的正峰之間的時間。圖8e描繪了在三維神經(jīng)構建體中使用0.5μm河豚毒素(ttx)阻斷na+通道活性。平均跡線顯示了ttx消除了群體響應，n＝3。圖8f描繪了響應振幅具有顯著差異，p＝0.029，其中在ttx洗入之后平均振幅從448.75μv降低到0.04μv。振幅是從峰到峰測量的。圖9a描繪了在三維神經(jīng)構建體中興奮性谷氨酸阻斷劑dnqx和apv無作用，n＝4。在藥物洗入之前(t1-t5)和之后(t16-t20)響應的平均跡線顯示藥物的響應振幅(圖9b)或持續(xù)時間(圖9c)沒有顯著的變化。在dnqx和apv之后，響應振幅和持續(xù)時間沒有統(tǒng)計學差異。振幅是峰到峰測量的并且持續(xù)時間是在半峰處測量的以使測量結果之間的變異減到最低限度。圖9d描繪了在三維神經(jīng)構建體中高頻刺激期間響應的一致發(fā)放，n＝3。示例跡線顯示在50hz序列期間電誘發(fā)的群體峰電位的一致性，示出了開始和結束時放大的跡線以進行比較。在50hz脈沖序列結束時響應的振幅(圖9e)和持續(xù)時間(圖9f)與開始時的那些沒有顯著差異。振幅是從峰到峰測量的并且持續(xù)時間是在半峰處測量的以使測量結果之間的變異減到最低限度。圖10a-10f描繪了在培養(yǎng)的神經(jīng)元上進行的電生理學實驗。圖10a描繪了用于全細胞膜片鉗的記錄電極(左側)和刺激電極(右側)的放置。圖10b描繪了三維神經(jīng)構建體中初級感覺神經(jīng)元的成功全細胞膜片鉗。圖10c描繪了三維神經(jīng)培養(yǎng)物中成功的全細胞膜片鉗記錄，所述記錄沒有表現(xiàn)出突觸活動的證據(jù)，n＝3。示例跡線顯示從神經(jīng)節(jié)中的細胞記錄的電誘發(fā)的動作電位。圖10d描繪了放大的跡線，它顯示響應的快速的非分級的起始相。圖10e描繪了在沒有自發(fā)電流的情況下的電壓鉗跡線。圖10f描繪了沒有表現(xiàn)出電位的自發(fā)變化的電流鉗跡線。圖11a-11b描繪了構建體中神經(jīng)突生長的深度的分析。圖11a描繪了在存在和不存在puramatrix的情況下在構建體中β-iii標記的神經(jīng)突的平均高度(p<0.005)。圖11b描繪了在整個puramatrix深度上呈總神經(jīng)突生長百分比形式的神經(jīng)突生長。圖12a-12f描繪了在體外7天之后神經(jīng)突生長的熒光顯微鏡術。圖12a描繪了從頂部焦平面示出的puramatrix中前端神經(jīng)突生長的分支和隨機取向。圖12b描繪了從底部焦平面示出的puramatrix中前端神經(jīng)突生長的分支和隨機取向。圖12c描繪了在沒有puramatrix的通道中沿著插入膜表面的有限神經(jīng)突生長。圖12d描繪了沿著peg邊界的優(yōu)先生長。圖12e描繪了在fluoromyelintm紅色熒光髓磷脂染劑之前不存在髓磷脂。圖12f描繪了在fluoromyelintm紅色熒光髓磷脂染劑之后不存在髓磷脂。圖13描繪了用于共培養(yǎng)sc和drg的方法。步驟1是形成peg模具；步驟2是插入drg；步驟3是以特定的細胞計數(shù)將sc與凝膠溶液混合并且將凝膠溶液添加到空隙中；步驟4是使用負像掩模輻照并且形成凝膠。圖14描繪了在三維中四個培養(yǎng)模型中的每一個中神經(jīng)元生長的量的定量。觀測到在具有膠原的兩種系統(tǒng)中有更多的神經(jīng)元生長。在神經(jīng)元生長方面沒有檢測到由于培養(yǎng)基方案的變化所造成的顯著影響。圖15描繪了在25天之后髓磷脂蛋白質(mbp)的產生。將drg/sc與神經(jīng)元一起共培養(yǎng)，固定并且用抗mbp和β-iii微管蛋白抗體針對致密髓磷脂和神經(jīng)絲進行免疫標記；物鏡20×；比例尺表示25μm。在所有實驗組中，在25天之后sc完全包圍軸突，從而形成mbp陽性軸突。圖16a-16b描繪了共聚焦圖像的三維渲染。圖16a描繪了mbp蛋白質的免疫組織化學。圖16b描繪了mag的免疫組織化學。這兩者的培養(yǎng)物厚度是190μm，從而確認了體外系統(tǒng)的三維髓磷脂形成能力。圖17a-17c描繪了神經(jīng)絲β-iii和mbp的免疫組織化學。圖17a可視地描繪了各種培養(yǎng)基中的免疫組織化學。這些圖是用共聚焦顯微鏡術使用z-棧采集來采集的。隨后獲得最大投影。在25天之后可以觀測到密集的成束生長。比例尺＝500μm。圖17b描繪了髓鞘形成的體積的圖表。在膠原存在下mbp陽性髓磷脂的量增加。具有更少的aa暴露的ncol-15具有最少量的髓磷脂。圖17c描繪了mbp陽性髓磷脂的體積與神經(jīng)絲的體積的比率的圖表，描繪了更長時間暴露于aa的培養(yǎng)物形成更致密的髓磷脂。在所有實驗組中，髓磷脂形成的百分比在對照組中顯著降低，從而證實外源性sc在髓鞘形成過程中具有主要作用。圖18a-18c描繪了神經(jīng)絲β-iii和po的免疫組織化學。圖18a可視地描繪了各種培養(yǎng)基中的免疫組織化學。比例尺＝500填充。圖18b描繪了髓鞘形成的體積的圖表。在膠原存在下po陽性髓磷脂的量增加。po存在于pns致密髓磷脂中并且因此po陽性髓磷脂表示pns致密髓磷脂。具有更高的aa暴露和膠原的并入的col-25具有最大量的致密髓磷脂。減少的趨勢證實了去除這兩種因素，即膠原的存在和更長時間暴露于aa，將使得在25天之后三維培養(yǎng)物中髓磷脂的形成最少。圖18c描繪了相對于神經(jīng)絲，po陽性髓磷脂的百分比的圖表，顯示盡管存在神經(jīng)元產生的體積，但是所述系統(tǒng)僅引起髓磷脂形成。排除在存在或不存在膠原的情況下(col或n-col)顯示的神經(jīng)元生長的體積，暴露于aa在三維中的髓磷脂形成中起重要作用。然而，col-15在統(tǒng)計學上等同于ncol-25，這證實在不存在膠原的情況下aa暴露25天之后構建體的效率類似于在膠原存在下aa暴露15天之后的效率。應當指出的是，如圖18b中所示，所述量是顯著不同的。圖19a-19c描繪了神經(jīng)絲β-iii和mag的免疫組織化學。圖19a可視地描繪了各種培養(yǎng)基中的免疫組織化學。mag是存在于非致密髓磷脂中的主要蛋白質之一。比例尺＝500μm。圖19b描繪了在所有四個實驗組中致密髓磷脂的體積的圖表。具有更高的aa暴露和膠原的并入的col-25具有最大量的非致密髓磷脂。圖19c描繪了mag陽性髓磷脂與神經(jīng)絲的體積的比率的圖表，證實了具有最短的aa暴露時間并且不存在膠原的ncol-15在非致密髓磷脂形成方面具有最低的效率，不論系統(tǒng)中神經(jīng)纖維的體積如何。圖20a-20f描繪了神經(jīng)培養(yǎng)物橫截面的透射電子顯微鏡照片，顯示了在25天培養(yǎng)物中單個神經(jīng)纖維周圍的髓鞘：(圖20a)ncol-25；(圖20b)ncol-15；(圖20d)col-25；(圖20e)col-15。圖20c描繪了通道中高密度的平行的成束的神經(jīng)突。神經(jīng)元是有髓鞘的或sc已經(jīng)開始在神經(jīng)纖維周圍包覆，從而解釋了在免疫組織化學染色中有大量髓磷脂蛋白質呈陽性。圖20f描繪了厚髓鞘的放大。a＝軸突，m＝髓磷脂，s＝施旺細胞。圖21a-21b描繪了結構-功能相關性。圖21a描繪了用β-iii微管蛋白神經(jīng)突、dapi核、以及s100施旺細胞染色的接近背根神經(jīng)節(jié)、處于中點、以及遠離神經(jīng)節(jié)的無髓鞘神經(jīng)纖維束的共聚焦圖像棧。圖21b描繪了數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)顯示所記錄的在近端刺激的cap比在遠端刺激的那些顯示更高的振幅和更短的潛伏期。圖22a-22c描繪了在高葡萄糖條件存在下在毒性應激下神經(jīng)培養(yǎng)物的生理學評價。圖22a描繪了在25mm和60mm葡萄糖存在下持續(xù)48小時的細胞培養(yǎng)物的電生理學跡線。圖22b描繪了顯示暴露于60mm葡萄糖條件使得復合動作電位振幅降低的圖表。圖22b描繪了顯示暴露于60mm葡萄糖條件使得復合動作電位潛伏期延長的圖表。圖23a-23c描繪了在0.1μm紫杉醇(paclitaxel)存在下在毒性應激下神經(jīng)培養(yǎng)物的生理學評價。圖23a描繪了在施用紫杉醇之前和之后細胞培養(yǎng)物的電生理學跡線。圖23b描繪了顯示暴露于紫杉醇降低了復合動作電位振幅的圖表。圖23c描繪了顯示暴露于紫杉醇延長了復合動作電位潛伏期的圖表。圖24描繪了可以在背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)節(jié)處、在背根神經(jīng)節(jié)的近側神經(jīng)束處、在背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)束的中點處、以及在背根神經(jīng)節(jié)的遠側神經(jīng)束處獲取的形態(tài)學和生理學測量結果的列表。圖25描繪了所提出的在背根神經(jīng)節(jié)、微管、離子通道、髓磷脂、線粒體、以及小神經(jīng)纖維處由化學治療誘導的外周神經(jīng)毒性的靶標的列表。圖26描繪了實驗設計，其中將在培養(yǎng)物生長和髓鞘形成之后獲取基線生理學記錄。實驗將限于急性(48小時)施用每一種藥物，繼而通過生理學記錄(rec)和成像(cfm和tem)立即或延遲(7天)評估。對照組將由媒介物施用組成而無藥物。圖27a-27b描繪了視網(wǎng)膜(cns)組織的培養(yǎng)物。將來自胚胎大鼠的視網(wǎng)膜外植體在三維微圖案化的水凝膠內培養(yǎng)在補充有cntf(圖27a)或bdnf(圖27b)的“神經(jīng)基礎sato”培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)一周之后將可觀測的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突延伸可視化，用β-iii微管蛋白染色。圖28描繪了實驗，所述實驗顯示drg神經(jīng)突優(yōu)先朝向ngf生長，所述ngf與bsa相對，從水凝膠構建體中的貯器中擴散。圖29描繪了微生理培養(yǎng)系統(tǒng)和非侵入性電生理學分析，它們的特征在于選擇性照射和同時激活單個皮層神經(jīng)元以及表達gfp和chr2的細胞中的單個樹突。dlp顯微鏡術和光遺傳學用于光學神經(jīng)激活的這一應用與電壓敏感性染料成像，如vf組合。圖30描繪了利用熒光顯微鏡術和電生理學的多孔形式。具體實施方式在整個本說明書和權利要求書中使用了與本公開的方法和其它方面有關的各種術語。除非另外指明，否則這些術語將被給予它們的本領域的普通含義。其它具體定義的術語應當以與本文所提供的定義一致的方式來解釋。除非上下文另外明確規(guī)定，否則如在本說明書以及所附權利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(種)(a/an)”和“所述”包括復數(shù)指代對象。如本文所用的術語“大于2”被定義為大于數(shù)字2的任何整數(shù)，例如3、4、或5。如本文所用的術語“多個(種)”被定義為大于或多于1的任何量或數(shù)目。術語“生物反應器”指的是其中培養(yǎng)細胞，任選地在懸浮液中培養(yǎng)細胞的封閉物或部分封閉物。在一些實施方案中，所述生物反應器指的是其中培養(yǎng)細胞的封閉物或部分封閉物，其中所述細胞可以處于液體懸浮液中，或可替代地可以與另一種非液體基質接觸、在另一種非液體基質上或以內生長，所述基質包括但不限于固體生長支持材料。在一些實施方案中，所述固體生長支持材料或固體基質包含以下各項中的至少一種或組合：二氧化硅、塑料、金屬、烴、或凝膠。本公開涉及一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括生物反應器，所述生物反應器包括一個或多個培養(yǎng)容器，可以在所述培養(yǎng)容器中在細胞生長培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)神經(jīng)元細胞。如本文所用的術語“培養(yǎng)容器”被定義為適用于使細胞生長、培養(yǎng)、培育細胞、使細胞增殖、繁殖、或以其它方式類似地操作細胞的任何容器。培養(yǎng)容器在本文也可以被稱為“培養(yǎng)插入物”。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器是由生物相容性塑料和/或玻璃制成的。在一些實施方案中，所述塑料是塑料薄層，所述塑料薄層包含一個或多個孔隙，所述孔隙允許蛋白質、核酸、營養(yǎng)物質(如重金屬和激素)、抗生素、以及其它細胞培養(yǎng)基組分擴散穿過所述孔隙。在一些實施方案中，所述孔隙具有不大于約0.1微米、0.5微米、1.0微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、15微米、20微米、25微米、30微米、40微米、50微米的寬度。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器處于水凝膠基體中并且不含基底或任何其它結構。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器被設計成含有水凝膠或水凝膠基體和各種培養(yǎng)基。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器由水凝膠或水凝膠基體組成或基本上由水凝膠或水凝膠基體組成。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器的唯一塑料部件是培養(yǎng)容器的構成培養(yǎng)容器的側壁和/或底部的部件，所述側壁和/或底部將細胞生長的孔或區(qū)域的體積與培養(yǎng)容器外部的點分開。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器包含水凝膠和一個或多個分離的膠質細胞。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)容器包含水凝膠和一個或多個分離的膠質細胞，向其中接種一個或多個神經(jīng)元細胞。術語“電刺激”指的是其中細胞正在暴露于交流電(ac)或直流電(dc)的電流的過程?？梢詫㈦娏饕牍腆w基質中或經(jīng)由細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的其它合適的組分施加。在一些實施方案中，通過將一個或多個電極定位在器件或系統(tǒng)內的不同位置處以跨越細胞培養(yǎng)容器形成電壓電位來向所述器件或系統(tǒng)提供電刺激。所述電極通過一個或多個電線與一個或多個放大器、電壓計、電流計、和/或電化學系統(tǒng)(如電池或發(fā)電機)可操作地連接。這些器件和電線形成電路，通過該電路產生電流并且通過該電路跨越組織培養(yǎng)系統(tǒng)產生電位。如本文所用的術語“水凝膠”被定義為聚合物鏈的任何水不溶性的交聯(lián)的三維網(wǎng)絡，所述網(wǎng)絡在聚合物鏈之間具有填充有或能夠填充以水的空隙。如本文所用的術語“水凝膠基體”被定義為任何三維水凝膠構建體、系統(tǒng)、器件、或類似的結構。水凝膠和水凝膠基體是本領域已知的并且各種類型已經(jīng)描述于例如美國專利號5,700,289、和6,129,761；以及curley和moore,2011；curley等,2011；irons等,2008；以及tibbitt和anseth,2009中，這些文獻中的每一篇以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體可以通過使液化的預凝膠溶液經(jīng)受具有高于約300nm、400nm、450nm或500nm的波長的紫外光、可見光或日光而凝固。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體可以凝固成各種形狀，例如被設計成模擬神經(jīng)元神經(jīng)束的分叉形狀。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(peg)。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含puramatrix。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含甲基丙烯酸縮水甘油酯-葡聚糖(medex)。在一些實施方案中，將神經(jīng)元細胞并入水凝膠或水凝膠基體中。在一些實施方案中，將來自神經(jīng)系統(tǒng)的細胞并入水凝膠或水凝膠基體中。在一些實施方案中，所述來自神經(jīng)系統(tǒng)的細胞是施旺細胞和/或少突膠質細胞。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含來自動物(如哺乳動物)的神經(jīng)系統(tǒng)的組織外植體和補充細胞群體，所述補充細胞群體源自于神經(jīng)系統(tǒng)，但是被分離和培養(yǎng)以使它的群體在培養(yǎng)物中富集。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含組織外植體，如視網(wǎng)膜組織外植體、drg、或脊髓組織外植體以及分離和培養(yǎng)的施旺細胞、少突膠質細胞、和/或小膠質細胞的群體。在一些實施方案中，在細胞培養(yǎng)容器中同時使用兩種或更多種水凝膠或水凝膠基體。在一些實施方案中，在同一個細胞培養(yǎng)容器中同時使用兩種或更多種水凝膠或水凝膠基體，但是所述水凝膠由壁分開，從而形成組織培養(yǎng)容器，如孔中可獨立定位的微環(huán)境。在多重化組織培養(yǎng)容器中，對于一些實施方案來說有可能在細胞培養(yǎng)容器內包括許多上述孔或可獨立定位的位置以使得一個孔或位置中的水凝膠基體與細胞培養(yǎng)容器的另一個孔或位置中的水凝膠基體不同或相同。在一些實施方案中，所述兩種或更多種水凝膠可以包含不同量的peg和/或puramatrix。在一些實施方案中，所述兩種或更多種水凝膠可以具有各種密度。在一些實施方案中，所述兩種或更多種水凝膠可以具有能夠允許細胞在所述水凝膠內生長的各種滲透性。在一些實施方案中，所述兩種或更多種水凝膠可以具有各種柔性。術語“細胞可穿透聚合物”指的是具有相同的或混合的單體亞單元的親水性聚合物，所述聚合物的濃度和/或密度足以在以固態(tài)或半固態(tài)在固體基質上交聯(lián)時形成空間，所述空間具有足夠的生物相容性以使得細胞或細胞的一部分可以在培養(yǎng)物中生長。術語“細胞不可穿透聚合物”指的是具有相同的或混合的單體亞單元的親水性聚合物，所述聚合物的濃度和/或密度足以在以固態(tài)或半固態(tài)在固體基質上交聯(lián)時不形成生物相容性空間或隔室。換句話說，細胞不可穿透聚合物是在以特定的濃度和/或密度交聯(lián)之后不能支持細胞或細胞的一部分在培養(yǎng)物中生長的聚合物。本領域普通技術人員可以了解的是，細胞不可穿透聚合物和細胞可穿透聚合物可以包含相同的或基本上相同的聚合物，但是在交聯(lián)之后濃度或密度的差異形成具有有助于細胞或細胞的一部分在培養(yǎng)物中生長的一些部分的水凝膠基體。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體可以具有各種厚度。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約150μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約200μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約250μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約300μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約350μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約400μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約450μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約500μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約550μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約600μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約650μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約700μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約750μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約750μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約700μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約650μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約600μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約550μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約500μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約450μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約400μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約350μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約300μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約250μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約200μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約150μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約300μm至約600μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約400μm至約500μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體可以具有各種厚度。