本文公開了組合物，包括包含減毒活重組李斯特菌(listeria)菌株的組合物的用途，所述減毒活重組李斯特菌菌株包含融合到異源性抗原的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的融合蛋白，所述異源性抗原包括腫瘤相關抗原，其中所述組合物還包含抗體或其片段或與抗體或其片段共施用。還公開了用于治療、防御腫瘤和/或誘導對腫瘤的免疫應答的組合療法，所述組合療法包括與抗體或其片段相結合使用這些包含減毒活重組李斯特菌菌株的組合物，特別是其中所述治療、防御和/或誘導免疫應答增加受試者的存活百分比。
背景技術：
：單核細胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)(lm)是導致李斯特菌溶血的革蘭氏陽性兼性細胞內病原體。一旦侵入宿主細胞，lm即可通過產生裂解血管膜的成孔蛋白李斯特菌溶血素o(llo)而逃離吞噬溶酶體，使其進入細胞質，在該處根據肌動蛋白多聚化蛋白(acta)的遷移性復制并傳播到相鄰的細胞。在細胞質中，lm分泌蛋白被蛋白酶降解，并加工為內質網中與mhci類分子相關的肽。此獨特特性使其成為非常有吸引力的癌癥疫苗載體，因為腫瘤抗原可通過mhci類分子呈遞，以活化腫瘤特異性細胞毒性t淋巴細胞(ctl)。此外，一旦被吞噬，lm即可在吞噬溶酶體隔室中加工，并且肽在mhcii類上呈遞以用于lm特異性cd4-t細胞應答的激活?；蛘?，lm可逃離吞噬體并進入胞質溶膠，在胞質溶膠中，肽聚糖被核寡聚域樣受體識別以及l(fā)mdna被dna傳感蛋白aim2識別將激活炎性級聯反應。該炎性應答和抗原向mhci和mhcii通路的有效遞送的組合使lm成為治療腫瘤、防御腫瘤和誘導對腫瘤的免疫應答的強大疫苗載體。然而，腫瘤細胞通常誘導了免疫抑制微環(huán)境，這有助于免疫細胞諸如髓源性抑制細胞(mdsc)和調節(jié)性t細胞(treg)的免疫抑制群體的形成。理解腫瘤的免疫調節(jié)的復雜性對于免疫療法的開發(fā)是重要的。各種增強抗腫瘤免疫應答和克服“免疫檢查點”的策略正在開發(fā)中。此外，組合免疫療法的施用可提供更有效和持久的應答。例如，腫瘤介導的免疫抑制的若干機理之一是腫瘤對t細胞共刺激分子的表達。這些分子在接合到其配體之后可抑制外周和腫瘤微環(huán)境中的效應淋巴細胞。目前，仍需要為可消除腫瘤生長和癌癥的腫瘤靶向方法提供有效的組合療法。本發(fā)明通過提供基于李斯特菌的疫苗與包括添加抗體或其片段的各種療法的組合而解決該需求，該組合可增強或促進記憶和效應t細胞的增殖，并激活t細胞或抗原呈遞細胞上的共刺激受體。據認為，共刺激除了因施用基于李斯特菌的疫苗而導致的抗原呈遞外可能還對產生針對特定腫瘤或癌癥的有效抗腫瘤免疫應答至關重要。靶向免疫調節(jié)療法主要關注于共刺激受體的激活，例如通過使用靶向腫瘤壞死因子受體超家族的成員的激動劑抗體，這些成員包括4-1bb、ox40和gitr(糖皮質激素誘導的tnf受體相關的)。gitr的調節(jié)已展示出在抗腫瘤和疫苗情形中的潛力。激動劑抗體的另一靶標是用于t細胞激活的共刺激信號分子。靶向共刺激信號分子可導致增強t細胞激活并促進更強效的免疫應答。共刺激還可有助于防止抑制性影響受到檢查點抑制，并增加抗原特異性t細胞增殖。遺憾的是，使用此類激動劑抗體可導致毒性問題。因此，有必要開發(fā)抗腫瘤免疫療法以確立與所考慮的基于李斯特菌的免疫治療組合物相結合的任何激動劑抗體的安全有效劑量。因此，仍然需要對與任何免疫療法激動劑抗體結合的基于李斯特菌的免疫治療組合物的施用劑量和計劃進行優(yōu)化。本發(fā)明還通過提供基于李斯特菌的疫苗與響應于腫瘤發(fā)生的激動劑抗體的組合而解決這一需求。鑒于某些疾病(包括癌癥)的復雜性，存在對治療這些疾病的組合方法的需求。如在下文的“具體實施方式”中所見，這些組合療法可改善免疫療法的總體抗腫瘤功效。技術實現要素：在一個方面，本公開涉及一種包含重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物，所述重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，所述組合物還包含抗體或其片段。在另一個方面，抗體或其片段是激動劑抗體或其片段。在另一個方面，抗體或其片段結合到抗原或其部分，所述抗原或其部分包括t細胞受體共刺激分子、抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子或tnf受體超家族的成員。在另一個方面，本公開涉及一種免疫源性組合物，所述組合物包含含有核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，所述組合物還包含抗體或其片段。在另一個方面，抗體或其片段是激動劑抗體或其片段。在另一個方面，抗體或其片段結合到抗原或其部分，所述抗原或其部分包括t細胞受體共刺激分子、抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子或tnf受體超家族的成員。在另一個相關方面，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子編碼截短llo蛋白。在另一個相關方面，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子編碼截短llo蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在一個相關方面，本發(fā)明涉及一種引起受試者中的增強的抗腫瘤t細胞應答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗tnf受體抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個相關方面，本公開涉及引起受試者中的增強的抗腫瘤t細胞應答的方法，所述方法包括使用包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短llo蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗tnf受體抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個相關方面，本公開涉及一種增加受試者中的抗原特異性t細胞的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗tnf受體抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個相關方面，本公開涉及一種增加受試者中的t細胞應答的方法，所述方法包括使用包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短llo蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗tnf受體抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個相關方面，本公開涉及一種治療受試者中的腫瘤或癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗tnf受體抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個相關方面，本方面的用于治療受試者中的腫瘤或癌癥的方法包括使用包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗tnf受體抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個相關方面，本發(fā)明涉及一種增加受試者存活的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗tnf受體抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個相關方面，本方面的用于增加受試者存活的方法包括使用包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短llo蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗tnf受體抗體或其片段的組合物的步驟。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將由于以下詳細描述的實例和附圖而變得顯而易見。但是，應當理解，該詳細描述和具體實例盡管指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但是僅僅通過例證給出，因為本發(fā)明的精神和范圍內的各種變化和修改對閱讀了該詳細描述的本領域技術人員而言將是顯而易見的。附圖說明被視為本發(fā)明的主題在說明書的結論部分特別指出并明確要求進行保護。然而，在結合附圖閱讀時，通過參考以下具體實施方式，可以最好地理解本發(fā)明(對組織和操作方法來說皆是如此)及其目的、特征和優(yōu)點，在附圖中：圖1a和1b.lm-e7和lm-llo-e7(adxs11-001)使用不同的表達系統來表達和分泌e7。通過將基因盒引入單核細胞增多性李斯特菌基因組的orfz域中來產生lm-e7(圖1a)。hly啟動子驅動hly信號序列和llo的前五個氨基酸(aa)以及隨后的hpv-16e7的表達。(圖1b)，通過以質粒pgg-55轉化prfa-菌株xfl-7來產生lm-llo-e7。pgg-55具有驅動llo-e7非溶血性融合體的表達的hly啟動子。pgg-55也含有prfa基因，以選擇xfl-7在體內對質粒的保留。圖2.lm-e7和lm-llo-e7分泌e7。使lm-gag(泳道1)、lm-e7(泳道2)、lm-llo-np(泳道3)、lm-llo-e7(泳道4)、xfl-7(泳道5)和10403s(泳道6)在luria-bertoni液體培養(yǎng)基中于37℃生長過夜。沉淀相等數目的細菌(通過600nm處吸光度od確定)，并將18ml的每種上清液進行tca沉淀。通過western印跡分析e7表達。用抗e7mab、隨后用hrp-偶聯的抗小鼠(amersham)探測該印跡，接著使用ecl檢測試劑顯影。圖3.llo-e7融合體的腫瘤免疫抑制功效。顯示了腫瘤接種后第7、第14、第21、第28和第56天小鼠中以毫米計的腫瘤大小。未暴露的小鼠：空心圓圈；lm-llo-e7：實心圓圈；lm-e7：正方形；lm-gag：空心菱形；和lm-llo-np：實心三角形。圖4.來自lm-llo-e7-免疫的小鼠的脾細胞在暴露于tc-1細胞時增殖。將c57bl/6小鼠用lm-llo-e7、lm-e7或對照rlm菌株免疫和強化。在強化后6天收獲脾細胞，并以顯示的比率與經照射的tc-1細胞一起鋪板。將細胞用3h胸苷脈沖處理并收獲。將cpm定義為(實驗cpm)-(無tc-1對照)。圖5a和5b.(圖5a)western印跡證實lm-acta-e7分泌e7。泳道1：lm-llo-e7；泳道2：lm-acta-e7.001；泳道3；lm-acta-e7-2.5.3；泳道4：lm-acta-e7-2.5.4。(圖5b)施用lm-acta-e7(矩形)、lm-e7(橢圓形)、lm-llo-e7(x)和未暴露的小鼠(未接種疫苗；實心三角形)的小鼠中的腫瘤大小。圖6a-6c.(圖6a)用于制備4種lm疫苗的質粒插入片段的示意圖。lm-llo-e7插入片段含有所有使用的李斯特菌基因。它含有hly啟動子、hly基因(其編碼蛋白llo)的前1.3kb和hpv-16e7基因。hly的該前1.3kb包括信號序列(ss)和pest區(qū)域。lm-pest-e7包括hly啟動子、信號序列以及pest和e7序列，但是不包括截短的llo基因的剩余部分。lm-δpest-e7不包括pest區(qū)域，但是含有hly啟動子、信號序列、e7和截短的llo的剩余部分。lm-e7epi僅具有hly啟動子、信號序列和e7。(圖6b)上部插圖：含有pest區(qū)域的李斯特菌構建體誘導腫瘤消退。下部插圖：在2個單獨實驗中腫瘤挑戰(zhàn)后第28天時的平均腫瘤大小。(圖6c)含有pest區(qū)域的李斯特菌構建體在脾中誘導更高百分比的e7特異性淋巴細胞。顯示了來自3個實驗的數據的平均值和se。圖7a和7b.(圖7a)在施用tc-1腫瘤細胞并隨后施用lm-e7、lm-llo-e7、lm-acta-e7或無疫苗(未暴露的)的小鼠中，脾中e7特異性的分泌ifn-γ的cd8+t細胞的誘導和浸潤腫瘤的數目。(圖7b)針對(圖7a)描述的小鼠的脾和腫瘤中e7特異性的cd8+細胞的誘導和浸潤。圖8a和8b.含有pest區(qū)域的李斯特菌構建體在腫瘤中誘導更高百分比的e7特異性淋巴細胞。(圖8a)來自1個實驗的代表性數據。(圖8b)來自所有3個實驗的數據的平均值和se。圖9.來自隊列1和2的數據，指明在實例6所展示的臨床試驗中在患者中觀察到的療效。圖10a和10b.(圖10a)在klk3整合和acta缺失后lmdd-143和lmdda-143的染色體區(qū)域的示意圖；(圖10b)klk3基因被整合進lmdd和lmdda染色體。使用klk3特異性引物對來自各構建體的染色體dna制備物進行的pcr擴增對應于klk3基因的714bp的條帶，缺乏野生型蛋白的分泌信號序列。圖11a-11d.(圖11a)padv134質粒的圖譜。(圖11b)使來自lmdda-134培養(yǎng)上清液的蛋白質沉淀，在sds-page中分離，并且通過western印跡使用抗e7單克隆抗體來檢測llo-e7蛋白?？乖磉_盒由hly啟動子、截短的llo的orf和人psa基因(klk3)組成。(圖11c)padv142質粒的圖譜。(圖11d)western印跡顯示使用抗psa和抗llo抗體的llo-psa融合蛋白的表達。圖12a和12b.(圖12a)在具有和不具有選擇壓力(d-丙氨酸)的情況下培養(yǎng)時lmdda-llo-psa的體外質粒穩(wěn)定性。首先列出菌株和培養(yǎng)條件，然后列出用于cfu測定的板。(圖12b)lmdda-llo-psa體內清除和此時間期間的潛在質粒損失的評價。靜脈內注射細菌并且在指定時間點從脾臟分離。在bhi和bhi+d-丙氨酸板上測定cfu。圖13a和13b.(圖13a)在c57bl/6小鼠中施用108個cfu之后的菌株lmdda-llo-psa的體內清除。通過在bhi/str板上鋪板來測定cfu數量。此方法的檢測限為100個cfu。(圖13b)使用10403s、lmdda-llo-psa和xfl7菌株進行的j774細胞的細胞感染測定。圖14a-14e.(圖14a)在強化劑量之后第6天時，未暴露的小鼠和lmdda-llo-psa免疫小鼠的脾細胞中的psa四聚物特異性細胞。(圖14b)使用psa肽刺激未暴露的小鼠和lmdda-llo-psa免疫小鼠的脾細胞中ifn-γ的胞內細胞因子染色5小時。使用基于半胱天冬酶的測定法(圖14c)和基于銪的測定法(圖14d)，在不同效應子/靶比率下，來自lmdda-llo-psa免疫小鼠和未暴露的小鼠的體外刺激效應t細胞對用psa肽脈沖處理的el4細胞的特異性裂解。在psa肽存在下或無肽存在下刺激24小時后獲得的未暴露的和經免疫的脾細胞中的ifnγ斑點數(圖14e)。圖15a-15c.用lmdda-142免疫引起tramp-c1-psa(tpsa)腫瘤消退。小鼠不做處理(n＝8)(圖15a)或在第7天、第14天和第21天用lmdda-142(1×108個cfu/小鼠)(n＝8)(圖15b)或lm-llo-psa(n＝8)(圖15c)腹膜內免疫。測量各個腫瘤的腫瘤大小并且值表示為以毫米為單位的平均直徑。各線表示單個小鼠。圖16a和16b.(圖16a)未處理的小鼠和用lm對照菌株或lmdda-llo-psa(lmdda-142)免疫的小鼠的脾臟和浸潤t-psa-23腫瘤中的psa-四聚物+cd8+t細胞的分析。(圖16b)未處理的小鼠和用lm對照菌株或lmdda-llo-psa的脾臟和浸潤t-psa-23腫瘤中的cd4+調節(jié)性t細胞(定義為cd25+foxp3+)的分析。圖17a和17b.(圖17a)在klk3整合和acta缺失后lmdd-143和lmdda-143的染色體區(qū)域的示意圖；(圖8b)klk3基因被整合進lmdd和lmdda染色體。使用klk3特異性引物對來自各構建體的染色體dna制備物進行的pcr擴增對應于klk3基因的760bp的條帶。圖18a-c.(圖18a)lmdd-143和lmdda-143分泌llo-psa蛋白。使來自細菌培養(yǎng)上清液的蛋白質沉淀，在sds-page中分離并且通過western印跡使用抗llo和抗psa抗體來檢測llo和llo-psa蛋白；(圖18b)lmdd-143和lmdda-143產生的llo保留溶血活性。將綿羊紅細胞與細菌培養(yǎng)上清液的連續(xù)稀釋液一起培育并且通過590nm下的吸光度測量溶血活性；(圖18c)lmdd-143和lmdda-143在巨噬細胞樣j774細胞內部生長。將j774細胞與細菌一起培育1小時，隨后用慶大霉素處理以殺死胞外細菌。通過對在指示時間點獲得的j774裂解物的連續(xù)稀釋液進行鋪板來測量胞內生長。lm10403s在這些實驗中用作對照。圖19.用lmdd-143和lmdda-143免疫小鼠誘導psa特異性免疫應答。將c57bl/6小鼠用1x108個cfu的lmdd-143、lmdda-143或lmdda-142以1周間隔免疫兩次，并且在7天后收獲脾臟。在莫能菌素(monensin)存在下用1μmpsa65-74肽刺激脾細胞5小時。針對cd8、cd3、cd62l和胞內ifn-γ對細胞進行染色并且在facscalibur細胞計數器中分析。圖20a和20b.圖中顯示了腫瘤中mdsc和treg的減少。在lm疫苗接種(lmdda-psa和lmdda-e7)后mdsc(圖20b)和treg(圖20a)的數量。圖21a-21d.圖中顯示了抑制測定數據，證實來自tpsa23腫瘤(表達psa的腫瘤)的單核mdsc在李斯特菌接種后抑制性較差。mdsc的抑制能力的這種變化不是抗原特異性，因為用psa-抗原特異性t細胞以及用非特異性刺激的t細胞觀察到相同的抑制降低。在圖21a和21b中，佛波醇-肉豆蔻酸酯-乙酸酯和離子霉素(pma/i)代表非特異性刺激。在圖21c和21d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd3+cd8+代表％效應(應答)t細胞。無mdsc組顯示出當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示不存在mdsc時受刺激的細胞的分裂。圖21a和21c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖21b和21d顯示了合并的分裂周期。圖22a-22d顯示了抑制測定數據，證實李斯特菌對脾單核mdsc無影響，且它們僅以抗原特異性方式產生抑制。在圖22a和22b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖22c和22d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd3+cd8+代表％效應(應答)t細胞。無mdsc組顯示出當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示不存在mdsc時受刺激的細胞的分裂。圖22a和22c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖22b和22d顯示了合并的分裂周期。圖23a-23d顯示了抑制測定數據，證實來自腫瘤的粒細胞mdsc在李斯特菌接種后減弱了抑制t細胞的能力。mdsc的抑制能力的這種變化不是抗原特異性，因為用psa-抗原特異性t細胞以及用非特異性刺激的t細胞觀察到相同的抑制降低。在圖23a和23b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖23c和23d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd3+cd8+代表％效應(應答)t細胞。無mdsc組顯示出當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示不存在mdsc時受刺激的細胞的分裂。圖23a和23c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖23b和23d顯示了合并的分裂百分比。圖24a-24d顯示了抑制測定數據，證實李斯特菌對脾粒細胞mdsc無影響，且它們僅以抗原特異性方式產生抑制。在圖24a和24b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖24c和24d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd3+cd8+代表％效應(應答)t細胞。無mdsc組顯示出當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示不存在mdsc時受刺激的細胞的分裂。圖24a和24c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖24b和24d顯示了合并的分裂百分比。圖25a-25d顯示了抑制測定數據，證實來自腫瘤的treg仍是抑制性的。在該腫瘤模型中，treg的抑制能力以非抗原特異性方式輕微下降。在圖25a和25b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖25c和25d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd3+cd8+代表％效應(應答)t細胞。無treg組顯示當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示treg不存在時受刺激的細胞的分裂。圖25a和25c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖25b和25d顯示了合并的分裂百分比。圖26a-26d顯示了抑制測定數據，證實脾treg仍是抑制性的。在圖26a和26b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖26c和26d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd3+cd8+代表％效應(應答)t細胞。無treg組顯示當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示treg不存在時受刺激的細胞的分裂。圖26a和26c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖26b和26d顯示了合并的分裂百分比。圖27a-27d顯示了抑制測定數據，證實常規(guī)的cd4+t細胞對細胞分裂無影響，無論它們是在小鼠的腫瘤還是脾中發(fā)現的。在圖27a和27b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖27c和27d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd3+cd8+代表％效應(應答)t細胞。無treg組顯示當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示treg不存在時受刺激的細胞的分裂。圖27c-27d顯示來自合并的百分比分裂的數據。圖28a-28d顯示了抑制測定數據，證實來自4t1腫瘤(表達her2的腫瘤)的單核mdsc在李斯特菌接種后具有減弱的抑制能力。mdsc的抑制能力的這種變化不是抗原特異性，因為用her2/neu抗原特異性t細胞以及用非特異性刺激的t細胞觀察到相同的抑制降低。在圖28a和28b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖28c和28d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd8+代表％效應(應答)t細胞。無mdsc組顯示出當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示不存在mdsc時受刺激的細胞的分裂。圖28a和28c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖28b和28d顯示了合并的分裂百分比。圖29a-29d顯示了抑制測定數據，證實對脾單核mdsc無李斯特菌特異性影響。在圖29a和29b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖29c和29d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd8+代表％效應(應答)t細胞。無mdsc組顯示出當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示不存在mdsc時受刺激的細胞的分裂。圖29a和29c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖29b和29d顯示了合并的分裂百分比。圖30a-30d顯示了抑制測定數據，證實來自4t1腫瘤(表達her2的腫瘤)的粒細胞mdsc在李斯特菌接種后具有減弱的抑制能力。mdsc的抑制能力的這種變化不是抗原特異性，因為用her2/neu抗原特異性t細胞以及用非特異性刺激的t細胞觀察到相同的抑制降低。在圖30a和30b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖30c和30d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd8+代表％效應(應答)t細胞。無mdsc組顯示出當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示不存在mdsc時受刺激的細胞的分裂。圖30a和30c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖30b和30d顯示了合并的分裂百分比。圖31a-31d顯示了抑制測定數據，證實對脾粒細胞mdsc無李斯特菌特異性影響。在圖31a和31b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖31c和31d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd8+代表％效應(應答)t細胞。無mdsc組顯示出當它們不受刺激時缺乏應答t細胞的分裂，最后一組(添加了pma/i或肽)顯示不存在mdsc時受刺激的細胞的分裂。圖31a和31c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖31b和31d顯示了合并的分裂百分比。圖32a-32d顯示了抑制測定數據，證實來自4t1腫瘤(表達her2的腫瘤)的treg在李斯特菌接種后抑制能力減弱。在圖32a和32b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖32c和32d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd8+代表％效應(應答)t細胞。這種減弱為非抗原特異性的，因為用her2/neu特異性和非特異性應答t細胞都看到treg抑制能力的變化。圖32a和32c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖32b和32d顯示了合并的分裂百分比。圖33a-33d顯示了抑制測定數據，證實對脾treg無李斯特菌特異性影響。應答t細胞都能夠分裂，無論它們是否是抗原特異性的。在圖33a和33b中，pma/i代表非特異性刺激。在圖33c和33d中，術語“肽”代表特異性抗原刺激。百分比(％)cd8+代表％效應(應答)t細胞。圖33a和33c顯示了每個組的單個細胞分裂周期。圖33b和33d顯示了合并的分裂百分比。圖34a-34d顯示了抑制測定數據，證實粒細胞mdsc的抑制能力是由于tllo的過表達，且獨立于伴侶融合抗原。左側插圖(圖34a和34c)顯示了每個組的單個細胞分裂周期。右側插圖(圖34b和34d)顯示了合并的分裂百分比。圖35a-35d顯示了抑制測定數據，也證實單核mdsc的抑制能力是由于tllo的過表達，且獨立于伴侶融合抗原。左側插圖(圖35a和35c)顯示了每個組的單個細胞分裂周期。右側插圖(圖35b和35d)顯示了合并的分裂百分比。圖36a-36d顯示了抑制測定數據，證實在lm接種后，從脾純化的粒細胞mdsc保留了它們抑制抗原特異性應答t細胞分裂的能力(圖36a和36b)。但是，在非特異性刺激以后，(以pma/離子霉素)激活的t細胞仍然能夠分裂(圖36c和36d)。左側插圖顯示了每個組的單個細胞分裂周期。右側插圖顯示了合并的分裂百分比。圖37a-37d顯示了抑制測定數據，證實在lm接種后，從脾純化的單核mdsc保留了它們抑制抗原特異性應答t細胞分裂的能力(圖37a和37b)。然而，在非特異性激活(以pma/離子霉素刺激)以后，t細胞仍然能夠分裂(圖37c和37d)。左側插圖顯示了每個組的單個細胞分裂周期。右側插圖顯示了合并的分裂百分比。圖38a-38d顯示了抑制測定數據，證實不論應答細胞是抗原特異性(圖38a和38b)還是非特異性(圖38c和38d)激活的，從任意lm處理組的腫瘤純化的treg具有稍微減弱的抑制應答t細胞分裂的能力。左側插圖顯示了每個組的單個細胞分裂周期。右側插圖顯示了合并的分裂百分比。圖39a-39d顯示了抑制測定數據，證實從脾純化的treg仍能夠抑制抗原特異性(圖39a-39b)和非特異性(圖39c和39d)活化的應答t細胞的分裂。圖40a-40d顯示了抑制測定數據，證實腫瘤tcon細胞不能抑制t細胞的分裂，無論該應答細胞是抗原特異性(圖40a和40b)還是非特異性活化的(圖40c和40d)。圖41a-41d顯示了抑制測定數據，證實腫瘤tcon細胞不能抑制t細胞的分裂，無論該應答細胞是抗原特異性(圖41a和41b)還是非特異性活化的(圖41c和41d)。圖42a-42c.(圖42a)接受基于李斯特菌的疫苗(adxs11-001，其為lm-llo-e7)與抗ox40抗體的組合的小鼠的治療計劃的示意圖，其中在整個實驗中監(jiān)測腫瘤生長和小鼠存活。(圖42b)接受基于李斯特菌的疫苗(adxs11-001，其為lm-llo-e7)與抗gitr抗體的組合的小鼠的治療計劃的示意圖，其中在整個實驗中監(jiān)測腫瘤生長和小鼠存活。對于兩者(圖42a)和(圖42b)而言，在第0天，向小鼠注射7×105個tc-1腫瘤細胞以引發(fā)腫瘤形成。疫苗接種從第10天開始。對照包括lmdda-llo和李斯特菌菌株xfl7。(圖42a)顯示在整個實驗周期中每周兩次施用抗ox40抗體。(圖42b)顯示每周兩次施用抗gitr抗體，總共三劑。(圖42c)指示十二個施用方案，包括無處理(nt)。圖43a-b.在c57bl/6小鼠的腹側上皮下(s.c.)植入tc-1腫瘤。當腫瘤體積達到約0.06cm3時，以7天為間隔經腹膜內(i.p.)給予兩劑基于lm的e7特異性腫瘤疫苗(1×108個集落形成單位/小鼠)。從疫苗開始每周兩次i.p.注射gitr(5mg/kg體重；總共四劑)和ox40(1mg/kg體重；在整個實驗中)抗體。每周測量腫瘤大小兩次。顯示了腫瘤生長(圖43a)和存活百分比(圖43b)。n＝5只/組。結果示為得自一個代表性實驗的平均值±se。實驗重復兩次。*p≥0.05、**p≥0.01、****p≥0.0001。圖44a-b.在c57bl/6小鼠的腹側上皮下(s.c.)植入tc-1腫瘤。當腫瘤體積達到約0.06cm3時，以7天為間隔經腹膜內(i.p.)給予兩劑基于lm的e7特異性腫瘤疫苗(1×108個集落形成單位/小鼠)。從疫苗開始每周兩次i.p.注射ox40(1mg/kg體重；在整個實驗中)抗體。每周測量腫瘤大小兩次。顯示了腫瘤生長(圖44a)和存活百分比(圖44b)。n＝5只/組。結果示為得自一個代表性實驗的平均值±se。實驗重復兩次。*p≥0.05、**p≥0.01、****p≥0.0001。圖45.抗gitr抗體與基于李斯特菌的疫苗的組合療法的疫苗施用研究的示意圖。圖46a和46b.圖46a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性cd4+t細胞的數量。圖46b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性treg(cd4+foxp3+)細胞的數量。圖47a和47b.圖47a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性總非treg(cd4+foxp3-)細胞的數量。圖47b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性tregfoxp3+ofcd4+細胞的百分比。圖48a和48b.圖48a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性cd8+t細胞的數量。圖48b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性e7特異性cd8+t細胞(抗原特異性)的數量。