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約10μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約150μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約200μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約250μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約300μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約350μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約400μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約450μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約500μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約550μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約600μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約650μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約700μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約750μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約800μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約850μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約900μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約950μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約1000μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約1500μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約2000μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約2500μm至約3000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約2500μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約2000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約1500μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約1000μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約950μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約900μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約850μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約800μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約750μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約700μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約650μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約600μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約550μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約500μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約450μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約400μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約350μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約300μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約250μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約200μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約100μm至約150μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約300μm至約600μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體的厚度是約400μm至約500μm。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含一種或多種合成聚合物。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含下列合成聚合物中的一種或多種：聚乙二醇(聚氧化乙烯)、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚丙烯酰胺、有機硅、以及其任何衍生物或組合。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含一種或多種合成多糖和/或天然多糖。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含下列多糖中的一種或多種：透明質酸、硫酸肝素、肝素、葡聚糖、瓊脂糖、殼聚糖、藻酸鹽、以及其任何衍生物或組合。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含一種或多種蛋白質和/或糖蛋白。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含下列蛋白質中的一種或多種：膠原、明膠、彈性蛋白、肌聯(lián)蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白、角蛋白、絲素蛋白、以及其任何衍生物或組合。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含一種或多種合成多肽和/或天然多肽。在一些實施方案中，所述水凝膠或水凝膠基體包含下列多肽中的一種或多種：聚賴氨酸、聚谷氨酸或聚甘氨酸。在一些實施方案中，所述水凝膠包含選自以下文獻中所公開的那些的聚合物中的一種或組合：khoshakhlagh等,“作為用于神經(jīng)突生長的可選擇性調節(jié)的支架的透明質酸和puramatrix的光反應性互穿網(wǎng)絡(photoreactiveinterpenetratingnetworkofhyaluronicacidandpuramatrixasaselectivelytunablescaffoldforneuritegrowth)”,actabiomaterialia,2015年1月21日。適用于細胞生長的任何水凝膠可以通過將本文所公開的聚合物中的任一種或組合以足以形成以下兩種不同密度的交聯(lián)聚合物的濃度以及條件和足夠的時間段放置而形成：一種是細胞可穿透的并且一種是細胞不可穿透的。所述聚合物可以是合成聚合物、多糖、天然蛋白質或糖蛋白和/或多肽，如選自以下的那些。合成聚合物如聚乙二醇(聚氧化乙烯)、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯、聚丙烯酰胺、有機硅、它們的組合、以及它們的衍生物。多糖(無論是合成的還是源自于天然來源)如透明質酸、硫酸乙酰肝素、肝素、葡聚糖、瓊脂糖、殼聚糖、藻酸鹽、它們的組合、以及它們的衍生物。天然蛋白質或糖蛋白如膠原、明膠、彈性蛋白、肌聯(lián)蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白、角蛋白、絲素蛋白、它們的組合、以及它們的衍生物。多肽(無論是合成的還是天然來源)如聚賴氨酸、以及已經(jīng)列出的所有rad和eak肽。術語“分離的神經(jīng)元”指的是如下的神經(jīng)元細胞，所述神經(jīng)元細胞已經(jīng)從最初長出它們的生物體或培養(yǎng)物中被取出或解離。在一些實施方案中，分離的神經(jīng)元是于懸浮液中的神經(jīng)元。在一些實施方案中，分離的神經(jīng)元是更大的細胞混合物的組分，所述混合物包括組織樣品或含有非神經(jīng)元細胞的懸浮液。在一些實施方案中，在將神經(jīng)元細胞從作為它們的來源的動物中取出時，如在組織外植體的情況下，所述神經(jīng)元細胞已經(jīng)變成分離的。在一些實施方案中，分離的神經(jīng)元是從動物切下的drg中的那些神經(jīng)元。在一些實施方案中，所述分離的神經(jīng)元包含來自選自以下各項的一種物種或物種的組合的至少一個或多個細胞：綿羊細胞、山羊細胞、馬細胞、牛細胞、人類細胞、猴細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、兔細胞、狗細胞、貓細胞、豬細胞、或其它非人類哺乳動物。在一些實施方案中，所述分離的神經(jīng)元是人類細胞。在一些實施方案中，所述分離的神經(jīng)元是被預條件化以具有類似于或基本上類似于人類神經(jīng)元細胞的分化表型的干細胞。在一些實施方案中，所述分離的神經(jīng)元是人類細胞。在一些實施方案中，所述分離的神經(jīng)元是被預條件化以具有類似于或基本上類似于非人類神經(jīng)元細胞的分化表型的干細胞。在一些實施方案中，所述干細胞選自：間充質干細胞、誘導多能干細胞、胚胎干細胞、造血干細胞、表皮干細胞、從哺乳動物的臍帶中分離的干細胞、或內胚層干細胞。術語“神經(jīng)變性疾病”在整個本說明書中用于描述由對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷所引起的疾病?？梢宰鳛榭梢允褂盟_的模型、系統(tǒng)或器件研究的疾病的實例的示例性神經(jīng)變性疾病包括例如帕金森氏病(parkinson'sdisease)、亨廷頓氏病(huntington'sdisease)、肌萎縮性側索硬化(盧伽雷氏病(lougehrig'sdisease))、阿爾茨海默氏病(alzheimer'sdisease)、溶酶體貯積病(“白質病”或膠質/脫髓鞘疾病，如例如由folkerth,j.neuropath.exp.neuro.,58,1999年9月9日所述)、泰薩二氏病(taysachsdisease)(β氨基己糖苷酶缺乏癥)、其它遺傳性疾病、多發(fā)性硬化、由缺血、事故、環(huán)境損傷等所引起的腦損傷或創(chuàng)傷、脊髓損傷、共濟失調以及酒精中毒。此外，本發(fā)明可以用于測試藥劑對培養(yǎng)物中的神經(jīng)元細胞的功效、毒性、或神經(jīng)變性作用以研究用于神經(jīng)變性疾病的治療。術語神經(jīng)變性疾病還包括神經(jīng)發(fā)育病癥，包括例如自閉癥和相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如精神分裂癥等。如本文所用的術語“神經(jīng)元細胞”被定義為包含樹突、軸突、以及細胞體中的至少一種或組合的細胞、或可替代地，從神經(jīng)系統(tǒng)組織中分離的任何細胞或細胞群。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是包含軸突或能夠形成軸突的任何細胞。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是施旺細胞、膠質細胞、神經(jīng)膠質、皮層神經(jīng)元、從神經(jīng)元組織中分離或獲得的或已經(jīng)分化成具有神經(jīng)元表型或與神經(jīng)元細胞的表型基本上類似的表型的細胞的胚胎細胞、已經(jīng)分化成神經(jīng)元表型的誘導多能干細胞(ips)、或源自于神經(jīng)元組織或分化成神經(jīng)元表型的間充質干細胞。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是來自成年、青少年、幼年或胎兒受試者的背根神經(jīng)節(jié)(drg)組織、視網(wǎng)膜組織、脊髓組織、或腦組織的神經(jīng)元。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是從受試者的神經(jīng)元組織中分離的任何一個或多個細胞。在一些實施方案中，所述神經(jīng)元細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，所述細胞是人類細胞。在一些實施方案中，所述細胞是非人類哺乳動物細胞或衍生自從非人類哺乳動物分離的細胞。如果從作為所述細胞的來源的原始動物分離或解離，那么神經(jīng)元細胞可以包含來自多于一種物種的分離的神經(jīng)元。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是下列神經(jīng)元中的一種或多種：交感神經(jīng)元、脊髓運動神經(jīng)元、中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元、運動神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、gaba能神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、血清素能神經(jīng)元、中間神經(jīng)元、腎上腺素能神經(jīng)元、以及三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是下列膠質細胞中的一種或多種：星形細胞、少突膠質細胞、施旺細胞、小膠質細胞、室管膜細胞、放射狀膠質細胞、衛(wèi)星細胞、腸神經(jīng)膠質細胞、以及垂體細胞。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是下列免疫細胞中的一種或多種：巨噬細胞、t細胞、b細胞、白細胞、淋巴細胞、單核細胞、肥大細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞、以及嗜堿性粒細胞。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是下列干細胞中的一種或多種：造血干細胞、神經(jīng)干細胞、脂肪衍生的干細胞、骨髓衍生的干細胞、誘導多能干細胞、星形細胞衍生的誘導多能干細胞、成纖維細胞衍生的誘導多能干細胞、腎上皮衍生的誘導多能干細胞、角質細胞衍生的誘導多能干細胞、外周血液衍生的誘導多能干細胞、肝細胞衍生的誘導多能干細胞、間充質衍生的誘導多能干細胞、神經(jīng)干細胞衍生的誘導多能干細胞、脂肪干細胞衍生的誘導多能干細胞、前脂肪細胞衍生的誘導多能干細胞、軟骨細胞衍生的誘導多能干細胞、以及骨骼肌衍生的誘導多能干細胞。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是角質細胞。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞是內皮細胞。如本文所用的術語“神經(jīng)元細胞培養(yǎng)基”或簡稱“培養(yǎng)基”被定義為適用于支持神經(jīng)元細胞生長、培養(yǎng)、培育神經(jīng)元細胞、使神經(jīng)元細胞增殖、繁殖、或以其它方式操作神經(jīng)元細胞的任何營養(yǎng)物質。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含補充有神經(jīng)生長因子(ngf)的神經(jīng)基礎培養(yǎng)基。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含胎牛血清(fbs)。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含l-谷氨酰胺。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.001％重量/體積至約0.01％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.001％重量/體積至約0.008％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.001％重量/體積至約0.006％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.001％重量/體積至約0.004％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.002％重量/體積至約0.01％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.003％重量/體積至約0.01％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.004％重量/體積至約0.01％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.006％重量/體積至約0.01％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.008％重量/體積至約0.01％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.002％重量/體積至約0.006％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約0.003％重量/體積至約0.005％重量/體積范圍內的濃度的抗壞血酸。在一些實施方案中，水凝膠、水凝膠基體、和/或神經(jīng)元細胞培養(yǎng)基包含下列組分中的任何一種或多種：神經(jīng)胚素(artemin)、抗壞血酸、atp、β-內啡肽、bdnf、小牛血清、牛血清白蛋白、降鈣素基因相關肽、辣椒素、角叉菜膠、ccl2、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、cx3cl1、cxcl1、cxcl2、d-絲氨酸、胎牛血清、氟代檸檬酸鹽、福爾馬林、膠質細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質纖維酸性蛋白、谷氨酸鹽、il-1、il-1α、il-1β、il-6、il-10、il-12、il-17、il-18、胰島素、層粘連蛋白、脂氧素、mac-1-皂草素、甲硫氨酸砜亞胺、米諾環(huán)素(minocycline)、神經(jīng)調節(jié)蛋白-1、神經(jīng)保護素、神經(jīng)秩蛋白、ngf、一氧化氮、nt-3、nt-4、珀爾塞蛋白(persephin)、血小板裂解物、pmx53、聚-d-賴氨酸(pll)、聚-l-賴氨酸(pll)、丙戊茶堿、消退素、s100鈣結合蛋白b、硒、物質p、tnf-α、i型-v型膠原、以及酵母聚糖。如本文所述的術語“光遺傳學”指的是涉及使用光來控制活組織中的細胞(通常是神經(jīng)元)的生物技術，所述細胞已經(jīng)被遺傳修飾成表達光敏離子通道。它是一種用于神經(jīng)科學中的神經(jīng)調節(jié)方法，使用來自光學和遺傳學的技術的組合來控制和監(jiān)測活組織中，甚至是自由移動的動物體內單個神經(jīng)元的活動并且精確測量那些操作的實時效果。用于光遺傳學中的關鍵試劑是光敏蛋白?？臻g精確的神經(jīng)元控制是使用光遺傳學執(zhí)行子，如通道視紫紅質、鹽細菌視紫紅質(halorhodopsin)、以及古細菌視紫紅質(archaerhodopsin)來實現(xiàn)的，而時間精確的記錄可以在鈣(水母發(fā)光蛋白、卡默萊昂(cameleon)、gcamp)、氯離子(克洛梅隆(clomeleon))或膜電壓(墨梅徳(mermaid))的光遺傳學感受子的幫助下來完成。在一些實施方案中，被光遺傳學執(zhí)行子和/或感受子修飾的神經(jīng)細胞用于本文所描述的培養(yǎng)系統(tǒng)中。術語“塑料”指的是包含烴的生物相容性聚合物。在一些實施方案中，塑料選自由以下各項組成的組：聚苯乙烯(ps)、聚丙烯腈(pan)、聚碳酸酯(pc)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯(pvp)、聚乙烯醇縮丁醛(pvb)、聚氯乙烯(pvc)、聚乙烯基甲基醚(pvme)、聚乳酸-共-乙醇酸(plga)、聚(l-乳酸)、聚酯、聚己內酯(pcl)、聚氧化乙烯(peo)、聚苯胺(pani)、聚芴、聚吡咯(ppy)、聚乙烯二氧噻吩(pedot)、以及前述聚合物中的兩種或任一種的混合物。如本文所用的術語“接種”被定義為將一定量的細胞轉移到新的培養(yǎng)容器中。所述量可以被限定并且可以使用細胞的體積或數(shù)量作為限定量的基礎。細胞可以是懸浮液的一部分。如本文所用的術語“固體基質”指的是作為不含或基本上不含細胞毒素的固體載體的任何物質。在一些實施方案中，所述固體基質包含二氧化硅、塑料、以及金屬中的一種或組合。在一些實施方案中，所述固體基質包含具有足以允許蛋白質、營養(yǎng)物質、以及氣體在細胞培養(yǎng)基存在下擴散或非主動轉運穿過固體基質的尺寸和形狀的孔隙。在一些實施方案中，孔徑具有不超過約10微米、9微米、8微米、7微米、6微米、5微米、4微米、3微米、2微米、1微米的直徑。本領域普通技術人員可以基于細胞培養(yǎng)基的內含物以及在特定微環(huán)境中在固體基質上生長的細胞的暴露來確定多大的孔徑是必要的。舉例來說，本領域的普通技術人員可以觀測系統(tǒng)或器件中的任何培養(yǎng)細胞在使用包含各種直徑的孔隙的固體基質的條件下是否是存活的。在一些實施方案中，所述固體基質包含具有預定形狀的基底，所述預定形狀限定了所述外表面和所述內表面的形狀。在一些實施方案中，所述基底包含二氧化硅、塑料、陶瓷、或金屬中的一種或組合，并且其中所述基底呈圓柱體的形狀或呈基本上類似于圓柱體的形狀，以使得所述第一細胞不可穿透聚合物和第一細胞可穿透聚合物包被所述基底的內表面并且限定圓柱形或基本上圓柱形的內室；并且其中所述開口被定位在所述圓柱體的一端處。在一些實施方案中，所述基底包含足以允許蛋白質、營養(yǎng)物質、以及氧氣在所述細胞培養(yǎng)基存在下擴散穿過所述固體基質的尺寸和形狀的一個或多個孔隙。在一些實施方案中，所述固體基質包含具有不超過1微米直徑的孔徑的塑料基底并且包含至少一層水凝膠基體；其中所述水凝膠基體包含至少第一細胞不可穿透聚合物和至少第一細胞可穿透聚合物；所述基底包含預定形狀，所述第一細胞不可穿透聚合物和至少第一細胞可穿透聚合物物理粘附或化學鍵合在所述預定形狀周圍；其中所述固體基質包含至少一個隔室，所述隔室至少部分地由所述固體基質的內表面的形狀所限定并且可從所述固體基質外部的點通過開口進入，所述開口任選地被定位在所述固體基質的一端處。在實施方案中，在所述固體基質包含由至少一個內表面限定的中空內部部分的情況下，可以通過將細胞放置在開口處或附近以使得細胞可以在生長之前附著到所述固體基質的內表面的至少一部分上來接種懸浮液或組織外植體中的細胞。所述固體基質的至少一個隔室或中空內部允許將細胞容納在由固體基質的內表面的形狀限定的特定三維形狀中并且促進細胞遠離開口定向生長。在神經(jīng)元細胞的情況下，至少一個隔室的容納程度和形狀有助于軸突從被定位在至少一個隔室內并且處于開口處或附近的細胞體生長。在一些實施方案中，所述固體基質呈管狀或基本上呈管狀以使得內部隔室的形狀是圓柱形的或部分圓柱形的。在一些實施方案中，所述固體基質包含一個或多個分支管狀內部隔室。在一些實施方案中，固體的中空內部部分的分叉或多重分叉形狀被配置用于或允許軸突按多重分支模式生長。當(并且如果)將電極放置在軸突的遠端處至附近以及神經(jīng)元細胞體處或附近時，可以在器件或系統(tǒng)內測量電生理學量度，如細胞內動作電位。本公開還涉及一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：(i)水凝膠基體；(ii)于懸浮液中或作為組織外植體的組分的一個或多個神經(jīng)元細胞；(iii)電流發(fā)生器；(iv)電壓計和/或電流計；(v)至少第一刺激電極和至少第一記錄電極；其中所述發(fā)生器、電壓計和/或電流計以及電極是經(jīng)由電路彼此電連接的，其中電流從所述發(fā)生器饋送到所述至少一個刺激電極并且電流在所述記錄電極處被接收并且饋送到電壓計和/或電流計；其中所述刺激電極被定位在所述神經(jīng)元細胞的一個或多個細胞體處或附近，并且所述記錄電極被定位在遠離所述細胞體預定距離處，以使得跨越所述細胞培養(yǎng)容器建立電位。在一些實施方案中，所述固體基質由水凝膠或水凝膠基體組成。在一些實施方案中，所述固體基質由水凝膠或水凝膠基體組成并且不含玻璃、金屬或陶瓷。在一些實施方案中，所述固體基質被成型成被預定用于接種適用于軸突生長的特定尺寸的細胞的形式或模具。在一些實施方案中，所述固體基質或至少一個基底部分經(jīng)過成型而具有至少一個分支內部管狀結構，其中管的位置越遠離其中進行組織外植體或神經(jīng)元細胞的接種的位置，直徑任選地逐漸變細。舉例來說，本公開考慮了在所述固體基質的半圓柱形或圓柱形部分的一端處的中心點，所述中心點可在所述固體基質外部的點處通過外表面處的開口或洞進入。所述開口或洞可以用于將細胞(神經(jīng)元細胞和/或膠質細胞)放置或接種在上述中心點處。在使細胞在培養(yǎng)物中在幾天內生長時，細胞暴露于具有本文所公開的組分中的任一種的培養(yǎng)基，所述組分的濃度和暴露的時間段足以使得軸突從神經(jīng)元細胞生長。如果要使細胞形成髓鞘或期望髓鞘形成以進行研究，那么可以在添加神經(jīng)元細胞或外植體之前將膠質細胞通過相同的洞引入并且接種。在軸突在半圓柱形或管狀結構中生長時，軸突突起生長可以越來越遠離中心點發(fā)生。固體基質中越來越遠離中心點(或接種點)的點處的進入點或開口可以用于定位或觀測軸突狀態(tài)的軸突生長。本公開考慮了固體基質的結構采取促進軸突生長的任何形式。在一些實施方案中，容納軸突突起的內室或隔室包含半圓形或基本上圓柱形直徑。在一些實施方案中，所述固體基質在遠離中心點的點處在兩個或更多個內部隔室中分支。在一些實施方案中，這一分支可以類似于鑰匙孔形狀或樹，其中存在2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個或更多個管狀或基本上圓柱形的內室彼此處于流體連通以使得軸突生長源自于一個或多個細胞體的接種點并且沿著內室縱向延伸并且延伸到任何一個或多個分支中。在一些實施方案中，可以將一個或多個電極放置在一個或多個開口處或附近以使得可以在沿著軸突長度的一個或多個位置上獲取記錄。這還可以用于探查沿著軸突長度的一個或多個位置。如本文所用的術語“記錄”被定義為測量一個或多個神經(jīng)元細胞的響應。所述響應可以是電生理學響應，例如膜片鉗電生理學記錄或場電位記錄。本公開公開了獲得模擬臨床神經(jīng)傳導和nfd測試的體外神經(jīng)組織的微尺度器官型模型的生理學測量結果的方法和器件。通過使用這些方法和器件所獲得的結果更好地預測臨床結果，從而使得更具成本效益的方法能夠用于選擇具有更高的后期成功可能性的有前途的先導化合物。本公開包括制造和利用三維微工程系統(tǒng)，所述系統(tǒng)使得能夠生長特別密集的、高度平行的神經(jīng)纖維束。由于神經(jīng)束的局限性質，因此這一體外模型能夠測量cap和細胞內膜片鉗記錄這兩者。此外，后續(xù)的共聚焦和透射電子顯微鏡術(tem)分析允許定量結構分析，包括nfd。綜上所述，所述體外模型系統(tǒng)具有新的評估組織形態(tài)測定和群體電生理學的能力，類似于臨床組織病理學和神經(jīng)傳導測試。本公開還提供了一種用于測量使用本文所述的體外模型形成的軸突的髓鞘形成的方法。類似于人類傳入外周神經(jīng)的結構，這些體外構建體中的背根神經(jīng)節(jié)(drg)神經(jīng)元向外周伸出長的、平行的、成束的軸突。在天然組織中，不同直徑和髓鞘形成程度的軸突以不同的速度將感覺信息傳導回中樞神經(jīng)系統(tǒng)。施旺細胞通過使軸突形成髓鞘并且為更快的傳導提供隔離來支持感覺中繼。類似地，由這一體外構建體誘導的三維生長包含在密集的平行取向上跨越長達3mm的距離的各種直徑的軸突。在共聚焦和tem成像中觀測到施旺細胞的存在和包覆。盡管神經(jīng)元形態(tài)是表型成熟度的一個有用的指標，但是健康神經(jīng)元的更明確的標志是它們傳導動作電位的能力。單獨的細胞凋亡不是神經(jīng)元健康的全面量度，這是因為許多病理變化可能在細胞死亡表現(xiàn)之前出現(xiàn)。對動作電位生成的電生理學研究可以確定所觀測的結構是否支持預測的功能，并且測量臨床相關終點的能力產生更具預測性的結果。類似地，由成像收集的信息可以確定髓鞘形成程度的定量量度，同時cap測量結果表明髓磷脂的整體健康情況并且使得進一步深入了解所關注的各種試劑或化合物的毒性和神經(jīng)保護機制。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括小化合物。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括至少一種環(huán)境污染物或工業(yè)污染物。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的小化合物中的一種或組合：化學治療劑、鎮(zhèn)痛劑、心血管調節(jié)劑、膽固醇、神經(jīng)保護劑、神經(jīng)調節(jié)劑、免疫調節(jié)劑、抗炎劑、以及抗微生物藥物。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的化學治療劑中的一種或組合：放線菌素(actinomycin)、阿利維甲酸(alitretinoin)、全反式視黃酸、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、蓓薩羅丁(bexarotene)、博來霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine，dtic)、柔紅霉素(daunorubicin)、多烯紫杉醇(docetaxel)、多西菌定(doxifluridine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、埃博霉素(epothilone)、埃羅替尼(erlotinib)、依托泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、伊達比星(idarubicin)、伊馬替尼(imatinib)、伊立替康(irinotecan)、氮芥(mechlorethamine)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、亞硝基脲、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)、羅米地辛(romidepsin)、塔非布苷(tafluposide)、替莫唑胺(temozolomide)(口服達卡巴嗪)、替尼泊苷(teniposide)、硫鳥嘌呤(tioguanine)(以前稱為硫鳥嘌呤(thioguanine))、拓撲替康(topotecan)、維甲酸(tretinoin)、戊柔比星(valrubicin)、威羅菲尼(vemurafenib)、長春花堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、維莫德吉(vismodegib)、以及伏立諾他(vorinostat)。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的鎮(zhèn)痛劑中的一種或組合：撲熱息痛(paracetoamol)、非類固醇抗炎藥(nsaid)、cox-2抑制劑、阿片樣物質、氟吡汀(flupirtine)、三環(huán)抗抑郁藥、卡馬西平(carbamaxepine)、加巴噴丁(gabapentin)以及普瑞巴林(pregabalin)。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的心血管調節(jié)劑中的一種或組合：內匹司他(nepicastat)、膽固醇、煙酸、黃芩(scutellaria)、普尼拉明(prenylamine)、脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone)、莫那匹爾(monatepil)、艾氯胺酮(esketamine)、尼古地平(niguldipine)、阿塞那平(asenapine)、阿托莫西汀(atomoxetine)、氟桂利嗪(flunarizine)、米那普侖(milnacipran)、美西律(mexiletine)、安非他明(amphetamine)、硫噴妥鈉(sodiumthiopental)、類黃酮(flavonoid)、溴芐胺(bretylium)、奧沙西泮(oxazepam)、以及和厚樸酚(honokiol)。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的神經(jīng)保護劑和/或神經(jīng)調節(jié)劑中的一種或組合：色胺、甘丙肽受體2、苯丙氨酸、苯乙胺、n-甲基苯乙胺、腺苷、京都啡肽(kyptorphin)、物質p、3-甲氧酪胺、兒茶酚胺、多巴胺、gaba、鈣、乙酰膽堿、腎上腺素、去甲腎上腺素、以及血清素。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的免疫調節(jié)劑中的一種或組合：克諾立珠單抗(clenolizimab)、恩曲單抗(enoticumab)、利格珠單抗(ligelizumab)、西姆土珠單抗(simtuzumab)、瓦替利珠單抗(vatelizumab)、帕沙珠單抗(parsatuzumab)、英加妥珠單抗(imgatuzumab)、曲加立珠單抗(tregalizaumb)、帕特立珠單抗(pateclizumab)、那穆魯單抗(namulumab)、帕科珠單抗(perakizumab)、法拉莫單抗(faralimomab)、帕圖單抗(patritumab)、阿堤努單抗(atinumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、弗妥昔單抗(futuximab)以及杜利妥單抗(duligotumab)。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的抗炎劑中的一種或組合：布洛芬(ibuprofen)、阿司匹林(aspirin)、酮洛芬(ketoprofen)、舒林酸(sulindac)、萘普生(naproxen)、依托度酸(etodolac)、非諾洛芬(fenoprofen)、雙氯芬酸(diclofenac)、氟比洛芬(flurbiprofen)、酮咯酸(ketorolac)、吡羅昔康(piroxicam)、吲哚美辛(indomethacin)、甲芬那酸(mefenamicacid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、奧沙普秦(oxaprozin)、酮洛芬、法莫替丁(famotidine)、甲氯芬那酸(meclofenamate)、托美丁(tolmetin)、以及雙水楊酯(salsalate)。在一些實施方案中，所述至少一種試劑包括選自以下各項的抗微生物劑中的一種或組合：抗細菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗寄生物劑、熱、輻射、以及臭氧。本公開另外公開了一種在三維培養(yǎng)平臺中測量仿生神經(jīng)組織的細胞內記錄和細胞外記錄這兩者的方法。先前，電生理學實驗是在解離的表面接種的培養(yǎng)物或器官型切片制備物中進行的，具有每一種方法固有的限制。在解離的細胞培養(yǎng)物中進行研究通常受限于單細胞記錄，這是因為缺乏有組織的多細胞神經(jīng)突構造，如將在器官型制備物中所見到的那樣。器官型制備物具有完整的神經(jīng)回路并且允許細胞內研究和細胞外研究這兩者。然而，急性腦切片呈現(xiàn)一系列復雜的同時存在的變量而沒有控制單個因素的手段并且因此在本質上在通量可能性方面受限。體外三維培養(yǎng)物中的細胞內記錄先前已經(jīng)被證實。然而，神經(jīng)元生長在空間上不局限于支持細胞外群體研究的解剖相關結構。需要更仿生的三維神經(jīng)培養(yǎng)物以允許研究群體水平電生理學行為。本公開支持了全細胞膜片鉗技術和由呈三維幾何形狀的受限的神經(jīng)突生長產生的細胞外場記錄中的同步群體水平事件。在本公開之前，這些終點的測量直接類似于臨床神經(jīng)傳導測試，尚有待被證實以用于純細胞體外研究。使用本文所公開的方法和器件，使用場記錄來測量由所有募集的纖維中的信號傳導所引起的電位的組合細胞外變化。由電刺激所引出的群體響應是cap。電誘發(fā)的群體峰電位在性質上是分級的，包括慢纖維和快纖維中動作電位的組合效應。峰電位是單個連貫事件，具有快速的起始相和短的持續(xù)時間，這是cap或僅包含在不存在突觸輸入的情況下具有快速的信號傳導的動作電位的響應的特征。本公開所公開的三維神經(jīng)構建體還支持沿著神經(jīng)突束或通道從更遠的距離刺激的cap，這證實了神經(jīng)培養(yǎng)物能夠快速地傳送來自遠距離刺激的信號的能力，這非常像傳入外周神經(jīng)。本公開的三維神經(jīng)培養(yǎng)物支持了可用于測量傳導特性的近端和遠端刺激技術。本公開可以與誘導神經(jīng)纖維束中典型的許多纖維類型募集的一種或多種生長因子一起使用。具體來說，神經(jīng)生長因子(ngf)優(yōu)先地募集小直徑纖維，所述小直徑纖維常常與疼痛信號傳導相關，如本文所提供的數(shù)據(jù)中所證實。已經(jīng)證實的是，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)和神經(jīng)營養(yǎng)因子3(nt-3)優(yōu)先地支持更大直徑的本體感受纖維的生長。生長影響因素，如生物活性分子和藥理學試劑可以與電生理學研究結合以允許系統(tǒng)地操作用于機制研究的條件。使用本公開形成的三維神經(jīng)培養(yǎng)物可以用作平臺來研究髓磷脂損害性疾病和外周神經(jīng)病變潛在的機制，這是通過研究已知的髓鞘形成障礙藥劑、神經(jīng)病變誘發(fā)性培養(yǎng)條件、以及毒性神經(jīng)病變誘發(fā)性化合物對所述神經(jīng)培養(yǎng)物的作用來實現(xiàn)的。本公開容許使用傳導速度作為在毒性條件和治療條件下髓磷脂和神經(jīng)纖維完整性的功能量度，從而有助于對藥物安全性和功效進行研究。將遺傳突變和藥物并入到使用本文所公開的技術產生的神經(jīng)培養(yǎng)物中可以使得能夠以受控方式再現(xiàn)疾病現(xiàn)象，從而使得更好地理解神經(jīng)變性和可能的治療療法。本公開提供了涉及產生、維持、以及生理學探查被設計成模擬天然神經(jīng)組織解剖結構的微工程配置的神經(jīng)細胞的器件、方法、以及系統(tǒng)。在一些實施方案中，所述器件和系統(tǒng)包括一個或多個培養(yǎng)或分離的施旺細胞和/或一個或多個培養(yǎng)或分離的少突膠質細胞，所述細胞在細胞培養(yǎng)容器中與一個或多個神經(jīng)元細胞接觸，所述細胞培養(yǎng)容器包含固體基質，所述基質包含至少一個外表面、至少一個內表面以及至少一個內室；所述內室的形狀至少部分地由所述至少一個內表面所限定并且可從所述固體基質外部的點經(jīng)由所述外表面中的至少一個開口進入；其中所述一個或多個神經(jīng)元細胞的細胞體被定位在所述內室的一端處并且軸突能夠在所述內室內沿著所述內室的至少一個長度生長，以使得軸突尖端的位置從細胞體向遠側延伸。在一些實施方案中，所述固體基質的內表面呈圓柱體的形狀或是基本上圓柱形的，以使得來自神經(jīng)元細胞的細胞體被定位在圓柱形或基本上圓柱形內表面的一端處的開口附近，并且神經(jīng)元細胞的軸突包含從細胞體邊緣處的點沿著所述內表面的長度向遠離細胞體的點延伸的一段長度的細胞物質。在一些實施方案中，所述固體基質的內表面呈圓柱體的形狀或是基本上圓柱形的，以使得來自神經(jīng)元細胞的細胞體被定位在圓柱形或基本上圓柱形內表面的一端處的開口附近，并且神經(jīng)元細胞的軸突包含從細胞體邊緣處的點沿著所述內表面的長度向遠離細胞體的點延伸的一段長度的細胞物質。在一些實施方案中，所述固體基質的內表面呈圓柱體的形狀或是基本上圓柱形的，以使得來自神經(jīng)元細胞的細胞體被定位在圓柱形或基本上圓柱形內表面的一端處的開口附近，并且神經(jīng)元細胞的軸突包含從細胞體邊緣處的點沿著所述內表面的長度向遠離細胞體的點延伸的一段長度的細胞物質；其中如果所述細胞培養(yǎng)容器包含多個神經(jīng)元細胞，那么多個軸突從多個細胞體延伸以使得多個軸突限定能夠從細胞體沿著所述內表面的長度向遠側生長的一束軸突。在一些實施方案中，所述神經(jīng)元細胞在可穿透聚合物上和可穿透聚合物內生長。在一些實施方案中，一個或多個電極被定位在至少一個軸突的尖端處或附近，并且一個或多個電極被定位在細胞體處或附近以使得跨越一個或多個神經(jīng)元細胞的長度建立電壓電位。本公開的另一個目的在于提供一種神經(jīng)功能的中至高通量測定以用于篩查化學和生物試劑的藥理學和/或毒理學特性。在一些實施方案中，所述試劑是細胞，如本文所公開的任何類型的細胞、或抗體，如用于治療臨床疾病的抗體。在一些實施方案中，所述試劑是用于治療人類疾病的任何藥物或藥劑以使得可以在作為所提出的哺乳動物治療的新藥劑與人類疾病的現(xiàn)有治療之間比較毒性、作用或神經(jīng)調節(jié)作用。在一些實施方案中，用于治療人類疾病的新藥劑是用于神經(jīng)變性疾病的治療并且與用于神經(jīng)變性疾病的現(xiàn)有治療相比較。在作為非限制性實例的多發(fā)性硬化的情況下，可以將新藥劑(修飾的細胞、抗體、或小化合物)的作用與用于多發(fā)性硬化的現(xiàn)有治療的相同作用相比較和對比，所述現(xiàn)有治療諸如柯珮松(copaxone)、利比(rebif)、其它干擾素治療、泰斯布里(tysabri)、反丁烯二酸二甲酯、芬戈莫德(fingolimod)、特立氟胺(teriflunomide)、米托蒽醌(mitoxantrone)、潑尼松(prednisone)、替扎尼定(tizanidine)、巴氯芬(baclofen)。本公開的另一個目的在于將諸如二維和三維微工程神經(jīng)束的技術的獨特集合與神經(jīng)細胞群體的電生理刺激和記錄結合使用。本公開的另一個目的在于提供一種體外評價神經(jīng)生理機能的新型方法，所述方法使用復合動作電位(cap)作為臨床上類似的量度以獲得比由當前方法所提供的那些更靈敏和更能預測人類生理機能的結果。本公開的另一個目的在于提供微工程神經(jīng)組織，所述組織模擬天然的解剖和生理特征并且易于使用高通量電生理刺激和記錄方法來評價。本公開的另一個目的在于提供復制、操作、修改、以及評價髓磷脂損害性疾病和外周神經(jīng)病變潛在的機制的方法。本公開的另一個目的在于允許人類神經(jīng)細胞中神經(jīng)調節(jié)的中至高通量測定用于篩查化學和生物試劑的藥理學和/或毒理學活性。本公開的另一個目的在于將諸如二維和三維微工程神經(jīng)束的技術的獨特集合與人類神經(jīng)細胞群體的光學和電化學刺激和記錄結合使用。本公開的另一個目的在于定量仿生的工程丘腦皮層回路中誘發(fā)的突觸后電位。我們觀測到神經(jīng)束中逆行性生成的群體峰電位，這表明它們能夠執(zhí)行群體水平生理機能，如傳導復合動作電位和突觸后電位。本公開的另一個目的在于利用光遺傳學方法、照射的硬件和軟件控制、以及熒光成像來允許非侵入性刺激和記錄神經(jīng)回路中對誘發(fā)電位的多單位生理響應。本公開的另一個目的在于使用微工程回路來測試選擇性5-ht再攝取抑制劑(ssri)和第二代抗精神病藥以觀察它們是否改變它們的發(fā)育成熟。在一個實施方案中，利用使用數(shù)字微鏡器件(dmd)進行的投影光刻來將聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和puramatrix水凝膠的組合微圖案化，如圖1中所示。這種方法使得能夠將一種或多種水凝膠直接快速微圖案化到常規(guī)的細胞培養(yǎng)材料上。由于光掩模從不與凝膠材料接觸，因此多種水凝膠可以連續(xù)地快速固化，從而使得能夠在沒有自動化的情況下在1小時內制備許多凝膠構建體。這種方法使得能夠使用聚乙二醇(peg)(一種機械上穩(wěn)固的細胞生長限制性凝膠)將神經(jīng)突生長約束在仿生的生長促進凝膠內。在一些實施方案中，這種生長促進凝膠可以是puramatrix、瓊脂糖、或甲基丙烯酸酯化的葡聚糖。在使胚胎背根神經(jīng)節(jié)(drg)外植體在這一受約束的三維環(huán)境中生長時，軸突以高密度和束化從神經(jīng)節(jié)長出，如圖5和圖6中所示。大部分軸突表現(xiàn)為小直徑、無髓鞘的纖維，所述纖維在2周至4周內生長到接近1em的長度。