圖49a和49b.圖49a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的cd8+/treg細胞的比率。圖49b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的e7+cd8+/treg細胞的比率。圖50a、50b和50cb.圖50a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性髓源性抑制細胞(mdsc)的數量。圖50b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性cd8/mdsc的比率。圖50c展示條形圖，顯示了根據不同治療組的抗原特異性腫瘤浸潤性e7-cd8/mdsc的比率。圖51.抗ox40抗體與基于李斯特菌的疫苗的組合療法的疫苗施用研究的示意圖。圖52a和52b.圖52a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性cd4+t細胞的數量。圖52b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性treg(cd4+foxp3+)細胞的數量。圖53a和53b.圖53a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性總非treg(cd4+foxp3-)細胞的數量。圖53b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性tregfoxp3+ofcd4+細胞的百分比。圖54a和54b.圖54a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性cd8+t細胞的數量。圖54b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性e7特異性cd8+t細胞(抗原特異性)的數量。圖55a和55b.圖55a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的cd8+/treg細胞的比率。圖55b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的e7+cd8+/treg細胞的比率。圖56a、56b和56c.圖56a展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性髓源性抑制細胞(mdsc)的數量。圖56b展示條形圖，顯示了根據不同治療組的腫瘤浸潤性cd8/mdsc的比率。圖56c展示條形圖，顯示了根據不同治療組的抗原特異性腫瘤浸潤性e7-cd8/mdsc的比率。圖57a和57b.adxs31-164的構建。(圖57a)padv164的質粒圖譜，其具有在組成型李斯特菌p60啟動子控制下的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dal基因，用于補充lmdda菌株的染色體dal-dat缺失。它還含有截短的llo(1-441)與嵌合人her2/neu基因的融合體，該融合體通過直接融合3個片段her2/neu：ec1(aa40-170)、ec2(aa359-518)和ici(aa679-808)的直接融合而構建。(圖57b)通過對用抗llo抗體印跡的tca沉淀細胞培養(yǎng)上清液進行的western印跡分析檢測了lm-llo-chher2(lm-llo-138)和lmdda-llo-chher2(adxs31-164)中tllo-chher2的表達和分泌?！?04kd的差異條帶對應于tllo-chher2。檢測到內源性llo為58kd條帶。李斯特菌對照缺乏chher2表達。圖58a-58c.adxs31-164的免疫原性(圖58a)基于her2/neu李斯特菌的疫苗在免疫小鼠的脾細胞中引起的細胞毒性t細胞應答使用nt-2細胞作為刺激因子、3t3/neu細胞作為靶標進行測試。lm-對照基于在各個方面相同但表達不相關抗原(hpv16-e7)的lmdda背景。(圖58b)在體外用絲裂霉素c處理的nt-2細胞刺激24小時以后，通過elisa測定來自經免疫的fvb/n小鼠的脾細胞分泌進細胞培養(yǎng)基中的ifn-g。(圖58c)響應于與來自蛋白的不同區(qū)域的肽一起在體外溫育，來自用嵌合疫苗免疫的hla-a2轉基因小鼠的脾細胞的ifn-g分泌。重組chher2蛋白用作陽性對照，不相關肽或無肽組構成陰性對照，如圖例中所列出。使用72小時共溫育后收集的細胞培養(yǎng)上清液進行elisa分析，以測定ifn-γ分泌。每個數據點為一式三份數據的平均值+/-標準誤差。*p值<0.001。圖59.李斯特菌-chher2/neu疫苗的腫瘤預防研究使用每種重組李斯特菌-chher2或對照李斯特菌疫苗注射her2/neu轉基因小鼠六次。免疫在6周齡開始，每三周一次延續(xù)直到第21周。每周監(jiān)測腫瘤的外觀并以無腫瘤小鼠的百分比表示。*p<0.05，n＝9只每組。圖60.adxs31-164免疫對脾臟中％treg的作用。給fvb/n小鼠皮下接種1×106個nt-2細胞，并且使用每種疫苗以一周為間隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集脾臟。在分離免疫細胞后，對其進行染色，以通過抗cd3、cd4、cd25和foxp3抗體檢測treg。得自代表性實驗的treg的點圖，顯示了cd25+/foxp3+t細胞的頻率，其表示為不同治療組中總cd3+或cd3+cd4+t細胞的百分率。圖61a和61b.adxs31-164免疫對nt-2腫瘤中％腫瘤浸潤treg的作用。給fvb/n小鼠皮下接種1×106個nt-2細胞，并且使用每種疫苗以一周為間隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集腫瘤。在分離免疫細胞后，對其進行染色，以通過抗cd3、cd4、cd25和foxp3抗體檢測treg。(圖61a).來自代表性實驗的treg的點圖。(圖61b).cd25+/foxp3+t細胞的頻率，以不同治療組之間總cd3+或cd3+cd4+t細胞的百分比(左插圖)和腫瘤內cd8/treg比率(右插圖)表示。數據以2個獨立實驗獲得的平均值±sem表示。圖62a-62c.adxs31-164疫苗接種可延緩腦中乳腺癌細胞系的生長。balb/c小鼠使用adxs31-164或對照李斯特菌疫苗免疫三次。給麻醉小鼠顱內注射emt6-luc細胞(5,000個)。(圖62a)小鼠的離體成像使用xenogenx-100ccd照相機在指定的天數進行。(圖62b)像素強度以光子數/秒/cm2表面積繪圖；這以平均發(fā)光度表示。(圖62c)emt6-luc細胞、4t1-luc和nt-2細胞系的her2/neu表達通過使用抗her2/neu抗體的western印跡檢測。鼠科動物巨噬細胞樣細胞系j774.a2細胞用作陰性對照。圖63.顯示預先建立的fvb/nher2/neu,nt-2小鼠腫瘤模型的治療計劃。將領會的是，為了闡述的簡潔和清楚，顯示在圖中的要素未必是按比率繪制的。例如，為了清楚，一些要素的尺寸可以是相對其他要素而放大的。另外，在認為適合時，附圖標記可以在附圖之間重復，以指出對應的或類似的要素。具體實施方式在以下具體實施方式中，陳述了多個具體細節(jié)，以提供對本發(fā)明的透徹理解。然而，本領域的技術人員將理解可在不具有這些具體細節(jié)的情況下實施本公開。在其他情況中，為避免使本公開復雜化，未對熟知的方法、工序和組分進行詳細描述。在一個實施例中，公開了一種包含重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物，所述重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，并且其中所述組合物還包含抗體或其片段。在一個實施例中，本文公開的抗體或其片段為激動劑抗體。在另一個實施例中，抗體或其片段為抗tnf受體抗體。在另一個實施例中，抗體或其片段為激動劑抗tnf受體抗體。在另一個實施例中，本文公開了一種包含重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物，所述重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框，其中所述組合物還包含激動劑抗tnf受體抗體或其片段。在又一個實施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不編碼融合多肽。在另一個實施例中，本文公開了一種免疫源性組合物，所述組合物包含：激動劑抗體或其片段，和包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在另一個實施例中，本文公開了一種免疫源性組合物，所述組合物包含：激動劑抗tnf受體抗體或其片段，和包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不編碼融合多肽。在一個實施例中，激動劑抗體或其片段結合到包括t細胞受體共刺激分子的異源性抗原或其部分。因此，在另一個實施例中，本文公開了一種免疫源性組合物，所述組合物包含：結合t細胞受體共刺激分子的激動劑抗體或其片段，和包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包括截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在再一個實施例中，本文公開了一種免疫源性組合物，所述組合物包含：結合t細胞受體共刺激分子的激動劑抗體或其片段，和包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不編碼融合多肽。在另一個實施例中，所公開的激動劑抗體或其片段結合到包括抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子的抗原或其部分。因此，在另一個實施例中，本文公開了一種免疫源性組合物，所述組合物包含：結合抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子的激動劑抗體或其片段，和包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在另一個實施例中，該免疫源性組合物包含：結合抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子的激動劑抗體或其片段，和包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不編碼融合多肽。在另一個實施例中，激動劑抗體或其片段結合到包括腫瘤壞死因子(tnf)受體超家族的成員的抗原或其部分。因此，在另一個實施例中，本文公開了一種免疫源性組合物，所述組合物包含：結合tnf受體超家族的激動劑抗體或其片段，和包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在另一個實施例中，免疫源性組合物包含：結合tnf受體超家族的激動劑抗體或其片段，和包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，包含在李斯特菌菌株中的核酸分子不編碼融合多肽。在一個實施例中，公開了一種引起受試者中的增強的抗腫瘤t細胞應答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個實施例中，作為引起增強的抗腫瘤t細胞應答的方法的一部分而施用的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，第一開放閱讀框不編碼融合多肽。在另一個實施例中，公開了一種用于抑制受試者中腫瘤介導的免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個實施例中，作為用于抑制腫瘤介導的免疫抑制的方法的一部分而施用的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，第一開放閱讀框不編碼融合多肽。在另一個實施例中，公開了一種增加受試者脾臟和腫瘤中的效應t細胞與調節(jié)性t細胞(treg)的比率的方法，所述方法包括向所述受試者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個實施例中，作為用于增加受試者脾臟和腫瘤中的效應t細胞與調節(jié)性t細胞(treg)的比率的方法的一部分而施用的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，第一開放閱讀框不編碼融合多肽。在另一個實施例中，公開了一種用于增加受試者中的抗原特異性t細胞的方法，所述方法包括向所述受試者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個實施例中，作為用于增加受試者中的t細胞的方法的一部分而施用的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，第一開放閱讀框不編碼融合多肽。在另一個實施例中，公開了一種用于增加具有腫瘤或罹患癌癥的受試者的存活時間的方法，所述方法包括向所述受試者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個實施例中，作為用于增加具有腫瘤或罹患癌癥的受試者的存活時間的方法的一部分而施用的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，第一開放閱讀框不編碼融合多肽。在另一個實施例中，公開了一種用于治療受試者中的腫瘤或癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個實施例中，作為用于治療受試者中的腫瘤或癌癥的方法的一部分而施用的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在又一個實施例中，第一開放閱讀框不編碼融合多肽。重組李斯特菌菌株在一個實施例中，本發(fā)明的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包括融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在另一個實施例中，本發(fā)明的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在一個實施例中，所述重組李斯特菌菌株是減毒的。在另一個實施例中，截短李斯特菌o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列不融合到異源性抗原或其片段。在一個實施例中，截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白包含pest序列。在另一個實施例中，截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白包含推定的pest序列。在一個實施例中，截短acta蛋白包含含有pest的氨基酸序列。在另一個實施例中，截短acta蛋白包含推定的含pest的氨基酸序列。在一個實施例中，pest氨基酸(aa)序列包括截短llo序列。在另一個實施例中，該pest氨基酸序列為kensissmappasppaspktpiekkhadeidk(seqidno:1)。在另一個實施例中，抗原與來自李斯特菌的其他lmpestaa序列的融合也提高抗原的免疫原性。本發(fā)明的方法和組合物的n末端llo蛋白片段在另一個實施例中包含seqidno:3。在另一個實施例中，該片段包含llo信號肽。在另一個實施例中，該片段包含seqidno:4。在另一個實施例中，該片段大約由seqidno:4組成。在另一個實施例中，該片段基本上由seqidno:4組成。在另一個實施例中，該片段對應于seqidno:4。在另一個實施例中，該片段與seqidno:4同源。在另一個實施例中，該片段與seqidno:4的片段同源。用于一些實例的δllo的長度為416個aa(不包括信號序列)，因為包括含有半胱氨酸484的激活域在內的氨基末端的88個殘基被截短。本領域的技術人員將會知道，無激活域具體地講無半胱氨酸484的任何δllo均適用于本發(fā)明的方法和組合物。在另一個實施例中，異源性抗原與任何δllo(包括pestaa序列seqidno:1)的融合增強抗原的細胞介導的抗腫瘤免疫性。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。技術人員將領會的是，術語“含pest序列的肽”可涵蓋llo蛋白或其acta蛋白的pest序列肽或肽片段。pest序列肽在本領域是已知的，并在美國專利序列號7,635,479和美國專利公開序列號2014/0186387中有所描述，這兩篇專利均據此全文并入本文。在另一個實施例中，原核生物體的pest序列可根據諸如rechsteiner和roberts(tbs21:267-271,1996)針對單核細胞增多性李斯特菌所述的方法按照常規(guī)方式鑒定?；蛘撸瑏碜云渌松矬w的pest氨基酸序列也可基于這種方法來鑒定?？深A期其中存在pest氨基酸序列的其他原核生物體包括但不限于其他李斯特菌菌種。例如，單核細胞增多性李斯特菌蛋白acta包含四個這樣的序列。這些序列為kteeqpsevntgpr(seqidno:5)、kasvtdtsegdldssmqsadestpqplk(seqidno:6)、kneevnasdfpppptdeelr(seqidno:7)和rggiptseefsslnsgdftddensetteeeidr(seqidno:8)。來自鏈球菌菌種(streptococcussp.)的鏈球菌溶血素o也包含pest序列。例如，釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)鏈球菌溶血素o包含在氨基酸35-51處的pest序列kqntastettttneqpk(seqidno:9)，并且類馬鏈球菌(streptococcusequisimilis)鏈球菌溶血素o包含在氨基酸38-54處的pest樣序列kqntantettttneqpk(seqidno:10)。另外，據信，pest序列可嵌入抗原性蛋白內。因此，出于本發(fā)明的目的，當關于pest序列融合時，所謂“融合”是指抗原性蛋白既包含抗原也包含連在抗原一端或嵌入抗原內的pest氨基酸序列。在其他實施例中，pest序列或包含pest的多肽不是融合蛋白的一部分，該多肽也不包含異源性抗原。在另一個實施例中，該構建體或核酸分子從游離型或質粒載體表達，該游離型或質粒載體具有編碼含pest序列的多肽或含pest序列的肽的核酸序列。在另一個實施例中，該質粒在不存在抗生素選擇的情況下穩(wěn)定保持在重組李斯特菌菌株中。在另一個實施例中，該質粒不賦予重組李斯特菌抗生素抗性。在另一個實施例中，該片段為功能性片段。在另一個實施例中，該片段為免疫原性片段。在另一個實施例中，用于構建本發(fā)明的疫苗的llo蛋白具有以下序列：(genbank登錄號p13128；seqidno:2；核酸序列在genbank登錄號x15127中列出)。對應于該序列的前蛋白的前25個aa為信號序列，并在由細菌分泌時從llo切割。因此，在本實施例中，全長的活性llo蛋白為504個殘基長。在另一個實施例中，將以上llo片段用作并入本發(fā)明的疫苗中的llo片段的來源。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，用于本發(fā)明的組合物和方法的llo蛋白的n末端片段具有以下序列：(seqidno:3)。在另一個實施例中，該llo片段對應于本文所用的llo蛋白的約aa20-442。在另一個實施例中，llo片段具有以下序列：(seqidno:4)。在另一個實施例中，術語“n末端llo片段”、“截短llo”、“δllo”或其語法等同形式在本文可互換使用并指非溶血的llo片段。在另一個實施例中，該術語是指包含推定的pest序列的llo片段。在另一個實施例中，該llo片段因活化域的缺失或突變而成為非溶血的。在另一個實施例中，該llo片段因包含半胱氨酸484的區(qū)域的缺失或突變而成為非溶血的。在另一個實施例中，llo因膽固醇結合域(cbd)的缺失或突變而成為非溶血性的，如美國專利no.8,771,702中所述，該專利以引用方式并入本文。在另一個實施例中，該llo片段包含野生型llo蛋白的前441個aa。在另一個實施例中，該llo片段包含野生型llo的前420個aa。在另一個實施例中，該llo片段為野生型llo蛋白的非溶血形式。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-25構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-50構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-75構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-100構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-125構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-150構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-175構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-200構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-225構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-250構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-275構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-300構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-325構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-350構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-375構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-400構成。在另一個實施例中，該llo片段由大約殘基1-425構成。在另一個實施例中，llo片段包含對應于以上aa范圍之一的同源llo蛋白的殘基。殘基編號在另一個實施例中不必精確對應以上列舉的殘基編號；例如，如果該同源llo蛋白相對于本文所用的llo蛋白具有插入或缺失，則可因此而調整該殘基編號。在另一個實施例中，該llo片段為本領域已知的任何其他llo片段。在另一個實施例中，同源llo是指與本文公開的llo序列的同一性大于70％。在另一個實施例中，同源llo是指與本文公開的llo序列的同一性大于72％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于75％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于78％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于80％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于82％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于83％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于85％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于87％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于88％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于90％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于92％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于93％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于95％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于96％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于97％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于98％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性大于99％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的llo序列的同一性為100％。在一個實施例中，acta蛋白包含seqidno:11:所示的序列。對應于該序列的前蛋白的前29個aa為信號序列，并在由細菌分泌時從acta蛋白切割。在一個實施例中，acta多肽或肽包含信號序列即上述seqidno:11的aa1-29。在另一個實施例中，acta多肽或肽不包含信號序列即上述seqidno:11的aa1-29。在一個實施例中，截短acta蛋白包含acta蛋白的n末端片段。在另一個實施例中，截短的acta蛋白是acta蛋白的n末端片段。在一個實施例中，截短acta蛋白包含seqidno:12:所示的序列。在另一個實施例中，acta片段包含seqidno:12所示的序列。在另一個實施例中，截短acta蛋白包含seqidno:13:所示的序列。在另一個實施例中，acta片段為本領域已知的任何其他acta片段。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，編碼截短acta蛋白的重組核苷酸包含seqidno:14:所示的序列。在另一個實施例中，重組核苷酸具有seqidno:14所示的序列。在另一個實施例中，重組核苷酸包含任何其他的編碼acta蛋白的片段的序列。在另一個實施例中，“截短acta”或“δacta”是指包含pest域的acta片段。在另一個實施例中，該術語是指包含pest序列的acta片段。在另一個實施例中，該pest序列為源自原核生物體的另一pestaa序列。在另一個實施例中，pest序列是本領域已知的任何其他pest序列。在另一個實施例中，acta片段由acta蛋白的大約前100個aa構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-25構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-50構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-75構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-100構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-125構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-150構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-175構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-200構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-225構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-250構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-275構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-300構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-325構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-338構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-350構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-375構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-400構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-450構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-500構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-550構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-600構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-639構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-100構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-125構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-150構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-175構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-200構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-225構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-250構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-275構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-300構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-325構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-338構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-350構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-375構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-400構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-450構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-500構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-550構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基1-600構成。在另一個實施例中，該acta片段由大約殘基30-604構成。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，acta片段含有對應于以上aa范圍之一的同源acta蛋白的殘基。殘基編號在另一個實施例中不必精確對應以上列舉的殘基編號；例如，如果該同源acta蛋白相對于本文所用的acta蛋白具有插入或缺失，則可因此而調整該殘基編號。在另一個實施例中，acta片段為本領域已知的任何其他acta片段。在另一個實施例中，同源acta是指與本文公開的acta序列的同一性大于70％。在另一個實施例中，同源acta是指與本文公開的acta序列的同一性大于72％。在另一個實施例中，同源acta是指與本文公開的acta序列的同一性大于75％。