具有從神經(jīng)節(jié)延伸出的密集的、高度平行的、三維的神經(jīng)纖維束的這一培養(yǎng)模型的結構大致類似于外周神經(jīng)構造。它的形態(tài)可以使用神經(jīng)形態(tài)測定來評估，從而允許進行對于傳統(tǒng)的細胞測定來說不可用的臨床類似的評估。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)模型提供了記錄由復合動作電位(cap)產生的電誘發(fā)群體場電位的能力。示例跡線顯示特征性均勻的、快速的、短潛伏期、群體峰電位響應，它們在高頻(100hz)刺激下保持一致，如在圖8b中所看到的那樣。cap可逆地由河豚毒素(ttx)消除，如圖8e和圖8f中所示，這證實藥物可以被施用并且被證實具有作用。存在與遠端神經(jīng)束刺激相關的起始相延遲時間的可測量的延長，如在圖8c和圖8d中所看到的那樣。所述響應對神經(jīng)遞質阻斷劑不敏感，這表明誘發(fā)的響應主要是cap而不是突觸電位，如圖10中所示。胚胎drg培養(yǎng)物已經(jīng)被有效地用作外周神經(jīng)生物學的模型達數(shù)十年。雖然作為模型系統(tǒng)是非常有用的，但是已知常規(guī)的drg培養(yǎng)物在用傳統(tǒng)的細胞活力測定評估時對臨床毒性的預測性不佳。雖然有可能在drg培養(yǎng)物中進行單細胞膜片鉗記錄，但是沒有記錄cap的報告，這是因為缺乏組織構造。在一個優(yōu)選的實施方案中，本公開提供了類似于臨床組織病理學和神經(jīng)傳導測試，評估組織形態(tài)測定和群體電生理學的能力。在一些實施方案中，本公開使用人類神經(jīng)細胞使神經(jīng)組織在三維環(huán)境中生長，其中神經(jīng)元細胞體被管束在一起并且位于與軸突纖維束不同的位置處，從而模擬天然的神經(jīng)構造并且允許測量形態(tài)測定和電生理學數(shù)據(jù)，包括cap。在一些實施方案中，本公開使用源自于原代人類組織的神經(jīng)元細胞和膠質細胞。在其它實施方案中，神經(jīng)元細胞和膠質細胞可以衍生自人類干細胞，包括誘導多能干細胞。在另一個實施方案中，本公開使用傳導速度作為在毒性條件和治療條件下神經(jīng)組織狀況的功能量度。有關髓鞘形成程度、髓磷脂健康情況、軸突轉運、mrna轉錄以及神經(jīng)元損傷的信息可以通過電生理學分析來確定。結合神經(jīng)密度、髓鞘形成百分比以及神經(jīng)纖維類型的形態(tài)測定分析，可以確定所關注的化合物的作用機制。在一些實施方案中，本文所公開的器件、方法、以及系統(tǒng)可以包括遺傳突變和藥物而以受控方式復制疾病現(xiàn)象，從而使得更好地理解神經(jīng)變性和可能的治療療法。下列實施例意圖是如何作出和使用本申請中所公開的實施方案的非限制性實施例。在實施例或說明書的主體中公開的任何出版物以引用的方式整體并入本文。實施例實施例1：水凝膠構建體中神經(jīng)組織的生長和生理學評估(非假想)a.材料和方法動態(tài)掩模投影光刻：經(jīng)由投影光刻形成水凝膠微圖案。具有usb計算機接口(alp3basic)的dmd開發(fā)套件(discoverytm3000，德克薩斯州達拉斯的德克薩斯儀器公司(texasinstruments,dallas,tx))通過將數(shù)字黑白圖像轉換成dmd陣列上的微鏡圖案而用作動態(tài)掩模，其中單個鏡面可以分別通過將反射角從+12°旋轉到-12°而被“打開”或“關閉”。用可調整的準直適配器(expo公司)使來自omnicure1000(加拿大魁北克的exfo公司(exfo,quebec,canada))hg蒸氣光源的在320nm-500nm處過濾的紫外(uv)光準直并且投影到dmd陣列上。反射光通過具有數(shù)值孔徑0.13的4×planfluor物鏡(紐約州梅爾維爾的尼康儀器公司(nikoninstruments,melville,ny))投影并且直接聚焦到可光致交聯(lián)的水凝膠溶液上，如圖1a所示。調整uv光源的光圈以維持如使用輻射計(expo公司)所測量的5.0瓦特/平方厘米的輻照輸出。使水凝膠溶液固化約55秒，從而經(jīng)由自由基鏈反應誘導交聯(lián)。不同于先前的報道，這種方法用單次輻照在整個本體中引發(fā)交聯(lián)，從而不需要逐層的方法。雙重水凝膠構建體的形成：如先前對于動態(tài)掩模投影光刻所述進行水凝膠聚合。通過將具有平均分子量(mw)1000da的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(peg)(賓夕法尼亞州沃靈頓的polysciences公司(polysciences,warrington,pa))在含有作為光引發(fā)劑的0.5％(w/v)irgacure2959(1-2959)(瑞士巴塞爾的汽巴特種化學品公司(cibaspecialtychemicals,basel,switzerland))的pbs或生長培養(yǎng)基中稀釋到10％(w/v)來制備可光致交聯(lián)的溶液。peg的濃度和分子量是基于先前公開的數(shù)據(jù)來選擇的以使細胞粘附減到最低限度并且使水凝膠對聚合表面的粘附性達到最大。使微圖案化的peg構建體直接交聯(lián)到以下三種類型的滲透性細胞培養(yǎng)插入物之一上：具有24mm直徑膜和0.411m孔隙的聚酯、聚碳酸酯、以及膠原包被的ptfe滲透性支持物(紐約州科寧的康寧公司(corning,corning,ny))。用(德克薩斯州休斯敦的sopusproducts公司(sopusproducts,houston,tx))處理培養(yǎng)插入物的內壁而不是膜本身以減少peg溶液的彎液面效應。將每一個支持物放置在被定位在光刻投影透鏡正下方的倒置顯微鏡的臺上。在交聯(lián)之后，沖洗支持物，從而去除過量的未交聯(lián)的peg溶液，并且微圖案化的peg保持附著于表面。如果不立即使用的話，那么在緩沖鹽水溶液(4℃)中維持peg凝膠的水化。在使用之前將自組裝肽凝膠puramatrix(馬薩諸塞州貝德福德的碧迪生物科技公司(bdbiosciences,bedford,ma))在去離子h2o中稀釋到0.15％(w/v)并且在用于神經(jīng)突生長實驗時，在預膠凝的情況下補充以1μg/ml的可溶性層粘連蛋白(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(invitrogen,carlsbad,ca))。這一第二凝膠也已經(jīng)被瓊脂糖以及透明質酸、肝素和葡聚糖的甲基丙烯酸酯化型式所替代。puramatrix的濃度和層粘連蛋白的添加這兩者是根據(jù)制造商關于神經(jīng)應用的說明書。使用移液管，將這一溶液小心地添加到微圖案化的peg水凝膠內的空隙中。與水化peg凝膠的鹽溶液接觸誘導puramatrix的自組裝，它保持局限于peg幾何形狀內。通過在37℃和5％co2下孵育來維持puramatrix的膠凝。組織收集和培養(yǎng)：遵守nih實驗室動物護理和使用指南(nih出版號85-23rev.1985)。將胚胎第15天(e-15)幼仔從定時懷孕的longevans大鼠(馬薩諸塞州威爾明頓的查爾斯河公司(charlesriver,wilmington,ma))取出并且放置在漢克氏平衡鹽溶液(hank'sbalancedsaltsolution)中。將脊柱從胚胎中分離，從所述脊柱收集背根神經(jīng)節(jié)(drg)并且將所述背根神經(jīng)節(jié)放置在補充有神經(jīng)生長因子(ngf)、10％胎牛血清(fbs)、以及青霉素/鏈霉素(p/s)(英杰公司)的神經(jīng)基礎培養(yǎng)基中以促進貼壁。在貼壁后，將drg放置在膠原包被的細胞培養(yǎng)插入物上并且在37℃和5％co2下維持在孵育箱中，其中用b-27和l-谷氨酰胺代替fbs用于生長培養(yǎng)基。經(jīng)由通過胰蛋白酶消化和研磨以解離drg來獲得原代drg神經(jīng)元，隨后使用氟脫氧尿苷和尿苷取出支持細胞(3天處理)。然后根據(jù)制造商的方案將細胞以3×105個細胞/毫升的濃度懸浮在puramatrix中。將足以獲得約480μm厚的水凝膠的體積的細胞懸浮液添加到24孔細胞培養(yǎng)插入物或24孔組織培養(yǎng)板(康寧公司)中，并且在添加生長培養(yǎng)基時引發(fā)自組裝(n＝4)。將構建體孵育約48小時，之后測試細胞活力。雙重水凝膠中的神經(jīng)突生長：將膠原包被的ptfe細胞培養(yǎng)插入物在貼壁培養(yǎng)基中浸泡過夜以將膜水化。然后將四個drg放置在插入物的表面上并且使其貼壁，持續(xù)約2小時，之后將培養(yǎng)基更換為500μl于如先前所述的不含fbs的生長培養(yǎng)基中的10％peg。可以調整這一體積以改變peg構建體的厚度。將dmd用可見光源照射以有助于投影掩模與每一個貼壁的drg對準。然后將可見光源替換成紫外光源并且peg水凝膠在組織外植體周圍交聯(lián)。將含有drg的peg構建體用pbs洗滌三次以去除任何未交聯(lián)的peg溶液。在適用時，將修飾的puramatrix添加到peg內部的空隙中，并且為了誘導puramatrix自組裝，將1.5ml生長培養(yǎng)基引入到插入物的下方。除了不添加puramatrix之外，如上文所述制備被稱為不含puramatrix的構建體，從而將drg限制于膠原包被的ptfe膜的二維環(huán)境。將構建體在孵育箱中在37℃和5％co2下維持7天，并且在第二天和第五天之后更換培養(yǎng)基。制備構建體并且針對形態(tài)、活力、神經(jīng)突生長、以及容納程度將其可視化。如果沒有神經(jīng)突被可視化為在peg空隙上或外部生長，那么認為所述樣品具有被容納的生長。這是在添加puramatrix和沒有添加puramatrix的相同peg構建體中進行的，并且針對上文所述的五個不同的peg高度嘗試了每一種條件的十二次試驗。在不完全的peg聚合或缺乏drg貼壁的情況下，試驗被否決。標本制備和可視化：用測定(英杰公司)，按照制造商的說明書評價活標本的活力。對于在puramatrix中的細胞懸浮液，在每一個水凝膠標本的三個不同區(qū)域中在整個凝膠深度上在多個焦平面處捕捉寬場熒光圖像。然后通過對鈣黃綠素am(活標記)和乙錠同二聚體-1(死標記)進行計數(shù)(從而提供每種條件總共12個樣品)針對細胞培養(yǎng)插入物和組織培養(yǎng)板這兩者中的細胞活力來分析標準偏差投影。將用免疫組織化學評價的標本在4％多聚甲醛中固定約2小時。按照制造商的說明書，將細胞核用dapi核酸染劑(分子探針公司(molecularprobes))染色。使用針對神經(jīng)元特異性βiii微管蛋白的小鼠單克隆[2g10]一抗和山羊抗小鼠lgg-h+l(cy2)二抗將神經(jīng)突染色，并且使用針對map2的兔多克隆一抗和驢抗兔iggdylight594二抗(馬薩諸塞州劍橋的艾博抗公司(abcam,cambridge,ma))進行樹突染色。將每一個步驟在含0.1％皂苷和2.0％bsa的pbs中進行過夜，繼而在含0.1％皂苷的pbs中洗滌三次。用裝備有熒光立方體的nikonazl00立體變焦顯微鏡(紐約州梅爾維爾的尼康公司)采集明視野和常規(guī)的熒光圖像，而使用zeisslsm510meta顯微鏡(德國上科亨的蔡司公司(zeiss,oberkocken,germany))采集共聚焦圖像。由共聚焦圖像計算β-iii標記的結構的平均深度以測量含有熒光的第一個焦平面與最后一個焦平面之間的距離(n＝7)。用imagej(馬里蘭州貝塞斯達的國立衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md))進行圖像處理，并且使用v3d軟件(弗吉尼亞州阿什本的霍華德休斯醫(yī)學研究所(howardhughesmedicalinstitute,ashburn,va))將共聚焦圖像棧以3d可視化。由手動閾值處理的共聚焦切片的像素計數(shù)來定量在凝膠深度上神經(jīng)突生長的比例。將共聚焦切片以總深度的10％增量合并，并且將合并的切片的測量熒光與對于每一個z-棧所測量的總數(shù)相比較以得出在整個構建體深度上神經(jīng)突生長的比例(n＝3)。使用volumej插件來創(chuàng)建神經(jīng)突生長的深度編碼的z-棧投影。使用含有puramatrix的構建體和不含puramatrix的構建體這兩者的3.0μm厚的切片(1024×1024×63)，經(jīng)由可見的神經(jīng)突生長的最大深度(186μm)采集共聚焦z-棧。使用具有光譜深度編碼lut的zcodestack功能來添加顏色，并且使用標準偏差z投影將棧合并。最后，將z-棧去斑以去除背景噪音。通過將標本冷凍在液氮漿中并且用hitachis4800場發(fā)射sem(德國克雷費爾德的日立公司(hitachi,krefeld,germany))和gatanalto2500低溫系統(tǒng)(賓夕法尼亞州沃倫代爾的gatan公司(gatan,warrendale,pa))在3kv和-130℃下成像來進行低溫掃描電子顯微鏡術(cryo-sem)。背根神經(jīng)節(jié)外植體的并入：所有動物處理和組織收集程序是在遵守由nih(nih出版號85-23rev.1985)和杜蘭大學(tulaneuniversity)的機構動物護理和使用委員會(institutionalanimalcareandusecommittee，iacuc)所制定的指南下進行的。如上文所述將神經(jīng)外植體并入雙重水凝膠構建體中。簡單地說，將6孔膠原包被的ptfe細胞培養(yǎng)插入物在貼壁培養(yǎng)基中浸泡過夜，所述培養(yǎng)基由補充有青霉素/鏈霉素、神經(jīng)生長因子(ngf)、10％胎牛血清(fbs)、以及l(fā)-谷氨酰胺(加利福尼亞州卡爾斯巴德的gibco公司-英杰公司)的神經(jīng)基礎培養(yǎng)基組成。將從long-evans大鼠胚胎第15天幼仔(馬薩諸塞州威爾明頓的查爾斯河公司)分離的四個背根神經(jīng)節(jié)(drg)放置在水化的細胞培養(yǎng)插入物上并且在貼壁培養(yǎng)基中在37℃和5％co2下孵育約2小時以貼壁。然后將貼壁培養(yǎng)基用500μl于pbs中10％的peg/0.5％的irgacure2959替換以進行構建體聚合。使用可見光和倒置顯微鏡將用于peg構建體的投影光掩模圖案在貼壁的drg周圍對準。使用uv光將相同的光掩模投影55秒，如上文所述，并且將drg有效地局限于聚合的peg構建體內。將組織培養(yǎng)物在生物安全柜外部所耗費的時間保持在最低限度以有助于防止污染，并且將未交聯(lián)的水凝膠溶液用含有1％青霉素/鏈霉素(加利福尼亞州卡爾斯巴德的gibco公司-英杰公司)的pbs沖洗3次以去除未聚合的peg溶液并且提高培養(yǎng)無菌度。將過量的pbs從peg內部的圖案化空隙中去除并且將puramatrix小心地吸移到其余空間中。立即將各自具有活drg外植體的含有雙重水凝膠構建體的插入物放置在1.5ml生長培養(yǎng)基(補充有ngf、青霉素/鏈霉素、l-谷氨酰胺、以及b27的神經(jīng)基礎培養(yǎng)基；加利福尼亞州卡爾斯巴德的gibco公司-英杰公司)中以引發(fā)puramatrix的自組裝并且維持在37℃和5％co2下，約每48小時更換一次培養(yǎng)基。在7天之后開始實驗以容許神經(jīng)突生長和神經(jīng)元成熟。免疫細胞化學：在37℃將用免疫組織化學評價的標本在4％多聚甲醛(賓夕法尼亞州哈特菲爾德的電子顯微鏡科技公司(electronmicroscopysciences,hatfield,pa))中固定約2小時。根據(jù)制造商的說明書(俄勒岡州尤金的分子探針公司(molecularprobes,eugene,or))將細胞核用dapi核酸染劑染色。將神經(jīng)突使用小鼠單克隆[2g10]神經(jīng)元特異性β-iii微管蛋白一抗(1:200)標記，繼而用cy3.5綴合的山羊抗小鼠免疫球蛋白g(h+l)二抗(1:100；馬薩諸塞州劍橋的abeam公司(abeam,cambridge,ma))熒光標記。將膠質細胞使用兔多克隆s100特異性一抗(1:500，馬薩諸塞州劍橋的abeam公司)和cy2綴合的山羊抗兔免疫球蛋白g(h+l)二抗(1:100，賓夕法尼亞州西格羅夫的杰克遜免疫研究實驗室公司(jacksonimmunoresearchlaboratories,westgrove,pa))染色?？贵w標記步驟是在含有0.1％皂苷和2％牛血清白蛋白(密蘇里州圣路易斯的西格瑪-奧德里奇公司(sigma-aldrich,st.louis,mo))的pbs中在4℃進行過夜，繼而在室溫在含有0.1％皂苷的pbs中進行三次10分鐘洗滌。對于針對髓磷脂染色的構建體，將神經(jīng)突使用小鼠單克隆[2g10]神經(jīng)元特異性β-iii微管蛋白一抗(1:200)標記，繼而使用cy2綴合的山羊抗小鼠免疫球蛋白g(h+l)二抗(1:500；馬薩諸塞州劍橋的abeam公司)熒光標記。根據(jù)制造商推薦的制備方法，使用fluoromyelintm紅色熒光髓磷脂染劑(俄勒岡州尤金的分子探針公司)將髓磷脂染色40分鐘。熒光顯微鏡術和圖像處理：使用nikonaz100立體變焦顯微鏡，使用1×和2×物鏡(紐約州梅爾維爾的尼康公司)采集明視野和常規(guī)的熒光圖像，而使用leicatcssp2激光掃描顯微鏡和20×物鏡(伊利諾伊州布法羅格羅夫的徠卡微系統(tǒng)公司(leicamicrosystems,buffalogrove,il))拍攝共聚焦圖像。經(jīng)由在各自512×512的20個切片上成像的具有55μm-65μm范圍的厚度的可見神經(jīng)突生長的最大深度采集共聚焦z-棧。使用imagej(馬薩諸塞州貝塞斯達的國立衛(wèi)生研究院)進行圖像處理。對于共聚焦z-棧中的顏色編碼深度，使用用于lmagej的macbiophotonics插件包應用具有rainbowlui的zcodestack功能。獲取z-棧的投影作為最大強度投影。v3d-viewer軟件(弗吉尼亞州阿什本的霍華德休斯醫(yī)學研究所的珍利亞農場研究園區(qū)(janeliafarmresearchcampus,howardhughesmedicalinstitute,ashburn,va))允許共聚焦z-棧圖像的三維渲染和可視化。透射電子顯微鏡術：使用透射電子顯微鏡術定性地評估神經(jīng)培養(yǎng)物的形態(tài)、空間分布、以及納米級特征。在體外7天之后，將構建體在37℃在4％多聚甲醛中固定約2小時，用pbs洗滌三次，持續(xù)10分鐘，并且切片以暴露所關注的區(qū)域。在有限光環(huán)境中進行使用1％oso4約1小時和使用2％乙酸雙氧鈾約30分鐘的后固定，在之間進行三次10分鐘pbs洗滌。將樣品用乙醇(50％、70％、95％、以及2×100％，各自約30分鐘)脫水，并且在1:1的環(huán)氧丙烷-spurr樹脂中包埋約45分鐘并且在100％spur樹脂中包埋過夜(低粘度包埋試劑盒，賓夕法尼亞州哈特菲爾德的電子顯微鏡科技公司)。在70℃經(jīng)過24小時進行標本的聚合。使用reichertultracuts超薄切片機(伊利諾伊州布法羅格羅夫的徠卡微系統(tǒng)公司)和超級45°鉆石刀(賓夕法尼亞州華盛頓堡的diatome公司(diatome,fortwashington,pa))以從80nm到100nm變動的厚度將包埋的樣品修剪和切片。將切片放置在具有200目的formvar涂有碳的銅網(wǎng)上并且用2％乙酸雙氧鈾和0.1％檸檬酸鉛(各自約20分鐘)染色。將樣品安裝在單傾轉臺上并且用feitecnaig2f30twin透射電子顯微鏡(俄勒岡州希爾斯伯勒的fei公司(fei,hillsboro,or))使用200kv的加速器電壓來檢查。使用4000×4000像素分辨率以3,000×-20,000×放大倍率拍攝圖像。用于樣品制備的所有材料和試劑均是從電子顯微鏡科技公司(賓夕法尼亞州的哈特菲爾德)獲得的。場電位記錄：在體外7天之后，將含有活drg外植體的雙重水凝膠構建體轉移到保持在室溫并且灌注有碳酸氫鹽緩沖的人工腦脊髓液(acsf)的界面室中，所述腦脊髓液由124mm的nacl、5mm的kcl、26mm的nahco3、1.23mm的nah2po4、4mm的mgso4、2mm的cacl2、以及10mm的葡萄糖制成。將acsf始終用95％o2、5％co2鼓泡以維持一致的氧合和ph值。將構建體用1％溴酚藍(密蘇里州圣路易斯的西格瑪-奧德里奇公司)染色以對比并且使用smz745立體顯微鏡(紐約州梅爾維爾的尼康公司)可視化。使用p-97flaming/brown微量移液管拉制器(加利福尼亞州諾瓦托的薩特儀器公司(sutterinstrumentco.,novato,ca))將薄壁硼硅酸鹽玻璃移液管(od＝1.5，id＝1.6；康涅狄格州哈姆登的華納儀器公司(warnerinstruments,hamden,ct))拉制到約3mq至約7mq的電阻并且用acsf回填。如圖8a中所示，將記錄電極在每一個神經(jīng)節(jié)附近放置在細胞體附近，并且在沿著神經(jīng)突束遠離神經(jīng)節(jié)不同距離處用同心雙極電極(cbarb75，緬因州鮑登的fhc公司(cbarb75,fhc,bowdoin,me))刺激構建體。將axopatch-1c放大器(加利福尼亞州桑尼維爾的分子器件公司(moleculardevices,sunnyvale,ca))聯(lián)合孤立脈沖刺激器(型號2100；華盛頓州塞基姆的a-m系統(tǒng)公司(a-msystems,sequim,wa))、powerlab26t數(shù)字化儀(科羅拉多州科羅拉多斯普林斯的ad儀器公司(adinstruments,coloradosprings,co))、以及l(fā)abchart軟件(科羅拉多州科羅拉多斯普林斯的ad儀器公司)用于記錄、刺激以及數(shù)據(jù)采集。將記錄以5khz過濾，顯示于tektronix示波器上，并且使用igorpro(俄勒岡州波特蘭的wavemetrics公司(wavemetrics,portland,or))中的定制書寫例程進行離線分析。在適當時計算標準偏差。使用雙尾配對t檢驗計算統(tǒng)計值，其中p值<0.05被認為具有顯著性。所有值以作為平均值的標準誤差(sem)的誤差報告。使用20μm的dnqx(6,7-二硝基喹喔啉-2,3-二酮)和50μm的apv((2r)-氨基-5-膦?；焖狨?鑒定和阻斷突觸活動。使用0.5μm河豚毒素(ttx)作為na+通道活性的完全阻斷。用于實驗溶液中的所有藥物和鹽分別是從托克斯公司(tocris)(明尼蘇達州的明尼阿波利斯(minneapolis,mn))和西格瑪-奧德里奇公司(密蘇里州的圣路易斯)獲得的。全細胞膜片鉗記錄：在體外7天之后，將構建體在室溫轉移到浸沒型記錄室中并且使其平衡20分鐘。將碳酸氫鹽緩沖的acsf溶液(含有124mm的nacl、5mm的kcl、26mm的nahco3、1.23mm的nah2po4、1.5mm的mgcl2、2mm的cacl2、以及10mm的葡萄糖)始終用95％o2、5％co2鼓泡以維持一致的氧合和ph值。對于電壓鉗記錄，將硼硅酸鹽玻璃移液管填充以銫取代的細胞內溶液，該溶液含有120mm的csmeso3、1mm的nacl、0.1mm的cacl2、2mm的atp、0.3mm的gtp、10mm的hepes、以及10mm的egta。對于電流鉗記錄，將移液管填充以葡萄糖酸鉀基內部溶液，該溶液含有120mm的葡萄糖酸鉀、10mm的kcl、10mm的hepes、10mm的d-山梨糖醇、1mm的mgcl2×6h2o、1mm的nacl、1mm的cacl2、10mm的egta、2mm的atp。移液管電阻在約4mq至約7mq的范圍。串聯(lián)進入電阻在約7mq至約15mq的范圍，并且監(jiān)測其一致性。對于誘發(fā)動作電位記錄，將同心雙極刺激電極(cbarc75，緬因州鮑登的fhc公司)放置在drg的傳入纖維中，并且在獲得全細胞膜片之后，使用必要的最小刺激，通常<0.01ma來誘發(fā)動作電位。記錄電極和刺激電極的放置示于以下圖10a中。用bx61wiolympus立式顯微鏡(賓夕法尼亞州中心谷的奧林帕斯公司(olympus,centervalley,pa))通過活微分干涉相襯(dic)成像將drg可視化。用pc-505b膜片鉗放大器(康涅狄格州哈恩登的華納儀器公司(warnerinstruments,harnden,ct))進行全細胞記錄。將信號用powerlab26t數(shù)字化儀數(shù)字化并且用labchart采集軟件(科羅拉多州科羅拉多斯普林斯的ad儀器公司)收集。將信號放大，以20khz采樣，濾波到2khz，并且使用igorpro(俄勒岡州波特蘭的wavemetrics公司)中的定制書寫例程進行分析。大鼠神經(jīng)節(jié)外植體和電生理學評估：在用上文所述的動態(tài)掩模投影光刻方法微圖案化的雙重水凝膠構建體中培養(yǎng)大鼠e-15背根神經(jīng)節(jié)外植體。將神經(jīng)構建體孵育1周或2周，并且神經(jīng)突生長局限于填充有puramatrix的狹窄管道，其被測量為具有約200μm的直徑、約400μm的厚度、以及高達約2mm的長度。將構建體放置在灌注有碳酸氫鹽緩沖的acsf溶液的界面室上，并且用細胞外場電位電極評估電生理學。將記錄電極在每一個神經(jīng)節(jié)附近放置在細胞體附近，并且在沿著神經(jīng)突束遠離神經(jīng)節(jié)不同距離處用雙極電極刺激構建體。b.結果雙重水凝膠中的神經(jīng)突生長：通過將drg外植體在具有遞增厚度的構建體中培養(yǎng)來研究約束神經(jīng)突生長所需的peg厚度。在此測量容納程度，這是因為它對于這一系統(tǒng)能夠可靠地用作體外模型的能力是至關重要的。使用233μm厚的peg經(jīng)常出現(xiàn)部分聚合，從而產生不可用的構建體。此外，在整個聚合過程中，一些drg從膜的表面脫離，從而導致低于預期的用于分析的試驗數(shù)。對于含有puramatrix的構建體，觀察到神經(jīng)突的容納程度隨著凝膠厚度增加而有不同的增加，如表1中所示。在233μm的厚度，沒有構建體限制神經(jīng)突的生長。368μm、433μm、481μm、以及543μm的后續(xù)高度的容納率是：10％、22.2％、63.6％、以及87.5％?？傮w上，在缺乏puramatrix的構建體中觀察到更高的容納百分比。在這兩組中神經(jīng)突似乎能夠在某些厚度的傾斜peg壁上生長，但是在不含puramatrix的構建體中，除了534μm以外，在類似的高度存在更有效的容納，并且與在含有puramatrix的peg中相比，更低的高度有更有效的容納，如表1中所列。表1：隨水凝膠厚度而變化的神經(jīng)突生長容納程度為了平衡空隙尺寸分辨率和圖案保真度與神經(jīng)突容納程度，在具有481μm的平均peg厚度的構建體(500μl溶液)中進行后續(xù)的神經(jīng)突生長實驗。在5天之后監(jiān)測構建體的細胞活力證實有大量的活細胞，有非常小部分的死細胞位于drg自身中，如圖3a所示。在7天時固定和染色之后，神經(jīng)突和遷移細胞受peg水凝膠的幾何形狀約束，如通過用β-iii微管蛋白和dapi進行雙重標記所表明，見于圖(b)中。神經(jīng)突生長始終是穩(wěn)健的，并且所有標記的結構都集中在雙重水凝膠的puramatrix部分內部，如圖1a-1e和圖5a-5d所示。此外，map2抗體標記表明構建體中神經(jīng)突生長的大部分似乎是樹突狀的，如在圖3e中所看到的那樣。生長似乎首先沿著兩種凝膠之間的邊界發(fā)生，如圖3a中所示。然而，在沿著通道延伸的神經(jīng)突之后，觀察到生長充滿peg之間的內部空間中，也如圖3a中所示。在puramatrix的三維本體中前端神經(jīng)突生長的圖像顯示了沿隨機方向生長的傾向，如圖3d所示。與之形成鮮明對照的是，沿著細胞培養(yǎng)插入物的表面生長的神經(jīng)突自身傾斜地取向，顯然緊密地跟隨插入物膜的纖維，如圖3f中所示。觀測到生長在分叉點處散開而沒有明顯的在方向上的偏好。觀測到大量的分支和束化，這在生長的前沿處是特別明顯的，如在圖3d中所看到的那樣。在約7天內，在整個通道的長度上觀察到生長。與在沒有puramatrix的構建體中所看到的明顯無效的有限生長相比，在填充有puramatrix的構建體中觀測到顯著更多的生長，如圖4b和4c所示。共聚焦成像確認了神經(jīng)突生長在三個維度中發(fā)生，如圖7a-7d中所示。在含有puramatrix的構建體中β-iii標記的結構的平均厚度是159.8μm±23.9μm的厚度，而在不含puramatrix的構建體中的平均厚度是85.4μm±38.6μm，該差異被發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計顯著性并且由圖11a所示，p<0.005。圖4d顯示了缺乏puramatrix的構建體中生長的實例，其中生長似乎是擁擠的并且神經(jīng)突生長到54.0μm的最大高度。在沒有puramatrix的構建體中神經(jīng)突的生長被可視化為沿著膠原包被的ptfe的膜生長，而沒有生長發(fā)生在peg本身中?；蛘撸瑘D4e顯示了在雙重水凝膠構建體中神經(jīng)突的生長，其中觀測到顯著更少的神經(jīng)突擁擠，并且單個神經(jīng)突在多個焦平面中通過puramatrix生長，從而達到120.0μm的最大高度。圖11b還顯示神經(jīng)突生長沒有被局限于puramatrix的膜或頂部表面，這是因為在切片的底部和頂部10％中分別僅觀察到總生長的7.3％±2.9％和4.9％±1.3％。不同于神經(jīng)突，dapi染色表明遷移細胞沒有受到影響而遷移到puramatrix中，從而保持局限于支持表面附近，如圖4a所示，盡管先前的研究表明膠質細胞遷移和神經(jīng)突生長常常在一起發(fā)生。三維神經(jīng)培養(yǎng)物的空間和形態(tài)特征：本公開公開了一種體外三維神經(jīng)培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物近似于天然傳入外周神經(jīng)組織的細胞尺度和宏觀尺度構造。所述三維神經(jīng)構建體由在細胞培養(yǎng)插入物的表面上培養(yǎng)的drg組織外植體組成，所述外植體由容許在填充有puramatrix的圖案化空隙內生長的peg構建體所容納。引導神經(jīng)突沿著x軸從神經(jīng)節(jié)生長的狹窄管道被測量為具有約490μm的直徑、高達約400μm的厚度、以及約3mm的長度。在體外7天之后含有drg神經(jīng)元、神經(jīng)膠質、以及神經(jīng)突生長的三維雙重水凝膠構建體示于圖12a-12d中。神經(jīng)突和支持膠質細胞有效地由peg水凝膠的幾何形狀所約束。用抗β-iii微管蛋白、抗s100、以及dapi進行的同時標記確認了在體外7天之后的生長始終是穩(wěn)健的并且所有標記的結構均處于構建體的puramatrix部分內，如圖5a和5b中所示。包括膠質細胞在內的支持細胞的存在和遷移跨越通道長度的高達四分之三，如從直通道的起點所測量，距離神經(jīng)節(jié)接近1.875mm，如圖5c和5d中所示。在整個puramatrix深度上前端神經(jīng)突生長隨機地發(fā)生在通道內，在多個焦平面處存在大量的分支和束化，如圖6a-6c中所示。相反，缺乏puramatrix的通道中的生長似乎是有限的并且沿著膜表面處插入物的纖維排列。圖像中的抗體標記表明沿著通道邊緣的更密集的神經(jīng)突生長，如圖12d所示。與表明髓磷脂在體外14天之后開始形成的文獻相一致，在體外7天時在用fluoromyelintm紅色熒光髓磷脂染劑(俄勒岡州尤金的分子探針公司)染色之后，三維神經(jīng)培養(yǎng)物沒有顯示髓磷脂的存在，如圖12e和f所示。共聚焦成像確認了β-iii微管蛋白陽性神經(jīng)突在通道的起點、中間、以及末端處在三個維度上存在，如先前所證實的那樣。dapi染色的核和s100陽性膠質細胞在整個z-棧中存在，如圖6a-6c所示。使用在包埋生物樣品上進行透射電子顯微鏡術(tem)的樣品制備方案的技術，對神經(jīng)構建體嘗試了后固定程序的幾次重復，之后獲得具有可辨別的結構的tem圖像。對染色方案的另外的改動可以提供具有更高分辨率的結構以用于更清晰的可視化。來自tem的橫截面圖像支持了由熒光顯微鏡術所顯示的證據(jù)。在神經(jīng)節(jié)內和神經(jīng)束中所采集的切片顯示高密度的平行的、高度束化的無髓鞘的神經(jīng)突，如在圖7a和7b中所看到的那樣；施旺細胞的存在，如在圖7d中所看到的那樣；以及施旺細胞開始封裝神經(jīng)突，如在圖7c中所看到的那樣。三維構建體中神經(jīng)元的電生理學特性：為了測試三維神經(jīng)培養(yǎng)物的功能特性并且確定它是否用作傳入外周神經(jīng)組織的生理活性和相關模型，在體外7天之后進行細胞內和細胞外電生理學實驗。使用改編自急性嚙齒類動物腦切片中的傳統(tǒng)場電位記錄的技術，在允許使用定制的裝備以進行細胞外記錄的界面室上研究這些構建體。對于每一個實驗，將記錄電極放置在構建體的神經(jīng)節(jié)或細胞體區(qū)域中并且將刺激電極在通道中沿著神經(jīng)突束插入，如圖8a中所示。在刺激后，復合動作電位(cap)以逆行方式傳播到細胞體區(qū)域中并且被記錄為每一個構建體的神經(jīng)節(jié)中的所得細胞外電位變化(n＝19)。所述三維神經(jīng)構建體支持了持續(xù)超過一小時的場記錄并且在刺激時始終顯示一致的群體峰電位。群體響應或cap的示例跡線示于圖8b中。類似于從完整神經(jīng)記錄的復合動作電位，響應一致地表現(xiàn)出到起始相短的潛伏期，繼而是具有分級性質的單個連貫事件，代表了募集的軸突和相應細胞上每一個動作電位的總和效應。所述響應的一致的短包絡和起始相延遲時間也是cap的特征并且表明了單純由動作電位驅動的快速事件。如同神經(jīng)刺激一樣，在更高的刺激強度下更多的纖維被募集，從而產生更強的響應直到最大激發(fā)發(fā)生為止。在記錄電極與刺激電極之間的距離增大時，響應的起始相延遲時間也延長，如圖8c和8d中所示，這確認了幾何限制的神經(jīng)培養(yǎng)物能夠沿著它的神經(jīng)樣神經(jīng)束以不同距離傳導信號的能力。平均來說，在近端或在如從直通道的起點所測量的距離神經(jīng)節(jié)區(qū)域1.5mm內刺激時，響應顯示0.82ms的起始相延遲時間。然而，當將刺激電極移動到距離神經(jīng)節(jié)2.25mm時，遠端刺激產生具有2.88ms的平均值的起始相延遲時間，與在近端刺激中所觀測到的那些相比，這具有統(tǒng)計顯著性，p<0.05[p＝0.02，圖8d]。如在熒光顯微鏡術中所看到以及圖6a-6c和圖12a和12b中所示的那樣，體外生長7天沒有使得神經(jīng)突完全充滿通道；在遠端刺激中表現(xiàn)出振幅有29.46％的降低。此外，通過抑制na+通道活性，在刺激時不能再產生動作電位。在引入0.5μmttx的2分鐘內，來自構建體的響應可以被完全消除，這確認了響應的來源和生物性質。在ttx洗入之前的響應和之后的響應具有統(tǒng)計顯著性，p＝0.029，n＝3，如圖8e和f中所示。為了研究所述響應是否是突觸性質，分別以20μm和50μm引入谷氨酸受體抑制劑dnqx和apv以阻斷興奮性突觸傳遞。實驗持續(xù)了35分鐘，每一分鐘獲取記錄一次，并且時間點被稱為t1-t35以供簡單參考。藥物洗入在進入實驗5分鐘時(t6)進行，并且在20分鐘后或在進入實驗25分鐘時(在t26時)洗脫。將在藥物洗入之前(t1-t5)的響應與在進入藥物洗入階段10分鐘(t16-t20)記錄的響應相比較，從而允許藥物有充足的時間灌注和起作用。在藥物洗入之前和之后在響應振幅或持續(xù)時間方面沒有觀測到統(tǒng)計顯著性差異，如圖9a-9c中所示，這表明沒有響應的突觸組分被阻斷。還誘導了高頻脈沖序列以評估響應的特征。當將20個脈沖以50hz施加到培養(yǎng)物時，群體峰電位維持一致的起始相延遲時間、包絡、以及振幅，這表明能夠反復發(fā)放而沒有由突觸輸入所引起的壓抑或促進的強響應。在高頻刺激之前和之后響應振幅和半峰持續(xù)時間沒有統(tǒng)計顯著性，如圖9d-9f所示。還使用細胞內記錄，從而使得全細胞膜片鉗能夠進入三維神經(jīng)構建體內部，持續(xù)超過1小時。來自急性嚙齒類動物腦切片中的全細胞膜片鉗位的修改的技術允許電壓鉗和電流鉗記錄。puramatrix凝膠比天然腦組織更具粘性并且密集的drg外植體含有結締組織。如同場記錄一樣，這些特征使得電極的移動、更換、以及持續(xù)使用變得困難。與腦切片神經(jīng)纖維網(wǎng)中通常由具有不同衍射指數(shù)的特征包圍的更稀疏分布的細胞相比，drg內的細胞是分布密集的，具有更小的對比度，并且更難以可視化。經(jīng)由在多個焦平面中的反復可視化、通過凝膠時的正壓、以及傾斜的電極接近角，成功的全細胞膜片鉗記錄是可能的，如圖10a-10f中所示。將雙極刺激電極放置在通道內的神經(jīng)突束中并且在構建體的細胞體區(qū)域中從細胞獲取記錄，如圖10a和10b中所示。細胞支持從通道中的神經(jīng)突延伸結構驅動的電誘發(fā)動作電位，如圖10c所示。作為缺乏突觸輸入的響應的特征，細胞內響應具有快速的上升時間，平均為2ms的基線到峰時間，具有明顯的非分級的起始相，如圖10d中所示。在響應的起始相之前沒有導致閾值的電位上升，如在圖10d中所看到的那樣，在響應之后也不存在任何更小的分級事件，如在圖10c中所看到的那樣，從而沒有獲得突觸輸入的證據(jù)。此外，如果突觸活動促成響應的起始相，那么引發(fā)動作電位的閾值將更難以在超極化下達到。然而，在從靜息膜電位(rmp)超極化到-100mv(平均來說是rmp的1/1.95)時細胞仍能夠支持動作電位，并且顯示的響應與在rmp時沒有不同。此外，在電壓鉗或電流鉗下的基線記錄中沒有觀測到由突觸激活所引起的自發(fā)活動，如圖10e和10f中所示。實施例2：在水凝膠構建體中在施旺細胞存在下神經(jīng)組織的生長以及髓鞘形成和脫髓鞘的評估(非假想)外周神經(jīng)系統(tǒng)(pns)中成功的軸突再生取決于適當?shù)厥股窠?jīng)元生長靶向所選擇的位置以及形成用于信號傳播的功能性突觸。pns原生的施旺細胞(sc)在這一過程中起主要作用。sc將發(fā)育中的軸突包裹在髓磷脂中并且產生細胞外基質(ecm)組分、細胞粘附分子、以及神經(jīng)營養(yǎng)因子。這些事件依賴于來自局部微環(huán)境的復雜的信號網(wǎng)絡，包括sc到神經(jīng)元、sc到sc、以及sc到ecm的通信。含有sc/神經(jīng)元共培養(yǎng)物的實驗提供了對這些過程的深入了解，從而產生了用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新臨床方法。先前已經(jīng)將原代神經(jīng)元和sc共培養(yǎng)在二維系統(tǒng)和三維系統(tǒng)中以研究涉及sc/神經(jīng)元結合的機制。已經(jīng)證實的是，sc在將發(fā)育中的軸突朝向它們所期望的目標定向方面起重要的作用，從而在這些模型中產生功能性重新神經(jīng)支配，不論維數(shù)如何。然而，涉及sc/神經(jīng)元結合的許多特性，如形態(tài)和基因表達受到系統(tǒng)構造的顯著影響。三維系統(tǒng)提供了神經(jīng)元微環(huán)境的結構和功能的更準確的表示以及對細胞-細胞和細胞-ecm機制的更好的了解。已經(jīng)證實的是，與三維模型相比，靜息電位、動作電位傳播以及電壓門控通道的功能在二維模型中是顯著不同的。盡管利用三維仿生神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的重要性已經(jīng)被證實，但是很少有研究探究了在共培養(yǎng)物中的sc/神經(jīng)元相互作用以及它們對髓磷脂形成的影響。在此，使用與簡單顯微鏡物鏡相結合的數(shù)字微鏡器件(dmd)，利用上文所述的簡易和快速的技術以將所期望的三維水凝膠光圖案化。dmd能夠進行結構和分子三維微圖案化。這一體外模型提供了模擬ecm的支持和三維構造的環(huán)境，具有能夠將固定的或可溶性的化學生物分子、機械線索、以及藥物獨立地引入以評價每一種對神經(jīng)元行為的作用的能力。這一系統(tǒng)提供了平臺以在一個標本中三維共培養(yǎng)不同的細胞類型以在更仿生的環(huán)境中對它們進行研究。使用這種方法將官能化的葡聚糖光微圖案化并且將drg和sc在更接近它們的天然環(huán)境的條件下封裝在三維共培養(yǎng)系統(tǒng)中并且研究引起髓磷脂形成的因素。a.材料和方法雙重水凝膠系統(tǒng)的制造：使用數(shù)字投影光刻制造雙重水凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)，如上文所述。所述工藝的示意圖見于圖13中。簡單地說，利用光刻裝置照射具有0.4μm孔徑的滲透性細胞培養(yǎng)插入物中所容納的可光致固化的水凝膠溶液，所述光刻裝置包括準直uv光源(具有320nm-500nm濾光器的omnicure1000，加拿大魁北克的exfo公司)和可見光源(具有375nm-650nm濾光器的sola光引擎，美國俄勒岡州的lumencor公司(lumencor,or,usa))、作為動態(tài)光掩模的數(shù)字微鏡器件(dmd)(discoverytm3000，德克薩斯州達拉斯的德克薩斯儀器公司)以及2×planfluor物鏡(日本東京的尼康儀器公司)。所述插入物是膠原包被的ptfe滲透性支持物或transwelltm透明聚酯膜插入物(美國紐約州科寧的康寧公司)以研究膠原化的基質對sc/神經(jīng)元結合的影響。雙重水凝膠系統(tǒng)由兩個隔室組成：容納神經(jīng)元的細胞容許性部分和用作水凝膠模具的細胞限制性部分。為了制備細胞限制性部分，將10％(w/v)peg-二丙烯酸酯(mn1000；賓夕法尼亞州沃靈頓的polysciences公司)和0.5％(w/v)irgacure2959于pbs中的溶液用如通過輻射計(306uv功率計，加利福尼亞州圣荷西的opticalassociates公司(opticalassociates,sanjose,ca))所測量的85mw/cm2的uv光照射38秒以產生peg微型模具，如圖13中所示。在添加凝膠溶液之前將細胞培養(yǎng)插入物用經(jīng)過過濾的原始玻璃處理(originalglasstreatment)(德克薩斯州休斯敦的rainx公司(rainx,houston,tx))處理以避免彎液面行為。將0.5ml的溶液添加到每一個6孔板插入物中。添加0.5ml的溶液產生480μm的凝膠厚度。將水凝膠構建體在含有1％抗生素-抗霉菌添加劑的dpbs中洗滌以抑制污染。葡聚糖合成和凝膠組合物的表征：基于公開的方案將葡聚糖(mw＝70kda)由甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)接枝。最初，稱取1g葡聚糖并且在氮氣下添加到9ml二甲亞砜(dmso)中。將0.2g的4-二甲基氨基吡啶(dmap)溶解在1mldmso中。隨后，在氮氣下將dmap溶液逐滴添加到葡聚糖溶液中，繼而添加232μl的gma。將最終溶液在室溫攪拌48小時。為了在48小時之后淬滅反應，將280μl的37％鹽酸(hcl)添加到溶液中，并且將所得產物相對于去離子水透析約三天并且凍干約兩天。所得產物是甲基丙烯酸縮水甘油酯-葡聚糖(medex)，并且使用1hnmr確認甲基丙烯酸酯基向葡聚糖中的添加[(d2o)δ6.1-5.7(m,2h,ch2),δ5.2(m,1h,ch),δ4.9(m,1h,ch),δ1.9(s,3h,ch3)]，其中取代度是42％。制備50％(w/v)的medex、medex的0.1％(w/w)的arg、medex的0.001％(w/w)的rf、最終溶液的0.2％(v/v)的temed的凝膠組合物。雙重水凝膠系統(tǒng)中的原代組織培養(yǎng)：作為共培養(yǎng)的第一個步驟，進行原代組織培養(yǎng)。在組織培養(yǎng)之前制備peg構建體并且將其浸泡在貼壁培養(yǎng)基中并且孵育(37℃、5％co2)過夜。貼壁培養(yǎng)基包含補充有b27(2％v/v)、l-谷氨酰胺(0.25％v/v)、神經(jīng)生長因子(ngf)(0.02μg/ml)、胎牛血清(fbs)(10％v/v)以及青霉素/鏈霉素(1％v/v)的神經(jīng)基礎培養(yǎng)基(所有均來自加利福尼亞州的生命科技公司(lifetechnologies,ca))。然后遵照機構動物護理和使用委員會的指南，將構建體與longevans大鼠胚胎背根神經(jīng)節(jié)(drg)組織一起培養(yǎng)。從胚胎第15天大鼠胚胎中分離drg并且在培養(yǎng)之前進行修剪。將單個drg外植體放置在每一個構建體中。然后將drg在新鮮的貼壁培養(yǎng)基中孵育過夜以使組織貼壁到插入物。施旺細胞培養(yǎng)：購買從新生大鼠坐骨神經(jīng)中分離的sc細胞系(加利福尼亞州的sciencell研究實驗室公司(sciencellresearchlaboratories,ca))。將具有>5×105個細胞/毫升的冷凍保存的小瓶在37℃水浴中解凍。然后將小瓶的內容物輕輕地重懸并且分配到平衡的聚l-賴氨酸包被的培養(yǎng)容器中以促進細胞附著，接種密度是2:10,000個細胞/平方厘米。之后使培養(yǎng)物不受干擾至少16小時。為了去除殘余的dmso和未附著的細胞，最初在24小時之后更換培養(yǎng)基并且之后每隔一天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由含有fbs(5％v/v)、青霉素/鏈霉素(1％v/v)以及sc培養(yǎng)基補充劑(1％v/v)的sc培養(yǎng)基(所有均來自加利福尼亞州的sciencell研究實驗室公司)構成。每當培養(yǎng)物達到90％匯合度時，將它進行傳代，并且在第三次傳代之后不被使用。在雙重水凝膠系統(tǒng)中sc的封裝和結合：將sc分散于如上文所述的sc培養(yǎng)基中的50％medex溶液中以達到20×106個細胞/毫升的細胞計數(shù)。為了實現(xiàn)均勻分布的單細胞溶液，將凝膠混合物上下劇烈吹吸。輕輕地將貼壁培養(yǎng)基從通道中吸出以避免干擾貼壁的drg并且將2μl的medex單細胞溶液添加到每一個peg微型模具中。將負像光掩模裝載到dmd上，并且在使用可見光源(具有375nm-650nm濾光器的sola光引擎，美國俄勒岡州的lumencor公司)照射30秒之后，用如通過輻射計(306uv功率計，加利福尼亞州圣荷西的opticalassociates公司)所測量的85mw/cm2的可見光使通道中的凝膠溶液交聯(lián)。使用上文所述的洗滌緩沖液將構建體輕輕地洗滌三次。