在另一個實施例中，同源acta是指與本文公開的acta序列的同一性大于78％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于80％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于82％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于83％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于85％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于87％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于88％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于90％。在另一個實施例中，同源是指與seqidno:11中的一者的同一性大于92％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于93％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于95％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于96％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于97％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于98％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性大于99％。在另一個實施例中，同源是指與本文公開的acta序列的同一性為100％。技術人員將領會的是，當提及本文公開的任何核酸序列時，術語“同源性”可以指候選序列中與相應天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。在一個實施例中，通過序列比對的計算機算法、通過本領域中充分描述的方法來確定同源性。例如，核酸序列同源性的計算機算法分析可以包括使用多種可用軟件包，比如blast、domain、beauty(blastenhancedalignmentutility)、genpept和trembl軟件包。在另一個實施例中，“同源性”是指與選自本文公開的序列的序列的同一性大于68％。在另一個實施例中，“同源性”是指與選自本文公開的序列的序列的同一性大于70％。在另一個實施例中，“同源性”是指與選自本文公開的序列的序列的同一性大于72％。在另一個實施例中，該同一性大于75％。在另一個實施例中，該同一性大于78％。在另一個實施例中，該同一性大于80％。在另一個實施例中，該同一性大于82％。在另一個實施例中，該同一性大于83％。在另一個實施例中，該同一性大于85％。在另一個實施例中，該同一性大于87％。在另一個實施例中，該同一性大于88％。在另一個實施例中，該同一性大于90％。在另一個實施例中，該同一性大于92％。在另一個實施例中，該同一性大于93％。在另一個實施例中，該同一性大于95％。在另一個實施例中，該同一性大于96％。在另一個實施例中，該同一性大于97％。在另一個實施例中，該同一性大于98％。在另一個實施例中，該同一性大于99％。在另一個實施例中，該同一性為100％。在另一個實施例中，通過確定候選序列雜交來確定同源性，其方法在現有技術中有充分描述(參見例如“nucleicacidhybridization"hames,b.d.和higginss.j.編(1985)；sambrook等人,2001,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborpress,n.y.；以及ausubel等人,1989,currentprotocolsinmolecularbiology,greenpublishingassociatesandwileyinterscience,n.y)。例如，可在中等至嚴格條件下進行與編碼天然半胱天冬酶肽的dna的互補序列雜交的方法。雜交條件為例如在包含以下物質的溶液中42℃下溫育過夜：10-20％甲酰胺、5×ssc(150mmnacl，15mm檸檬酸三鈉)、50mm磷酸鈉(ph7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性的經剪切的鮭魚精dna。在一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株缺乏抗生素抗性基因。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含質粒，所述質粒包含編碼抗生素抗性基因的核酸。在一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌能夠逃離吞噬溶酶體。在一個實施例中，異源性抗原或抗原多肽與llo同框整合進李斯特菌染色體中。在另一個實施例中，整合的核酸分子與acta同框整合進acta基因座。在另一個實施例中，編碼acta的染色體核酸被編碼抗原的核酸分子替代。在一個實施例中，異源性抗原是腫瘤相關抗原。在另一個實施例中，腫瘤相關抗原是天然存在的腫瘤相關抗原。在另一個實施例中，腫瘤相關抗原是合成的腫瘤相關抗原。在又一個實施例中，腫瘤相關抗原是嵌合的腫瘤相關抗原。在一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌包含核酸分子。在另一個實施例中，本文所公開的核酸分子包含編碼重組多肽的第一開放閱讀框，該重組多肽包含異源性抗原或其片段。在另一個實施例中，該重組多肽還包含融合到異源性抗原的截短llo蛋白、截短acta蛋白或pest序列肽。在另一個實施例中，截短llo蛋白是n末端llo或其片段。在另一個實施例中，截短acta蛋白是n末端acta蛋白或其片段。在另一個實施例中，本文公開的核酸分子包含編碼重組多肽的第一開放閱讀框，所述重組多肽包含截短llo蛋白、截短acta蛋白或pest序列肽，其中所述截短llo蛋白、截短acta蛋白或pest序列肽不融合到異源性抗原。在另一個實施例中，第一開放閱讀框編碼包含n末端llo或其片段的截短llo蛋白。在另一個實施例中，第一開放閱讀框編碼包含n末端acta蛋白或其片段的截短acta蛋白。在另一個實施例中，第一開放閱讀框編碼基本上由n末端llo或其片段組成的截短llo蛋白。在另一個實施例中，第一開放閱讀框編碼基本上由n末端acta蛋白或其片段組成的截短acta蛋白。在另一個實施例中，第一開放閱讀框編碼由n末端llo或其片段組成的截短llo蛋白。在另一個實施例中，第一開放閱讀框編碼由n末端acta蛋白或其片段組成的截短acta蛋白。在一個實施例中，術語“抗原”、“抗原片段”、“抗原部分”、“異源性蛋白”、“異源性抗原”、“異源性蛋白抗原”、“蛋白抗原”、“抗原”、“抗原性多肽”或其語法等同形式在本文可互換使用并且意指在存在于受試者細胞中的mhci類和/或ii類分子上加工和呈遞從而當存在于宿主體內時或在另一個實施例中被宿主檢測到時導致產生免疫應答的如本文所述的多肽、肽或重組肽。在一個實施例中，抗原可以是宿主外源的。在另一個實施例中，抗原可以存在于宿主中，但宿主因免疫耐受而不引起對該抗原的免疫應答。在一個實施例中，本文公開的核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框。在另一個實施例中，該代謝酶補充重組李斯特菌菌株的染色體中缺乏的內源性基因。在另一個實施例中，由該第二開放閱讀框編碼的代謝酶為丙氨酸消旋酶(dal)。在另一個實施例中，由該第二開放閱讀框編碼的代謝酶為d-氨基酸轉移酶(dat)。在另一個實施例中，本文公開的李斯特菌菌株在內源性dal/dat基因中包含突變。在另一個實施例中，該李斯特菌缺乏dal/dat基因。在另一個實施例中，該dal/dat基因在李斯特菌基因組中缺失。在另一個實施例中，該dal/dat基因在李斯特菌基因組中截短。在另一個實施例中，所公開的方法和組合物的核酸分子可操作地連接至啟動子/調控序列。在另一個實施例中，所公開的方法和組合物的第一開放閱讀框可操作地連接至啟動子/調控序列。在另一個實施例中，所公開的方法和組合物的第二開放閱讀框可操作地連接至啟動子/調控序列。在另一個實施例中，每個開放閱讀框可操作地連接至啟動子/調控序列。“代謝酶”在另一個實施例中是指參與宿主細菌所需的營養(yǎng)物的合成的酶。在另一個實施例中，該術語是指宿主細菌所需的營養(yǎng)物的合成所需的酶。在另一個實施例中，該術語是指參與宿主細菌所利用的營養(yǎng)物的合成的酶。在另一個實施例中，該術語是指參與宿主細菌持續(xù)生長所需的營養(yǎng)物的合成的酶。在另一個實施例中，該酶為營養(yǎng)物的合成所需。在另一個實施例中，該重組李斯特菌為減毒的營養(yǎng)缺陷型菌株。在另一個實施例中，該重組李斯特菌是如美國專利no.8,114,414中所述的lm-llo-e7菌株，該專利以引用方式全文并入本文。在一個實施例中，該減毒的菌株為lmdal(-)dat(-)(lmdd)。在另一個實施例中，該減毒的菌株為lmdal(-)dat(-)δacta(lmdda)。lmdda基于李斯特菌菌株，該菌株因缺失毒力基因acta而為減毒的并保留了質粒，以通過補充dal基因用于期望的異源性抗原或截短的llo在體內和體外表達。在另一個實施例中，該減毒菌株為lmδacta。在另一個實施例中，該減毒菌株為lmδprfa。在另一個實施例中，該減毒菌株為lmδplcb。在另一個實施例中，該減毒菌株為lmδplca。在另一個實施例中，該菌株為任何上文提及的菌株的雙突變體或三突變體。在另一個實施例中，該菌株發(fā)揮強烈的佐劑效應，這是基于李斯特菌的疫苗的固有特性。在另一個實施例中，該菌株從egd李斯特菌骨架構建。在另一個實施例中，用于本發(fā)明的菌株為表達非溶血llo的李斯特菌菌株。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株為營養(yǎng)缺陷型突變體。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是編碼維生素合成基因的基因缺陷的。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是編碼泛酸合酶的基因缺陷的。在一個實施例中，d-丙氨酸缺陷的李斯特菌aa菌株的生成例如可以按本領域的技術人員熟知的多種方式實現，這些方式包括缺失誘變、插入誘變、以及導致生成移碼突變的誘變、導致蛋白的提前終止的突變、或影響基因表達的調控序列的突變。在另一個實施例中，誘變可使用重組dna技術或使用傳統誘變技術實現，所述傳統誘變技術使用誘變化學品或輻射，隨后選擇突變體。在另一個實施例中，由于伴隨的營養(yǎng)缺陷型表型反轉的可能性很低，缺失突變體是優(yōu)選的。在另一個實施例中，可在簡單的實驗室培養(yǎng)分析中測試根據本文提供的方案生成的d-丙氨酸突變體在不存在d-丙氨酸的情況下的生長能力。在另一個實施例中，選擇在不存在該化合物的情況下不能生長的那些突變體進行進一步研究。在另一個實施例中，除上述d-丙氨酸相關基因之外，本文所公開的涉及代謝酶合成的其他基因可用作李斯特菌誘變的靶標。在另一個實施例中，代謝酶補充重組細菌菌株的染色體其余部分中缺乏的內源性代謝基因。在另一個實施例中，內源性代謝基因在染色體中是突變的。在另一個實施例中，內源性代謝基因從染色體缺失。在另一個實施例中，該代謝酶為氨基酸代謝酶。在另一個實施例中，代謝酶催化用于重組李斯特菌菌株中的細胞壁合成的氨基酸的形成。在另一個實施例中，代謝酶為丙氨酸消旋酶。在另一個實施例中，代謝酶是d-氨基酸轉移酶。在一個實施例中，營養(yǎng)缺陷型李斯特菌菌株包含游離型表達載體，該游離型表達載體包含補充營養(yǎng)缺陷型李斯特菌菌株的營養(yǎng)缺陷體的代謝酶。在另一個實施例中，該構建體以游離型形式包含于李斯特菌菌株中。在另一個實施例中，外源抗原從重組李斯特菌菌株攜帶的載體表達。在另一個實施例中，游離型表達載體缺乏抗生素抗性標記。在一個實施例中，本文公開的方法和組合物的抗原融合到包含pest序列的多肽。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是氨基酸(aa)代謝酶缺陷的。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是d-谷氨酸合酶基因缺陷的。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是dal基因缺陷的。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是dga基因缺陷的。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是二氨基庚二酸cysk合成中涉及到的基因缺陷的。在另一個實施例中，該基因為維生素-b12非依賴性甲硫氨酸合酶。在另一個實施例中，該基因為trpa。在另一個實施例中，該基因為trpb。在另一個實施例中，該基因為trpe。在另一個實施例中，該基因為asnb。在另一個實施例中，該基因為gltd。在另一個實施例中，該基因為gltb。在另一個實施例中，該基因為leua。在另一個實施例中，該基因為argg。在另一個實施例中，該基因為thrc。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是一個或多個上文描述的基因缺陷的。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是合酶基因缺陷的。在另一個實施例中，該基因為氨基酸合成基因。在另一個實施例中，該基因為folp。在另一個實施例中，該基因為二氫尿苷合酶家族蛋白。在另一個實施例中，該基因為ispd。在另一個實施例中，該基因為ispf。在另一個實施例中，該基因為磷酸烯醇丙酮酸合酶。在另一個實施例中，該基因為hisf。在另一個實施例中，該基因為hish。在另一個實施例中，該基因為flii。在另一個實施例中，該基因為核糖體大亞基假尿苷合酶。在另一個實施例中，該基因為ispd。在另一個實施例中，該基因為雙功能gmp合酶/谷氨酰胺氨基轉移酶蛋白。在另一個實施例中，該基因為cobs。在另一個實施例中，該基因為cobb。在另一個實施例中，該基因為cbid。在另一個實施例中，該基因為尿卟啉-iiic-甲基轉移酶/尿卟啉原-iii合酶。在另一個實施例中，該基因為cobq。在另一個實施例中，該基因為upps。在另一個實施例中，該基因為trub。在另一個實施例中，該基因為dxs。在另一個實施例中，該基因為mvas。在另一個實施例中，該基因為dapa。在另一個實施例中，該基因為ispg。在另一個實施例中，該基因為folc。在另一個實施例中，該基因為檸檬酸合酶。在另一個實施例中，該基因為argj。在另一個實施例中，該基因為3-脫氧-d-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶。在另一個實施例中，該基因為吲哚-3-甘油-磷酸合酶。在另一個實施例中，該基因為鄰氨基苯甲酸合酶/谷氨酰胺氨基轉移酶組分。在另一個實施例中，該基因為menb。在另一個實施例中，該基因為甲基萘醌特異的異分支酸合酶。在另一個實施例中，該基因為磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶i或ii。在另一個實施例中，該基因為磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶。在另一個實施例中，該基因為carb。在另一個實施例中，該基因為cara。在另一個實施例中，該基因為thya。在另一個實施例中，該基因為mgsa。在另一個實施例中，該基因為arob。在另一個實施例中，該基因為hepb。在另一個實施例中，該基因為rlub。在另一個實施例中，該基因為ilvb。在另一個實施例中，該基因為ilvn。在另一個實施例中，該基因為alss。在另一個實施例中，該基因為fabf。在另一個實施例中，該基因為fabh。在另一個實施例中，該基因為假尿苷合酶。在另一個實施例中，該基因為pyrg。在另一個實施例中，該基因為trua。在另一個實施例中，該基因為pabb。在另一個實施例中，該基因為atp合酶基因(例如，atpc、atpd-2、aptg、atpa-2等)。在另一個實施例中，該基因為phop。在另一個實施例中，該基因為aroa。在另一個實施例中，該基因為aroc。在另一個實施例中，該基因為arod。在另一個實施例中，該基因為plcb。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是肽轉運蛋白缺陷的。在另一個實施例中，該基因為abc轉運蛋白/atp結合/通透酶蛋白。在另一個實施例中，該基因為寡肽abc轉運蛋白/寡肽結合蛋白。在另一個實施例中，該基因為寡肽abc轉運蛋白/通透酶蛋白。在另一個實施例中，該基因為鋅abc轉運蛋白/鋅結合蛋白。在另一個實施例中，該基因為糖abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為磷酸轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為zip鋅轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為emrb/qaca家族的耐藥轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為硫酸轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為質子依賴性寡肽轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為鎂轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為甲酸/硝酸轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為亞精胺/腐胺abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為na/pi-協同轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為磷酸糖轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為谷氨酰胺abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為主要協助家族轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為甘氨酸甜菜堿/l-脯氨酸abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為鉬abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為磷壁酸abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為鈷abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為銨轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為氨基酸abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為細胞分裂abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為錳abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為鐵化合物abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為麥芽糖/麥芽糖糊精abc轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為bcr/cfla家族的耐藥轉運蛋白。在另一個實施例中，該基因為上述蛋白之一的亞基。在一個實施例中，本文公開了核酸分子，該核酸分子用于轉化李斯特菌以便獲得重組李斯特菌。在另一個實施例中，本文公開的用于轉化李斯特菌的核酸缺乏毒力基因。在另一個實施例中，該核酸分子整合進李斯特菌基因組并攜帶非功能性毒力基因。在另一個實施例中，該毒力基因在該重組李斯特菌中是突變的。在又一個實施例中，該核酸分子用于使李斯特菌基因組中存在的內源性基因失活。在又另一個實施例中，該毒力基因為acta基因、inla基因和inlb基因、inlc基因、inlj基因、plbc基因、bsh基因或prfa基因。技術人員應當理解，該毒力基因可為本領域已知的任何與重組李斯特菌的毒力相關的基因。在一個實施例中，李斯特菌菌株包含一個或多個內源性基因中的突變。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是dal突變體、dat突變體、inla突變體、inlb突變體、inlc突變體、inlj突變體、prfa突變體、acta突變體、dal/dat突變體、prfa突變體、plcb缺失突變體，或plca和plcb、或acta和inlb、或dal和dat雙突變體，或dal/dat和acta三突變體。在另一個實施例中，本文公開的李斯特菌在這些基因的任一個中或在這些基因的組合中包含突變。在另一個實施例中，本文公開的李斯特菌缺乏這些基因中的每一個。在另一個實施例中，本文公開的李斯特菌缺乏至少一個且最多十個本文公開的任何基因，包括acta、prfa和dal/dat基因。在另一個實施例中，包含dal和dat突變的李斯特菌菌株通過代謝酶補充，所述代謝酶由在存在于李斯特菌菌株質粒中的核酸序列中的第二開放閱讀框編碼。在另一個實施例中，包含prfa突變的李斯特菌菌株由包含d133v氨基酸突變的突變體prfa蛋白補充。在另一個實施例中，突變體d133vprfa蛋白由在存在于李斯特菌菌株質粒中的核酸序列中的第二開放閱讀框編碼。在一個實施例中，減毒活李斯特菌為重組李斯特菌。在另一個實施例中，該重組李斯特菌在基因組內化素c(inlc)基因中包含突變。在另一個實施例中，該重組李斯特菌在基因組acta基因和基因組內化素c基因中包含突變。在一個實施例中，李斯特菌向鄰近細胞的遷移通過參與該過程的acta基因和/或inlc基因的缺失而被抑制，由此產生出乎意料的高水平減毒，具有增加的免疫原性，并用作疫苗的骨架。在一個實施例中，代謝基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色體中缺乏的。在另一個實施例中，代謝基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色體以及任何游離型遺傳元件中缺乏的。在另一個實施例中，代謝基因、毒力基因等是毒力菌株的染色體中缺乏的。在另一個實施例中，毒力基因在染色體中是突變的。在另一個實施例中，毒力基因從染色體缺失。在一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株為減毒的。在另一個實施例中，重組李斯特菌缺乏acta毒力基因。在另一個實施例中，重組李斯特菌缺乏prfa毒力基因。在另一個實施例中，重組李斯特菌缺乏inlb基因。在另一個實施例中，重組李斯特菌同時缺乏acta和inlb基因。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含內源性acta基因的失活突變。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含內源性inlb基因的失活突變。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含內源性inlc基因的失活突變。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含內源性acta和inlb基因的失活突變。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含內源性acta和inlc基因的失活突變。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含內源性acta、inlb和inlc基因的失活突變。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含內源性acta、inlb和inlc基因的失活突變。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含內源性acta、inlb和inlc基因的失活突變。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含以下基因中任何單個基因或組合中的失活突變：acta、dal、dat、inlb、inlc、prfa、plca、plcb。技術人員將領會的是，術語“突變”及其語法等同形式包括對序列(核酸或氨基酸序列)的任何類型的突變或修飾，并包括缺失、截短、失活、破壞或易位。這些類型的突變是本領域眾所周知的。在一個實施例中，為了選擇包含編碼代謝酶或補充本文公開的基因的質粒的營養(yǎng)缺陷型細菌，諸如營養(yǎng)缺陷型李斯特菌，使轉化的營養(yǎng)缺陷型細菌在將會選擇氨基酸代謝基因或補充基因的表達的培養(yǎng)基上生長。在另一個實施例中，用包含用于d-谷氨酸合成的基因的質粒轉化d-谷氨酸合成缺陷型細菌，并且該營養(yǎng)缺陷型細菌將在不存在d-谷氨酸的情況下生長，而未被該質粒轉化或者不表達編碼用于d-谷氨酸合成的蛋白的質粒的營養(yǎng)缺陷型細菌將不會生長。在另一個實施例中，如果本發(fā)明的質粒包含編碼用于d-丙氨酸合成的氨基酸代謝酶的分離的核酸，d-丙氨酸合成營養(yǎng)缺陷型的細菌當被轉化且表達所述質粒時，將在不存在d-丙氨酸的情況下生長。這樣的用于制備適當的培養(yǎng)基(其包含或缺少必需生長因子、補充劑、氨基酸、維生素、抗生素等)的方法是本領域熟知的，且可商購獲得(becton-dickinson,franklinlakes,nj)。在另一個實施例中，一旦在適當培養(yǎng)基上選擇了包含補充性質粒的營養(yǎng)缺陷型細菌，細菌即可在存在選擇壓力的情況下繁殖。這樣的繁殖包括使細菌在無營養(yǎng)缺陷因子的培養(yǎng)基中生長。表達氨基酸代謝酶的質粒在營養(yǎng)缺陷型細菌中的存在將確保，該質粒將與該細菌一起復制，從而連續(xù)地選擇攜帶該質粒的細菌。技術人員在獲知本文的公開內容和方法后將能夠容易地通過調整培養(yǎng)基(包含質粒的營養(yǎng)缺陷型細菌在其中生長)的體積來放大重組李斯特菌菌株的生產。技術人員將領會的是，在另一個實施例中，其他營養(yǎng)缺陷型菌株和互補系統適合與本公開一起使用。在一個實施例中，n末端llo蛋白片段和異源性抗原直接互相融合。在另一個實施例中，編碼n末端llo蛋白片段和異源性抗原的基因直接互相融合。在另一個實施例中，n末端llo蛋白片段和異源性抗原通過接頭肽可操作地連接。在另一個實施例中，n末端llo蛋白片段和異源性抗原通過異源性肽連接。在另一個實施例中，n末端llo蛋白片段是異源性抗原的n末端。在另一個實施例中，n末端llo蛋白片段單獨即以非融合形式表達和使用。在另一個實施例中，n末端llo蛋白片段是融合蛋白的最n末端部分。在另一個實施例中，截短llo在c末端截短以得到n末端llo。在另一個實施例中，截短llo是非溶血llo。如本文所公開，粒細胞mdsc的抑制能力存在意外變化，這是由于獨立于伴侶融合抗原(參見實例19)的tllo的過表達所致。在一個實施例中，n末端acta蛋白片段和異源性抗原直接互相融合。在另一個實施例中，編碼n末端acta蛋白片段和異源性抗原的基因直接互相融合。在另一個實施例中，n末端acta蛋白片段和異源性抗原通過接頭肽可操作地連接。在另一個實施例中，n末端acta蛋白片段和異源性抗原通過異源性肽連接。在另一個實施例中，n末端acta蛋白片段是異源性抗原的n末端。在另一個實施例中，n末端acta蛋白片段單獨即以非融合形式表達和使用。在另一個實施例中，n末端acta蛋白片段是融合蛋白的最n末端部分。在另一個實施例中，截短acta在c末端截短的以得到n末端acta。在另一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株表達重組多肽。在另一個實施例中，該重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽的質粒。在另一個實施例中，本文公開的重組核酸在本文公開的重組李斯特菌菌株的質粒中。在另一個實施例中，該質粒是不整合進重組李斯特菌菌株染色體中的游離型質粒。在另一個實施例中，該質粒是整合進李斯特菌菌株染色體中的整合型質粒。在另一個實施例中，該質粒為多拷貝質粒。在一個實施例中，本文所公開的組合物和方法的重組李斯特菌菌株表達異源抗原性多肽，所述異源抗原性多肽被腫瘤細胞表達。在一個實施例中，腫瘤相關抗原為前列腺特異性抗原(psa)。在另一個實施例中，腫瘤相關抗原為人乳頭瘤病毒(hpv)抗原。在又一個實施例中，腫瘤相關抗原為美國專利公開no.us2011/014279中描述的her2/neu嵌合抗原，這些文獻全文以引用方式并入本文。在又一個實施例中，腫瘤相關抗原是血管新生抗原。在一個實施例中，本文公開的組合物和方法的重組李斯特菌菌株包含編碼前列腺特異性抗原(psa)的第一或第二核酸分子，在一個實施例中，該核酸分子是前列腺腫瘤高度表達的前列腺癌標記物。在一個實施例中，psa是前列腺上皮細胞分泌的激肽釋放酶絲氨酸蛋白酶(klk3)，在一個實施例中，它被廣泛用作前列腺癌的標記物。如本文所用，術語psa和klk3可互換使用，均具有相同的含義和特性。在一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含編碼腫瘤相關抗原的核酸分子。在一個實施例中，腫瘤相關抗原包含klk3多肽或其片段。在一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含編碼klk3蛋白的核酸分子。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:15；genbank登錄號caa32915)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:15的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:15的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:15的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:15的片段。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:16)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:16的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:16的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:16的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:16的片段。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:17；genbank登錄號aaa59995.1)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:17的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:17的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:17的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:17的片段。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子編碼：(seqidno:18；genbank登錄號x14810)。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:18的殘基401..446、1688..1847、3477..3763、3907..4043和5413..5568編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:18的同源物編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:18的變體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:18的異構體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:18的片段編碼。