用于在三維水凝膠系統(tǒng)中進行drg/sc共培養(yǎng)的培養(yǎng)基方案：為了了解在三維共培養(yǎng)物中各種培養(yǎng)基方案對drg和sc的行為的影響，應用兩種不同的培養(yǎng)系統(tǒng)。所述培養(yǎng)系統(tǒng)描述于表2中。培養(yǎng)系統(tǒng)1具有兩個階段，其中將培養(yǎng)基1(10天)和培養(yǎng)基2(15天)按照這個順序施用。這一培養(yǎng)基方案先前已經(jīng)被用于促進生長和神經(jīng)突延伸以及促進drg本體的內源性sc并入髓鞘形成過程中。培養(yǎng)系統(tǒng)2僅施用培養(yǎng)基2，所述培養(yǎng)基2專門用于誘導髓磷脂。對于每一個實驗組中的每一個標本，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。表2：培養(yǎng)基系統(tǒng)免疫組織化學：為了評價神經(jīng)突生長和髓磷脂形成，利用免疫組織化學技術。最初，將組織在37℃用4％多聚甲醛(pfa)固定2小時，繼而在進行每一個染色程序之前進行三個洗滌步驟。除非另外說明，否則所有試劑均是由馬薩諸塞州劍橋的艾博抗公司提供的。將神經(jīng)突用小鼠單克隆[2g10]神經(jīng)元特異性β-iii微管蛋白一抗和cy3.5綴合的山羊抗小鼠免疫球蛋白g(h+l)二抗(馬薩諸塞州劍橋的艾博抗公司)標記。標記步驟是在4℃在于pbs中2％的牛血清白蛋白(bsa)和0.1％的皂苷中過夜完成的，并且在每一個步驟之后用pbs進行三個洗滌步驟。為了評估髓磷脂形成，將構建體針對三種髓磷脂蛋白質進行標記：髓磷脂堿性蛋白(mbp)、蛋白零(proteinzero，po)以及髓磷脂相關糖蛋白(mag)。利用一抗雞多克隆抗髓磷脂堿性蛋白、小鼠單克隆抗髓磷脂相關糖蛋白以及兔多克隆抗髓磷脂蛋白零抗體。將染劑在2％bsa/pbs溶液中以1:500的濃度稀釋。將構建體在室溫在5％山羊血清中浸泡30分鐘以避免任何非特異性蛋白結合。將構建體在4℃在一抗溶液中儲存過夜并且用pbs洗滌三次。在三次洗滌循環(huán)之后，將水凝膠系統(tǒng)在二抗溶液中在4℃孵育。如下制備二抗溶液：1:500抗體于2％bsa溶液中的溶液，分別是山羊抗雞igyh+l、山羊抗小鼠iggh+l以及山羊抗兔iggh+l。圖像處理、神經(jīng)突生長、以及髓磷脂形成：利用共聚焦顯微鏡(日本東京的尼康ai公司)測量三維水凝膠中生長的體積。由于在模型中纏結和密集的神經(jīng)突生長，因此在單個神經(jīng)元沿著長度延伸時，難以對單個神經(jīng)元的數(shù)目進行計數(shù)。因此，為了測量在三個維度中系統(tǒng)的生長，最佳的是獲取雙重水凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞物質的體積。將每一個樣品在三個維度中成像，其中光學切片不大于11μm的深度，每個樣品有平均20個切片，分辨率是1024×1024像素并且使用10×物鏡。均勻地跨越所有圖像應用包括閾值處理和轉換成二進制表示的預處理步驟。使用imagej和matlab(馬薩諸塞州納蒂克的mathworks公司(mathworks,natick,ma))中的定制算法進行數(shù)據(jù)分析。使用在整個凝膠深度上閾值切片的像素計數(shù)來定量神經(jīng)突生長。在25天之后，髓磷脂是密集的和纏結的，并且利用相同的圖像處理程序來評價在整個深度上髓磷脂的體積。這一過程允許在考慮培養(yǎng)物的三維性質的情況下測量在整個深度上的體積。由于構建體的尺寸太大而無法一次性成像，因此對于上述兩個成像過程，采用大圖像z-棧(1×5)。對于論證照片，將樣品在三個維度中成像，其中光學切片在深度上不大于11μm，每個樣品有平均20個切片，分辨率是1024×1024像素，并且使用20×物鏡。使用最大投影采集來形成總生長的二維圖像。對于生長的體積，利用相同的程序并且使用三維體積采集來確認生長和髓鞘形成發(fā)生在整個深度上。透射電子顯微鏡術：利用tem來研究水凝膠培養(yǎng)物中神經(jīng)元突起、sc的納米級結構以及它們的空間串擾、分布、以及形態(tài)。除非另有說明，否則用于這一程序的所有試劑均是由賓夕法尼亞州哈特菲爾德的電子顯微鏡科技公司提供的。將水凝膠構建體在37℃在4％pfa溶液中浸泡約兩小時之后固定。然后將樣品用pbs以15分鐘的時間間隔洗滌三次。后固定步驟包括用于100mm磷酸乙酯中的1％四氧化鋨(oso4)染色約2小時，繼而用pbs進行四個洗滌步驟。然后在室溫在暗處將組織用2％乙酸雙氧鈾水溶液染色約30分鐘。在所述程序之后進行脫水步驟，包括將樣品在50％和70％乙醇中浸漬，各自持續(xù)10分鐘，然后在95％乙醇中浸漬過夜。然后將樣品在用分子篩(密蘇里州圣路易斯的西格瑪-奧德里奇公司)過濾的100％乙醇中浸泡兩個30分鐘的時間間隔。切割構建體以僅維持所關注的區(qū)域，繼而進行樹脂包埋。使用1:1環(huán)氧丙烷-spurr樹脂進行浸片步驟，持續(xù)45分鐘。然后將樣品在70℃在100％spur樹脂中包埋約48小時以允許樹脂聚合完成。使用reichertultracuts超薄切片機(伊利諾伊州布法羅格羅夫的徠卡微系統(tǒng)公司)和超級45°鉆石刀(賓夕法尼亞州華盛頓堡的diatome公司)以從80nm到100nm變動的厚度將包埋的樣品修剪和切片。將切片裝載在銅網(wǎng)(formvar涂有碳，200目)上，并且使所述載網(wǎng)在2％乙酸雙氧鈾的液滴上漂浮約20分鐘并且通過以1分鐘的時間間隔在去離子水液滴上漂浮三次來沖洗。在將所述載網(wǎng)安裝在單傾轉臺上之后，使用feitecnaig2f30twin透射電子顯微鏡(俄勒岡州希爾斯伯勒的fei公司)以100kv-200kv的加速器電壓將它們成像。在3,000×-20,000×放大倍率下以4000×4000像素分辨率拍攝圖像。b.結果三維雙重水凝膠系統(tǒng)和drg/sc共培養(yǎng)：本公開提供了一種三維模型來研究雙重水凝膠平臺用于共培養(yǎng)應用的用途；以及一種使用dmd作為動態(tài)光刻工具的三維水凝膠系統(tǒng)。利用這一模型，研究機械刺激和化學線索(包括排斥的和有吸引力的生物分子)對體外神經(jīng)元生長的影響。這一模型模擬了ecm的三維結構并且更準確地體現(xiàn)了神經(jīng)元微環(huán)境。評價了這一系統(tǒng)在單一培養(yǎng)物中處理兩種細胞類型以及研究細胞行為的能力。將sc和神經(jīng)元共培養(yǎng)以在更接近它們的天然環(huán)境的條件下研究髓鞘形成過程。這一模型允許髓磷脂形成作為在三個維度中sc-神經(jīng)元共培養(yǎng)的結果。用于雙重水凝膠系統(tǒng)的方法描繪于圖13中。膠原對三維共培養(yǎng)物中神經(jīng)突生長的影響：展示了在具有或沒有膠原包被層的滲透性插入物中形成的水凝膠內三維培養(yǎng)物的形成。這兩種培養(yǎng)物中的生長均是穩(wěn)健的、束化的、以及對齊的。這一特征將這種系統(tǒng)與先前開發(fā)的體外模型區(qū)分開來，這是因為生長在通道內被定向。盡管生長在25天之后是高度密集的，但是它主要被容納在三維水凝膠系統(tǒng)的細胞容許性部分中。β-iii微管蛋白陽性神經(jīng)元絲描繪于圖17a、圖18a、以及圖19a中。與在不存在膠原的情況下的培養(yǎng)物相比，在膠原存在下培養(yǎng)物中神經(jīng)元生長的體積顯著更高(n＝15個-18個構建體)。在兩種培養(yǎng)基方案之間，生長的量基本上沒有不同。雙重水凝膠系統(tǒng)中三維共培養(yǎng)模型中髓磷脂的發(fā)育：目前公開的共培養(yǎng)系統(tǒng)促進三個維度中髓磷脂的形成。利用免疫組織化學和tem以證實髓磷脂的形成。將培養(yǎng)物用三種抗體染色：mbp、mag以及po。所述構建體呈mag、mblp以及po陽性，這確認了致密和非致密髓磷脂的形成。圖17b和圖18b這兩者示出了針對β-iii微管蛋白染色的神經(jīng)絲和合并圖像，所述圖像確認了mbp和po段沿著軸突延伸結構的形成；圖17b示出了mbp陽性成熟髓鞘；并且圖18b示出了po陽性成熟髓鞘。如上文所述，經(jīng)由z-棧采集拍攝所有圖像。共聚焦成像確認了神經(jīng)突生長在三個維度上發(fā)生在整個通道中。這些構建體的生長和髓鞘形成的深度是88μm±15μm。tem圖像確認了髓磷脂形成，如在圖20a-20f中所看到的那樣。在神經(jīng)束中采集的切片示出了高密度的平行的高度束化的和有髓鞘的神經(jīng)突、施旺細胞的存在、以及施旺細胞對神經(jīng)突的封裝。在tem圖像中一致地鑒定出髓磷脂段，從而確認了致密髓磷脂形成。這些發(fā)現(xiàn)證實了這一三維體外模型使得sc能夠在神經(jīng)突周圍形成成熟的髓磷脂層?？箟难?aa)對髓磷脂在三個維度中的形成的作用：將兩種培養(yǎng)基方案用于培養(yǎng)。對于ncol-25和col-25，25天的含有aa的培養(yǎng)基使得髓磷脂的量顯著增加。髓磷脂的量證實了培養(yǎng)物形成髓鞘的能力，不論神經(jīng)元生長的量如何。測量髓磷脂與神經(jīng)元生長的比率，證實了在更長時間暴露于aa的情況下，構建體中髓磷脂的百分比增加。這經(jīng)由針對mbp、mag、以及po的三種免疫組織化學抗體染劑所確認，從而證實了這對于致密髓磷脂和非致密髓磷脂這兩者來說都是準確的。膠原對髓磷脂發(fā)育的影響：在所述系統(tǒng)中評價膠原i和膠原iii對致密和非致密髓磷脂發(fā)育的影響。髓磷脂蛋白質遵循類似的趨勢，如圖17a-17c、圖18a-18c以及圖19a-19c中所示。膠原的添加增加了系統(tǒng)中髓磷脂形成的量。col-15和ncol-25的髓磷脂與神經(jīng)突生長的比率是相似的。這證實了與ncol-25相比col-15中髓磷脂量的增加是因為神經(jīng)元生長的量增加。這兩種系統(tǒng)在使髓磷脂發(fā)育方面的效率取決于aa暴露。圖16a和16b示出了膠原顯著增加了神經(jīng)元生長。ncol-15顯示在不存在膠原的情況下以及在更短時間暴露于aa的情況下，形成最少的髓磷脂。c.討論髓鞘是圍繞軸突并且降低神經(jīng)系統(tǒng)電容的具有多層螺旋結構的特化細胞膜。有良好髓鞘的神經(jīng)由髓鞘完全包圍，除了被稱為郎飛氏結(nodesofranvier)的暴露于細胞外環(huán)境的小的周期性間隙之外。髓磷脂以兩種形式存在：致密和非致密。致密髓磷脂超微結構由螺旋狀細胞鞘組成，所述細胞鞘缺乏細胞質以及細胞外間隙，但是含有兩個質膜。非致密髓磷脂是髓磷脂的通道樣段并且是非凝聚的并且由施-蘭切跡(schmidt-lantermanincisure)、髓磷脂層中的周期性中斷以及結側區(qū)構成。致密髓磷脂和非致密髓磷脂各自含有各種蛋白質，如髓磷脂堿性蛋白(mbp)，所述髓磷脂堿性蛋白是cns和pns致密髓磷脂的必要組分。mbp位于髓鞘的細胞質表面上并且?guī)в写罅侩姾伞ns中的另一種至關重要的髓磷脂蛋白質是po，它是一種跨膜糖蛋白，影響細胞粘附，維持pns致密髓磷脂的主要密集線，并且在將致密髓磷脂之間的間距保持一致中起重要作用。非致密髓磷脂的主要組分之一是髓磷脂相關糖蛋白(mag)，它不存在于髓磷脂的外層上，但是存在于內層中。它與軸突接觸，從而使它連接到致密髓磷脂。這三種蛋白質對于髓磷脂形成和維持來說是必要的并且已經(jīng)廣泛地用于檢測培養(yǎng)物中的髓磷脂。源自于原代組織來源或細胞系的sc和神經(jīng)元的共培養(yǎng)系統(tǒng)可以準確地描繪天然pns的事件和復雜髓磷脂構造。pc12細胞系和sc先前已經(jīng)被使用以建立運動神經(jīng)元/sc共培養(yǎng)模型來研究運動神經(jīng)元疾病。感覺神經(jīng)元和sc的體外模型先前被用于了解髓鞘形成背后的機制。許多先前的研究使用drg，這是因為它們被深入研究并且被認為是使用神經(jīng)元/sc共培養(yǎng)物的發(fā)育來評價pns中的髓鞘形成過程的強有力的體外模型。這些先前的體外共培養(yǎng)模型主要是在二維細胞培養(yǎng)物和三維組織切片中進行的。很少有研究在三維培養(yǎng)物中探究神經(jīng)元/sc共培養(yǎng)物的結合以及它們對髓磷脂形成的影響。為了設計三維仿生聚合物模型以研究神經(jīng)元/sc共培養(yǎng)物中的髓鞘形成，利用光微圖案化配置。光圖案化已經(jīng)被用于研究神經(jīng)系統(tǒng)，這是因為它允許適當?shù)厝S地體現(xiàn)仿生神經(jīng)元微環(huán)境。這一研究中所用的動態(tài)掩模投影光刻裝置提供了一種容易的制造技術來產生微圖案化的水凝膠。這些水凝膠是在滲透性細胞培養(yǎng)插入物上形成的，所述插入物提供了用于神經(jīng)再生實驗的基底。為了產生這些構建體，利用dmd器件形成動態(tài)光掩模。將這一掩模與被照射的peg溶液一起使用以形成模具，drg最初附著到所述模具中，之后添加可光致固化的單細胞medex溶液。利用負像動態(tài)光掩模在三個維度中封裝sc并且將它們與drg結合。利用具有短(30秒)暴露時間長度的可見光對于水凝膠形成和細胞封裝來說是最實用的以降低細胞毒性，并且將這些程序用于這一設計。這一模型提供了一種長期(25天)體外平臺，該平臺確保了在三維環(huán)境中神經(jīng)元的存活、它們的伸長、以及它們的髓鞘形成。這些模型使用了兩種不同的細胞培養(yǎng)基，如表2中所述。培養(yǎng)基1由已經(jīng)被良好表征并且已知支持drg和sc生長的因子構成。這種培養(yǎng)基含有bsa，它已經(jīng)被證實支持sc的遷移。然而，這一系統(tǒng)不是專門用于促進髓磷脂形成。培養(yǎng)基2含有fbs連同抗壞血酸，它已經(jīng)被證實促進二維培養(yǎng)物中的髓鞘形成。先前在神經(jīng)元存在下對sc的研究證實它們能夠在體外形成具有基底層和膠原纖維的完整ecm。sc/drg共培養(yǎng)已經(jīng)證實抗壞血酸可以促進sc產生髓磷脂，這是通過使它們能夠形成基底層而實現(xiàn)的。培養(yǎng)基2還含有its(胰島素、轉鐵蛋白以及硒)，它已經(jīng)被證實促進大鼠細胞系中的髓鞘形成。在每一個實驗組中使用了層粘連蛋白，這是因為它已經(jīng)在神經(jīng)元/sc共培養(yǎng)物中被證實是為髓鞘形成所必需的。在體內，已經(jīng)證實不存在層粘連蛋白會導致小鼠和人類的外周神經(jīng)病變。缺乏層粘連蛋白的突變小鼠將有神經(jīng)內膜基底層的破壞，這隨后降低了神經(jīng)傳導速度。目前公開的系統(tǒng)還經(jīng)由使用膠原包被的基質研究了在這一三維模型中膠原的存在對神經(jīng)元生長的作用。利用i型膠原和iii型膠原進行這些研究。iii型膠原結合并且激活施旺細胞上的粘附g-蛋白偶聯(lián)受體gpr56，這可以引起gpr125的激活以引發(fā)髓鞘形成。i型膠原和iii型膠原是神經(jīng)外膜的關鍵組分，所述神經(jīng)外膜是支持和圍繞外周神經(jīng)和髓磷脂的密集組織的最外層。為了研究神經(jīng)元細胞在三維模型中形成髓磷脂的能力，評價了兩種不同的培養(yǎng)基的影響和膠原的影響。所述四種培養(yǎng)系統(tǒng)是通過膠原的存在和共培養(yǎng)物所暴露的培養(yǎng)基方案來區(qū)分的。利用兩種培養(yǎng)基方案。一種方案包括培養(yǎng)基1，持續(xù)10天，然后是培養(yǎng)基2，持續(xù)15天(培養(yǎng)系統(tǒng)1)；在第二種方案中，僅使細胞暴露于培養(yǎng)基2，持續(xù)25天(培養(yǎng)系統(tǒng)2)。表3描述了組。為了確定髓鞘形成是否受外源性sc的影響，在沒有將封裝的sc添加到雙重水凝膠系統(tǒng)中的情況下進行上述實驗，而保持所有其它變量恒定。表3：培養(yǎng)組培養(yǎng)物名稱i型膠原和iii型膠原培養(yǎng)基方案ncol-15否培養(yǎng)基1(10天)；培養(yǎng)基2(15天)ncol-25否培養(yǎng)基2(25天)col-15是培養(yǎng)基1(10天)；培養(yǎng)基2(15天)col-25是培養(yǎng)基2(25天)使用免疫組織化學和共聚焦成像確認髓磷脂的形成并且通過tem進一步驗證。20×放大倍率的二維圖像顯示mbp/β-iii微管蛋白陽性培養(yǎng)物中包裹在神經(jīng)元突出物周圍的髓磷脂段的形成，如圖15中所示。由于致密髓磷脂和非致密髓磷脂的形成而針對mbp和mag這兩者染色的髓磷脂的三維發(fā)育描繪于圖16a和16b中。tem圖像還確認了在所有實驗組中成熟髓磷脂層的出現(xiàn)和豐度，如圖20a-20d中所示。髓磷脂層的放大圖像描繪于圖20f中。圖20e示出了在培養(yǎng)25天之后，sc已經(jīng)在許多神經(jīng)突周圍形成髓鞘，并且一些sc已經(jīng)開始將細胞質層裹在神經(jīng)纖維周圍。這一圖像證實髓磷脂的量是顯著的并且所述培養(yǎng)物可以被用于長期研究，包括持久的三維藥物評價。圖20a-20f還示出了培養(yǎng)物中高密度的對齊的、高度束化的神經(jīng)元。所進行的第一組分析定量了在三個維度中四種培養(yǎng)系統(tǒng)中的每一種中神經(jīng)元生長的量，如圖14所述。公認的是，膠原和它們的受體促進神經(jīng)突生長。在此所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證實了在其中存在膠原的兩種系統(tǒng)中有顯著更多的神經(jīng)元生長。然而，沒有由于所利用的培養(yǎng)基方案而對生長造成顯著影響，這證實它對在所含系統(tǒng)中在25天之后神經(jīng)突延伸的量幾乎沒有影響。通過兩種不同的方法測量髓磷脂的量。第一種方法是將髓鞘形成視為獨立變量并且仔細檢查髓鞘形成的總量，不論系統(tǒng)中神經(jīng)元發(fā)育的量如何。第二種方法是計算髓磷脂與神經(jīng)突延伸的比率并且將髓磷脂發(fā)育的量歸一化。這提供了對髓鞘形成效率的了解并且描述了周圍包裹有髓鞘的神經(jīng)元突出物的百分比。利用mbp、mag以及po的染劑以研究由四個實驗組產生的髓磷脂的量。圖17c描述了培養(yǎng)系統(tǒng)中形成的髓磷脂的百分比。利用mbp抗體獲得這些數(shù)據(jù)。雖然所有四個樣品在培養(yǎng)25天之后均呈mbp陽性，但是在各組之間存在顯著性差異。mbp是存在于致密髓磷脂中的蛋白質，并且它在培養(yǎng)物中的表達驗證了成熟髓鞘的致密膜段的形成。當aa暴露增加時，在這些系統(tǒng)中發(fā)生增加的髓鞘形成。這些結果是在比典型的二維培養(yǎng)物或組織切片更準確模擬神經(jīng)系統(tǒng)的環(huán)境的三維體外模型中實現(xiàn)的。數(shù)據(jù)表明當暴露于髓鞘形成培養(yǎng)基25天時，在這些系統(tǒng)中髓磷脂與神經(jīng)元生長的比率顯著增加。當在膠原存在下將培養(yǎng)持續(xù)相同的暴露時間長度時，培養(yǎng)基方案引起髓鞘形成增加?；谶@些數(shù)據(jù)，以下兩種因素在這些培養(yǎng)物中起作用：膠原的存在和更長時間的aa暴露。缺乏這兩種因素的構建體(ncol-15)有最少的髓鞘形成。培養(yǎng)物的髓磷脂相對于神經(jīng)元生長的百分比證實相同的aa暴露具有相似的作用，不論已經(jīng)產生的神經(jīng)元的數(shù)目如何。然而，圖17b示出了當這兩種因素均存在于實驗中(col-25)時，觀測到協(xié)同響應，從而使得髓磷脂量值顯著增加。包括z-棧平面的最大投影以支持這些數(shù)據(jù)。為了確認外源性sc顯著改變髓鞘形成，利用了沒有另外的sc的對照組。圖17c中的數(shù)據(jù)顯示每一個實驗組相比于它的相應對照組具有髓鞘形成的顯著增加，這證實外源性sc對系統(tǒng)有很大的影響。所述結果顯示膠原顯著地增加了對照組中的髓鞘形成，但是aa暴露持續(xù)時間有較小的影響。使用po蛋白質抗體在三維培養(yǎng)物中測量髓鞘形成。pns髓磷脂中總蛋白的70％由po組成，并且這種蛋白質的缺乏將驗證非致密髓磷脂的缺乏。評價了po表達與β-iii微管蛋白陽性神經(jīng)絲的比率。圖18c中所示的結果證實ncol-15存在所有培養(yǎng)物中最少量的po。在25天內在存在aa的培養(yǎng)物中po表達的百分比是顯著更高的，這與來自mbp染色的結果相一致，所述結果顯示col-25組中有最高的mbp表達。這是有趣的，這是因為po和mbp都是pns中致密髓磷脂的特征蛋白，但是具有不同的職能。po保持髓磷脂膜的ecm和細胞質間隔這兩者的有組織的重現(xiàn)，而mbp在細胞質融合中起作用。該值與ncol-25組是等同的，這表明培養(yǎng)基2在25天之后的培養(yǎng)物的效率是相同的，不論膠原是否存在于培養(yǎng)物中。圖18b示出了在用po標記的培養(yǎng)物中髓磷脂的量。col-25顯示最大量的致密髓磷脂po發(fā)育，不論神經(jīng)元生長的量如何。所述結果顯示培養(yǎng)物中含有膠原的樣品產生更多的神經(jīng)元，從而產生更高量的髓磷脂。在兩個含有膠原的樣品之間，暴露于aa增加了po出現(xiàn)的量。這甚至在通過計算髓磷脂與神經(jīng)絲體積的比率來將含有膠原的樣品中髓磷脂的體積值歸一化之后仍被維持，如圖18c中所示。圖像證實在不含膠原的構建體(ncol-15和ncol-25)中，po的量顯著減少。神經(jīng)元生長的體積也減少，并且因此，致密髓磷脂形成的百分比與col-15沒有顯示出任何顯著的差異。在這些長期的三維構建體中，在使培養(yǎng)物暴露于aa25天之后表達po的致密髓磷脂的百分比與在15天內在aa存在下含有膠原的培養(yǎng)物中表達po的致密髓磷脂的百分比基本上沒有差異。aa是為二維培養(yǎng)物的含血清培養(yǎng)基中的髓鞘形成所必需的。aa暴露的持續(xù)時間在髓磷脂形成的效率方面起重要作用。膠原i和iii支持神經(jīng)元生長并且可以有助于引發(fā)髓鞘形成過程。系統(tǒng)中膠原的存在增加了神經(jīng)元三維延伸，并且因此，增加了三維環(huán)境中髓磷脂形成的量。用于髓磷脂的一個不同量度是mag，它是非致密髓磷脂中富含的蛋白質。通過mag免疫染色來評價大鼠drg/sc共培養(yǎng)物在三維構建體中形成髓磷脂的能力。所有構建體均呈mag陽性并且與po和mbp遵循相同的模式。類似于po和mbp，通過mag的共聚焦顯微鏡術分析證實了高水平的髓磷脂合成。mag指示了施-蘭切跡和結側區(qū)，它們是非致密髓磷脂的特征。不論神經(jīng)元生長的體積如何，在col-25組中在膠原存在下在更長時間的aa暴露下非致密髓磷脂的量是更高的。aa幫助系統(tǒng)形成基底層并且促進髓磷脂形成。mag標記的結構的百分比在具有相同的aa暴露的培養(yǎng)物之間(col-25和n-col25)基本上沒有差異。然而，當不向系統(tǒng)中添加膠原時，生長量顯著降低。本公開公開了一種允許結合sc和神經(jīng)元的新型三維體外共培養(yǎng)模型。利用提供三維環(huán)境的簡單的高通量光刻方法在受控的微環(huán)境中復制神經(jīng)元現(xiàn)象而以高分辨的時空精度引入機械線索和化學線索。在此，數(shù)據(jù)證實這一共培養(yǎng)環(huán)境提供了對齊的高度束化的神經(jīng)元生長，具有沿著它們很好地包裹的髓鞘。經(jīng)由免疫組織化學和tem確認了髓鞘形成。使用了兩種培養(yǎng)系統(tǒng)，并且研究了膠原對神經(jīng)元生長和髓鞘形成的影響。這一平臺提供了對于藥物發(fā)現(xiàn)和評價有用的器件、方法以及系統(tǒng)。實施例3：模型的校準和可行性(非假想和假想)藥物開發(fā)管線受到不可接受的損耗率的困擾，這在很大程度上歸因于在開發(fā)的臨床前階段中沒有鑒定的毒性。特別是化學治療劑，它們雖然對一系列廣泛的癌癥具有臨床有效性，但是通常與劑量限制性全身毒性相關。在很多情況下，外周神經(jīng)系統(tǒng)首先受到這些不良作用的影響，并且這樣的毒性往往只能首先在動物研究中被鑒定出或被忽略直到臨床試驗為止。化學治療誘發(fā)的外周神經(jīng)病變(cipn)是癌癥治療的一種常見的副作用，從而導致許多患者改變劑量方案并且一些由于嚴重的神經(jīng)毒性損傷而完全停止治療。在細胞模型中針對外周神經(jīng)毒性篩選藥物候選者的能力將通過在進行高成本的和耗時的動物研究之前幫助公司鑒定出有前途的先導化合物來加速藥物發(fā)現(xiàn)過程?！邦惼鞴傩酒奔夹g作為先進的細胞模型顯示出巨大的前景，所述細胞模型可以提供可用于后期藥物開發(fā)的中等通量和高內涵數(shù)據(jù)，前提條件是它們提供了預測人類生理或病理的信息。許多合同研究組織已經(jīng)取得了為各種器官系統(tǒng)提供這樣的測定的商業(yè)成功。然而，外周神經(jīng)芯片測定的開發(fā)是滯后的。常用的外周神經(jīng)培養(yǎng)制備物對臨床毒性沒有預測性，這在某種程度上是因為它們通常利用細胞凋亡或神經(jīng)突伸長作為可測量的終點，而成體外周神經(jīng)元已完全生長并且已知會抵抗細胞凋亡。組織活檢的神經(jīng)傳導測試和組織形態(tài)測定是神經(jīng)病變的最具臨床相關性的量度。然而，目前沒有提供這些量度的培養(yǎng)模型。我們已經(jīng)開發(fā)了一種創(chuàng)新性的感覺神經(jīng)芯片模型，這是通過將背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)在微圖案化的水凝膠構建體中以在類似于外周神經(jīng)解剖結構的三維排列上約束軸突生長而實現(xiàn)的。此外，在這些模型系統(tǒng)中可以可再現(xiàn)地記錄由復合動作電位(cap)產生的電誘發(fā)群體場電位。這些早期結果證實了使用適合于類似于臨床測試的形態(tài)學和生理學測量的微工程神經(jīng)組織的可行性。我們假設化學治療誘導的神經(jīng)毒性將以模擬臨床神經(jīng)病理學的方式表現(xiàn)在這些測量中。這一提案的目標在于證實使用復合動作電位波形作為體外外周神經(jīng)毒性的量度的可行性。為此，我們將施用具有已知的外周神經(jīng)毒性的化學治療藥物，測量cap的變化，并且與形態(tài)變化以及所記錄的臨床病理生理學相比較。以下具體目標將允許我們實現(xiàn)這一目標：目標1：通過定量關鍵的形態(tài)學量度并且與復合動作電位(cap)量度相關聯(lián)來校準神經(jīng)芯片模型?！な褂霉簿劢购屯干潆娮语@微鏡術定量在體外四周內細胞體的尺寸和密度、以及神經(jīng)突密度、直徑、以及在沿著神經(jīng)束的三個長度上有髓鞘的神經(jīng)突％?！ご_定四周內誘發(fā)群體動作電位響應的一致性?！な筩ap波形與形態(tài)測定參數(shù)相關聯(lián)以確定基線結構-功能關系。目標2：證實使用cap波形測量通過急性施用已知會引起臨床神經(jīng)病變的四種化學治療劑所誘導的毒性的可行性?！ぴ趯嶒炐匝芯恐写_定適合于神經(jīng)芯片模型的奧沙利鉑、紫杉醇、長春新堿、以及硼替佐米的劑量和孵育時間?！ぴ谝詫嶒炐匝芯恐兴_定的終點施用藥物之后測量cap傳導速度、振幅、潛伏期、以及積分?！ざ啃螒B(tài)測定變化并且確定與cap波形的變化的相關性。普遍認識到的是，當前從發(fā)現(xiàn)進展到臨床使用的實驗藥物的損耗率是高到不可接受的，從而驅使單個藥物上市的成本高達26億美元(dimasi等,2014)。據(jù)估計在藥物開發(fā)期間沒有被發(fā)現(xiàn)的劑量限制性毒性是上市后藥物撤回的第二大原因，并且這些后期失敗一般與缺乏對于藥物候選者毒性的可靠篩查方法相關(kola和landis2004；li2004；schuster等,2005)。盡管如此，fda針對體外-體內相關性(ivivc)的最新指南強調了藥物溶解與生物利用率之間的關系(emami2006)；沒有ivivc指南被限定用于使臨床毒性與體外毒性測試相關聯(lián)。顯然，基于細胞的毒性篩查測定將幫助公司鑒定出具有更低毒性的先導化合物，但是可靠地預測臨床毒理學的體外測定少得可憐并且迫切需要這樣的測定(astashkina和grainger2014)。化學治療劑是一類特殊的藥物，這是因為它們本身具有細胞毒性。毒性副作用因此是不可避免的，并且臨床上可耐受的全身毒性的水平限制了藥物的劑量。神經(jīng)系統(tǒng)是特別易受不良作用影響的，與化學治療相關的神經(jīng)毒性的發(fā)生率僅次于血液毒性(malik和stillman2008；windebank和grisold2008)。外周神經(jīng)是特別敏感的，這很可能是因為處于保護性血腦屏障外部并且具有從它們的細胞體到達很遠處的非常長的軸突。據(jù)估計，化學治療誘發(fā)的外周神經(jīng)病變(cipn)在接受治療的患者的30％-40％中發(fā)生，并且感覺神經(jīng)一致地比運動神經(jīng)受到更嚴重的影響(windebank和grisold2008)。癥狀從四肢的慢性疼痛到麻刺感、缺乏感覺或關節(jié)位置感、以及運動障礙不等。國家癌癥研究所(nationalcancerinstitute)將cipn鑒定為最具劑量限制性副作用之一以及患者選擇降低劑量或完全停止治療的最常見原因(moyadelpino2010)。在一些情況下，在停止治療之后癥狀消退，但是最經(jīng)常，cipn僅是部分可逆的，一些癥狀永久保留。不同于能夠容易治療的血液毒性，目前沒有針對cipn的護理標準臨床治療(windebank和grisold2008)。已知會造成最大的外周神經(jīng)毒性風險的化學治療劑的類別是鉑衍生物；微管蛋白結合化合物，包括長春花生物堿、紫杉烷、以及埃博霉素；蛋白酶體抑制劑硼替佐米；以及沙利度胺(thalidomide)。這些藥物也是六種最常見的惡性腫瘤的護理標準(argyriou等,2012；cavaletti和marmiroli2010；wang等,2012)。導致所報告的癥狀范圍的確切神經(jīng)毒性分子機制是不同的并且在一些情況下，仍然不清楚。一般來說，鉑化合物結合dna并且引起細胞凋亡，而抗微管蛋白劑破壞微管蛋白動力學，包括軸突轉運(malik和stillman2008)；硼替佐米被認為破壞神經(jīng)節(jié)中的mrna轉錄和加工，并且沙利度胺的機制是未知的，盡管它可能涉及與血管系統(tǒng)和/或炎性細胞的相互作用(argyriou等,2012)。cipn的具體表現(xiàn)和嚴重程度可以通過神經(jīng)傳導測試和/或皮膚或神經(jīng)活檢來最客觀地和可靠地診斷(dyck和thomas2005)。這些測量結果目前僅可從動物和人類中的安全測試中獲得。因此，大多數(shù)的藥物公司根本就不會專門針對外周神經(jīng)毒性進行篩查直到先導化合物鑒定之后為止，盡管它是開發(fā)后期中最有可能的失敗原因之一。三維“類器官芯片”模型的使用作為開發(fā)適用于藥物開發(fā)和毒性篩查的預測性基于細胞的測定的最佳希望正在被接受(ghaemmaghami等,2012；kimlin等,2013)。然而，關鍵的是，這樣的模型系統(tǒng)超越了常規(guī)細胞活力測定的三維型式而成為真正再現(xiàn)可以被評價以鑒定毒性途徑的器官生理學的功能方面的模型(astashkina和grainger2014)。這樣的生理學評估對于外周神經(jīng)組織來說是特別有挑戰(zhàn)性的，其中經(jīng)過長距離的生物電傳導按理說可以是最相關的生理學終點。出于這個原因，外周神經(jīng)的三維組織模型落后于上皮組織、代謝組織、以及腫瘤組織的模型，其中可溶性分析物用作適當?shù)牧慷?。利用臨床相關毒性量度的神經(jīng)芯片模型通過使得能夠選擇具有更低的由于外周神經(jīng)毒性導致后期失敗的可能性的有前途的先導化合物而對于臨床前藥物開發(fā)來說將是非常有價值的。此外，由這樣的模型所提供的高內涵信息通過提供對可能的毒性機制的深入了解，從而指導重新配制而將對于調查毒理學是有價值的。通過證實我們的模型系統(tǒng)的可行性，我們期望用預測性篩查外周神經(jīng)毒性的首先進入市場的技術使我們自己強有力地定位為商業(yè)領跑者。我們已經(jīng)開發(fā)了一種簡單但是獨特的數(shù)字投影光刻方法以用于將一種或多種水凝膠直接快速微圖案化到常規(guī)的細胞培養(yǎng)材料上(curley等,2011；curley和moore2011)。我們的簡單和快速的方法使用兩種凝膠：作為限制性模具的聚乙二醇(peg)、以及作為容許性基體的交聯(lián)甲基丙烯酸酯化的肝素(me-hep，我們先前使用puramatrix)。這些雙重凝膠有效地將來自胚胎背根神經(jīng)節(jié)(drg)外植體的神經(jīng)突生長約束在特定的三維幾何形狀內，從而產生具有高密度和束化作用的軸突生長。當在髓磷脂誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，我們觀測到極大程度的呈髓磷脂堿性蛋白(mbp)陽性的髓磷脂染色，這表明了致密髓磷脂，它的特征性螺旋結構在tem圖像上是明顯的。具有從神經(jīng)節(jié)延伸的密集的、高度平行的、有髓鞘的三維神經(jīng)纖維束的這一培養(yǎng)模型的獨特結構對應于外周神經(jīng)構造；它可以使用神經(jīng)形態(tài)測定來評估，從而允許進行對于傳統(tǒng)細胞測定來說不可用的臨床類似評估。我們的神經(jīng)芯片培養(yǎng)模型的最獨特之處在于能夠記錄由復合動作電位(cap)產生的電誘發(fā)群體場電位的能力。跡線顯示了特征性均勻的、短潛伏期的群體響應，所述響應在高頻(100hz)刺激下保持一致，顯示出與遠端神經(jīng)束刺激相關的可測量的潛伏期延長(圖21a和21b)，可以由河豚毒素(ttx)可逆地消除，并且所述響應對神經(jīng)遞質阻斷劑不敏感，這表明了cap而不是突觸電位(huval等,2015)。初步的證據(jù)表明與中等葡萄糖水平(20mm)相比，高水平的葡萄糖(60mm)使得cap振幅顯著降低，以及潛伏期延長(圖22a-22c)。初步的證據(jù)還表明急性(48小時)施用0.1μm的紫杉醇(ptx)使得cap振幅顯著降低以及潛伏期延長(圖23a-23c)。與在我們的模型中顯著的可測量的cap變化相比，這個濃度先前在常規(guī)的drg培養(yǎng)物中已經(jīng)引起50％細胞死亡，這表明了一種潛在更具信息性的毒性量度。胚胎drg培養(yǎng)物已經(jīng)被有效地用作外周神經(jīng)生物學的模型達數(shù)十年(melli和hoke2009)。雖然作為模型系統(tǒng)是有用的，但是已知常規(guī)的drg培養(yǎng)物在用傳統(tǒng)的細胞死亡測定評估時對臨床毒性的預測性不佳。雖然可以從drg獲得單細胞記錄，但是我們意識到?jīng)]有記錄cap的報告，這是因為缺乏組織構造。使我們的模型系統(tǒng)具有創(chuàng)新性的是能夠類似于臨床組織病理學和神經(jīng)傳導測試評估組織形態(tài)測定和群體電生理學的獨特能力。該項目的目的是證實某些外周神經(jīng)毒性化學治療劑將在可以使用類似于臨床量度的形態(tài)學和生理學量度加以定量的微工程神經(jīng)組織中誘導毒性。我們將通過首先校準所述模型系統(tǒng)以確定基線變異性并且對結構-功能關系進行表征來接近這一目的。我們然后將對由已知會引起臨床神經(jīng)病變的特定化學治療劑的急性施用所誘導的變化進行定量以證實使用復合動作電位(cap)波形作為神經(jīng)毒性的臨床前測定的技術優(yōu)點。目標1基本原理和理由：傳統(tǒng)的神經(jīng)元細胞活力測定尚未被證實可用作神經(jīng)毒性的臨床前篩查。這并不奇怪，這是因為公知的是，胚胎背根神經(jīng)節(jié)(drg)神經(jīng)元比成熟神經(jīng)細胞更加容易受到細胞凋亡的影響(kole等,2013)。drg神經(jīng)突生長的測定作為毒性的早期高通量篩查可以是更相關的(melli和hoke2009)。然而，可用于辨別潛在的神經(jīng)病變表現(xiàn)以及告知先導化合物選擇的高內涵測定仍然是令人困惑的。與二維培養(yǎng)物相比，三維培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞已經(jīng)被證實表現(xiàn)出更仿生的形態(tài)學和電生理學行為(desai等,2006；irons等,2008；lai等,2012；paivalainen等,2008)。因此，在三維培養(yǎng)物中的功能測量可以是用于這樣的高內涵分析的最有前途的候選者，只要它們與臨床相關器官生理學相當即可。神經(jīng)傳導測試已經(jīng)被證實能夠甚至在癥狀完全表現(xiàn)之前預測臨床神經(jīng)病理學的類型和嚴重程度(velasco等,2014)。我們提出了一種在體外環(huán)境中類似的電生理學量度；為了解釋結果，我們首先需要建立基線測量并且確定結構-功能相關性。目標1研究設計：將使用在我們發(fā)表的論文之上的改進方案來制備有髓鞘的以及無髓鞘的神經(jīng)組織構建體(curley和moore2011；huval等,2015)。將由填充有補充有膠原和層粘連蛋白的me-hep凝膠的peg凝膠微型模來制造雙重水凝膠構建體。神經(jīng)突生長構建體將被制造成約400μm寬和高達5mm長。將從胚胎第15天(e15)大鼠胚胎中解剖的脊髓胸段中獲取背根神經(jīng)節(jié)(drg)并且將其并入雙重水凝膠構建體的球狀區(qū)域內。將有髓鞘的組織構建體在含有its補充劑和0.2％bsa的基礎伊格氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天以促進施旺細胞遷移和神經(jīng)突生長，繼而在另外補充有15％fbs和50μg/ml抗壞血酸的相同的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)長達四周以誘導髓鞘形成(eshed等,2005)。將通過在相同的但是缺乏抗壞血酸的培養(yǎng)基方案(誘導生長，繼而誘導髓磷脂)中培養(yǎng)來形成無髓鞘的構建體。在含有抗壞血酸的髓磷脂誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少兩周是為致密髓磷脂的顯著形成所需的。為了評估成熟的各個階段的組織形態(tài)，將各自約12個有髓鞘和無髓鞘的組織構建體在髓鞘形成誘導培養(yǎng)基中一周、兩周、三周、以及四周(或17天、24天、31天、以及38天的體外總天數(shù)(div))時在4％多聚甲醛中固定并且針對核(赫斯特(hoechst))、神經(jīng)突(βiii-微管蛋白)、施旺細胞(s-100)、髓磷脂堿性蛋白(mbp)、以及細胞凋亡(膜聯(lián)蛋白-v和tunel)染色。將樣品用共聚焦顯微鏡術在drg內、接近神經(jīng)節(jié)、纖維束中點附近、以及遠離神經(jīng)節(jié)的纖維束中的區(qū)域處成像；精確的距離將與每一組中平均最大神經(jīng)突范圍成比例。在共聚焦成像之后，將樣品在2％四氧化鋨中后固定，脫水，并且包埋于環(huán)氧樹脂中。將約10個超薄橫截面從每一個樣品中在每一個限定的區(qū)域(即神經(jīng)節(jié)、近端、中點、遠端)處切割并且用檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾染色以進行tem成像。將如先前所述進行生理學分析(huval等,2015)。將有髓鞘的構建體和無髓鞘的構建體這兩者從培養(yǎng)物中取出并且放置在灌注有人工腦脊髓液(acsf)的場記錄裝備上。如圖24中所描繪，將場電位電極放置在drg外植體的細胞體區(qū)域中并且將雙極刺激電極在接近神經(jīng)節(jié)、靠近中點、以及遠離神經(jīng)節(jié)的距離處以約300μm的深度插入到通道中；距離將通過形態(tài)測定來告知。對于每一個刺激位置處的每一個標本，將增加刺激強度直到記錄到特征性快速的(<5ms)、短潛伏期的、負偏轉電位為止。將在17div、24div、31div、以及38div時，從約5個-10個標本獲取來自每一個刺激位置的drg峰電位記錄。將這些相同的標本在電生理學記錄之后立即固定并且處理以進行共聚焦和tem分析。將如圖24中所匯總來評估形態(tài)分析。將在神經(jīng)節(jié)中測量細胞體的密度和直徑分布。在神經(jīng)纖維束中，測量結果將包括軸突的密度和直徑分布、具有髓磷脂的軸突％、以及髓鞘的厚度分布。這一分析將提供形態(tài)變異性的重要的定量量度和與生理學的相關性。生理學量度也匯總于圖24中。將在沿著神經(jīng)束的長度的三個點處記錄cap，并且測量結果將包括cap振幅(和峰數(shù))、包絡(寬度)、積分(曲線下面積)、以及傳導速度(從潛伏期)的分布。將所記錄的構建體的形態(tài)測定參數(shù)與更大的形態(tài)測定數(shù)據(jù)池比較以確保它們在預期的變異范圍內。我們將進行統(tǒng)計互相關以確定哪些形態(tài)學量度與哪些生理學量度具有最好的相關性(manoli等,2014)。此外，這些實驗將提供用于統(tǒng)計功效分析的變異性的量度以確定用于目標2的適當?shù)臉颖玖?，并且它們將用于限定排除標準，例如具有與平均值相差多于/少于2倍標準偏差的神經(jīng)突生長的樣品將被排除。目標1預期結果：我們假設所記錄的cap波形將反映形態(tài)學觀測結果。舉例來說，我們的初步數(shù)據(jù)表明在培養(yǎng)兩周之后，水凝膠通道內接近神經(jīng)節(jié)處的神經(jīng)突生長比遠離神經(jīng)節(jié)處的神經(jīng)突生長要密集得多(圖21a和21b)。因此，當近端刺激時，與遠端刺激相比，所記錄的cap顯示更大的振幅和積分。當遠端刺激時，cap的潛伏期果然是更長的，這反映了傳導時間。在主要含有小直徑、無髓鞘的軸突的構建體中，所計算的傳導速度是約0.5m/s，這不出意料是緩慢的。在所提出的實驗中，我們預期看到cap傳導速度與髓鞘形成％和/或軸突直徑具有相關性，而cap振幅應當與刺激位置處軸突的密度具有相關性。我們還將通過觀測峰數(shù)、包絡、以及積分，并且用形態(tài)學量度進行相關性分析來尋找進一步的相關性。目標1潛在問題和替代策略：初步的發(fā)現(xiàn)強有力證實了為了這一目標所提出的工作的技術可行性。最可能的預期缺陷是當我們測量更多的培養(yǎng)物時，我們可能發(fā)現(xiàn)形態(tài)學和/或生理學變異性可能過高以致許多強相關性不能被鑒定。如果發(fā)生這種情況，我們將根據(jù)需要增加樣本量和/或將我們的努力集中在代表最強相關性的那些量度上。我們還可以嘗試改進培養(yǎng)條件以降低變異性，如通過使用確定成分培養(yǎng)基、或使用從多個動物匯集的解離細胞。目標2基本原理和理由：具有最嚴重的所記錄的神經(jīng)毒性的最常施用的化學治療劑是鉑衍生物；微管蛋白結合化合物，包括長春花生物堿、紫杉烷以及埃博霉素；蛋白酶體抑制劑硼替佐米；以及沙利度胺(argyriou等,2012；cavaletti和marmiroli2010)。所有這些試劑似乎對感覺神經(jīng)元比對運動神經(jīng)元或交感神經(jīng)元更具毒性，但是它們各自靶向神經(jīng)的不同部分，如圖25中所匯總，從而產生臨床上可測量的組織學變化和生理學變化的不同集合。毒性的高內涵功能測定應當能夠檢測與這些化合物相關的體內作用的范圍。為了使可管理的范圍成為可能，我們將實驗限于奧沙利鉑、長春新堿、紫杉醇、以及硼替佐米。這一清單確保了適當多樣的響應范圍，這是因為它包括每一個家族的一種化合物，不包括埃博霉素，這是因為它們以類似于紫杉烷的方式結合微管蛋白，并且不包括沙利度胺，這是因為它可能涉及與其它細胞類型和細胞因子的相互作用(argyriou等,2012)。我們將實驗進一步限于被確認在體外具有神經(jīng)毒性的神經(jīng)毒性劑量的急性施用。長期和低劑量施用將被保留用于未來的詳細研究。我們建議通過定量對這四種化學治療劑的形態(tài)學和生理學響應來證實使用cap作為毒性的量度的可行性。所提出的實驗被設計成建立具有直接類似于神經(jīng)傳導測試以及臨床組織學的評估的模型。分子機制研究超出了這一提案的范圍，但是重要的是注意到微圖案化培養(yǎng)物的準三維性質適合于常規(guī)的細胞和分子測定。目標2研究設計：我們將首先進行小的實驗性研究以確保使用有效劑量。我們將從被證實在急性施用(48小時)之后在體外誘導統(tǒng)計顯著性神經(jīng)元細胞死亡的劑量開始并且驗證在這些濃度下形態(tài)變化和生理變化在我們的模型中是可測量的。整體實驗設計匯總于圖26中。根據(jù)髓鞘形成誘導方案，將drg外植體(n＝20)培養(yǎng)在微圖案化的凝膠(如目標1中所述)中。在由目標1確定為產生完全有髓鞘的構建體的時間點，將針對足夠的神經(jīng)突生長(細胞示蹤劑綠色(celltrackergreen))和髓鞘形成(fluoromyelin紅色)檢查標本；此時沒有足夠的神經(jīng)突生長和/或髓鞘形成的標本將被排除在實驗以外。將獲取健康組織構建體的電生理學記錄，并且在第二天，將神經(jīng)毒性濃度的四種藥物急性施用48小時，如表4中所匯總。對照組將接受不含藥物的媒介物。將在48小時施用期結束時對一半(n＝10)的外植體進行電生理學，并且在施用期后7天時對另一半進行電生理學。將所有標本在最終的記錄之后立即固定，染色，并且評估，如圖24中所匯總。此外，將對細胞體和軸突損傷，如染色質凝聚、起泡、以及軸突斷裂進行定性觀測。表1：用于初始實驗性研究的藥物劑量。將使用這一實驗性研究的結果來評估劑量施用的適當性，并且將根據(jù)全面研究的需要調整劑量(下文)。還將使用實驗性研究的結果來確定最強相關的形態(tài)學量度和生理學量度，并且進行統(tǒng)計功效分析以估計在這些量度中檢測約10％差異所需的樣本量。在更大的研究中，我們假設在急性藥物施用之后體外的形態(tài)變化和生理變化將與如文獻中所報道的體內神經(jīng)病變非常相似。這個實驗的目的在于將在我們的神經(jīng)芯片模型中所述藥物中的每一種的可定量的神經(jīng)毒性標志編目。全面實驗設計將反映實驗性研究，如圖26中所描繪，但是所有四種藥物(奧沙利鉑、長春新堿、紫杉醇、硼替佐米)的樣本量和劑量將反映由實驗性研究所確定的任何變化。目標2預期結果：我們假設每一種藥物的急性施用將誘導可以通過測量cap相對于基線的變化來檢測的毒性。我們預期這些變化中的大部分將與如通過我們的形態(tài)測定分析所定量的任何形態(tài)損傷具有相關性。舉例來說，參考圖25，使用微管蛋白結合藥物長春新堿和紫杉醇，我們預期看到軸突萎縮，如通過軸突直徑和密度減小所測量，我們預期這將伴隨cap振幅的降低。我們還可能看到髓磷脂厚度和有髓鞘的軸突％的降低，這可能伴有cap傳導速度的降低。使用奧沙利鉑，我們預期將看到更高水平的細胞凋亡，但是看到較少的軸突萎縮和髓磷脂損傷。