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:19；genbank登錄號np_001019218)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:19的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:19的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:19的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:19的片段。每種可能性代表了如本文所公開的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子編碼：(seqidno:20；genbank登錄號nm_001030047)。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:20的殘基42-758編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:20的同源物編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:20的變體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:20的異構體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:20的片段編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:21；genbank登錄號np_001025221)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:21的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:21的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白的序列包含seqidno:21。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:21的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:21的片段。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子編碼：(seqidno:22)。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:22的殘基42-758編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:22的同源物編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:22的變體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:22的異構體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:22的片段編碼。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，作為klk3肽的來源的klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:23)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:23的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:23的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:23的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:23的片段。在另一個實施例中，klk3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子編碼：(seqidno:24)。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:24的殘基42-758編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:24的同源物編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:24的變體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:24的異構體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:24的片段編碼。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:25；genbank登錄號np_001025219)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:25的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:25的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:25的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:25的片段。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子編碼：(seqidno:26；genbank登錄號nm_001030048)。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:26的殘基42-758編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:26的同源物編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:26的變體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:26的異構體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:26的片段編碼。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:27；genbank登錄號np_001639)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:27的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:27的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:27的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:27的片段。在另一個實施例中，klk3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子編碼：(seqidno:28；genbank登錄號nm_001648)。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:28的殘基42-827編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:28的同源物編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:28的變體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:28的異構體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:28的片段編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:29；genbank登錄號aax29407.1)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:29的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:29的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:29的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白的序列包含seqidno:29。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:29的片段。在另一個實施例中，klk3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子編碼：(seqidno:30；genbank登錄號bc056665)。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:30的殘基47-832編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:30的同源物編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:30的變體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:30的異構體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:30的片段編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:31；genbank登錄號aj459782)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:31的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:31的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:31的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:31的片段。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:32；genbank登錄號aj512346)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:32的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:32的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:32的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白的序列包含seqidno:32。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:32的片段。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:33；genbank登錄號aj459784)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:33的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:33的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白的序列包含seqidno:33。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:33的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:33的片段。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:34；genbank登錄號aj459783)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:34的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:34的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:34的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:34的片段。在另一個實施例中，klk3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子編碼：aagtttcccttctccc(seqidno:35；genbank登錄號x07730)。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:35的殘基67-1088編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:35的同源物編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:35的變體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:35的異構體編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由seqidno:35的片段編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:36；genbank登錄號nm_001030050)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:36的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:36的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白的序列包含seqidno:36。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:36的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:36的片段。在另一個實施例中，作為klk3肽的來源的klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:37；genbank登錄號nm_001064049)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:37的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:37的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:37的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:37的片段。在另一個實施例中，klk3蛋白具有以下序列：(seqidno:38；genbank登錄號nm_001030048)。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:38的同源物。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:38的變體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:38的異構體。在另一個實施例中，klk3蛋白是seqidno:38的片段。在另一個實施例中，klk3蛋白由以下genbank登錄號之一所示的序列編碼：bc005307、aj310938、aj310937、af335478、af335477、m27274和m26663。在另一個實施例中，klk3蛋白由以上genbank登錄號之一所示的序列編碼。在另一個實施例中，klk3蛋白由以下genbank登錄號之一所示的序列編碼：nm_001030050、nm_001030049、nm_001030048、nm_001030047、nm_001648、aj459782、aj512346或aj459784。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在一個實施例中，klk3蛋白由任何本文所述的序列的變型形式編碼，其中該序列缺乏mwvpvvfltlsvtwigaaplilsr(seqidno:39)。在另一個實施例中，klk3蛋白具有的序列包含以下genbank登錄號之一所示的序列：x13943、x13942、x13940、x13941和x13944。在另一個實施例中，klk3蛋白是本領域已知的任何其他klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3肽是本領域已知的任何其他klk3肽。在另一個實施例中，klk3肽是本領域已知的任何其他klk3肽的片段。每種類型的klk3肽代表了如本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，“klk3肽”是指全長klk3蛋白。在另一個實施例中，該術語是指klk3蛋白的片段。在另一個實施例中，該術語是指缺乏klk3信號肽的klk3蛋白的片段。在另一個實施例中，該術語是指包含除klk3信號肽之外的整個klk3序列的klk3蛋白。在另一個實施例中，“klk3信號序列”是指天然存在于klk3蛋白的任何信號序列。在另一個實施例中，本文公開的方法和組合物的klk3蛋白不含任何信號序列。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，作為用于本文公開的方法和組合物的klk3肽的來源的激肽釋放酶相關肽酶3(klk3蛋白)是psa蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是p-30抗原蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是γ-精漿蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是激肽釋放酶3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是精液瓊脂酶(semenogelase)蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是精囊素蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是本領域已知的任何其他類型的klk3蛋白。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白是剪接變體1klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是剪接變體2klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是剪接變體3klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是轉錄變體1klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是轉錄變體2klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是轉錄變體3klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是轉錄變體4klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是轉錄變體5klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是轉錄變體6klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是剪接變體rp5klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是本領域已知的任何其他剪接變體klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是本領域已知的任何其他轉錄變體klk3蛋白。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，klk3蛋白是成熟klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是前klk3蛋白。在另一個實施例中，前導序列已從本文公開的方法和組合物的成熟klk3蛋白移除。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，作為本文公開的方法和組合物的klk3肽的來源的klk3蛋白是人klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是靈長類klk3蛋白。在另一個實施例中，klk3蛋白是本領域已知的任何其他物種的klk3蛋白。在另一個實施例中，上述klk3蛋白中的一者在本領域中稱為“klk3蛋白”。在一個實施例中，包含融合到本文公開的psa蛋白的截短llo的本文公開的重組多肽由包含(seqidno:91)的序列編碼。在另一個實施例中，融合蛋白由seqidno:91的同源物編碼。在另一個實施例中，融合蛋白由seqidno:91的變體編碼。在另一個實施例中，融合蛋白由seqidno:91的異構體編碼。在一個實施例中，融合蛋白內的“ctcgag”序列表示用于將腫瘤抗原連接至質粒中的截短llo的xhoi限制性位點。在另一個實施例中，包含融合到本文公開的psa蛋白的截短llo的本文公開的重組多肽包含以下序列：(psa序列標有下劃線)(seqidno:92)。在另一個實施例中，tllo-psa融合蛋白是seqidno:92的同源物。在另一個實施例中，tllo-psa融合蛋白是seqidno:92的變體。在另一個實施例中，tllo-psa融合蛋白是seqidno:92的異構體。在另一個實施例中，tllo-psa融合蛋白是seqidno:92的片段。在一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含編碼腫瘤相關抗原的核酸分子，其中該抗原包含hpv-e7蛋白。在一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含編碼hpv-e7蛋白的核酸分子。在一個實施例中，整個e7蛋白或其片段融合到llo蛋白或其截短或肽、acta蛋白或其截短或肽或含pest樣序列肽，以生成本發(fā)明的組合物和方法的重組多肽或肽。所用的e7蛋白(作為整體或作為片段的來源)在另一個實施例中具有序列(seqidno:40)。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:40的同源物。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:40的變體。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:40的異構體。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:40的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:40的同源物的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:40的變體的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:40的異構體的片段。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，e7蛋白的序列為：mhgpkatlqdivlhlepqneipvdllcheqlsdseeendeidgvnhqhlparraepqrhtmlcmcckcearielvvessaddlrafqqlflntlsfvcpwcasqq(seqidno:41)。在另一個實施例中，該e6蛋白是seqidno:41的同源物。在另一個實施例中，該e6蛋白是seqidno:41的變體。在另一個實施例中，該e6蛋白是seqidno:41的異構體。在另一個實施例中，該e6蛋白是seqidno:41的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白是seqidno:41的同源物的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白是seqidno:41的變體的片段。在另一個實施例中，該e6蛋白是seqidno:41的異構體的片段。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，該e7蛋白具有以下genbank條目之一所示的序列：m24215、nc_004500、v01116、x62843或m14119。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的同源物。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的變體。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的異構體。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的同源物的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的變體的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白為來自以上genbank條目之一的序列的異構體的片段。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，該hpv抗原為hpv16。在另一個實施例中，該hpv為hpv-18。在另一個實施例中，該hpv選自hpv-16和hpv-18。在另一個實施例中，該hpv為hpv-31。在另一個實施例中，該hpv為hpv-35。在另一個實施例中，該hpv為hpv-39。在另一個實施例中，該hpv為hpv-45。在另一個實施例中，該hpv為hpv-51。在另一個實施例中，該hpv為hpv-52。在另一個實施例中，該hpv為hpv-58。在另一個實施例中，該hpv為高風險hpv型。在另一個實施例中，該hpv為粘膜hpv型。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，hpve6來自hpv-16。在另一個實施例中，hpve7來自hpv-16。在另一個實施例中，hpv-e6來自hpv-18。在另一個實施例中，hpv-e7來自hpv-18。在另一個實施例中，在用于治療或改善hpv相關疾病、障礙或癥狀的本發(fā)明的組合物和方法中，代替e7抗原或作為其補充，使用hpve6抗原。在另一個實施例中，代替hpv-18e6和e7或與之組合，使用hpv-16e6和e7。在這樣的實施例中，重組李斯特菌可從染色體表達hpv-16e6和e7并從質粒表達hpv-18e6和e7，或反之亦然。在另一個實施例中，hpv-16e6和e7抗原以及hpv-18e6和e7抗原從存在于本文公開的重組李斯特菌中的質粒表達。在另一個實施例中，hpv-16e6和e7抗原以及hpv-18e6和e7抗原從本文公開的重組李斯特菌的染色體表達。在另一個實施例中，hpv-16e6和e7抗原以及hpv-18e6和e7抗原在以上實施例的任何組合中表達，包括其中得自各hpv株的各e6和e7抗原從質?；蛉旧w表達的實施例。在另一個實施例中，整個e7蛋白或其片段融合到llo蛋白、acta蛋白或含pest氨基酸序列的肽以生成本文公開的重組多肽。在一個實施例中，所用的e7蛋白(作為整體或作為片段的來源)包含seqidno:93(seqidno:93)所示的序列。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:93的同源物。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:93的變體。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:93的異構體。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:93的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:93的同源物的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:93的變體的片段。在另一個實施例中，該e7蛋白是seqidno:93的異構體的片段。在另一個實施例中，融合到e7蛋白的截短llo的氨基酸序列包含以下氨基酸序列：(seqidno:94)所示的序列。在另一個實施例中，tllo-e7的融合蛋白是seqidno:94的同源物。在另一個實施例中，融合蛋白是seqidno:94的變體。在另一個實施例中，tllo-e7融合蛋白是seqidno:94的異構體。在另一個實施例中，tllo-e7融合蛋白是seqidno:94的片段。在另一個實施例中，tllo-e7融合蛋白是seqidno:94的同源物的片段。在另一個實施例中，tllo-e7融合蛋白是seqidno:94的變體的片段。在另一個實施例中，tllo-e7融合蛋白是seqidno:94的異構體的片段。在一個實施例中，本文公開的重組李斯特菌菌株包含編碼腫瘤相關抗原的核酸分子，其中腫瘤相關抗原包含her-2/neu肽。在一個實施例中，腫瘤相關抗原包含her-2/neu抗原。在一個實施例中，her-2/neu肽包含嵌合her-2/neu抗原(cher-2)。在一個實施例中，減毒的營養(yǎng)缺陷型李斯特菌菌株基于李斯特菌疫苗載體，該載體由于毒力基因acta的缺失而減毒，并且由于dal基因的互補而維持用于her2/neu的體內和體外表達的質粒。在一個實施例中，李斯特菌菌株表達和分泌融合到李斯特菌溶血素o(llo)的前441個氨基酸的嵌合her2/neu蛋白。在另一個實施例中，李斯特菌是在dal、dat和acta內源性基因中具有突變的dal/dat/acta李斯特菌。在另一個實施例中，突變是突變基因的缺失、截短或失活。在另一個實施例中，李斯特菌菌株發(fā)揮強烈的和抗原特異性的抗腫瘤應答，在轉基因動物中能夠打破對her2/neu的耐受性。在另一個實施例中，dal/dat/acta菌株是高度減毒的，并且具有比前一代李斯特菌疫苗更高的安全譜，因為它能更迅速地從免疫小鼠的脾臟清除。在另一個實施例中，李斯特菌菌株使轉基因動物中的腫瘤發(fā)病延緩期比lm-llo-chher2(該疫苗的抗生素抗性和毒性更強的形式)更長(參見美國公開no.2011/0142791，該文獻全文以引用方式并入本文)。在另一個實施例中，李斯特菌菌株使腫瘤內調節(jié)性t細胞(treg)顯著減少。在另一個實施例中，lmdda疫苗處理的腫瘤中treg頻率的下降使腫瘤內cd8/treg比率升高，暗示在lmdda疫苗免疫后可獲得更有利的腫瘤微環(huán)境。在一個實施例中，本發(fā)明提供包含融合到her-2嵌合蛋白或融合到其片段的llo蛋白的n末端片段的重組多肽。在一個實施例中，本發(fā)明提供由融合到her-2嵌合蛋白或融合到其片段的llo蛋白的n末端片段組成的重組多肽。在該實施例中，異源性抗原是her-2嵌合蛋白或其片段。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的her-2嵌合蛋白是人her-2嵌合蛋白。在另一個實施例中，her-2嵌合蛋白是小鼠her-2嵌合蛋白。在另一個實施例中，her-2嵌合蛋白是大鼠her-2嵌合蛋白。在另一個實施例中，her-2嵌合蛋白是靈長類her-2嵌合蛋白。在另一個實施例中，her-2蛋白是本領域已知的人或任何其他動物物種的her-2嵌合蛋白或它們的組合。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，her-2蛋白是稱為“her-2/neu”、“erbb2”、“v-erb-b2”、“c-erb-b2”、“neu”或“cneu”的蛋白。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，her2-neu嵌合蛋白具有her2/neu抗原的兩個胞外片段和一個胞內片段，該抗原示出癌基因的mhci類表位簇，而在另一個實施例中，嵌合蛋白具有3個h2dq和至少17個her2/neu抗原的標繪的人mhci類表位(片段ec1、ec2和ic1)(圖45)。在另一個實施例中，嵌合蛋白具有至少13個標繪的人mhci類表位(片段ec2和ic1)。在另一個實施例中，嵌合蛋白具有至少14個標繪的人mhci類表位(片段ec1和ic1)。在另一個實施例中，嵌合蛋白具有至少9個標繪的人mhci類表位(片段ec1和ic2)。在另一個實施例中，her2-neu嵌合蛋白融合到非溶血李斯特菌溶血素o(llo)。在另一個實施例中，her2-neu嵌合蛋白融合到單核細胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素o(llo)蛋白的前441個氨基酸，并且由單核細胞增多性李斯特菌減毒營養(yǎng)缺陷型菌株lmdda表達和分泌。在另一個實施例中，來自本文公開的減毒營養(yǎng)缺陷型菌株(表達嵌合her2/neu抗原/llo融合蛋白)的融合蛋白tllo-chher2的表達和分泌與體外生長8小時后tca沉淀細胞培養(yǎng)上清液中l(wèi)m-llo-chher2的表達和分泌相當(圖45b)。在一個實施例中，在未暴露的動物(animal)或不相關李斯特菌疫苗注射的小鼠中未檢測到ctl活性(圖46a)。而在另一個實施例中，本文公開的減毒營養(yǎng)缺陷型菌株能夠通過得自野生型fvb/n小鼠的脾細胞刺激ifn-γ的分泌(圖46b)。在另一個實施例中，her-2嵌合蛋白由以下seqidno:95所示的核酸序列編碼(seqidno:95)。在另一個實施例中，her-2嵌合蛋白包含以下序列：(seqidno:96)。在一個實施例中，本文公開的方法和組合物的her2嵌合蛋白或其片段不包括其信號序列。在另一個實施例中，由于信號序列的高疏水性，信號序列的省去使her2片段能夠在李斯特菌中成功表達。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的her2嵌合蛋白的片段不包括其跨膜域(tm)。在一個實施例中，由于tm的高疏水性，tm的省去使her2片段能夠在李斯特菌中成功表達。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，lmdda164包含具有編碼融合到cher2的tllo的開放閱讀框的核酸序列，其中所述核酸序列包含seqidno:97:(seqidno:97)，其中大寫字母序列編碼cher2，小寫字母序列編碼tllo，并且?guī)聞澗€的“ctcgag”序列表示用于在質粒中將腫瘤抗原連接到截短llo的xhoi限制性位點。在另一個實施例中，質粒padv168包含seqidno:97。在一個實施例中，截短llo-cher2融合體是seqidno:97的同源物。在另一個實施例中，截短llo-cher2融合體是seqidno:97的變體。在另一個實施例中，截短llo-cher2融合體是seqidno:97的異構體。在一個實施例中，包含融合到cher2的tllo的重組蛋白的氨基酸序列包含seqidno:98：(seqidno:98)。在一個實施例中，截短llo-cher2融合體是seqidno:98的同源物。在另一個實施例中，截短llo-cher2融合體是seqidno:98的變體。在另一個實施例中，截短llo-cher2融合體是seqidno:98的異構體。據報道，當基于小片段李斯特菌的疫苗或曲妥單抗(針對位于her2/neu抗原的胞外域的表位的單克隆抗體)靶向耐藥腫瘤時，致癌蛋白her2/neu中的點突變或氨基酸缺失介導了這些腫瘤細胞的治療。在一個實施例中，公開了基于嵌合her2/neu的組合物，該組合物具有her2/neu抗原的兩個胞外片段和一個胞內片段，該抗原示出癌基因的mhci類表位簇。具有3個h2dq和至少17個her2/neu抗原的標繪的人mhci類表位的該嵌合蛋白融合到單核細胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素o蛋白的前441個氨基酸，且由單核細胞增多性李斯特菌減毒菌株lmdda表達和分泌。在另一個實施例中，所關注的抗原是klk9多肽。在另一個實施例中，腫瘤相關抗原是hpv-e7。在另一個實施例中，該抗原為hpv-e6。在另一個實施例中，該抗原為her-2。在另一個實施例中，該抗原為ny-eso-1。在另一個實施例中，該抗原為端粒酶。在另一個實施例中，該抗原為scce。在另一個實施例中，抗原為wt-1。在另一個實施例中，該抗原為hiv-1gag。在另一個實施例中，抗原為蛋白酶3。在另一個實施例中，該抗原為酪氨酸酶相關蛋白2。在另一個實施例中，該抗原為psa(前列腺特異性抗原)。在另一個實施例中，該抗原選自e7、e6、her-2、ny-eso-1、端粒酶、scce、wt-1、hiv-1gag、蛋白酶3、酪氨酸酶相關蛋白2、psa(前列腺特異性抗原)。在另一個實施例中，該抗原是腫瘤相關抗原。在另一個實施例中，該抗原是感染性疾病抗原。在另一個實施例中，該腫瘤相關抗原是血管新生抗原。在另一個實施例中，該血管新生抗原在腫瘤新生血管中的激活周細胞和周細胞二者上表達，在另一個實施例中，它與體內新血管形成相關。在另一個實施例中，該血管新生抗原是hmw-maa。在另一個實施例中，該血管新生抗原是本領域已知的抗原，并且在wo2010/102140中公開，該專利以引用方式并入本文。在一個實施例中，抗原源自真菌病原體、細菌、寄生蟲、蠕蟲或病毒。在另一個實施例中，該抗原選自破傷風類毒素、來自流感病毒的血凝素分子、白喉類毒素、hivgp120、hivgag蛋白、iga蛋白酶、胰島素肽b、馬鈴薯粉痂病菌(spongosporasubterranea)抗原、弧菌抗原、沙門氏菌(salmonella)抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞體病毒抗原、流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenza)外膜蛋白、幽門螺桿菌(helicobacterpylori)脲酶、腦膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(n.gonorrhoeae)菌毛蛋白、黑素瘤相關抗原(trp-2、mage-1、mage-3、gp-100、酪氨酸酶、mart-1、hsp-70、β-hcg)、來自hpv-16、hpv-18、hpv-31、hpv-33、hpv-35或hpv-45型人乳頭瘤病毒的人乳頭瘤病毒抗原e1和e2、腫瘤抗原cea、突變或者其他形式的ras蛋白、突變或者其他形式的p53蛋白、muc1、間皮素、egfrviii或psa。在其他實施例中，該抗原與以下疾病之一相關：霍亂、白喉、嗜血桿菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、腦膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、腦灰質炎、狂犬病、風疹、破傷風、肺結核、傷寒、水痘-帶狀皰疹、百日咳、黃熱病、來自愛迪生氏病的免疫原和抗原、過敏癥、過敏反應、布魯頓綜合征、癌癥、包括實體和血源性腫瘤、濕疹、橋本氏甲狀腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征、移植排斥、例如腎、心臟、胰腺、肺、骨骼和肝臟移植物、格雷夫斯病、多內分泌自身免疫病、肝炎、顯微鏡下多動脈炎、結節(jié)性多動脈炎、天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、惡性貧血、乳糜瀉、抗體介導的腎炎、血管球性腎炎、風濕病、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、血清陰性脊椎關節(jié)病、鼻炎、sjogren綜合征、全身性硬化癥、硬化性膽管炎、韋格納氏肉芽腫、皰疹樣皮炎、牛皮癬、白癜風、多發(fā)性硬化癥、腦脊髓炎、吉蘭-巴雷綜合征、重癥肌無力、蘭伯特-伊頓綜合征、鞏膜、鞏膜外層、色素層炎、慢性粘膜皮膚念珠菌病、風疹、嬰兒短暫性低丙種球蛋白血癥、骨髓瘤、x-連鎖高igm綜合征、斯科特-奧爾德里奇綜合征、共濟失調性毛細血管擴張癥、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、自身免疫性中性粒細胞減少癥、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血、淀粉樣變性、慢性淋巴細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原以及李斯特菌病。每種抗原代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，本文所公開的異源性抗原為腫瘤相關抗原，其在一個實施例中為以下腫瘤抗原之一：mage(黑素瘤相關抗原e)蛋白，例如mage1、mage2、mage3、mage4、酪氨酸酶；突變體ras蛋白；突變體p53蛋白；p97黑素瘤抗原、與晚期癌癥相關的ras肽或p53肽；與宮頸癌相關的hpv16/18抗原、與乳腺癌相關的klh抗原、與結腸直腸癌相關的cea(癌胚抗原)、與黑素瘤相關的mart1抗原gp100或與前列腺癌相關的psa抗原。在另一個實施例中，用于本文所公開的組合物和方法的抗原為黑素瘤相關抗原，其在一個實施例中為trp-2、mage-1、mage-3、gp-100、酪氨酸酶、hsp-70、β-hcg或它們的組合。在另一個實施例中，該腫瘤相關抗原是血管新生抗原。在一個實施例中，所述抗原為美國專利申請公開us2011/0142791中描述的嵌合her2抗原，通過引用將該專利全文并入本文。在另一個實施例中，該異源性抗原是感染性疾病抗原。在一個實施例中，抗原是自體抗原或自身抗原。在另一個實施例中，該異源性抗原源自真菌病原體、細菌、寄生蟲、蠕蟲或病毒。在另一個實施例中，抗原選自破傷風類毒素、來自流感病毒的血凝素分子、白喉類毒素、hivgp120、hivgag蛋白、iga蛋白酶、胰島素肽b、馬鈴薯粉痂病菌(spongosporasubterranea)抗原、弧菌抗原、沙門氏菌(salmonella)抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞體病毒抗原、流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenza)外膜蛋白、幽門螺桿菌(helicobacterpylori)脲酶、腦膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(n.gonorrhoeae)菌毛蛋白、來自hpv-16、hpv-18、hpv-31、hpv-33、hpv-35或hpv-45型人乳頭瘤病毒的人乳頭瘤病毒抗原e1和e2、或它們的組合。在本文所公開的方法和組合物的另一個實施例中，“核酸”或“核苷酸”指一串至少兩個堿基-糖-磷酸的組合。該術語在一個實施例中包括dna和rna。在一個實施例中，“核苷酸”是指核酸聚合物的單體單元。在一個實施例中，rna可為trna(轉運rna)、snrna(小核rna)、rrna(核糖體rna)、mrna(信使rna)、反義rna、小干擾rna(sirna)、微rna(mirna)和核糖酶的形式。sirna和mirna的使用已有所描述(caudyaa等人genes&devel16:2491-96及其中引用的參考文獻)。dna可以是質粒dna、病毒dna、線性dna或染色體dna或這些分組的衍生物的形式。此外，這些形式的dna和rna可以是單鏈、雙鏈、三鏈或四鏈的。在另一個實施例中，該術語還包括可包含其他類型的主鏈但具有相同堿基的人工核酸。在一個實施例中，人工核酸是pna(肽核酸)。pna包含肽主鏈和核苷酸堿基，并且在一個實施例中能夠結合dna和rna兩種分子。在另一個實施例中，核苷酸是氧雜環(huán)丁烷修飾的。在另一個實施例中，核苷酸通過用硫代磷酸鍵代替一個或多個磷酸二酯鍵來修飾。在另一個實施例中，人工核酸包含本領域已知的天然核酸的磷酸主鏈的任何其他變體。硫代磷酸核酸和pna的使用是本領域的技術人員已知的，并且在例如neilsenpe,curropinstructbiol9:353-57和raznk等人biochembiophysrescommun.297:1075-84中有所描述。核酸的制備和使用是本領域的技術人員已知的，并且在例如molecularcloning,(2001),sambrook和russell編以及methodsinenzymology:methodsformolecularcloningineukaryoticcells(2003)purchioandg.c.fareed中有所描述。每種核酸衍生物代表了如本文所公開的獨立實施例。在一個實施例中，術語“寡核苷酸”可與術語“核酸”互換，并且可以指可包括但不限于原核序列、真核mrna、得自真核mrna的cdna、得自真核(例如哺乳動物)dna的基因組dna序列和甚至合成dna序列的分子。該術語還指包括任何已知的dna和rna堿基類似物的序列。在另一個實施例中，本文公開的構建體或核酸分子使用同源重組整合進李斯特菌染色體。用于同源重組的技術是本領域熟知的，并且例如在baloglus,boylesm等人(immuneresponsesofmicetovacciniavirusrecombinantsexpressingeitherlisteriamonocytogenespartiallisteriolysinorbrucellaabortusribosomall7/l12protein.vetmicrobiol2005,109(1-2):11-7)和jiangll,songhh等人(characterizationofamutantlisteriamonocytogenesstrainexpressinggreenfluorescentprotein.actabiochimbiophyssin(shanghai)2005,37(1):19-24)中有所描述。在另一個實施例中，如美國專利no.6,855,320所述進行同源重組。在這種情況下，通過hly啟動子控制下的e7基因的染色體整合，制備表達e7的重組lm菌株，并且包含hly信號序列以確?；虍a物的分泌，從而產生稱作lm-az/e7的重組體。在另一個實施例中，將溫敏質粒用于選擇重組體。每種技術代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，該構建體或核酸分子采用轉座子插入整合進李斯特菌染色體。用于轉座子插入的技術在本領域是熟知的，尤其是sun等人(infectionandimmunity1990,58:3770-3778)在dp-l967的構建中所描述的。在另一個實施例中，轉座子誘變具有可形成穩(wěn)定的基因組插入突變體的優(yōu)點，但缺點是外源基因在基因組中的插入位置是未知的。在另一個實施例中，使用噬菌體整合位點將該構建體或核酸分子整合進李斯特菌染色體(lauerp,chowmy等人,construction,characterization,anduseoftwolisteriamonocytogenessite-specificphageintegrationvectors.jbacteriol2002；184(15):4177-86)。在該方法的某些實施例中，使用噬菌體(例如u153或psa李斯特噬菌體)的整合酶基因和連接位點將異源基因插入對應的連接位點，該連接位點可以是基因組中的任何適當的位點(例如comk，或argtrna基因的3’末端)。在另一個實施例中，內源性原噬菌體在構建體或異源基因整合之前從所利用的連接位點解離。在另一個實施例中，這種方法產生單拷貝的整合體。在另一個實施例中，本發(fā)明還包括用于臨床應用的基于噬菌體的染色體整合系統，其中可使用必需酶(包括但不限于d-丙氨酸消旋酶)營養(yǎng)缺陷的宿主菌株，例如lmdal(-)dat(-)。在另一個實施例中，為了避免“噬菌體解離步驟”，使用基于psa的噬菌體整合系統。這在另一個實施例中需要通過抗生素持續(xù)選擇以維持整合基因。因此，在另一個實施例中，本發(fā)明使得能建立基于噬菌體的染色體整合系統，該系統不需要以抗生素選擇。作為替代，可補充營養(yǎng)缺陷型宿主菌株。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在本文所公開的方法和組合物的一個實施例中，術語“重組位點”或“位點特異性重組位點”是指核酸分子中的堿基序列，該序列可被重組酶(在一些情況下連同相關蛋白)識別，該重組酶介導位于重組位點側翼的核酸片段的交換或切除。重組酶及相關蛋白統稱為“重組蛋白”，參見例如landy,a.,(currentopinioningenetics&development)3:699-707；1993)?！笆删w表達載體”或“噬?！敝赣糜谠隗w外或體內在任何細胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)中組成型或誘導型表達如本文所公開的方法和組合物的核酸序列的目的的任何基于噬菌體的重組表達系統。噬菌體表達載體通常既可在細菌細胞中繁殖，又可在適合條件下產生噬菌體顆粒。該術語還包括線狀或環(huán)狀表達系統，并涵蓋保持游離或者整合進宿主細胞基因組的兩種基于噬菌體的表達載體。在一個實施例中，如本文所用的術語“可操作地連接”意味著將轉錄和翻譯調控核酸相對于任何編碼序列以使得引發(fā)轉錄的方式定位。一般來講，這意味著將啟動子和轉錄引發(fā)或起始序列定位在編碼區(qū)的5'。在一個實施例中，“開放閱讀框”或“orf”為生物體基因組的一部分，其含有可潛在地編碼蛋白的堿基序列。在另一個實施例中，orf的開始和結束端不等同于mrna的末端，但它們通常包含在該mrna內。在一個實施例中，orf位于基因的開始密碼子序列(起始密碼子)和結束密碼子序列(終止密碼子)之間。因此，在一個實施例中，可操作地整合進基因組中與內源多肽一起作為開放閱讀框的核酸分子為已整合進基因組中與內源多肽處于相同開放閱讀框中的核酸分子。在一個實施例中，本發(fā)明提供包含接頭序列的融合多肽。在一個實施例中，“接頭序列”是指連接兩個異源多肽或其片段或域的氨基酸序列。一般來講，如本文所用，接頭是共價連接多肽以形成融合多肽的氨基酸序列。接頭通常包含在從展示載體移除報告基因后從剩余重組信號翻譯的氨基酸，以產生包含由開放閱讀框編碼的氨基酸序列和展示蛋白的融合蛋白。如本領域技術人員將領會的是，接頭可包含另外的氨基酸，諸如甘氨酸和其他小中性氨基酸。在一個實施例中，“內源性”是指已在參考生物體內發(fā)育或起源的或因參考生物體內的成因而產生的某物。在另一個實施例中，內源性是指天然的。在另一個實施例中，“穩(wěn)定保持”是指核酸分子或質粒在不存在選擇(例如抗生素選擇)的情況下保持10代，而沒有可檢測的損失。在另一個實施例中，周期為15代。在另一個實施例中，周期為20代。在另一個實施例中，周期為25代。在另一個實施例中，周期為30代。在另一個實施例中，周期為40代。在另一個實施例中，周期為50代。在另一個實施例中，周期為60代。在另一個實施例中，周期為80代。在另一個實施例中，周期為100代。在另一個實施例中，周期為150代。在另一個實施例中，周期為200代。在另一個實施例中，周期為300代。在另一個實施例中，周期為500代。在另一個實施例中，該周期為更多代。在另一個實施例中，該核酸分子或質粒在體外(例如培養(yǎng)物中)穩(wěn)定保持。在另一個實施例中，該核酸分子或質粒在體內穩(wěn)定保持。在另一個實施例中，該核酸分子或質粒在體外和體內都穩(wěn)定保持。在另一個實施例中，本文所公開的方法和組合物的重組李斯特菌菌株包含可操作地整合進李斯特菌基因組中與內源性acta序列一起作為開放閱讀框的核酸分子。在另一個實施例中，本文所公開的方法和組合物的重組李斯特菌菌株包含游離型表達載體，所述載體包含編碼融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含融合到acta或截短的acta的抗原。在一個實施例中，抗原的表達和分泌受acta啟動子和acta信號序列的控制，并且其作為與acta的1-233號氨基酸(截短的acta或tacta)的融合體而表達。在另一個實施例中，截短的acta由野生型acta蛋白的前390個氨基酸組成，如美國專利no.7,655,238中所述，該專利以引用方式全文并入本文。在另一個實施例中，截短的acta是acta-n100或其修飾型式(稱為acta-n100*)，其中pest基序缺失，并且包含非保守的qdnkr置換，如美國專利公布no.2014/0186387中所述。在另一個實施例中，“功能性片段”是免疫原性片段，當給受試者單獨或在本文公開的疫苗組合物中施用時引起免疫應答。在另一個實施例中，功能性片段具有生物學活性，如技術人員所了解的并且如本文所進一步公開。本文所公開的方法和組合物的重組李斯特菌菌株在另一個實施例中是重組單核細胞增多性李斯特菌菌株。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是重組西爾李斯特菌(listeriaseeligeri)菌株。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是重組格雷李斯特菌(listeriagrayi)菌株。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是重組伊萬諾夫李斯特菌(listeriaivanovii)菌株。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是重組默里李斯特菌(listeriamurrayi)菌株。在另一個實施例中，李斯特菌菌株是重組威耳遜李斯特菌(listeriawelshimeri)菌株。在另一個實施例中，該李斯特菌菌株是本領域已知的任何其他李斯特菌屬菌種的重組菌株。在另一個實施例中，本文所公開的重組李斯特菌菌株已經在動物宿主中傳代。在另一個實施例中，該傳代讓該菌株作為疫苗載體的效能最佳化。在另一個實施例中，該傳代穩(wěn)定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一個實施例中，該傳代穩(wěn)定李斯特菌菌株的毒力。在另一個實施例中，該傳代增強李斯特菌菌株的免疫原性。在另一個實施例中，該傳代增強李斯特菌菌株的毒力。在另一個實施例中，該傳代除去李斯特菌菌株的不穩(wěn)定亞株。在另一個實施例中，該傳代降低李斯特菌菌株的不穩(wěn)定亞株的普遍性。在另一個實施例中，李斯特菌菌株包含編碼含抗原重組肽的基因的基因組插入。在另一個實施例中，李斯特菌菌株攜帶包含編碼含抗原重組肽的基因的質粒。在另一個實施例中，該傳代如本文所述進行。在另一個實施例中，該傳代通過本領域已知的任何其他方法進行。在另一個實施例中，本文所公開的重組李斯特菌菌株未通過動物宿主傳代。在另一個實施例中，本文公開的重組核酸可操作地連接至驅動編碼肽在李斯特菌菌株中表達的啟動子/調控序列?？捎糜隍寗踊虻慕M成型表達的啟動子/調控序列是本領域熟知的，并且包括但不限于例如李斯特菌的phlya、pacta和p60啟動子，鏈球菌(streptococcus)bac啟動子，灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)sgia啟動子以及蘇云金芽孢桿菌(b.thuringiensis)phaz啟動子。在另一個實施例中，編碼本文所公開的肽的核酸的誘導型和組織特異性表達通過將編碼該肽的核酸置于誘導型或組織特異性啟動子/調控序列的調控下實現?？捎糜诖四康牡慕M織特異性或誘導型啟動子/調控序列的例子包括但不限于mmtvltr誘導型啟動子和sv40晚期增強子/啟動子。在另一個實施例中，采用響應于誘導劑(諸如金屬、糖皮質素等等)而誘導的啟動子。因此，將領會的是，本發(fā)明包括使用任何已知或未知的并且能夠驅動與其可操作地連接的所需蛋白的表達的啟動子/調控序列。技術人員將領會的是，術語“異源性”涵蓋源自與參考物種不同的物種的核酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白。因此，例如，表達異源多肽的李斯特菌菌株在一個實施例中將表達不是該李斯特菌菌株天然的或內源性的多肽，或在另一個實施例中，通常不由該李斯特菌菌株表達的多肽，或在另一個實施例中，來自該李斯特菌菌株之外的來源的多肽。在另一個實施例中，異源性可用于描述源自同一物種內的不同生物體的某物。在另一個實施例中，異源性抗原由李斯特菌的重組菌株表達，并在哺乳動物細胞被該重組菌株感染后加工且呈遞到細胞毒性t細胞。在另一個實施例中，由李斯特菌菌種表達的異源性抗原不需要與腫瘤細胞或傳染原中對應的未修飾的抗原或蛋白精確匹配，只要其導致可識別在哺乳動物中天然表達的未修飾抗原或蛋白的t細胞應答即可。技術人員將領會的是，術語“游離型表達載體”涵蓋這樣的核酸載體，其可以為線性的或環(huán)狀的，并且其通常為雙鏈的形式且在染色體外，因為其存在于宿主細菌或細胞的細胞質中，而不是整合進細菌或細胞的基因組。在一個實施例中，游離型表達載體包含所關注的基因。在另一個實施例中，游離型載體在細菌細胞質中保持多個拷貝，從而導致所關注的基因的擴增，并在另一個實施例中，在必要時提供病毒反式作用因子。在另一個實施例中，游離型表達載體在本文可被稱為質粒。在另一個實施例中，“整合型質?！卑@樣的序列，該序列將該質粒的插入或所攜帶的所關注基因的插入靶向宿主基因組內。在另一個實施例中，插入的所關注基因不中斷，或不受到通常因整合進細胞dna中而發(fā)生的調控約束。在另一個實施例中，存在所插入的異源性基因不導致細胞自身重要區(qū)域的重排或中斷。在另一個實施例中，在穩(wěn)定的轉染程序中，使用游離型載體通常導致比使用染色體整合質粒更高的轉染效率(belt,p.b.g.m.等人(1991)efficientcdnacloningbydirectphenotypiccorrectionofamutanthumancellline(hprt2)usinganepstein-barrvirus-derivedcdnaexpressionvector.nucleicacidsres.19,4861-4866；mazda,o.等人(1997)extremelyefficientgenetransfectionintolympho-hematopoieticcelllinesbyepstein-barrvirus-basedvectors.j.immunol.methods204,143-151)。在一個實施例中，如本文所公開的方法和組合物的游離型表達載體可通過用于將dna分子遞送到細胞的多種方法中的任一種遞送到體內、離體、體外細胞。載體也可以單獨地或以增強向受試者細胞遞送的藥物組合物的形式遞送。在一個實施例中，術語“融合”是指通過共價鍵合可操作地連接。在一個實施例中，該術語包括(核酸序列或其開放閱讀框的)重組融合。在另一個實施例中，該術語包括化學偶聯。在一個實施例中，“轉化”是指將細菌細胞工程化為吸收質粒或其他異源性dna分子。在另一個實施例中，“轉化”是指將細菌細胞工程化為表達質粒的基因或其他異源性dna分子。每種可能性代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在另一個實施例中，使用接合將遺傳物質和/或質粒引入細菌中。接合的方法是本領域熟知的，并例如在nikodinovicj等人(asecondgenerationsnp-derivedescherichiacoli-streptomycesshuttleexpressionvectorthatisgenerallytransferablebyconjugation.plasmid.2006年11月；56(3):223-7)和auchtungjm等人(regulationofabacillussubtilismobilegeneticelementbyintercellularsignalingandtheglobaldnadamageresponse.procnatlacadsciusa.2005年8月30日；102(35):12554-9)中有所描述。每種方法代表了本文所公開的方法和組合物的獨立實施例。在一個實施例中，術語“減毒”是指細菌在動物中的致病能力降低。換句話講，減毒李斯特菌菌株的病原學特性與野生型李斯特菌相比已降低，雖然減毒李斯特菌能夠在培養(yǎng)中生長和維持。例如，使用減毒李斯特菌對balb/c小鼠的靜脈內接種，50％的接種動物存活所處的致死劑量(ld50)優(yōu)選地比野生型李斯特菌的ld50升高至少約10倍，更優(yōu)選地至少約100倍，更優(yōu)選地至少約1,000倍，甚至更優(yōu)選地至少約10,000倍，最優(yōu)選地至少約100,000倍。李斯特菌的減毒菌株因此是不殺死施用該菌株的動物的菌株，或是僅當施用的細菌數遠高于殺死相同動物所需的野生型非減毒細菌數時才殺死動物的菌株。減毒細菌還應被解釋為意指不能夠在一般環(huán)境中復制的細菌，因為在該環(huán)境中不存在其生長所需的營養(yǎng)物。因此，該細菌在提供了所需營養(yǎng)物的受控環(huán)境中以受限方式復制。本發(fā)明的減毒菌株因此是環(huán)境安全的，因為它們不能以不可控制的方式復制。組合物在一個實施例中，本發(fā)明的組合物是免疫原性組合物。在一個實施例中，本發(fā)明的組合物誘導強烈的干擾素-γ先天刺激，該干擾素-γ在一個實施例中具有抗血管新生性質。在一個實施例中，本文所公開的李斯特菌誘導強烈的干擾素-γ先天刺激，該干擾素-γ在一個實施例中具有抗血管新生性質(dominiecki等人,cancerimmunolimmunother.2005年5月；54(5):477-88.2004年10月6日電子版，以引用方式全文并入本文；beatty和paterson,j.immunol.2001年2月15日；166(4):2276-82，以引用方式全文并入本文)。在一個實施例中，李斯特菌的抗血管新生性質通過cd4+t細胞介導(beatty和paterson，2001)。在另一個實施例中，李斯特菌的抗血管新生性質通過cd8+t細胞介導。在另一個實施例中，因李斯特菌疫苗接種導致的ifn-γ分泌由nk細胞、nkt細胞、th1cd4+t細胞、tc1cd8+t細胞或它們的組合介導。在另一個實施例中，本文公開的組合物的施用誘導一種或多種抗血管新生蛋白或因子的生成。在一個實施例中，該抗血管新生蛋白為ifn-γ。在另一個實施例中，該抗血管新生蛋白為色素上皮衍生因子(pedf)、血管新生抑制素、內皮抑素、fms樣酪氨酸激酶(sflt)-1或可溶性內皮因子(seng)。在一個實施例中，本發(fā)明的李斯特菌參與抗血管新生因子的釋放，由此，在一個實施例中，除了作為用于將抗原引入受試者的載體之外還具有治療作用。每個李斯特菌菌株及其類型代表了本發(fā)明的獨立實施例。本文所公開的方法和組合物所誘導的免疫應答在另一個實施例中為t細胞應答。在另一個實施例中，免疫應答包括t細胞應答。在另一個實施例中，應答為cd8+t細胞應答。在另一個實施例中，該應答包括cd8+t細胞應答。每種可能性代表了如本文所公開的獨立實施例。在另一個實施例中，施用本文所公開的組合物增加抗原特異性t細胞的數量。在另一個實施例中，施用組合物激活t細胞上的共刺激受體。在另一個實施例中，施用組合物誘導記憶和/或效應t細胞的增殖。在另一個實施例中，施用組合物增加t細胞的增殖。如全文所用，術語“組合物”和“免疫原性組合物”可互換使用，均具有相同的含義和特性。在一個實施例中，用于同時或順序施用各組分的包含重組李斯特菌菌株并且還包含抗體的本文公開的免疫原性組合物也稱為“組合療法”。在另一個實施例中，用于同時或順序施用各組分的包含重組李斯特菌菌株并且還包含抗體的本文公開的免疫原性組合物也稱為“組合療法”。技術人員應當理解的是，組合療法也可以包括另外的組分、抗體、療法等。在一些實施例中，術語“藥物組合物”是指適用于藥物用途，例如給需要的受試者施用的組合物。本發(fā)明的組合物可用于本發(fā)明的方法，以便引發(fā)受試者中的增強的抗腫瘤t細胞應答，以便抑制受試者中的腫瘤介導的免疫抑制，或用于提高受試者的脾臟和腫瘤中效應t細胞與調節(jié)性t細胞(treg)的比率，或它們的任何組合。在另一個實施例中，包含本文公開的李斯特菌菌株的組合物還包含佐劑。在一個實施例中，本發(fā)明的組合物還包含佐劑。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物所用的佐劑是粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)蛋白。在另一個實施例中，該佐劑包含gm-csf蛋白。在另一個實施例中，該佐劑為編碼gm-csf的核苷酸分子。在另一個實施例中，該佐劑為包含編碼gm-csf的核苷酸分子。在另一個實施例中，該佐劑為皂苷qs21。在另一個實施例中，該佐劑包含皂苷qs21。在另一個實施例中，該佐劑為單磷酰脂質a。在另一個實施例中，該佐劑包含單磷酰脂質a。在另一個實施例中，該佐劑為sbas2。在另一個實施例中，該佐劑包含sbas2。在另一個實施例中，該佐劑為含有未甲基化的cpg的寡核苷酸。在另一個實施例中，該佐劑包含含有未甲基化的cpg的寡核苷酸。在另一個實施例中，該佐劑為免疫刺激性細胞因子。在另一個實施例中，該佐劑包含免疫刺激性細胞因子。在另一個實施例中，該佐劑為編碼免疫刺激性細胞因子的核苷酸分子。在另一個實施例中，該佐劑包含編碼免疫刺激性細胞因子的核苷酸分子。在另一個實施例中，該佐劑為或包含刺糖苷(quillglycoside)。在另一個實施例中，該佐劑為或包含細菌有絲分裂原。在另一個實施例中，該佐劑為或包含細菌毒素。在另一個實施例中，該佐劑為或包含本領域已知的任何其他佐劑。