因此，雖然cap振幅可能由于奧沙利鉑對na+通道的作用而仍降低，但是在沒有髓磷脂毒性的情況下，我們預期不會看到傳導速度降低很多。我們進一步預期生理變化和形態(tài)變化將與如通過神經(jīng)傳導測試和組織形態(tài)測定所測量的記錄的臨床病理學相似。目標2潛在問題和替代策略：雖然已經(jīng)在體外觀測到待測試的四種化合物的神經(jīng)毒性，但是生物效應可能以不可預測的方式受三維制備物的影響。有可能，預期種類的形態(tài)和生理病理學將不在實驗性研究中表現(xiàn)，要不就是細胞死亡將蓋過功能量度。如果是這樣的話，我們可以增加/降低劑量和/或轉變成長期施用(7天)。另一個似乎合理的情況是神經(jīng)病變將是明顯的，但是定量量度如此可變以致于使得10％的可檢測的差異是不切實際的。如果是這樣的話，我們將設計更大的研究以在切實可行的情況下檢測20％-30％的可檢測的差異。參考文獻：argyriouaa,brunaj,marmirolip,cavalettig.2012.《化學治療誘導的外周神經(jīng)毒性(cipn)：最新情報(chemotherapy-inducedperipheralneurotoxicity(cipn):anupdate)》,criticalreviewsinoncology/hematology82:51-77.doi:10.1016/j.critrevonc.2011.04.012.pubmedpmid:21908200。astashkinaa,graingerdw.2014.《用于高通量藥物候選者毒性評估的三維類器官體外細胞培養(yǎng)模型的批判性分析(criticalanalysisof3-dorganoidinvitrocellculturemodelsforhigh-throughputdrugcandidatetoxicityassessments)》,advanceddrugdeliveryreviews69-70:1-18.doi:10.1016/j.addr.2014.02.008.pubmedpmid:24613390。cavalettig,marmirolip.2010.《化學治療誘導的外周神經(jīng)毒性(chemotherapy-inducedperipheralneurotoxicity)》,naturereviews.neurology6:657-66.doi:10.1038/nrneurol.2010.160.pubmedpmid:21060341。curleyjl,jenningssr,mooremj.2011.《使用動態(tài)掩模投影光刻制造用于神經(jīng)培養(yǎng)系統(tǒng)的微圖案化水凝膠(fabricationofmicropatternedhydrogelsforneuralculturesystemsusingdynamicmaskprojectionphotolithography)》,journalofvisualizedexperiments48:e2636.doi:10.3791/2636.pubmedpmid:21372777；pmcid:3197419。curleyjl,mooremj.2011.《用于神經(jīng)突生長的三維模型的雙重水凝膠系統(tǒng)的簡易微圖案化(facilemicropatterningofdualhydrogelsystemsfor3dmodelsofneuriteoutgrowth)》,journalofbiomedicalmaterialsresearch.部分a99:532-43.doi:10.1002/jbm.a.33195.pubmedpmid:21936043；pmcid:3213030。desaia,kisaalitaws,keithc,wuzz.2006.《用于基于細胞的生物傳感的三維膠原水凝膠中人類成神經(jīng)細胞瘤(sh-sy5y)細胞培養(yǎng)和分化(humanneuroblastoma(sh-sy5y)cellcultureanddifferentiationin3-dcollagenhydrogelsforcell-basedbiosensing)》,biosensors&bioelectronics21:1483-92.doi:10.1016/j.bios.2005.07.005.pubmedpmid:16084714。dimasija,grabowskihg,hansenrw.2014.《開發(fā)新藥和獲得新藥上市批準的成本是26億美元：塔夫茨藥物開發(fā)研究中心(costtodevelopandwinmarketingapprovalforanewdrugis$2.6billion:tuftscenterforthestudyofdrugdevelopment)》,http://csdd.tufts.edu/。dyckpj,thomaspk.2005.《外周神經(jīng)病變(peripheralneuropathy)》,費城(philadelphia):saunders。emamij.2006.《體外-體內相關性：從理論到應用(invitro-invivocorrelation:fromtheorytoapplications)》,journalofpharmacy&pharmaceuticalsciences9:169-89.doi.pubmedpmid:16959187。eshedy,feinbergk,poliaks,sabanayh,sarig-nadiro等,2005.《神經(jīng)膠質蛋白介導施旺細胞-軸突相互作用和郎飛氏結的分子組裝(gliomedinmediatesschwanncell-axoninteractionandthemolecularassemblyofthenodesofranvier)》,neuron47:215-29.doi:10.1016/j.neuron.2005.06.026.pubmedpmid:16039564。ghaemmaghamiam,hancockmj,harringtonh,kajih,khademhosseinia.2012.《用于藥物發(fā)現(xiàn)的芯片上的仿生組織(biomimetictissuesonachipfordrugdiscovery)》,drugdiscoverytoday17:173-81.doi:10.1016/j.drudis.2011.10.029.pubmedpmid:22094245；pmcid:3273552。huvalrm,milleroh,curleyjl,fany,hallbj,mooremj.2015.《用于臨床前生理學測試的微工程外周神經(jīng)芯片(microengineeredperipheralnerve-on-a-chipforpreclinicalphysiologicaltesting)》,labonachipinpress,10.1039/c4lc01513d。ironshr,cullendk,shapironp,lambertna,leerh,laplacamc.2008.《三維神經(jīng)構建體：用于神經(jīng)生理學研究的新型平臺(three-dimensionalneuralconstructs:anovelplatformforneurophysiologicalinvestigation)》,journalofneuralengineering5:333-41.doi:10.1088/1741-2560/5/3/006.pubmedpmid:18756031。kimlinl,kassisj,viradorv.2013.《三維體外組織模型和它們用于藥物篩選的潛能(3dinvitrotissuemodelsandtheirpotentialfordrugscreening)》,expertopinionondrugdiscovery8:1455-66.doi:10.1517/17460441.2013.852181.pubmedpmid:24144315。kolai,landisj.2004.《制藥行業(yè)能否降低損耗率？(canthepharmaceuticalindustryreduceattritionrates？)》,naturereviews.drugdiscovery3:711-5.doi:10.1038/nrd1470.pubmedpmid:15286737。koleaj,annisrp,deshmukhm.2013.《成熟神經(jīng)元：具備存活條件(matureneurons:equippedforsurvival)》,celldeath&disease4:e689.doi:10.1038/cddis.2013.220.pubmedpmid:23807218；pmcid:3702294。laiy,chengk,kisaalitaw.2012.《三維神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物更準確地模擬新鮮解剖的神經(jīng)組織中電壓門控鈣通道的功能(threedimensionalneuronalcellculturesmoreaccuratelymodelvoltagegatedcalciumchannelfunctionalityinfreshlydissectednervetissue)》,plosone7:e45074.doi:10.1371/journal.pone.0045074.pubmedpmid:23049767；pmcid:3458113。liap.2004.《準確預測人類藥物毒性：藥物開發(fā)中的主要挑戰(zhàn)(accuratepredictionofhumandrugtoxicity:amajorchallengeindrugdevelopment)》,chemico-biologicalinteractions150:3-7.doi:10.1016/j.cbi.2004.09.008.pubmedpmid:15522257。luop,linm,lil,yangb,heq.2011.《蛋白酶體抑制劑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么使用peg水凝膠的可光降解型式，我們已能合成所述型式。這種凝膠允許將peg屏障放置在皮層池與丘腦池之間，可以在期望時用uv光使其降解以允許突觸形成。實施例6：微生理培養(yǎng)系統(tǒng)與非侵入性電生理學分析的組合(假想)本發(fā)明的一個實施方案是利用微生理培養(yǎng)系統(tǒng)與非侵入性電生理學分析的獨特組合。這具有潛在范式改變能力以在體外在仿生配置中進行群體水平的功能測定。我們已經(jīng)在熒光顯微鏡記錄裝備上手動配置了dlp器件并且已經(jīng)顯示選擇性照射和同時激活單個皮層神經(jīng)元以及表達gfp和chr2的細胞中的單個樹突。我們還已經(jīng)開發(fā)了定制軟件，所述定制軟件通過使得能夠直接在如由用戶所看到的顯微鏡照相機的實時饋送上指定所關注的區(qū)域來對照射進行靈活的用戶控制。dlp顯微鏡術和光遺傳學用于光學神經(jīng)激活的這一強效和通用的應用與新形式的電壓敏感性染料成像，如vf組合。光遺傳學和vf成像與dlp顯微鏡術的這一獨特的和適時的組合代表了用于非侵入性刺激我們的微工程回路的強效的、完全光學的方法；圖29。在一個實施方案中，分別在傳統(tǒng)的平面的解離的丘腦神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元培養(yǎng)物中制定dlp光學刺激和記錄方案。使用上文所述的方法產生皮層和丘腦培養(yǎng)物。我們將使用基于chr2質粒和慢病毒的dna構建體，我們已經(jīng)從光遺傳學公司(optogenetics,inc.)獲得了所述構建體，并且其中包括紅色熒光蛋白(mcherry)作為轉染/感染報告基因。將神經(jīng)元接種并且用chr2感染，然后用vf染料(2μm)染色。然后在轉染/感染的細胞上建立全細胞膜片記錄，然后dlp以約475nm(藍綠色)照射。將以電流鉗模式記錄分級電位和動作電位，同時改變照射強度和放大倍率(4×-40×)。或者，將電壓鉗位到可變電位，同時以約535nm(黃綠色；vf對激發(fā)波長相對不敏感)監(jiān)測vf熒光，再次同時也改變激發(fā)強度和放大倍率。重復這些測試以確定照射和電壓靈敏度的范圍和極限。此外，在這個實施例中，確定用于光學刺激和記錄的同時照射(或接近同時)的時間要求。對于誘發(fā)和記錄突觸電位，產生低密度的皮層培養(yǎng)物。需要這一操作(約10-100k個細胞/毫升)來使連接性達到最大并且在這些皮層培養(yǎng)物中的單個視野中獲得連接的神經(jīng)元。在建立全細胞膜片之后，然后用dlp照射轉染/感染的相鄰細胞并且將以電流鉗模式記錄突觸后電位。使用這些實驗來確定檢測chr2/光誘發(fā)突觸后電位所需的精確的光學設置、照射、以及光學取樣的時間。隨后在三維細胞群體中制定光學刺激和記錄方案。刺激和記錄是在相對低的放大倍率(10×)下進行的以使得丘腦池和皮層池在視野內同時可見。根據(jù)上述方法將tc回路微工程化。然而，通過將顆粒添加到于puramatrix溶液中的細胞懸浮液中來使丘腦細胞感染chr2病毒，之后注入到peg微型模中，然后將凝膠洗滌幾次以去除顆粒，之后添加皮層神經(jīng)元。將刺激場電極放置在丘腦神經(jīng)元池中，并且將記錄電極放置在皮層神經(jīng)元池中，并且確認誘發(fā)epsp的能力。在之后立即使用dlp照射chr2以刺激丘腦神經(jīng)元，同時記錄皮層池中的響應。研究在不同的放大倍率(4×-40×)下對不同的突觸前chr2照射強度的epsp響應。在一些實施方案中，使用在具有vf染色的皮層神經(jīng)元的tc回路中的場記錄來確認epsp，并且之后立即在用場電極刺激丘腦神經(jīng)元時通過vf熒光來測量皮層池中的電誘發(fā)突觸后響應。epsp的熒光測量的特征在于動力學分析和谷氨酸能突觸藥理學。最終，在用場刺激和記錄確認之后不久，用chr2刺激丘腦神經(jīng)元，同時用vf測量皮層epsp。根據(jù)被確定用于回路制備的技術，在水凝膠中病毒chr2的感染可能會造成問題，這是因為感染效率會降低或凝膠中殘留的病毒會引起皮層神經(jīng)元的不期望的感染。病毒感染是優(yōu)選的，這是因為它預期產生最高的效率，但是在其它實施方案中，也可以使用化學轉染和電穿孔方法。必要時，可以將丘腦細胞常規(guī)地接種以進行感染，充分洗滌，然后解離并且懸浮在puramatrix中。如果不可能平衡為將整個tc回路可視化所需的低放大倍率與為以高速分辨vf熒光所需的snr，那么使用替代設備配置，包括具有低放大倍率和高數(shù)值孔徑的專門的物鏡以及具有更高的速度和靈敏度的照相機(ccd或pmt)。或者，在其它實施方案中，使用獨立于顯微鏡光路的用于chr2刺激的光的光纖應用。實施例7：培養(yǎng)系統(tǒng)的高通量形式(假想)本發(fā)明的一個實施方案將是用于如圖30中所描繪的多孔形式。在一個實施方案中，將配置熒光顯微鏡和電生理學裝備。配置落射熒光顯微鏡和記錄平臺，包括具有數(shù)字干涉相襯(“dic”)和熒光光學器件的固定臺立式顯微鏡以及分別用于放置刺激電極和記錄電極的粗微型操縱器和細微型操縱器。將場電位和全細胞放大器補充以數(shù)字刺激能力以允許進行基于電極的微電極分析，從而用于所需要的對光學激活和記錄的確認。此外，顯微鏡裝備有dlp自適應照射器(安道爾科技有限公司(andortechnology,plc.))、快速固態(tài)多譜光源(如spectraxlightenginetm，lumencor公司)、以及用于同步dlp、光源以及照相機的接口。對系統(tǒng)的控制將經(jīng)由與定制的labview界面通信的用于照射和成像的市售軟件和用于數(shù)據(jù)采集和分析的igorpro的組合來實現(xiàn)?？梢匀缟衔乃鰜碇苽湮⒐こ蘢rg構建體，并且將其在標準六孔組織培養(yǎng)板形式中培養(yǎng)和記錄。這些當前構建體的尺寸非常適合于快速篩選。在一個實施方案中，優(yōu)選的是，通過使培養(yǎng)的組織的密度達到最大來使信號一致性穩(wěn)定。通過產生簡單的單突觸回路，有可能增加靶細胞池來抵消這個問題。在照射方面，對于刺激和記錄，dlp系統(tǒng)的強度是它的適應性。軟件將創(chuàng)建在視野內對照射和記錄進行空間模式化的能力。在一個實施方案中，以24孔板形式制備構建體。在其它實施方案中，使用96孔板。在每一個階段，研究響應振幅和響應的一致性以及在控制條件下孔之間的個體變異性。在分析速度與需要被記錄的構建體數(shù)之間確定平衡以使變異性減到最低限度而足以觀察到突觸傳遞的生物相關變化。為此，在測試孔中進行受控的改動以研究確定的傳遞變化。舉例來說，通過在這些構建體中添加20μm的dnqx+50μm的apv對傳遞進行100％抑制將提供陰性對照。還進行更精細尺度的操作，例如添加環(huán)噻嗪(cyclothiazide)以去除基礎水平的ampar脫敏可以用于將這些突觸處的傳遞增強約10％-20％。對于每個操作，使用基于電極的電生理學來確認傳遞的抑制或增強的平均程度。確定我們需要光學測量的構建體數(shù)以對于每一種條件可靠地記錄這一傳遞變化％。在功能評估之后，將tc回路固定并且選擇隨機樣品進行形態(tài)學評估。將構建體的細胞核、神經(jīng)突、樹突以及突觸染色。使用共聚焦顯微鏡術定量這些形態(tài)學參數(shù)的相對密度，并且研究形態(tài)變異性與功能變異性之間的相關性，這有助于改進制備程序。這一測定的主要優(yōu)勢在于通過去除對放置微電極以記錄生物相關突觸電位的需要所帶來的在記錄方面的進步。在一些實施方案中，在制備被證明是限制因素的情況下，使用噴墨式細胞沉積的細胞印刷，這或許與投影光刻組合。如果流體處理被證明是瓶頸，那么使用機器人移液系統(tǒng)或其它自動化流體處理機。實施例8：治療劑對神經(jīng)傳遞的作用(假想)在一個實施方案中，本發(fā)明用于測試治療劑對神經(jīng)傳遞的作用。在一個實施方案中，對于慢性暴露和急性暴露這兩者，制備tc構建體。對于慢性實驗，使構建體生長直到皮層神經(jīng)元的tc軸突神經(jīng)支配的初始點為止，此時將實驗培養(yǎng)物用外源性5-ht來源單獨或結合來自我們的組的藥物之一來處理(圖16)。在實施例1和實施例2中確定了與皮層神經(jīng)元的神經(jīng)支配相關的時間點。作為對照，還包括沒有被提供外源性5-ht供應的培養(yǎng)物。使用缺乏5-ht的培養(yǎng)物與僅5-ht培養(yǎng)物之間的比較來證實在這些突觸處突觸傳遞的發(fā)展中對這種血清素能信號傳導的需要。任何所觀測到的5-ht的作用是通過用5-ht受體拮抗劑的共同施用來逆轉這些變化而確認的。將培養(yǎng)的構建體在相同條件下同時產生和維持，以使實驗變異性減到最低限度。通過比較5-ht培養(yǎng)物與缺乏5-ht(僅培養(yǎng)基)培養(yǎng)物來研究5-ht對正常突觸功能的發(fā)展的作用。實驗藥物的長期處理的持續(xù)時間是基于5-ht介導的突觸響應變化的時程和強度來確定的。在記錄階段，使用vsd染色的皮層神經(jīng)元和通道視紫紅質介導的對丘腦軸突的刺激來測量以下突觸響應參數(shù)：1)自發(fā)興奮性突觸后電位在它們的事件頻率和振幅方面的水平；2)通道視紫紅質誘發(fā)的突觸后電位的振幅和動力學以及刺激響應關系；以及3)興奮性突觸電位的藥理學。使用這些藥理學測量來驗證這些突觸處ampar/nmdar介導的突觸電流的適當進展，這在發(fā)展過程中增加。記錄每種條件的多個構建體以允許統(tǒng)計測量。5-ht增強了突觸特性的發(fā)展，包括自發(fā)活動和ampar/nmdar電流比的增加。使用已知會增強自發(fā)活動的處理作為陽性對照來確認我們使用我們的光學方法記錄這些變化的能力。舉例來說，已知會按比例放大培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中自發(fā)突觸響應的振幅和頻率這兩者的3天ttx處理。本發(fā)明測試了5-ht是否將為這些突觸處突觸傳遞的正常發(fā)展所需。然而，如果沒有慢性阻斷sert的作用，那么這將表明急性神經(jīng)傳遞與這些突觸輸入的發(fā)展空間模式化之間的有趣脫離。根據(jù)先前的研究，最初將以1.3μg/ml和5μg/ml測試氟西汀的濃度。對于每一種條件，使用在先前實施例中開發(fā)的光學激活和記錄技術來收集數(shù)據(jù)，按照先前的文獻施用藥物，并且測量相同的三個參數(shù)。通過在初始神經(jīng)支配(7-14div)之后施用藥物以及通過記錄每種實驗條件的多個構建體來使由于軸突導向(以及因此丘腦神經(jīng)元的皮層神經(jīng)支配的強度)的變化所引起的響應參數(shù)的潛在變化減到最低限度。通過將培養(yǎng)物針對軸突蛋白標志物τ免疫染色并且定量地測量每一種處理條件下皮層神經(jīng)元中染色的強度來研究軸突生長。事后實驗中的突觸染色允許我們將突觸數(shù)與這些操作相比較并且允許我們根據(jù)增加的突觸數(shù)以及增加的單個突觸強度來解釋電壓敏感性染料記錄。通過研究突觸前標志物(vglut1/2混合抗體)和psd-95染劑的共定位以鑒定突觸后結構來確定突觸。此外，在初始研究中在適當時通過電學記錄和免疫組織化學來確認數(shù)據(jù)。如果血清素快速地改變這些突觸處的突觸功能，那么響應于ssri或5-ht拮抗劑的施用，應當觀測到基線谷氨酸能傳遞的雙向相反變化。有趣的是，有證據(jù)說明ssri對突觸傳遞有快速的作用而與它們對血清素再攝取的作用無關。這些作用預期會在快得多的時間尺度期間發(fā)生。舉例來說，氟西汀可以抑制t型、n型以及l(fā)型ca2+電流、na+電流、以及k+電流。出于這個原因，研究所有這些藥物對興奮性突觸傳遞的急性作用。在這些急性實驗中，進行基線記錄10分鐘，然后添加藥物，持續(xù)10分鐘，繼而是10分鐘洗脫期。誘發(fā)刺激并且自始至終以0.1hz記錄。對于這些急性記錄，測量突觸后響應的振幅和動力學來確定這些藥物對突觸傳遞的潛在作用。在這一測定中純光學刺激和記錄的使用允許快速篩查這些藥物的急性暴露和慢性暴露這兩者的作用并且允許測試這些藥物對興奮性突觸功能的絕對敏感性和劑量依賴性作用這兩者。通過自動化例程分析編譯的數(shù)據(jù)并且結果為了解血清素調節(jié)在發(fā)展tc突觸時對谷氨酸能突觸功能的急性作用和慢性作用這兩者提供了基礎。在一些實施方案中，通過在我們的突觸測定中測量這些藥物的調節(jié)潛能并且與體內副作用的出現(xiàn)率相比較，這一測定用于針對調節(jié)血清素能功能的能力來篩選新型分子和肽，同時使諸如改變谷氨酸能突觸功能的‘脫靶’效應減到最低限度。除了大容量、高通量篩選之外，在一些實施方案中，這種系統(tǒng)還可以通過快速地研究小分子和已知藥劑對所觀測的效應的作用來用于機制工作。舉例來說，可以通過共同施用阻斷特異性細胞途徑或受體亞型的化合物來確定在ssri調節(jié)突觸功能中對不同的下游信號傳導途徑的需要。除了電壓記錄之外，還可以應用突觸前或突觸后神經(jīng)元的鈣負載來觀察末端鈣變化并且將其與遞質釋放中的功能變化相比較。此外，在一些實施方案中，可以容易地應用替代刺激范式的應用以通過測量成對脈沖比并且施加強直刺激以誘發(fā)增強來測試諸如突觸前釋放概率的參數(shù)的變化以及篩選可塑性的調節(jié)劑。在一些實施方案中，使用自動化培養(yǎng)基系統(tǒng)，如自動化移液機和/或細胞孵育箱的內置流體室允許去除藥物施用和培養(yǎng)基去除的手動操作。當前第1頁12