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，本文公開的免疫源性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在另一個實施例中，本文公開的免疫源性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在一個實施例中，本文公開的免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，所述組合物還包含抗體或其片段。在另一個實施例中，所述抗體或其片段包括多克隆抗體、單克隆抗體、fab片段、f(ab')2片段、fv片段、單鏈抗體或其任何組合。在另一個實施例中，本文公開的免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述重組李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，所述組合物還包含抗體或其片段。在另一個實施例中，所述抗體或其片段包括多克隆抗體、單克隆抗體、fab片段、f(ab')2片段、fv片段、單鏈抗體或其任何組合。在一些實施例中，術語“抗體”是指完整分子以及它們的功能性片段，在本文也稱為“抗原結合片段”，諸如能夠與如本文所述的所需靶標特異性相互作用，例如結合到tnf受體超家族成員或t細胞受體共刺激分子或抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子的fab、f(ab’)2和fv。在一些實施例中，該抗體片段包括：(1)fab，即包含抗體分子的單價抗原結合片段的片段，它可通過用木瓜蛋白酶消化全抗體以生成完整輕鏈和一條重鏈的一部分來制備；(2)fab’，即這樣的抗體分子的片段：其可通過用胃蛋白酶處理全抗體，然后還原，以生成完整輕鏈和重鏈的一部分來獲得；每個抗體分子獲得兩個fab’片段；(3)(fab’)2，即這樣的抗體的片段：其可通過用胃蛋白酶處理全抗體，然后不用還原來獲得；f(ab’)2是兩個fab’片段通過兩個二硫鍵保持在一起形成的二聚體；(4)fv，即包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程片段，所述輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)以兩條鏈表達；或(5)單鏈抗體(”sca”)，即包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程分子，所述輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)通過合適的多肽接頭連接為基因融合的單鏈分子。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。這些片段的制備方法是本領域已知的。(參見例如harlow和lane,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork,1988，該文獻以引用方式并入本文)。在一些實施例中，抗體片段可通過抗體的蛋白水解或通過在大腸桿菌或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵細胞培養(yǎng)物或其他蛋白表達系統)中表達編碼該片段的dna來制備。在一些實施例中，抗體片段可通過常規(guī)方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗體獲得。例如，抗體片段可通過用胃蛋白酶對抗體進行酶裂解，從而得到以f(ab’)2表示的5s片段來制備。該片段可使用硫醇還原劑，以及任選地使用從二硫鍵的裂解獲得的巰基基團的封端基團進一步裂解，以生成3.5sfab’單價片段?；蛘?，使用胃蛋白酶進行酶裂解直接生成兩個單價fab’片段和fc片段。這些方法例如由goldenberg在美國專利no.4,036,945和4,331,647以及其中包含的參考文獻中進行了描述，這些專利的全文據此以引用方式并入。另見porter,r.r.,biochem.j.,73:119-126,1959。只要片段結合到由完整抗體識別的抗原，也可使用裂解抗體的其他方法，諸如分離重鏈以形成單價輕鏈-重鏈片段，進一步裂解片段，或其他酶學、化學或基因技術。fv片段包含vh和vl鏈的締合。該締合可以是非共價的，如在inbar等人,proc.nat'lacad.sci.usa69:2659-62,1972中所述?；蛘撸勺冩溈赏ㄟ^分子間二硫鍵連接，或通過化合物諸如戊二醛交聯。優(yōu)選地，fv片段包含通過肽接頭連接的vh和vl鏈。這些單鏈抗原結合蛋白(sfv)通過構建包含dna序列的結構基因來制備，該dna序列編碼通過寡核苷酸連接的vh和vl域。該結構基因插入表達載體，隨后將該表達載體引入宿主細胞諸如大腸桿菌。重組宿主細胞合成具有橋接兩個v域的接頭肽的單條多肽鏈。sfv的制備方法例如在whitlow和filpula,methods,2:97-105,1991；bird等人,science242:423-426,1988；pack等人,bio/technology11:1271-77,1993；以及l(fā)adner等人的美國專利no.4,946,778中有所描述，這些文獻全文據此以引用方式并入?？贵w片段的另一種形式是編碼單互補決定區(qū)(cdr)的肽。cdr肽(“最小識別單位”)可通過構建編碼所關注的抗體的cdr的基因獲得。這樣的基因例如使用聚合酶鏈式反應合成產抗體細胞的rna的可變區(qū)來制備。參見例如larrick和fry,methods,2:106-10,1991。在一些實施例中，如本文所述的抗體或片段可包括抗體的“人源化形式”。在一些實施例中，術語“抗體的人源化形式”是指非人(如鼠科動物)抗體，它是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白鏈或其包含來源于非人免疫球蛋白的最小序列的片段(諸如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗體的其他抗原結合子序列)。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中形成受體的互補決定區(qū)(cdr)的殘基被具有所需特異性、親和性和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔子的cdr的殘基替代。在某些情況下，人免疫球蛋白的fv框架殘基被對應的非人殘基替代。人源化抗體還可包含既不存在于受體抗體也不存在于導入cdr或框架序列中的殘基。一般來講，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個且通常兩個可變域，其中所有或基本上所有的cdr區(qū)對應于非人免疫球蛋白的那些cdr區(qū)，并且所有或基本上所有的fr區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些fr區(qū)。最佳地，人源化抗體還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常為人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分[jones等人,nature,321:522-525(1986)；riechmann等人,nature,332:323-329(1988)；以及presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596(1992)]。人源化非人抗體的方法是本領域熟知的。一般來講，人源化抗體具有從非人來源引入的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為導入殘基，它們通常取自導入可變域。人源化基本上可按照winter及其同事的方法[jones等人,nature,321:522-525(1986)；riechmann等人,nature332:323-327(1988)；verhoeyen等人,science,239:1534-1536(1988)]，通過將嚙齒動物cdr或cdr序列替換為人抗體的對應序列來進行。因此，此類人源化抗體是嵌合抗體(美國專利no.4,816,567)，其中遠小于完整人可變域被非人物種的對應序列替代。在實施過程中，人源化抗體是通常其中一些cdr殘基以及可能地一些fr殘基被嚙齒動物抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。人抗體也可使用本領域已知的各種技術，包括噬菌體展示文庫制備[hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等人,j.mol.biol.,222:581(1991)]。cole等人和boerner等人的技術也可用于人單克隆抗體的制備[cole等人,monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,第77頁(1985)和boerner等人,j.immunol.,147(1):86-95(1991)]。相似地，人可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物如小鼠來制備，其中該內源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。在挑戰(zhàn)后，觀察人抗體的產生，該抗體在所有方面與人密切相似，包括基因重排、組裝和抗體譜。該方法例如在美國專利no.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和以下科學出版物中有所描述：marks等人,bio/technology10,779-783(1992)；lonberg等人,nature368856-859(1994)；morrison,nature368812-13(1994)；fishwild等人,naturebiotechnology14,845-51(1996)；neuberger,naturebiotechnology14,826(1996)；lonberg和huszar,intern.rev.immunol.1365-93(1995)。在一個實施例中，抗體或其功能性片段結合到抗原或其部分，所述抗原或其部分包括t細胞受體共刺激分子、抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子或tnf受體超家族的成員。在另一個實施例中，抗原或其部分包含t細胞受體共刺激分子，包括cd28、icos。在另一個實施例中，抗原或其部分包括抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子，包括cd80受體、cd86受體或cd46受體。在另一個實施例中，抗原或其部分包括tnf受體超家族成員，包括糖皮質激素誘導的tnf受體(gitr)、ox40(cd134受體)、4-1bb(cd137受體)或tnfr25。在一個實施例中，抗體或功能性片段包括t細胞受體共刺激分子結合區(qū)、抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子結合區(qū)或tnf受體超家族成員結合區(qū)。在另一個實施例中，本文公開的抗體是cd28抗體、icos抗體或針對此前未命名的共刺激受體的抗體。在另一個實施例中，抗體是cd80受體抗體、cd86受體抗體或cd46受體抗體。在另一個實施例中，抗體是tnf受體超家族成員結合性抗體，其包括糖皮質激素誘導的tnf受體(gitr)抗體、ox40(cd134受體)抗體、4-1bb(cd137受體)抗體或tnfr25抗體?？贵w的形式可以是單克隆抗體、多克隆抗體、人抗體或衍生自非人類動物物種的人源化抗體?？贵w可以是完整的或部分的，其中一條或兩條抗體鏈的可變部分是特異性的以充當共刺激受體結合位點的激動劑。在另一個實施例中，本文公開的抗體為抗ox40抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，抗體為抗gitr抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，公開了一種治療受試者中的癌癥或感染性疾病的方法，所述方法包括以下步驟：獲得效應t細胞群，用gitr激動劑處理所述細胞群，所述激動劑選自gitrl、gitrl的活性片段、包含gitrl的融合蛋白、包含gitrl的活性片段的融合蛋白、激動性小分子和激動性抗抗體。在另一個實施例中，受試者受癌癥的折磨。在另一個實施例中，公開了一種包含重組李斯特菌菌株和gitr激動劑的組合療法，所述激動劑選自gitrl、gitrl的活性片段、包含gitrl的融合蛋白、包含gitrl的活性片段的融合蛋白、激動性小分子和激動性抗抗體，其中所述組合療法用于治療具有腫瘤或癌癥的受試者。在一個實施例中，本公開提供結合到人cd134的分離的結合分子，包括抗cd134抗體和抗cd134的衍生物。在另一個實施例中，本公開提供結合到人cd134的結合分子，其中該結合分子不妨礙人cd134(ox40配體(ox40l))，并且其中所述結合分子還不阻礙人cd134表達性效應t細胞上的人ox40l的免疫刺激和/或增殖響應。在另一個實施例中，本公開提供結合到人cd134的結合分子，其中對ox40l結合到人cd134表達性t細胞上的cd134的效應降低不超過約70％、或約60％、或約50％、或約40％、或約30％、或約20％、或約10％或更低，并且其中所述結合分子增強人cd134表達性效應t細胞上的人ox40l的免疫刺激和/或增殖響應。在另一個實施例中，本公開提供結合到人cd134的結合分子，其中該結合分子不妨礙人cd134(ox40配體(ox40l))，并且其中所述結合分子增強人cd134表達性效應t細胞上的人ox40l的免疫刺激和/或增殖響應。在一個實施例中，本文所公開的疾病為癌癥或腫瘤。在一個實施例中，由本發(fā)明的方法處理的癌癥為乳腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為宮頸癌。在另一個實施例中，該癌癥為含her2的癌癥。在另一個實施例中，該癌癥為黑素瘤。在另一個實施例中，該癌癥為胰腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為卵巢癌。在另一個實施例中，該癌癥為胃癌。在另一個實施例中，該癌癥為胰腺的癌性病變。在另一個實施例中，該癌癥為肺腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為肺腺癌。在另一個實施例中，其為多形性膠質母細胞瘤。在另一個實施例中，該癌癥為結直腸腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為肺鱗癌。在另一個實施例中，該癌癥為胃腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為卵巢表面上皮腫瘤(例如其良性的、增生性的或惡性的種類)。在另一個實施例中，該癌癥為口腔鱗狀細胞癌。在另一個實施例中，該癌癥為非小細胞肺癌。在另一個實施例中，該癌癥為子宮內膜癌。在另一個實施例中，該癌癥為膀胱癌。在另一個實施例中，該癌癥為頭頸癌。在另一個實施例中，該癌癥為前列腺癌。在另一個實施例中，該癌癥為口咽癌。在另一個實施例中，該癌癥為肺癌。在另一個實施例中，該癌癥為肛門癌。在另一個實施例中，該癌癥為結腸直腸癌。在另一個實施例中，該癌癥為食道癌。在另一個實施例中，該癌癥為間皮瘤。在一個實施例中，本文公開的異源性抗原為hpv-e7。在另一個實施例中，該抗原為hpv-e6。在另一個實施例中，hpve7來自hpv株16。在另一個實施例中，hpve7來自hpv株18。在另一個實施例中，hpv-e6來自hpv株16。在另一個實施例中，hpve7來自hpv株18。在另一個實施例中，本發(fā)明也涵蓋本文公開的異源性抗原的片段。在另一個實施例中，該抗原為her-2/ne。在另一個實施例中，該抗原為ny-eso-1。在另一個實施例中，該抗原為端粒酶(tert)。在另一個實施例中，該抗原為scce。在另一個實施例中，該抗原為cea。在另一個實施例中，該抗原為lmp-1。在另一個實施例中，該抗原為p53。在另一個實施例中，該抗原為碳酸酐酶ix(caix)。在另一個實施例中，該抗原為psma。在另一個實施例中，抗原為前列腺干細胞抗原(psca)。在另一個實施例中，該抗原為hmw-maa。在另一個實施例中，抗原為wt-1。在另一個實施例中，該抗原為hiv-1gag。在另一個實施例中，抗原為蛋白酶3。在另一個實施例中，該抗原為酪氨酸酶相關蛋白2。在另一個實施例中，該抗原為psa(前列腺特異性抗原)。在另一個實施例中，該抗原選自hpv-e7、hpv-e6、her-2、ny-eso-1、端粒酶(tert)、scce、hmw-maa、egfr-iii、存活素、凋亡重復序列包含棒狀病毒抑制因子5(birc5)、wt-1、hiv-1gag、cea、lmp-1、p53、psma、psca、蛋白酶3、酪氨酸酶相關蛋白2、muc1、psa(前列腺特異性抗原)或它們的組合。在另一個實施例中，“免疫原性片段”為當向受試者單獨施用或在本文公開的疫苗組合物中施用時引起免疫應答的片段。在另一個實施例中，這樣的片段包含必要的表位，以引起體液免疫應答和/或適應性免疫應答。在一個實施例中，本文公開的組合物包含抗體或其功能性片段。在另一個實施例中，該組合物包含至少一種抗體或其功能性片段。在另一個實施例中，組合物可包含2種抗體、3種抗體、4種抗體或多于4種抗體。在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含lm菌株和抗體或其功能性片段。在另一個實施例中，本文公開的組合物包含lm菌株和至少一種抗體或其功能性片段。在另一個實施例中，本文公開的組合物包含lm菌株和2種抗體、3種抗體、4種抗體或多于4種抗體。在另一個實施例中，本文公開的組合物包含抗體或其功能性片段。存在于相同或不同組合物中的不同抗體不必具有相同的形式，例如一種抗體可以是單克隆抗體，另一種可以是fab片段。在一個實施例中，本文公開的組合物包含特異性結合gitr或其部分的抗體或其功能性片段。在另一個實施例中，本文公開的組合物包含特異性結合ox40或其部分的抗體或其功能性片段。在另一個實施例中，組合物可包含特異性結合gitr或其部分的抗體和特異性結合ox40的抗體。在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含lm菌株和特異性結合gitr的抗體或其功能性片段。在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含lm菌株和特異性結合ox40的抗體或其功能性片段。在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含lm菌株以及特異性結合gitr或其部分的抗體和特異性結合ox40或其部分的抗體。在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含特異性結合gitr的抗體或其功能性片段，其中該組合物不含本文公開李斯特菌菌株。在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含特異性結合ox40的抗體或其功能性片段，其中該組合物不含本文公開李斯特菌菌株。在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含特異性結合gitr的抗體或其功能性片段和特異性結合gitr的抗體，其中該組合物不含本文公開李斯特菌菌株。存在于相同或不同組合物中的不同抗體不必具有相同的形式，例如一種抗體可以是單克隆抗體，另一種可以是fab片段。每種可能性代表了本發(fā)明的不同實施例。術語“抗體功能性片段”是指完整抗體的能夠特異性結合抗原以導致本發(fā)明所預期的生物作用的一部分?？贵w片段的例子包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段、線性抗體、scfv抗體以及從抗體片段形成的多特異性抗體。如本文所用，“抗體重鏈”是指在所有抗體分子中以其天然存在的構象存在的兩種類型多肽鏈中的較大者。如本文所用，“抗體輕鏈”是指在所有抗體分子中以其天然存在的構象存在的兩種類型多肽鏈中的較小者，κ和λ輕鏈是指兩種主要的抗體輕鏈同種型。技術人員將理解的是，術語“合成抗體”可涵蓋使用重組dna技術生成的抗體，比如由如本文所述的噬菌體表達的抗體。該術語還應被理解為意指這樣的抗體：其通過編碼抗體的dna分子的合成而生成，并且該dna分子表達抗體蛋白或約定該抗體的氨基酸序列，其中dna或氨基酸序列使用本領域可用的和熟知的合成dna或氨基酸序列技術獲得。在一個實施例中，抗體或其功能性片段包括抗原結合區(qū)。在一個實施例中，抗原結合區(qū)是抗體或其抗原結合域。在一個實施例中，其抗原結合域是fab或scfv。技術人員將領會的是，就抗體而言的術語“結合”或“特異性結合”涵蓋抗體或其功能性片段，其識別特異抗原，而基本上不識別或結合樣品中的其他分子。例如，特異性結合來自一個物種的抗原的抗體可能也結合來自一個或多個物種的該抗原，但是，這種跨物種反應性本身不改變將抗體分類為特異性的。在另一例子中，特異性結合抗原的抗體可能也結合該抗原的不同等位基因形式。但是，這種交叉反應性不改變將抗體分類為特異性的。在一些情況下，可在提及抗體、蛋白或肽與第二化學物相互作用中使用術語“特異性結合”或“特異地結合”，指該相互作用依賴于該化學物上特定結構(例如抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體識別并結合特異蛋白結構而不是特異氨基酸序列。在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包含重組單核細胞增多性李斯特菌(lm)菌株。在另一個實施例中，本文公開的組合物包含抗體或其功能性片段，如本文所描述的。在一個實施例中，免疫原性組合物包含本文公開的抗體或其功能性片段，和本文公開的重組減毒李斯特菌。在另一個實施例中，本文公開的免疫原性組合物的各組分在本文公開的免疫原性組合物的另一組分之前、同時或之后施用。在一個實施例中，即使同時施用時，lm組合物和抗體或其功能性片段也可以作為兩個分開的組合物施用。替代性地，在另一個實施例中，lm組合物可以包含抗體或其功能性片段。在另一個實施例中，本文公開的組合物通過本領域技術人員已知的任何方法向受試者施用，例如胃腸外、癌旁、透粘膜、透皮、肌肉內、靜脈內、真皮內、皮下、腹膜內、心室內、顱內、陰道內或腫瘤內施用。在另一個實施例中，該組合物經口施用，并因此將其被配制為適合經口施用的形式，即，作為固體或液體制備物。適合的固體口服制劑包括片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、藥丸等。適合的液體口服制劑包括溶液、混懸液、分散劑、乳劑、油劑等。在本發(fā)明的另一個實施例中，將活性成分配制在膠囊中。根據該實施例，除活性化合物和惰性載體或稀釋劑之外，本發(fā)明的組合物還包括硬明膠膠囊。在另一個實施例中，通過靜脈內、動脈內或肌肉內注射液體制劑來施用組合物。適合的液體制劑包括溶液、混懸液、分散劑、乳劑、油劑等。在一個實施例中，將藥物組合物靜脈內施用，因此將其配制為適合靜脈內施用的形式。在另一個實施例中，將藥物組合物動脈內施用，因此將其配制為適合動脈內施用的形式。在另一個實施例中，將藥物組合物肌肉內施用，因此將其配制為適合肌肉內施用的形式。在一些實施例中，當抗體或其功能性片段與包含重組lm菌株的組合物分開施用時，該抗體可以靜脈內注射、皮下注射或直接注射進腫瘤或瘤床中。在一個實施例中，將包含抗體的組合物注射進腫瘤手術摘除后留下的空間內，例如在摘除前列腺腫瘤后的前列腺腺體內的空間。在一個實施例中，術語“免疫原性組合物”可以涵蓋本文公開的重組李斯特菌、佐劑、和抗體或其功能性片段或者它們的組合。在另一個實施例中，免疫原性組合物包含本文公開的重組李斯特菌。在另一個實施例中，免疫原性組合物包含本領域已知的或如本文所公開的佐劑。還應理解的是，這些組合物的施用增強免疫應答或增加效應t細胞與調節(jié)性t細胞比率或者引起抗腫瘤免疫應答，如本文進一步公開的。在一個實施例中，本發(fā)明提供使用方法，該方法包括施用包含所述李斯特菌菌株并且還包含抗體或其功能性片段的組合物。在另一個實施例中，使用方法包括施用多于一種本文所公開的抗體，該抗體可以存在于相同或不同的組合物中，并且可以存在于與李斯特菌相同的組合物中或單獨的組合物中。在一個實施例中，術語“藥物組合物”涵蓋治療有效量的一種或多種活性成分(包括李斯特菌菌株)，和至少一種抗體或其功能性片段，以及藥學上可接受的載體或稀釋劑。應當理解，術語“治療有效量”是指為給定病癥和施用方案提供治療效果的量。技術人員應當理解，術語“施用”涵蓋使受試者與本發(fā)明的組合物接觸。在一個實施例中，施用可在體外即在試管中實現，或在體內即活生物體(例如人)的細胞或組織內實現。在一個實施例中，本發(fā)明包括向受試者施用本發(fā)明的李斯特菌菌株及其組合物。如本文所用，術語“約”是數量術語，意指加或減5％，或在另一個實施例中，加或減10％，或在另一個實施例中，加或減15％，或在另一個實施例中，加或減20％。技術人員理解，術語“受試者”可涵蓋哺乳動物，包括需要治療病癥或其后遺癥或易受其影響的人類成人或兒童、少年或青少年，并且還可包括非人類哺乳動物，諸如狗、貓、豬、乳牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和小鼠。還將領會的是，該術語可以涵蓋家畜。術語”受試者”不排除在所有方面都正常的個體。在施用本文公開的免疫原性組合物之后，本文公開的方法誘導外周淋巴器官中的效應t細胞擴增，從而導致腫瘤部位存在的效應t細胞增加。在另一個實施例中，本文公開的方法誘導外周淋巴器官中的效應t細胞擴增，從而導致外周存在的效應t細胞增加。效應t細胞的這種擴增導致外周中和腫瘤部位的效應t細胞與調節(jié)性t細胞的比率提高，而不影響treg的數量。技術人員將領會的是，外周淋巴器官包括但不限于脾臟、培氏斑、淋巴結、腺狀腫等。在一個實施例中，效應t細胞與調節(jié)性t細胞的比率提高出現于外周中，而不影響treg的數量。在另一個實施例中，效應t細胞與調節(jié)性t細胞的比率提高出現于外周、淋巴器官和腫瘤部位，而不影響這些部位的treg數量。在另一個實施例中，效應t細胞的比率提高降低treg的頻率，而非這些部位的treg總數。組合療法及其使用方法在一個實施例中，本公開提供了一種引起受試者中的增強的抗腫瘤t細胞應答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個實施例中，抗體為激動劑抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，抗體為抗tnf受體抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，抗體為抗ox40抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，抗體為抗gitr抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，所述方法包括施用另外的抗體，該抗體可包含在含有所述重組李斯特菌菌株的組合物中或可包含在單獨的組合物中。在另一個實施例中，公開了一種引起受試者中的增強的抗腫瘤t細胞應答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株，所述李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框，其中所述方法還包括向所述受試者施用有效量的包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一個實施例中，抗體為激動劑抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，抗體為抗tnf受體抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，抗體為抗ox40抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，抗體為抗gitr抗體或其抗原結合片段。在另一個實施例中，所述方法包括施用另外的抗體，該抗體可包含在含有所述重組李斯特菌菌株的組合物中或可包含在單獨的組合物中。在一個實施例中，包含本文所述的李斯特菌菌株的任何組合物可用于本文公開的方法。在一個實施例中，包含李斯特菌菌株和抗體或其片段(例如，如本文所述的結合tnf受體超家族成員的抗體，或結合到t細胞受體共刺激分子的抗體，或結合到抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子的抗體)的任何組合物均可用在本發(fā)明的方法中。在一個實施例中，包含本文所述的抗體或其功能性片段的任何組合物均可用于本文公開的方法。包含李斯特菌菌株的具有和不具有抗體的組合物已在上文詳細描述。具有抗體的組合物也已在上文詳細描述。在一些實施例中，在本發(fā)明的方法中，包含抗體或其片段(例如，結合到tnf受體超家族成員的抗體，或結合到t細胞受體共刺激分子的抗體，或結合到抗原呈遞細胞受體結合性共刺激分子的抗體)的組合物可在施用包含李斯特菌菌株的組合物之前、同時或之后施用。在一個實施例中，本文公開的組合物的重復施用(劑量)可在治療的第一療程后立即進行或在幾天、幾周或幾個月的間隔后進行，以實現腫瘤消退。在另一個實施例中，重復劑量可在治療的第一療程后立即進行或在幾天、幾周或幾個月的間隔后進行，以實現腫瘤生長的抑制。評估可通過本領域已知的任何技術確定，包括診斷方法諸如成像技術、血清腫瘤標志物分析、活組織檢查、腫瘤相關癥狀的存在、不存在或改善。在一個實施例中，本文公開了用于預防、治療表達異源性抗原的腫瘤和針對所述腫瘤進行疫苗接種，并且誘導對異源性抗原的次優(yōu)勢表位的免疫應答同時防止腫瘤的逃逸突變的方法和組合物。在一個實施例中，用于預防、治療表達異源性抗原的腫瘤和針對所述腫瘤進行疫苗接種的方法和組合物包括使用截短李斯特菌溶血素(tllo)蛋白。在另一個實施例中，本文公開的方法和組合物包含過表達tllo的重組李斯特菌。在另一個實施例中，tllo從李斯特菌內的質粒表達。在另一個實施例中，本文公開了一種防止或治療受試者中的腫瘤生長或癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用免疫源性組合物的步驟，所述組合物包含如本文所述的抗體或其功能性片段以及包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在另一個實施例中，本文公開了一種防止或治療受試者中的腫瘤生長或癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用免疫源性組合物的步驟，所述組合物包含如本文所述的抗體或其功能性片段以及包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在一個實施例中，術語“治療”是指治愈疾病。在另一個實施例中，“治療”是指防止疾病。在另一個實施例中，“治療”是指減少疾病的發(fā)生。在另一個實施例中，“治療”是指改善疾病的癥狀。在另一個實施例中，“治療”是指提高患者的無進展存活期或總體存活期。在另一個實施例中，“治療”是指穩(wěn)定疾病的進展。在另一個實施例中，“治療”是指誘導緩解。在另一個實施例中，“治療”是指減緩疾病的進展。在另一個實施例中，術語“減少”、“阻遏”和“抑制”是指減輕或降低。在一個實施例中，本文公開了提高受試者脾臟和腫瘤微環(huán)境中的效應t細胞與調節(jié)性t細胞(treg)的比率的方法，該方法包括施用本文公開的免疫原性組合物。在另一個實施例中，提高受試者的脾臟和腫瘤微環(huán)境中效應t細胞與調節(jié)性t細胞(treg)的比率使得受試者中可以實現更明顯的抗腫瘤應答。在另一個實施例中，該效應t細胞包括cd4+foxp3-t細胞。在另一個實施例中，該效應t細胞是cd4+foxp3-t細胞。在另一個實施例中，該效應t細胞包括cd4+foxp3-t細胞和cd8+t細胞。在另一個實施例中，該效應t細胞是cd4+foxp3-t細胞和cd8+t細胞。在另一個實施例中，該調節(jié)性t細胞是cd4+foxp3+t細胞。在一個實施例中，本發(fā)明提供治療腫瘤、防御腫瘤以及誘導對腫瘤或癌癥的免疫應答的方法，該方法包括向受試者施用本文所公開的免疫原性組合物的步驟。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種預防或治療人受試者中的腫瘤或癌癥的方法，該方法包括向受試者施用本文公開的免疫原性組合物菌株的步驟，所述重組李斯特菌菌株包含含有l(wèi)lo蛋白的n末端片段和腫瘤相關抗原的重組多肽，由此重組李斯特菌菌株誘導對腫瘤相關抗原的免疫應答，從而治療人受試者中的腫瘤或癌癥。在另一個實施例中，該免疫應答是t細胞應答。在另一個實施例中，該t細胞應答是cd4+foxp3-t細胞應答。在另一個實施例中，該t細胞應答是cd8+t細胞應答。在另一個實施例中，該t細胞應答是cd4+foxp3-和cd8+t細胞應答。在另一個實施例中，本發(fā)明提供避免受試者罹患腫瘤或癌癥的方法，該方法包括向受試者施用本文公開的免疫原性組合物的步驟。在另一個實施例中，本發(fā)明提供誘導受試者中的腫瘤消退的方法，該方法包括向受試者施用本文公開的免疫原性組合物的步驟。在另一個實施例中，本文公開了降低腫瘤或癌癥的發(fā)生或復發(fā)的方法，該方法包括向受試者施用本文公開的免疫原性組合物的步驟。在另一個實施例中，本文公開了抑制受試者中的腫瘤形成的方法，該方法包括向受試者施用本文公開的免疫原性組合物的步驟。在另一個實施例中，本文公開了誘導受試者中的癌癥緩解的方法，該方法包括向受試者施用本文公開的免疫原性組合物的步驟。在一個實施例中，包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框的核酸分子整合進李斯特菌基因組。在另一個實施例中，核酸在重組李斯特菌疫苗株的質粒中。在一個實施例中，所述方法包括將重組李斯特菌與另外的療法共施用的步驟。在另一個實施例中，該另外的療法是手術、化療、免疫療法、放療、基于抗體的免疫療法或它們的組合。在另一個實施例中，該另外的療法在重組李斯特菌的施用之前進行。在另一個實施例中，該另外的療法在重組李斯特菌的施用之后進行。在另一個實施例中，該另外的療法是抗體療法。在另一個實施例中，該重組李斯特菌以增大劑量施用，以提高效應t細胞與調節(jié)性t細胞的比率，并產生更強大的抗腫瘤免疫應答。技術人員將領會的是，抗腫瘤免疫應答可通過給患有腫瘤的受試者提供細胞因子進一步增強，該細胞因子包括但不限于ifn-γ、tnf-α以及本領域已知的增強細胞免疫應答的其他細胞因子，這些細胞因子中的一些可見于美國專利no.6,991,785，該專利以引用方式并入本文。在一個實施例中，本文所公開的方法還包括將本文所公開的免疫原性組合物與在所述受試者中增強抗腫瘤免疫應答的抗體或其功能性片段共施用的步驟。在一個實施例中，本文公開的方法還包括將本文公開的免疫原性組合物與吲哚胺2,3-雙加氧酶(ido)通路抑制劑共施用的步驟。用于本發(fā)明的ido通路抑制劑包括任何本領域已知的ido通路抑制劑，其包括但不限于1-甲基色氨酸(1mt)、1-甲基色氨酸(1mt)、necrostatin-1、吡哆醛異煙腙、依布硒啉、5-甲基吲哚m-3-甲醛、cay10581、抗ido抗體或小分子ido抑制劑。在另一個實施例中，本文公開的組合物和方法還與在前的或隨后的化療或放療方案聯合使用。在另一個實施例中，ido抑制增強化療劑的功效。在另一個實施例中，本文公開了一種增加罹患癌癥或具有腫瘤的受試者的存活的方法，所述方法包括向所述受試者施用免疫源性組合物的步驟，所述組合物包含如本文所述的抗體或其功能性片段以及包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在另一個實施例中，本文公開了一種增加罹患癌癥或具有腫瘤的受試者中的抗原特異性t細胞的方法，所述方法包括向所述受試者施用免疫源性組合物的步驟，所述組合物包含如本文所述的抗體或其功能性片段以及包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述融合多肽包含融合到異源性抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列。在另一個實施例中，本文公開了一種增加罹患癌癥或具有腫瘤的受試者中的t細胞的方法，所述方法包括向所述受試者施用免疫源性組合物的步驟，所述組合物包含如本文所述的抗體或其功能性片段以及包含核酸分子的重組李斯特菌菌株，所述核酸分子包含編碼截短李斯特菌溶血素o(llo)蛋白、截短acta蛋白或pest氨基酸序列的第一開放閱讀框。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法還包括用如本文所公開的重組李斯特菌菌株或抗體或其功能性片段強化受試者的步驟。在另一個實施例中，用于強化接種的重組李斯特菌菌株與用于初始的“初免”接種的菌株相同。在另一個實施例中，強化菌株不同于初免菌株。在另一個實施例中，用于強化接種的抗體與用于初始的“初免”接種的抗體結合相同的抗原。在另一個實施例中，強化抗體不同于初免抗體。在另一個實施例中，將相同的劑量用于初免和強化接種。在另一個實施例中，將大劑量用于強化。在另一個實施例中，將小劑量用于強化。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法還包括將強化疫苗接種施用給受試者的步驟。在一個實施例中，強化疫苗接種在單次初免疫苗接種之后。在另一個實施例中，單次強化疫苗接種在初免疫苗接種后施用。在另一個實施例中，兩次強化疫苗接種在初免疫苗接種后施用。在另一個實施例中，三次強化疫苗接種在初免疫苗接種后施用。在一個實施例中，初免和強化菌株之間的周期由技術人員通過實驗確定。在另一個實施例中，初免和強化菌株之間的周期為1周，在另一個實施例中為2周，在另一個實施例中為3周，在另一個實施例中為4周，在另一個實施例中為5周，在另一個實施例中為6-8周，在又一個實施例中強化菌株在初免菌株后8-10周施用。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法還包括用包含本文公開的減毒李斯特菌菌株的免疫原性組合物強化受試者。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法包括施用強化劑量的免疫原性組合物的步驟，該組合物包含本文公開的減毒李斯特菌菌株。在另一個實施例中，該強化劑量是所述免疫原性組合物的替代形式。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法還包括將強化免疫原性組合物施用給受試者的步驟。在一個實施例中，該強化劑量在所述免疫原性組合物的單次初免劑量之后。在另一個實施例中，單次強化劑量在初免劑量后施用。在另一個實施例中，兩次強化劑量在初免劑量后施用。在另一個實施例中，三次強化劑量在初免劑量后施用。在一個實施例中，包含本文公開的減毒李斯特菌的免疫原性組合物的初免和強化劑量之間的周期由技術人員以實驗方法確定。在另一個實施例中，劑量由技術人員以實驗方法確定。在另一個實施例中，初免和強化劑量之間的周期為1周，在另一個實施例中為2周，在另一個實施例中為3周，在另一個實施例中為4周，在另一個實施例中為5周，在另一個實施例中為6-8周，在又一個實施例中強化劑量在免疫原性組合物的初免劑量后8-10周施用。異源性“初免強化”策略對于增強免疫應答和防御眾多病原體是有效的。schneider等人,immunol.rev.170:29-38(1999)；robinson,h.l.,nat.rev.immunol.2:239-50(2002)；gonzalo,r.m.等人,strain20:1226-31(2002)；tanghe,a.,infect.immun.69:3041-7(2001)。抗原以不同形式在初免和強化注射中提供似乎使對該抗原的免疫應答最大化。以dna菌株初免，接著以佐劑中的蛋白或者通過病毒載體遞送編碼抗原的dna來強化似乎是改善抗原特異性抗體以及各自的cd4+t細胞應答或cd8+t細胞應答的最有效方式。shiverj.w.等人,nature415:331-5(2002)；gilbert,s.c.等人,strain20:1039-45(2002)；billaut-mulot,o.等人,strain19:95-102(2000)；sin,j.i.等人,dnacellbiol.18:771-9(1999)。最近的來自猴疫苗接種研究的數據提示，當以hivgagdna對猴進行初免接種后接著以表達hivgag的腺病毒載體(ad5-gag)強化時，向編碼hivgag抗原的dna添加crl1005泊洛沙姆(12kda,5％poe)增強了t細胞應答。針對dna/泊洛沙姆初免和隨后的ad5-gag強化的細胞免疫應答強于以dna(無泊洛沙姆)初免和隨后進行ad5-gag強化所誘導的應答或者針對單獨的ad5-gag的應答。shiver,j.w.等人nature415:331-5(2002)。美國專利申請公開us2002/0165172a1描述了以編碼抗原的免疫原性部分的載體構建體和包含抗原的該免疫原性部分的蛋白同時施用，由此產生免疫應答。該文獻僅限于乙型肝炎抗原和hiv抗原。此外，美國專利no.6,500,432涉及通過以所關注的多核苷酸和多肽同時施用來增強核酸疫苗接種的免疫應答的方法。根據該專利，同時施用意指在相同的免疫應答期間，優(yōu)選地在彼此的0-10天或3-7天內施用多核苷酸和多肽。該專利所考慮的抗原包括：肝炎(所有形式)、hsv、hiv、cmv、ebv、rsv、vzv、hpv、脊髓灰質炎、流感、寄生蟲(例如，來自瘧原蟲(plasmodium)屬)和病原菌(包括但不限于結核分枝桿菌(m.tuberculosis)、麻風桿菌(m.leprae)、衣原體(chlamydia)、志賀氏菌(shigella)、伯氏疏螺旋體(b.burgdorferi)、腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenice.coli)、傷寒沙門氏菌(s.typhosa)、幽門螺桿菌(h.pylori)、霍亂弧菌(v.cholerae)、百日咳桿菌(b.pertussis)等)抗原等。通過引用將以上所有文獻全文并入本文。在一個實施例中，本發(fā)明的處理方案為治療性的。在另一個實施例中，該方案為預防性的。在另一個實施例中，將本發(fā)明的組合物用于保護人們免于諸如乳腺癌的癌癥或其他類型的腫瘤的風險，因為家族性遺傳或其他情況使得它們易于罹患這些類型的疾病，如技術人員將理解的那樣。在另一個實施例中，疫苗在通過手術、常規(guī)化療或放療摧毀腫瘤生長后用作癌癥免疫療法。在此類治療后，本發(fā)明的疫苗的施用使得對疫苗的腫瘤抗原的ctl應答破壞了其余的轉移并且延長了癌癥的緩解。在另一個實施例中，將本發(fā)明的疫苗用于影響之前建立的腫瘤的生長并殺死現有的腫瘤細胞。在一些實施例中，術語“包含”或其語法形式是指包括指定的活性劑，諸如本發(fā)明的lm菌株，以及包括其他活性劑，諸如抗體或其功能性片段，以及制藥行業(yè)已知的藥學上可接受的載體、賦形劑、緩和劑、穩(wěn)定劑等。在一些實施例中，術語“基本上由…組成”是指這樣的組合物：其唯一的活性成分是指定的活性成分，然而，可包括用于穩(wěn)定、保存制劑等等但不直接涉及指定的活性成分的治療效果的其他化合物。在一些實施例中，術語“基本上由…組成”可以指這樣的組分：其通過不同于指定的活性成分的機制發(fā)揮治療效果。在一些實施例中，術語“基本上由…組成”可以指這樣的組分：其發(fā)揮治療效果并且屬于與指定的活性成分不同的一類化合物。在一些實施例中，術語“基本上由…組成”可以指這樣的組分：其例如通過不同作用機制的作用而發(fā)揮治療效果并且可以不同于指定的活性成分。在一些實施例中，術語“基本上由…組成”可以指有助于釋放活性成分的組分。在一些實施例中，術語“由...組成”是指這樣的組合物：其包含活性成分和藥學上可接受的載體或賦形劑。如本文所用，除非上下文明確地相反指出，否則單數形式“一個”、“一種”和“該/所述”包括復數含義。例如，術語“一種化合物”或“至少一種化合物”可包括多種化合物，包括它們的混合物。遍及本申請，本發(fā)明的各個實施例可以以范圍的形式表示。應理解，以范圍形式描述僅是出于方便和簡潔，而不應認為是對發(fā)明范圍的呆板限制。因此，對范圍的描述應認為是已具體公開了所有可能的子范圍以及該范圍內的各個數值。例如，對諸如1至6的范圍的描述應理解為已具體公開了諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范圍，以及該范圍內的各個數值，例如1、2、3、4、5和6。這種適用性與范圍的廣度無關。每當在本文中指出數值范圍時，其旨在包括該指出的范圍內的任何引用的數字(分數或整數)。短語第一指定數和第二指定數“之間的范圍”和“從”第一指定數“至”第二指定數的“范圍”在本文中可互換使用，旨在包括第一和第二指定數以及它們之間的所有分數和整數。如本文所用，術語“方法”是指用于實現給定任務的方式、手段、技術和工序，包括但不限于化學、藥理學、生物學、生物化學和醫(yī)學領域的專業(yè)人員已知的或易于從已知的方式、手段、技術和工序開發(fā)的那些方式、手段、技術和工序。在以下實例中，陳述了多個具體細節(jié)，以提供對本發(fā)明的透徹理解。然而，本領域的技術人員將理解可在不具有這些具體細節(jié)的情況下實施本發(fā)明。在其他情況中，為避免使本發(fā)明復雜化，未對熟知的方法、工序和組分進行詳細描述。實例材料和實驗方法(實例1-2)細胞系c57bl/6同基因tc-1腫瘤經hpv-16e6和e7永生化并以c-ha-ras癌基因轉化。t.c.wu(johnshopkinsuniversityschoolofmedicine,baltimore,md)提供的tc-1為高度致瘤的肺上皮細胞，該細胞表達低水平的hpv-16e6和e7，并被c-ha-ras癌基因轉化。讓tc-1于37℃及10％co2下生長在rpmi1640、10％fcs、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、100μm非必需氨基酸、1mm丙酮酸鈉、50微摩爾(mcm)2-me、400微克(mcg)/mlg418以及10％國家典型菌種保藏中心-109培養(yǎng)基(nationalcollectiontypeculture-109medium)中。c3為來自c57bl/6小鼠的小鼠胚胎細胞，該細胞經完整hpv16基因組永生化并經pej-ras轉化。el-4/e7為經e7逆轉錄病毒轉導的胸腺瘤el-4。單核細胞增多性李斯特菌菌株和繁殖所用的李斯特菌菌株為lm-llo-e7，本文也稱為adxs11-001(在游離型表達系統中的hly-e7融合基因；圖1a)、lm-e7(整合進李斯特菌基因組中的單拷貝e7基因盒)、lm-llo-np(“dp-l2028”；在游離型表達系統中的hly-np融合基因)和lm-gag(“zy-18”；整合進染色體中的單拷貝hiv-1gag基因盒)。將e7用引物5'-ggctcgagcatggagatacacc-3'(seqidno:51；xhoi位點標有下劃線)和5'-ggggactagtttatggtttctgagaaca-3'(seqidno:52；spei位點標有下劃線)通過pcr擴增并連接進pcr2.1(invitrogen,sandiego,ca)。通過xhoi/spei消化從pcr2.1切離e7，并將其連接進pgg-55。將hly-e7融合基因和多能轉錄因子prfa克隆進pam401，即一種多拷貝穿梭質粒(wirthr等人,jbacteriol,165:831,1986)，從而生成pgg-55。hly啟動子驅動hly基因產物的前441個氨基酸(缺乏溶血性c-端，在下文中被稱作“δllo”，并具有seqidno:3所示的序列)的表達，其通過xhoi位點連接至e7基因，從而產生hly-e7融合基因，該基因被轉錄和分泌成llo-e7。用為了在體內保留質粒而選擇的pgg-55轉化prfa陰性李斯特菌菌株xfl-7(由haoshen博士提供，universityofpennsylvania)(圖1a-b)。使用引物5'-gggggctagccctcctttgattagtatattc-3'(seqidno:53；nhei位點標有下劃線)和5'-ctccctcgagatcataatttacttcatc-3'(seqidno:54；xhoi位點標有下劃線)生成hly啟動子和基因片段。將prfa基因用引物5'-gactacaaggacgatgaccgacaagtgataacccgggatctaaataaatccgttt-3'(seqidno:55；xbai位點標有下劃線)和5'-cccgtcgaccagctcttcttggtgaag-3'(seqidno:56；sali位點標有下劃線)進行pcr擴增。通過將含有驅動e7的表達和分泌的hly啟動子和信號序列的表達盒引入lm基因組的orfz域中，產生lm-e7。將e7用引物5'-gcggatcccatggagatacacctac-3'(seqidno:57；bamhi位點標有下劃線)和5'-gctctagattatggtttctgag-3'(seqidno:58；xbai位點標有下劃線)通過pcr擴增。然后將e7連接進pzy-21穿梭載體。用得到的質粒pzy-21-e7轉化lm菌株10403s，該質粒包括插入在與lm基因組的orfx、y、z域對應的1.6-kb序列的中央的表達盒。該同源域允許e7基因盒通過同源重組插入orfz域中。針對e7基因盒在orfz域中的整合，篩選克隆。在含有(lm-llo-e7和lm-llo-np)或不含(lm-e7和zy-18)氯霉素(20μg/ml)的腦心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌。在-80℃以等分試樣冷凍細菌。通過western印跡法驗證表達(圖2)。western印跡法使李斯特菌菌株在luria-bertoni培養(yǎng)基中于37℃生長，并在600nm處測得的相同光密度下收獲。將上清液tca沉淀，并重懸于補充了0.1nnaoh的1x樣品緩沖液中。將相同量的每種細胞沉淀物或每種經tca沉淀的上清液上樣至4-20％tris-甘氨酸sds-page凝膠(novex,sandiego,ca)。將凝膠轉移至聚偏二氟乙烯，并用抗-e7單克隆抗體(mab)(zymedlaboratories,southsanfrancisco,ca)探測，然后與hrp-偶聯的抗小鼠二抗(amershampharmaciabiotech,littlechalfont,u.k.)一起溫育，用amershamecl檢測試劑顯影，并暴露于hyperfilm(amershampharmaciabiotech)。腫瘤生長的測量每隔一天用卡尺跨最短和最長表面直徑測量腫瘤。將這兩個測量結果的平均值作為平均腫瘤直徑(以毫米計)相對于不同時間點作圖。當腫瘤直徑達到20mm時，處死小鼠。僅顯示存活小鼠在每個時間點的腫瘤測量結果。李斯特菌重組體對建立的腫瘤生長的影響6-8周齡c57bl/6小鼠(charlesriver)在左脅腹皮下接受2×105個tc-1細胞。腫瘤接種后一周，腫瘤已經達到直徑為4-5mm的可觸知大小。然后在第7和14天用0.1ld50腹膜內lm-llo-e7(107個cfu)、lm-e7(106個cfu)、lm-llo-np(107個cfu)或lm-gag(5×105個cfu)處理8只小鼠的組。51cr釋放測定以0.1ld50lm-llo-e7、lm-e7、lm-llo-np或lm-gag腹膜內免疫6-8周齡c57bl/6小鼠。免疫接種后十天，收獲脾。將經照射的tc-1細胞作為飼養(yǎng)細胞，在培養(yǎng)物中建立脾細胞(100:1，脾細胞:tc-1)；在體外刺激5天，然后用在標準51cr釋放測定中，其中使用下述靶標：el-4、el-4/e7或經e7h-2b肽(rahynivtf)脈沖處理的el-4。一式三份地進行的e:t細胞比率為：80:1、40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1。在37℃溫育4h以后，將細胞沉淀，并從每個孔取出50μl上清液。以wallac1450閃爍計數器(gaithersburg,md)測定樣品。將特異性裂解百分比確定為[(每分鐘的實驗計數(cpm)-自發(fā)cpm)/(總cpm-自發(fā)cpm)]×100。tc-1特異性增殖將c57bl/6小鼠用0.1ld50免疫，并在20天后通過腹膜內注射1ld50lm-llo-e7、lm-e7、lm-llo-np或lm-gag進行強化。強化后六天，從經免疫的小鼠和未暴露的小鼠收獲脾。以2.5×104、1.25×104、6×103或3×103個經照射的tc-1細胞/孔作為e7ag的來源，或不用tc-1細胞或用10μg/mlcona，在平底96孔平板中以5×105個/孔在培養(yǎng)物中建立脾細胞。45h后以0.5μci[3h]胸苷/孔脈沖處理細胞。18h以后，采用tomtec采集器96(orange,ct)收獲平板，并用wallac1450閃爍計數器評估增殖。將以cpm計的變化計算為實驗cpm–無agcpm。流式細胞術分析將c57bl/6小鼠用0.1ld50lm-llo-e7或lm-e7靜脈內(i.v.)免疫，并在30天后強化。采用帶軟件(bectondickinson,mountainview,ca)的流式細胞計對cd8(53-6.7，pe偶聯的)、cd62配體(cd62l；mel-14，apc偶聯的)和e7h-2db四聚體進行三色流式細胞術。將強化后第5天收獲的脾細胞在室溫(rt)用負載了e7肽(rahynivtf)或對照(hiv-gag)肽的h-2db四聚體染色。以1/200稀釋度使用四聚體，其由larryr.pease博士(mayoclinic,rochester,mn)以及由niaidtetramercorefacility和nihaidsresearchandreferencereagentprogram提供。分析了四聚體+、cd8+、cd62l低細胞。b16f0-ova實驗給24只c57bl/6小鼠接種5×105個b16f0-ova細胞。在第3、10和17天，將8只小鼠的組用0.1ld50lm-ova(106個cfu)、lm-llo-ova(108個cfu)免疫，另八只動物保持不處理。統計為了對比腫瘤直徑，確定每個組的腫瘤大小的平均值和sd，并通過學生t檢驗確定統計顯著性。p≤0.05視作顯著的。實例1：llo-抗原融合體誘導抗腫瘤免疫結果對比了lm-e7和lm-llo-e7影響tc-1生長的能力。在c57bl/6小鼠的左脅腹上建立皮下腫瘤。七天后，腫瘤已經達到可觸知的大小(4-5mm)。在第7和14天，給小鼠接種0.1ld50lm-e7、lm-llo-e7或作為對照的lm-gag和lm-llo-np。lm-llo-e7誘導75％的建立的tc-1腫瘤的完全消退，而在該組中的其他2只小鼠中控制了腫瘤生長(圖3)。相反，使用lm-e7和lm-gag的免疫接種沒有誘導腫瘤消退。該實驗重復多次，總是得到非常類似的結果。另外，在不同的免疫方案下，lm-llo-e7也得到了類似的結果。在另一實驗中，單次免疫能夠治愈小鼠建立的5mmtc-1腫瘤。在其他實驗中，用另外2個表達e7的腫瘤細胞系得到了類似的結果：c3和el-4/e7。為了確認以lm-llo-e7接種的效力，分別在第60天或第40天用tc-1或el-4/e7腫瘤細胞重新挑戰(zhàn)已經消除了它們的腫瘤的動物。經lm-llo-e7免疫的動物保持無腫瘤直到實驗終止(就tc-1而言，第124天；就el-4/e7而言，第54天)。因此，抗原作為與δllo的融合蛋白的表達會增強所述抗原的免疫原性。實例2：lm-llo-e7處理引起tc-1特異性脾細胞增殖為了用lm-llo-e7測量lm-e7對t細胞的誘導，在經免疫的小鼠中測量了tc-1特異性增殖性應答(抗原特異性免疫活性的度量)。來自經lm-llo-e7免疫的小鼠的脾細胞當以20:1、40:1、80:1和160:1的脾細胞:tc-1比率暴露于經照射的tc-1細胞(作為e7的來源)時發(fā)生增殖(圖4)。反之，來自經lm-e7和rlm對照免疫的小鼠的脾細胞僅表現出背景水平的增殖。實例3：acta-e7和pest-e7融合體賦予抗腫瘤免疫材料和方法lm-acta-e7的構建lm-acta-e7是lm的重組菌株，其包含表達與截短形式的acta蛋白融合的e7蛋白的質粒。通過將質粒載體pdd-1引入李斯特菌而生成lm-acta-e7，所述質粒載體通過修改pdp-2028而構建。pdd-1包含表達310bphly啟動子和hly信號序列(ss)的拷貝的表達盒，該表達盒驅動acta-e7的表達和分泌；包含四個pest序列(seqidno:14)的1170bpacta基因(截短的acta多肽由分子的前390個aa組成，seqidno:12)、300bphpve7基因、1019bpprfa基因(控制毒力基因的表達)和cat基因(氯霉素抗性基因)用于選擇所轉化的細菌克隆(sewell等人(2004),arch.otolaryngol.headnecksurg.,130:92-97)。使用引物5'-ggggtctagacctcctttgattagtatattc-3'(xbai位點標有下劃線；seqidno:59)和引物5'-atcttcgctatctgtcgccgcggcgcgtgcttcagtttgttgcgc-'3(noti位點標有下劃線；前18個核苷酸為acta基因重疊；seqidno:60)從pgg55(實例1)對hly啟動子(phly)和基因片段進行pcr擴增。使用引物5'-gcgcaacaaactgaagcagcggccgcggcgacagatagcgaagat-3'(noti位點標有下劃線；seqidno:61)和引物5'-tgtaggtgtatctccatgctcgagagctaggcgatcaatttc-3'(xhoi位點標有下劃線；seqidno:62)從lm10403s野生型基因組對acta基因進行pcr擴增。使用引物5'-ggaattgatcgcctagctctcgagcatggagatacacctaca-3'(xhoi位點標有下劃線；seqidno:63)和引物5'-aaacggatttatttagatcccgggttatggtttctgagaaca-3'(xmai位點標有下劃線；seqidno:64)從pgg55(pllo-e7)對e7基因進行pcr擴增。使用引物5'-tgttctcagaaaccataacccgggatctaaataaatccgttt-3'(xmai位點標有下劃線；seqidno:65)和引物5'-gggggtcgaccagctcttcttggtgaag-3'(sali位點標有下劃線；seqidno:66)從lm10403s野生型基因組對prfa基因進行pcr擴增。通過pcr生成hly啟動子-acta基因融合體(phly-acta)，并使用上游phly引物(seqidno:59)和下游acta引物(seqidno:62)從純化的phlydna和純化的actadna進行擴增。通過pcr生成與prfa基因融合的e7基因(e7-prfa)，并使用上游e7引物(seqidno:63)和下游prfa基因引物(seqidno:66)從純化的e7dna和純化的prfadna進行擴增。通過pcr產生與e7-prfa融合產物融合的phly-acta融合產物，并使用上游phly引物(seqidno:59)和下游prfa基因引物(seqidno:66)從純化的融合phly-actadna基因產物和純化的融合e7-prfadna產物進行擴增，且連接到pcrii(invitrogen,lajolla,calif.)中。用pcrii-actae7轉化感受態(tài)大腸桿菌(top10'f,invitrogen,lajolla,calif.)。在裂解和分離后，使用bamhi(預期片段大小770bp和6400bp(或當插入片段逆向插入載體時：2500bp和4100bp))和bstxi(預期片段大小2800bp和3900bp)通過限制性分析篩選質粒，并且還使用上游phly引物(seqidno:59)和下游prfa基因引物(seqidno:66)通過pcr分析進行了篩選。將phly-acta-e7-prfadna插入片段通過用xbai和sali雙重消化而從pcrii切割，并連接進也用xbai和sali消化的pdp-2028。在用表達系統pactae7轉化top10'f感受態(tài)大腸桿菌(invitrogen,lajolla,calif.)后，使用上游phly引物(seqidno:59)和下游prfa基因引物(seqidno:66)通過pcr分析來篩選耐氯霉素克隆。使包含pactae7的克隆在腦心浸液培養(yǎng)基(具有氯霉素(20mcg(微克)/ml(毫升)，difco,detroit,mich.)中生長，并使用小量提取dna純化系統試劑盒(midiprepdnapurificationsystemkit)(promega,madison,wis.)分離pactae7。如在ikonomidis等人(1994,j.exp.med.180:2209-2218)中所描述的，用表達系統pactae7轉化青霉素處理的李斯特菌的prfa陰性菌株(菌株xfl-7)，并針對體內質粒保留來選擇克隆。于37℃在含有氯霉素(20mcg/ml)的腦心浸液中培養(yǎng)克隆。在-80℃在等分試樣中冷凍細菌。抗原表達的免疫印跡驗證為了驗證lm-acta-e7分泌acta-e7(約64kd)，使李斯特菌菌株在luria-bertoni(lb)培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)。用三氯乙酸(tca)從培養(yǎng)物上清液中沉淀蛋白，重懸于含有0.1n氫氧化鈉的1x樣品緩沖液中。將相等量的每種經tca沉淀的上清液加樣至4％至20％tris-甘氨酸十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(novex,sandiego,calif)。將凝膠轉移至聚偏二氟乙烯膜，并用1:2500抗-e7單克隆抗體(zymedlaboratories,southsanfrancisco,calif)探測，然后用1:5000辣根過氧化物酶偶聯的抗小鼠igg(amershampharmaciabiotech,littlechalfont,england)探測。將印跡用amersham增強的化學發(fā)光檢測試劑顯影，并暴露于放射自顯影膠片(amersham)(圖5a)。lm-pest-e7、lm-δpest-e7和lm-e7epi的構建(圖6a)lm-pest-e7與lm-llo-e7相同，但是它僅含有hly基因的啟動子和pest序列，具體而言，llo的前50個氨基酸。為了構建lm-pest-e7，使用soe(通過重疊延伸實現的基因剪接)pcr技術，讓hly啟動子和pest區(qū)域與全長e7基因融合。從質粒pgg-55(其含有l(wèi)lo的前441個氨基酸)擴增e7基因和hly-pest基因片段，并通過常規(guī)pcr技術剪接到一起。為了建立最終的質粒pvs16.5，將hly-pest-e7片段和prfa基因亞克隆進質粒pam401(其包括用于體外選擇的氯霉素抗性基因)中，并使用得到的質粒轉化xfl-7。lm-δpest-e7是與lm-llo-e7相同的重組李斯特菌菌株，但是它缺少pest序列。基本上如針對lm-pest-e7所描述的那樣進行制備，但是使用設計成從hly-e7融合基因除去含有pest的區(qū)域(bp333-387)的引物來構建游離型表達系統。lm-e7epi是分泌不含pest區(qū)域或llo的e7的重組菌株。用于轉化該菌株的質粒含有與e7基因融合的hly啟動子和信號序列的基因片段。該構建體不同于原始的lm-e7，該lm-e7表達整合進染色體中的單個拷貝的e7基因。除了表達的e7抗原的形式以外，lm-e7epi是與lm-llo-e7、lm-pest-e7和lm-δpest-e7完全同基因的。結果為了對比lm-acta-e7相對于lm-llo-e7誘導的抗腫瘤免疫，將2×105個tc-1腫瘤細胞皮下植入小鼠中，并讓其生長至可觸知的大小(大約5毫米[mm])。在第7和14天，用1ld50的lm-acta-e7(5×108個cfu)(十字叉)、lm-llo-e7(108個cfu)(正方形)或lm-e7(106個cfu)(圓形)腹膜內免疫小鼠。到第26天，在lm-llo-e7和lm-acta-e7中的所有動物都沒有腫瘤且保持如此，而所有未暴露的動物(三角形)和用lm-e7免疫的動物生長出大腫瘤(圖5b)。因而，使用acta-e7融合體的接種造成腫瘤消退。另外，針對它們引起表達e7的腫瘤的消退的能力，對比了lm-llo-e7、lm-pest-e7、lm-δpest-e7和lm-e7epi。40只c57bl/6小鼠的左脅腹上建立皮下tc-1腫瘤。在腫瘤已經達到4-5mm后，將小鼠分成5組，每組8只。每組用4種重組lm疫苗之一處理，1個組保持不處理。lm-llo-e7和lm-pest-e7分別在5/8和3/8的病例中誘導了建立的腫瘤的消退。在任何時間點在用lm-pest-e7或lm-llo-e7處理的小鼠的平均腫瘤大小之間沒有統計差異。但是，表達不含pest序列的e7、lm-δpest-e7和lm-e7epi的疫苗在除了一只以外的所有小鼠中沒有造成腫瘤消退(圖6b，上方插圖)。這代表2個實驗，其中在用lm-llo-e7或lm-pest-e7處理的腫瘤與用lm-e7epi或lm-δpest-e7處理的腫瘤之間，觀察到在第28天時平均腫瘤大小的統計上顯著的差異；p<0.001，學生t檢驗；圖6b，下方插圖)。另外，在經含有pest的疫苗接種的小鼠的脾中，在3個實驗中可再現地觀察到四聚體陽性脾細胞的增加的百分比(圖6c)。因而，使用pest-e7融合體的接種造成腫瘤消退。實例4：e7與llo、acta或pest樣序列的融合增強e7特異性免疫并產生浸潤腫瘤的e7特異性cd8+細胞材料和實驗方法在12只c57bl/6小鼠(n＝3)的左脅腹皮下植入500mcl(微升)其包含100微升的在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中的2×105個tc-1腫瘤細胞和400微升的(bdbiosciences,franklinlakes,n.j.)。在第7、14和21天腹膜內免疫小鼠，并在第28天收獲脾和腫瘤。將腫瘤matrigel從小鼠取出，并在含有2毫升(ml)rp10培養(yǎng)基的試管中在冰上4℃溫育過夜。將腫瘤用鑷子切碎，切成2mm塊，并與3ml酶混合物(pbs中0.2mg/ml膠原酶p、1mg/mldnase-1)一起在37℃溫育1小時。將組織懸液穿過尼龍網過濾，并用5％胎牛血清+0.05％的nan3在pbs中的溶液洗滌，以用于四聚體和ifn-γ染色。在存在布雷菲德菌素a的情況下以107個細胞/ml將脾細胞和腫瘤細胞與1微摩爾(mcm)e7肽一起溫育5小時。將細胞洗滌兩次，并在50微升的抗小鼠fc受體上清液(2.4g2)中4℃溫育1小時或過夜。針對表面分子cd8和cd62l將細胞染色，滲透化，使用滲透化試劑盒或(pharmingen,sandiego,calif.)固定，并針對ifn-γ染色。使用雙激光流式細胞計facscalibur獲取500,000個事件，并使用cellquest軟件(bectondickinson,franklinlakes,nj)分析。計算活化的(cd62l低)cd8+t細胞內的ifn-γ分泌細胞的百分比。對于四聚體染色，讓h-2db四聚體負載藻紅蛋白(pe)偶聯的e7肽(rahynivtf,seqidno:67)，在室溫染色1小時，并用抗別藻藍蛋白(apc)偶聯的mel-14(cd62l)和fitc偶聯的cd8在4℃染色30min。通過對比脾中和腫瘤中的四聚體+cd8+cd62l低細胞來分析細胞。結果為了分析lm-acta-e7增強抗原特異性免疫的能力，給小鼠植入tc-1腫瘤細胞，并用lm-llo-e7(1×107個cfu)、lm-e7(1×106個cfu)或lm-acta-e7(2×108個cfu)免疫，或者不處理(未暴露的)。來自lm-llo-e7和lm-acta-e7組的小鼠腫瘤含有比在lm-e7或未暴露的小鼠中更高百分比的分泌ifn-γ的cd8+細胞(圖7a)和四聚體特異性cd8+細胞(圖7b)。在另一個實驗中，給荷瘤小鼠施用lm-llo-e7、lm-pest-e7、lm-δpest-e7或lm-e7epi，并測量腫瘤內的e7特異性淋巴細胞的水平。在第7和14天用0.1ld50的4種疫苗處理小鼠。在第21天收獲腫瘤，并用針對cd62l、cd8的抗體和用e7/db四聚體染色。在接種lm-llo-e7和lm-pest-e7的小鼠中觀察到四聚體陽性的淋巴細胞在腫瘤內增加的百分比(圖8a)。該結果在三個實驗中是可再現的(圖8b)。因而，lm-llo-e7、lm-acta-e7和lm-pest-e7各自有效地誘導浸潤腫瘤的cd8+t細胞和腫瘤消退。實例5：llo和acta融合體減小e6/e7轉基因小鼠中的原部位(自發(fā))腫瘤為了確定lm-llo-e7和lm-acta-e7疫苗對e6/e7轉基因小鼠中原部位腫瘤的影響，將6至8周大的小鼠用1×108lm-llo-e7或2.5×108lm-acta-e7每月一次進行免疫，持續(xù)8個月。在最后一次免疫后20天處死小鼠，摘取其甲狀腺并稱重。該實驗重復兩次(表1)。表1.未接種疫苗和接種疫苗的轉基因小鼠在8月齡時的甲狀腺重量(mg)*。*使用學生t檢驗進行的統計分析表明，經lm-llo-np處理的小鼠與未處理的小鼠之間甲狀腺重量的差異不顯著，但經lm-llo-e7與lm-acta-e7處理的小鼠之間的差異非常顯著(p<0.001)兩個實驗的lm-llo-e7處理的小鼠與未經處理的小鼠之間以及l(fā)m-llo-acta處理的小鼠與未經處理的小鼠之間的甲狀腺重量差異顯著(分別p<0.001和p<0.05)，而lm-llo-np處理的小鼠(不相關抗原對照)與未經處理的小鼠之間的差異不顯著(學生t檢驗)，顯示lm-llo-e7和lm-acta-e7控制了自發(fā)腫瘤生長。因此，本發(fā)明的疫苗防止形成新的表達e7的腫瘤。為了概述以上實例中的發(fā)現，llo抗原和acta抗原融合體(a)誘導包括腫瘤浸潤性抗原特異性t細胞的腫瘤特異性免疫應答；并且對于正常尤其是侵襲性腫瘤能夠誘導腫瘤消退和控制腫瘤生長；(b)克服對自身抗原的耐受性；以及(c)防止自發(fā)腫瘤生長。如用多種不同的抗原、pest樣序列和腫瘤類型成功實施所證明，這些發(fā)現可適用于大量抗原、pest樣序列和腫瘤類型。實例6：lm-llo-e7疫苗是安全的并改善宮頸癌患者的臨床指標材料和實驗方法入選標準.試驗中的全部患者均診斷為“晚期、進展性或復發(fā)性宮頸癌”且入選時的評估指示全部分級為患有ivb疾病。全部患者均表現出對含有選自制念珠菌素、流行性腮腺炎、破傷風或結核菌素純化蛋白衍生物(ppd)的3種記憶抗原的失能組(anergypanel)具有陽性免疫應答，未懷孕或hiv陽性，在4周內未服用試驗藥且未接受類固醇。方案：以3周的間隔以250ml生理鹽水中的30分鐘靜脈內(iv)輸注形式向住院病人施用2次疫苗接種。5天后，患者接受單一療程的iv氨芐西林且出院，額外口服10天氨芐西林。karnofsky機能狀況量表(karnofskyperformanceindex)為整體活力和生活質量(諸如食欲、完成每日任務的能力、平靜睡眠等)的量度，其用于確定總體幸福感。另外，確定以下安全性和一般幸福感指標：堿性磷酸酶；直接膽紅素和總膽紅素；γ谷氨酰轉肽酶(ggt)；膽固醇；心臟收縮、心臟舒張和心率；用于評估疾病進展的美國東部腫瘤協作組(ecog)準則-karnofsky類生活質量指標；血容比；血紅蛋白；血小板水平；淋巴細胞水平；ast(天冬氨酸轉氨酶)；alt(丙氨酸轉氨酶)；以及l(fā)dh(乳酸脫氫酶)。在第二次給藥之后的3周和3個月對患者進行隨訪，此時確定患者的實體瘤治療療效評價標準(recist)評分，進行掃描以測定腫瘤大小，且收集血液樣品用于在試驗結束時進行免疫分析，其包括評價ifn-γ、il-4、cd4+和cd8+細胞群。李斯特菌菌株：lm-llo-e7的產生在實例1中描述。結果在臨床試驗前，開展了臨床前實驗以確定lm-llo-e7的靜脈內(i.v.)對比i.p.施用的抗腫瘤功效。在皮下建立了含有1×104個tc-1細胞的腫瘤。在第7和14天，將小鼠用108lm-llo-e7i.p.或lm-llo-e7i.v.以108、107、106或105的劑量免疫。在第35天，接受108lm-llo-e7(通過任一途徑)或107lm-llo-e7i.v.的8只小鼠中的5只，以及接受106lm-llo-e7的8只小鼠中的4只被治愈。相比之下，i.p.施用的小于107或者在一些情況下甚至108lm-llo-e7的劑量對于控制腫瘤生長無效。因此，lm-llo-e7的i.v.施用比i.p.施用更有效。臨床試驗開展了i/ii期臨床試驗以評估lm-llo-e7疫苗在具有晚期、進展性或復發(fā)性宮頸癌的患者中的安全性和療效。5名患者各自被分配到分別接受1×109或3.3×109個cfu的隊列1-2。另外5名患者各自將被分配到分別接受1×1010或3.31×1010個cfu的隊列3-4。安全性數據第一隊列第一隊列中的全部患者在輸注開始后1-2小時內均報導出現輕度至中度發(fā)熱和發(fā)冷。一些患者表現出伴有惡心或不伴有惡心的嘔吐。1個例外(下文描述)，單次劑量的非類固醇藥劑(諸如撲熱息痛)足以解決這些癥狀。觀察到輕微、短暫的心血管作用，與發(fā)熱相符且與發(fā)熱同時。未報導其他不良作用。在此宮頸癌的晚期，1年存活率通常為10-15％患者且尚無有效的腫瘤療法。實際上，患者2為患有極具侵襲性疾病的年輕患者，其在完成試驗之后不久去世。在施用后第2天、第3天和第5天評估定量血液培養(yǎng)物。在此隊列中的5名可評估患者中，4名在任何時間均表現出無血清李斯特菌，而1名在第2天具有極少量(35個cfu)的循環(huán)李斯特菌，在第3天或第5天具有不可檢測的李斯特菌。對初始疫苗接種起反應的患者5在施用之后48小時具有輕度發(fā)熱，且用抗炎劑治療。在1個情景中，發(fā)熱升至中等嚴重程度(任何時間均不超過38.4℃)，此后向她給予一個療程的氨芐西林，發(fā)熱消退。在抗生素施用期間，她經歷輕度風疹，在抗生素施用后結束。血液培養(yǎng)物全部無菌，心血管數據在針對其他患者觀測到的范圍內，且血清化學值正常，顯示此患者不具有李斯特菌疾病。另外，失能組指示對1/3記憶抗原的穩(wěn)健應答，指示存在功能性免疫(類似于其他患者)?；颊?隨后證明類似于全部其他患者在接受強化時的應答。第二隊列和總體安全性觀測在兩個隊列中，在輸注后觀察到肝功能測試中的輕微和短暫改變。這些改變由監(jiān)控試驗的主治醫(yī)生確定為不具有臨床意義，且預期存在從全身循環(huán)快速移除至肝臟和脾臟的短暫細菌感染。一般而言，上文的方法章節(jié)中所述的全部安全性指標幾乎不或不顯示出凈變化，指示優(yōu)異的安全特性。此隊列中的副作用特性與初始隊列中所見的幾乎完全相同，且似乎為與細胞因子和類似因子的后果相關的一系列非劑量依賴性癥狀，其因引起醫(yī)源性感染而產生。在任何時間均未觀測到血清李斯特菌且任一隊列中均未觀測到劑量限制性毒性。療效-第一隊列在完成試驗的第一隊列的3名患者中觀察到以下療效指示：(圖9)。入選試驗的患者1具有2個各為20mm的腫瘤，其在試驗過程中縮小至18和14mm，指示疫苗的治療功效。另外，入選試驗的患者1的karnofsky機能狀況量表為70，其在給藥后升至90。在安全性審查小組(safetyreviewpanel)會議中，塞爾維亞貝爾格萊德腫瘤學和放射學研究所腫瘤科(departmentofoncology,instituteforoncologyandradiology,belgrade,serbia)主任radulovic向開展試驗的單位的代表展示了結果：作為該單位的顧問工作的獨立腫瘤學家michaelkurman；艾莫利大學(emoryuniversity)的理論婦科腫瘤學家kevinault，其為merck開展iii期gardasil試驗且為glaxosmithkline開展cervarix試驗；以及tatethigpen，其為nci婦科腫瘤學小組(gynecologiconcologygroup)創(chuàng)始人和密西西比大學(universityofmississippi)婦科腫瘤學教授。在radulovic博士的觀點中，患者1表現出來自用疫苗治療的臨床益處。在去世之前，患者2表現出混合應答，腫瘤縮小1/2。入選的患者3患有副腫瘤疾病(癌癥附帶現象，其中患者的整體虛弱狀態(tài)具有繼發(fā)于癌癥的其他后遺癥)，包括血小板數升至936×109/ml。在第一劑之后，該計數降至405×109/ml，大致為正常水平。入選試驗的患者4具有2個各為20mm的腫瘤，其在試驗過程中縮小至18和14mm，指示疫苗的治療功效。患者4在第一和第二劑之間表現出1.6kg的體重增加和約10％的血紅蛋白計數增加。療效-第二隊列和一般觀察在最低劑量隊列中，2名患者證實腫瘤縮小。此作用的時間與免疫應答中觀察到的相符，因為其遵循免疫應答的時間順序發(fā)展。第二隊列中迄今為止評估腫瘤負荷的2名患者中的一名在疫苗接種后的時間點表現出顯著的腫瘤負荷降低。在試驗開始時，此患者具有13、13和14mm的3個腫瘤。2劑疫苗后，2個腫瘤縮小至9.4和12mm，且第三個不再可檢測。圖13b中描繪了2個隊列的腫瘤負荷?？傮w而言，即使在包括初免注射和單次強化的治療方案中施用的相對低劑量的lm-llo-e7也在6名已收集數據的患者中獲得3個客觀反應。討論在此宮頸癌的晚期，1年存活率通常為10-15％患者且尚無有效的腫瘤療法。沒有治療顯示出能有效逆轉ivb期宮頸癌。盡管治療此階段的宮頸癌有困難，但在2/6名患者中觀察到抗腫瘤作用。另外，如上文所述，在完成試驗的患者中觀察到其他療效指示。因此，lm-llo-e7在人類受試者中是安全的且即使在相對低的劑量下施用時也改善宮頸癌患者的臨床指標。當增加強化接種的劑量和數量時；和/或當以較低的劑量或在輸注后較晚的時間點施用抗生素時，可能觀察到額外的陽性結果。臨床前研究已顯示單個數量級的劑量增加可引起反應率的顯著改變(例如，從0％反應率變?yōu)?0-100％完全緩解率。額外的強化劑量還極有可能進一步提高所得的免疫應答。此外，觀察到的治療性免疫應答的陽性作用可能隨著額外時間的推移而繼續(xù)，因為免疫系統繼續(xù)攻擊癌癥。實例7：構建減毒李斯特菌菌株-lmddδacta并且將人klk3基因同框插入lmdd和lmdda菌株中的hly基因。材料和方法開發(fā)了分泌融合到tllo的psa的重組lm(lm-llo-psa)，該重組lm引起與前列腺癌小鼠模型中的腫瘤消退相關的強效psa特異性免疫應答，其中tllo-psa的表達源自基于pgg55的質粒(表2)，其賦予載體以抗生素抗性。我們最近開發(fā)出用于基于padv142質粒的psa疫苗的新菌株，其不具有抗生素抗性標記并且稱為lmdda-142(表3)。此新菌株與lm-llo-psa相比減毒10倍。另外，lmdda-142比lm-llo-psa略微更具免疫原性并且顯著更有效地消退psa表達腫瘤。表2.質粒和菌株質粒padv142(6523bp)的序列如下：(seqidno:68)。2008年2月20日在genewiz實驗室從大腸桿菌菌株對此質粒進行測序。通過毒力因子acta的不可逆缺失，使菌株lmdaldat(lmdd)減毒。構建acta在lmdaldat(lmdd)背景下的框內缺失，以避免對下游基因的表達的任何極化效應。lmdaldatδacta含有在n末端處的前19個氨基酸和c末端的28個氨基酸殘基，缺失了acta的591個氨基酸。通過擴增對應于acta的上游(657bp-寡核苷酸的adv271/272)部分和下游(625bp-寡核苷酸的adv273/274)部分的染色體區(qū)并且通過pcr接合而產生acta缺失突變體。用于此擴增的引物序列在表1中給出。acta的上游和下游dna區(qū)在ecori/psti限制位點克隆到pneb193中并且來自此質粒，ecori/psti進一步克隆到溫敏質粒pksv7中，從產生δacta/pksv7(padv120)。表1：用于擴增acta的上游和下游的dna序列的引物序列使用外部結合至acta缺失區(qū)的引物來驗證從其染色體位置的基因缺失，所述引物在圖10(a和b)中顯示為引物3(adv305-tgggatggccaagaaattc，seqidno:73)和引物4(adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg；seqidno:74)。在分離自lmdd和lm-ddδacta的染色體dna上進行pcr分析。預期在lmdd染色體dna中用兩組不同的引物對1/2和3/4擴增以后的dna片段的大小為3.0kb和3.4kb。另一方面，對于lmddδacta，使用引物對1/2和3/4的pcr的預期大小為1.2kb和1.6kb。因此，在圖10(a和b)中的pcr分析證實acta的1.8kb區(qū)在lmddδacta菌株中缺失。還對pcr產物進行了dna測序，以證實含有acta的區(qū)在菌株lm-ddδacta中的缺失。實例8：構建用于lm載體的抗原遞送的與抗生素無關的游離型表達系統。用于lm載體(padv142)的抗原遞送的與抗生素無關的游離型表達系統為不含抗生素的質粒ptv3的下一代(verch等人,infectimmun,2004.72(11):6418-25，以引用方式并入本文中)。用于毒力基因轉錄激活因子的基因prfa從ptv3缺失，因為李斯特菌菌株lmdd在染色體中含有prfa基因的拷貝。此外，nhei/paci限制位點的p60-李斯特菌dal的盒置換為p60-枯草芽孢桿菌dal，從而產生質粒padv134(圖11a)。李斯特菌和芽孢桿菌dal基因的相似性為～30％，從而實際上消除了質粒與lmdd染色體中的dal基因的剩余片段之間重組的機會。質粒padv134含有抗原表達盒tllo-e7。將lmdda菌株用padv134質粒轉化并且通過western印跡確認來自所選克隆的llo-e7蛋白的表達(圖11b)。源自10403s野生型菌株的lmdd系統缺乏抗生素抗性標記，但具有l(wèi)mdd鏈霉素抗性。另外，將padv134用xhoi/xmai限制以克隆人psaklk3，從而產生質粒padv142。新質粒padv142(圖11c，表2)含有在李斯特菌p60啟動子控制下的芽孢桿菌dal(b-dal)。穿梭質粒padv142在無外源性d-丙氨酸存在下補充大腸桿菌aladrxmb2159和單核細胞增多性李斯特菌菌株lmdd的生長。質粒padv142中的抗原表達盒由hly啟動子和llo-psa融合蛋白組成(圖11c)。質粒padv142轉化至李斯特菌背景菌株lmddacta菌株，從而產生lm-dda-llo-psa。llo-psa融合蛋白經菌株lm-dda-llo-psa的表達和分泌通過western印跡使用抗llo和抗psa抗體來確認(圖11d)。在兩次體內傳代后，菌株lm-dda-llo-psa穩(wěn)定表達和分泌llo-psa融合蛋白。實例9：菌株lmdda-llo-psa的體外和體內穩(wěn)定性通過在選擇性壓力存在或不存在下培養(yǎng)lmdda-llo-psa李斯特菌菌株八天來檢驗質粒的體外穩(wěn)定性。菌株lmdda-llo-psa的選擇性壓力為d-丙氨酸。因此，菌株lmdda-llo-psa在腦-心輸注(bhi)和bhi+100μg/mld-丙氨酸中傳代。在鋪板于選擇性(bhi)和非選擇性(bhi+d-丙氨酸)培養(yǎng)基上之后測定每天的cfu。預期質粒損失將導致鋪板于非選擇性培養(yǎng)基(bhi+d-丙氨酸)上之后cfu較高。如圖12a中所示，選擇性和非選擇性培養(yǎng)基中的cfu數量之間不存在差異。這表明當實驗終止時，質粒padv142穩(wěn)定至少50代。通過在c57bl/6小鼠中靜脈內注射5×107個cfulmdda-llo-psa來測定質粒體內維持。在24小時和48小時從在pbs中均質化的脾臟分離有活力的細菌。在bhi板和bhi+100g/mld-丙氨酸上測定各時間點的各樣品的cfu。將脾細胞鋪板于選擇性和非選擇性培養(yǎng)基之后，在24小時后回收集落。由于此菌株高度減毒，因此在24小時內體內清除細菌負荷。選擇性和非選擇性板上未檢測到顯著cfu差異，指示重組質粒在所有分離的細菌中穩(wěn)定存在(圖12b)。實例10：菌株lmdda-142(lmdda-llo-psa)的體內傳代、毒力和清除率lmdda-142為分泌游離型表達的tllo-psa融合蛋白的重組李斯特菌菌株。為了測定安全劑量，將小鼠用多種劑量的lmdda-llo-psa免疫并且測定毒性效應。lmdda-llo-psa引起最小毒性效應(數據未示出)。結果表明小鼠良好耐受108個cfulmdda-llo-psa劑量。毒力研究指示菌株lmdda-llo-psa高度減毒。測定在c57bl/6小鼠中腹膜內施用安全劑量108個cfu后lmdda-llo-psa的體內清除率。第2天后，用lmdda-llo-psa免疫的小鼠的肝臟和脾臟中不存在可檢測的集落。因為此菌株高度減毒，所以其在48小時時完全體內清除(圖13a)。為了確定lmdda-llo-psa的減毒是否會減弱菌株lmdda-llo-psa感染巨噬細胞和胞內生長的能力，進行了感染測定。將諸如j774a.1的小鼠巨噬細胞樣細胞系用李斯特菌構建體體外感染并且對胞內生長進行定量。陽性對照菌株野生型李斯特菌菌株10403s胞內生長，并且prfa突變體陰性對照xfl7不能逃離吞噬溶菌體并且因此不會在j774細胞中生長。lmdda-llo-psa的胞質內生長比10403s緩慢，因為此菌株失去從細胞擴散至細胞的能力(圖13b)。結果指示lmdda-llo-psa有能力感染巨噬細胞和胞質內生長。實例11：菌株-lmdda-llo-psa在c57bl/6小鼠中的免疫原性使用psa四聚物染色測定c57bl/6小鼠中由構建體lmdda-llo-psa引起的psa特異性免疫應答。小鼠以一周間隔用lmdda-llo-psa免疫兩次并且在強化后第6天將脾細胞針對psa四聚物染色。用psa特異性四聚物對脾細胞的染色顯示lmdda-llo-psa引起23％的psa四聚物+cd8+cd62l低細胞(圖14a)。使用胞內細胞因子染色檢驗psa特異性t細胞在用psa肽刺激5小時后分泌ifn-γ的功能性能力。lmdda-llo-psa組相較于未暴露的小鼠，用psa肽刺激的cd8+cd62l低ifn-γ分泌細胞的百分比提高200倍(圖14b)，指示lmdda-llo-psa極具免疫原性并且在脾臟中針對psa引起高水平的功能活性psacd8+t細胞應答。為了測定用lmdda-llo-psa免疫小鼠后針對psa產生的細胞毒性t細胞的功能性活性，我們在體外測定中測試了psa特異性ctl對用h-2db肽脈沖處理的細胞el4細胞進行裂解的能力。使用基于facs的卡斯蛋白酶測定(圖14c)和銪釋放(圖14d)來測量細胞裂解。用lmdda-llo-psa免疫的小鼠的脾細胞含有對呈現psa肽作為靶抗原的細胞具有高細胞溶解活性的ctl。進行elispot來測定效應t細胞在用抗原刺激24小時后分泌ifn-γ的能力。使用elispot，觀察到來自用特異性肽刺激的lmdda-llo-psa免疫的小鼠的脾細胞中的ifn-γ斑點數相較于未暴露的小鼠的脾細胞提高20倍(圖14e)。實例12：用lmdda-142菌株免疫誘導表達psa的腫瘤的消退和psa特異性ctl對腫瘤的浸潤。使用工程化以表達psa的前列腺腺癌細胞系測定構建體lmdda-142(lmdda-llo-psa)的治療功效(tramp-c1-psa(tpsa)；shahabi等人，2008年)。將小鼠皮下植入2×106個tpsa細胞。當腫瘤在腫瘤接種后第6天達到4-6mm可觸大小時，小鼠以一周間隔用108個cfulmdda-142、107個cfulm-llo-psa(陽性對照)免疫三次或不做處理。未暴露的小鼠逐漸產生腫瘤(圖15a)。用lmdda-142免疫的小鼠直至第35天全部無腫瘤并且8只小鼠中有3只逐漸產生腫瘤，其相較于未暴露的小鼠以慢得多的速率生長(圖15b)。在第70天，八只小鼠中有五只仍無腫瘤。正如預期，lm-llo-psa接種的小鼠的腫瘤比未暴露的對照小并且腫瘤產生比對照中緩慢(圖15c)。因此，構建體lmdda-llo-psa可消退tpsa細胞系建立的60％腫瘤并且減緩其他小鼠中的腫瘤生長。仍無腫瘤的治愈小鼠在第68天用tpsa腫瘤再挑戰(zhàn)。用lmdda-142免疫小鼠可控制7天建立的tramp-c1腫瘤的生長和誘導其消退，相較于未暴露的組中的無結果(圖15a)，所述腫瘤經工程化以在超過60％的實驗動物中表達psa(圖15b)。使用高度減毒載體(lmdda)和質粒padv142來構建lmdda-142(表2)。另外，研究了lmdda-llo-psa構建體產生的psa特異性cd8淋巴細胞浸潤腫瘤的能力。將腫瘤和基質膠的混合物皮下植入小鼠，隨后以七天間隔用未暴露的或對照(lm-llo-e7)李斯特菌或用lmdda-llo-psa免疫兩次。在第21天切除腫瘤并且分析腫瘤中浸潤的cd8+cd62l低psa四聚物+和cd4+cd25+foxp3+調節(jié)性t細胞群體。觀察到極低數量的cd8+cd62l低psa四聚物+腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)對未暴露的和lm-llo-e7對照免疫小鼠中存在的psa具有特異性。然而，用lmdda-llo-psa免疫的小鼠中psa特異性cd8+cd62l低psa四聚物+til百分比增加10-30倍(圖7a)。有趣的是，脾臟中的cd8+cd62l低psa四聚物+細胞群體比腫瘤中少7.5倍(圖16a)。另外，測定未處理的小鼠和李斯特菌免疫小鼠的腫瘤中cd4+/cd25+/foxp3+t調節(jié)細胞(treg)的存在。有趣的是，用李斯特菌免疫導致腫瘤而非脾臟中的cd4+cd25+foxp3+t-reg數量顯著降低(圖16b)。然而，構建體lmdda-llo-psa對降低腫瘤中的cd4+cd25+foxp3+t-reg的頻率的影響比未暴露的和lm-llo-e7免疫組強(圖16b)。因此，lmdda-142疫苗可誘導能夠浸潤腫瘤部位的psa特異性cd8+t細胞(圖16a)。有趣的是，用lmdda-142免疫與腫瘤中的調節(jié)性t細胞數量減少有關(圖16b)，從而可能形成對高效抗腫瘤ctl活性更有利的環(huán)境。實例13：盡管psa融合，但lmdd-143和lmdda-143分泌功能性llo。lmdd-143和lmdda-143含有全長人klk3基因，其編碼psa蛋白，該蛋白經同源重組下游插入并且與染色體中的hly基因同框。這些構建體使用pksv7質粒(smith和biochimie.1992；74(7-8)第705-711頁)通過同源重組制備，所述質粒為溫敏復制子，攜帶hly-klk3-mpl重組盒。因為第二重組事件之后切除質粒，所以失去用于整合選擇的抗生素抗性標記。此外，acta基因在lmdda-143菌株中缺失(圖17a)。通過兩個構建體中的pcr(圖17b)和測序(數據未示出)來驗證klk3與hly向染色體中的同框插入。這些染色體構建體的一個重要方面為llo-psa的產生將不會完全消除llo功能，李斯特菌從單核細胞增多性李斯特菌產生的吞噬體、胞質溶膠侵襲和高效免疫性逃離需要所述llo功能。對來自lmdd-143和lmdda-143培養(yǎng)上清液的分泌的蛋白質的western印跡分析揭示出，對應于llo-psa融合蛋白的～81kda條帶和～60kda條帶(其為llo的預期大小)(圖18a)，指示llo從llo-psa融合物裂解或仍作為單個蛋白質由單核細胞增多性李斯特菌產生，而與染色體中的融合基因無關。lmdd-143和lmdda-143分泌的llo相較于野生型單核細胞增多性李斯特菌10403s保留50％的溶血活性(圖18b)。與這些結果一致，lmdd-143和lmdda-143能夠在巨噬細胞樣j774細胞系中胞內復制(圖18c)。實例14：lmdd-143和lmdda-143均引起針對psa抗原的細胞介導的免疫應答。在顯示lmdd-143和lmdda-143能夠分泌融合到llo的psa之后，研究了這些菌株是否可在體內引起psa特異性免疫應答的問題。c57bl/6小鼠不做處理或用lmdd-143、lmdda-143或lmdda-142免疫兩次。通過用psa65-74肽刺激脾細胞和針對ifn-γ進行胞內染色來測量psa特異性cd8+t細胞應答。如圖19中示出，染色體和基于質粒的載體誘導的免疫應答類似。材料與方法(實例15-19)mdsc和treg功能取決于腫瘤模型，將腫瘤植入小鼠的脅腹或生理學部位。7天后，向小鼠接種疫苗，接種首日取決于使用的腫瘤模型。然后在給予疫苗后一周，向小鼠施用強化疫苗。然后在強化后1周處死小鼠，并收獲腫瘤和脾，或者在侵襲性腫瘤型的情況下，在強化后3-4天收獲腫瘤和脾。在收獲腫瘤之前五天，給非荷瘤小鼠接種疫苗，以用于應答t細胞。采用標準方法學制備脾細胞。簡而言之，制備腫瘤和脾的單細胞懸液。手工地破碎脾，并裂解紅血細胞。切碎腫瘤，并與膠原酶/dna酶一起溫育。備選地，將gentlemacstm解離器與腫瘤解離藥劑盒一起使用。采用miltenyi藥劑盒和柱或automacs分離器，從腫瘤和脾純化mdsc或treg。然后對細胞計數。制備單細胞懸液，并裂解紅血細胞。然后以cfse標記應答t細胞。以1×105個t細胞/孔的密度，將應答t細胞(來自所有分裂周期階段)與mdsc或treg以2:1比率一起鋪板在96孔板中。然后用適當的肽(psa或ca9)刺激應答t細胞，或者用pma/離子霉素非特異性地刺激。將細胞在5％co2下在37℃在暗處溫育2天。兩天后，將細胞染色進行facs，并在facs機器上分析。t細胞應答的分析對于通過elisa進行的細胞因子分析，收獲脾細胞，并在有培養(yǎng)基、sea或cona(作為陽性對照)存在下，以150萬個細胞/孔鋪板在48孔平板中。溫育72小時后，收獲上清液，通過elisa(bd)分析細胞因子水平。對于抗原特異性ifn-γelispot，收獲脾細胞，并在有培養(yǎng)基、特定ctl肽、不相關肽、特定輔助肽或cona(作為陽性對照)存在下，以30萬和15萬個細胞/孔鋪板在ifn-γelispot平板中。溫育20小時后，進行elispots(bd)，并通過immunospot分析儀(c.t.l.)對斑點計數。將每一百萬個脾細胞的斑點數繪圖。使用coultercounter,z1對脾細胞計數。使用標準的基于ifn-γ的elispot測定，確定在以gag-ctl、gag-輔助、培養(yǎng)基、不相關抗原和cona(陽性對照)再刺激以后，產生ifn-γ的cd8+t細胞的頻率。簡而言之，以5mg/ml使用mabr40-a2和以最佳稀釋度使用多克隆兔抗ifn-γ(由universityofpennsylvania,philadelphia,pa的phillipscott博士友情提供)檢測ifn-γ。通過與使用鼠ri++fn-γ(lifetechnologies,gaithersburg,md)繪制的標準曲線進行對比，計算ifn-γ的水平。使用過氧化物酶偶聯的山羊抗兔iggab(ifn-γ)讓平板顯影。然后在405nm處讀取平板。測定法的檢測下限為30pg/ml。實例15：在李斯特菌疫苗處理以后的抑制性細胞功能在第0天，將腫瘤植入小鼠中。在第7天，給小鼠接種lmdda-e7或lmdda-psa。在第14天，收獲腫瘤，并測量接種組和未暴露的組的浸潤性mdsc和treg的數目和百分比。據發(fā)現，在李斯特菌處理過的小鼠的腫瘤中mdsc和treg的百分比以及mdsc的絕對數目的減小，而在脾或引流淋巴結(tldn)中沒有觀察到該效應(圖20)。將從上述實驗中的荷瘤小鼠提取的分離的脾細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞(til)合并，并針對cd3和cd8染色，以闡明lm-llo-e7、lm–llo–psa和lm-llo-ca9、lm-llo-her2免疫對mdsc和treg(脾和腫瘤的mdsc和treg)在腫瘤中的存在的影響(圖21-23)。每個列代表處于特定細胞分裂階段的t細胞群體的百分比，并且在特定處理組(未暴露的、肽ca9或psa處理、無mdsc/treg和無mdsc+pma/離子霉素)下分成小組(圖21-23)。針對存在的treg和mdsc的百分比，分析來自荷瘤小鼠的血液。在lm接種后，在小鼠血液中存在mdsc和treg二者的下降。實例16：在李斯特菌疫苗接種后，來自tpsa23腫瘤而不是脾的mdsc具有更低的抑制性。用非特異性地激活的未暴露的鼠細胞和特異性地激活的細胞(psa、ca9、pma/離子霉素)，使用分離自tpsa23腫瘤的單核細胞和粒細胞mdsc，進行抑制測定。結果證實：與來自未暴露的小鼠的腫瘤的mdsc相比，分離自lm接種組的腫瘤的mdsc具有減小的抑制激活的t細胞分裂的能力。(參見圖21&23中的lm-llo-psa和lm-llo處理組，在圖中右側的插圖代表來自左側插圖的合并的細胞分裂數據)。另外，來自未處理小鼠(其中不存在mdsc，并且其中細胞未被刺激/激活)的t應答細胞保持處于它們的親代(休眠)狀態(tài)(圖21&23)，而觀察到用pma或離子霉素刺激的t細胞發(fā)生復制(圖21&23)。另外，據觀察，gr+ly6g+和grdimly6g-mdsc在李斯特菌疫苗處理后抑制性較低。這適用于它們降低的抑制激活的psa特異性t細胞和非特異性(pma/離子霉素刺激的)t細胞分裂的能力。此外，采用分離自tpsa23腫瘤的mdsc以及非特異性地激活的未暴露的鼠細胞進行的抑制測定證實：與來自未暴露的小鼠的腫瘤的mdsc相比，分離自lm接種組的腫瘤的mdsc具有減小的抑制激活的t細胞分裂的能力(圖21&23)。另外，當使用脾mdsc時，沒有觀察到上文剛剛關于圖21和27討論的觀察結果。在后者中，來自未暴露的組、李斯特菌處理組(psa、ca9)和pma/離子霉素刺激組(陽性對照)的脾細胞/t細胞都表現出相同的復制水平(圖22&24)。因此，這些結果表明：李斯特菌介導的對腫瘤中抑制性細胞的抑制以抗原特異性和非特異性方式起作用，而李斯特菌對脾粒細胞mdsc沒有影響，因為它們僅以抗原特異性方式產生抑制。實例17：腫瘤調節(jié)性t細胞的減少的抑制使用在李斯特菌處理后分離自tpsa23腫瘤的treg，進行抑制測定。據觀察，在李斯特菌處理后，來自腫瘤的treg的抑制能力下降(圖25),但是，發(fā)現脾treg仍然是抑制性的(圖26)。作為對照，使用常規(guī)cd4+t細胞替代mdsc或treg，并發(fā)現對細胞分裂沒有影響(圖27)。實例18：在李斯特菌接種后，來自4t1腫瘤而不是脾的mdsc和treg具有較低的抑制性。如上所述的，采用4t1腫瘤進行了相同實驗，并且得到了相同的觀察結果，即，在李斯特菌接種后mdsc具有較低的抑制性(圖28&30)，李斯特菌對脾單核mdsc沒有特異性作用(圖29&31)，在李斯特菌疫苗接種后來自4t1腫瘤的treg的抑制能力下降(圖32)，以及李斯特菌對脾treg的抑制能力沒有影響(圖33)。最后，據觀察，李斯特菌對脾treg的抑制能力沒有影響。實例19：粒細胞和單核mdsc的抑制能力的變化是由于tllo的過表達llo質粒顯示出與含有taa或不相關抗原的李斯特菌疫苗類似的結果(圖34)。這意味著，粒細胞mdsc的抑制能力的變化是由于tllo的過表達，且獨立于伴侶融合抗原。單獨的空質粒構建體也會導致mdsc的抑制能力的變化，盡管不是與在質粒上含有截短llo的任意疫苗剛好相同的水平。3個獨立實驗的平均值表明：空質粒和其他含有tllo(含有和不含腫瘤抗原)的質粒之間的抑制差異是顯著的。不論是使用抗原特異性還是非特異性刺激的應答t細胞，mdsc抑制能力的下降是相同的。類似于粒細胞mdsc，3個獨立實驗的平均值表明：當與其他疫苗構建體相比，在用lm空質粒接種以后，從腫瘤純化的單核mdsc觀察到的抑制能力的差異是顯著的(圖35)。類似于以上觀察結果，在lm接種以后，從脾純化的粒細胞mdsc保留了它們抑制抗原特異性應答t細胞分裂的能力(圖36)。但是，在非特異性刺激以后，(以pma/離子霉素)激活的t細胞仍然能夠分裂。這些結果都沒有隨單獨llo或空質粒疫苗的使用而改變，表明基于lm的疫苗不會影響脾粒細胞mdsc(圖35)。類似地，在lm接種以后，從脾純化的單核mdsc保留它們的抑制抗原特異性應答t細胞分裂的能力。但是，在非特異性激活(以pma/離子霉素刺激)以后，t細胞仍然能夠分裂。這些結果都沒有隨單獨llo或空質粒疫苗的使用而改變，表明lm疫苗不會影響脾單核mdsc(圖37)。不論應答細胞是抗原特異性還是非特異性激活的，從任意lm處理組的腫瘤純化的treg都具有略微降低的抑制應答t細胞分裂的能力。特別是對于非特異性激活的應答t細胞而言，看起來好像含有空質粒的疫苗顯示出與在質粒上含有l(wèi)lo的所有疫苗相同的結果。該實驗與其他實驗的平均值表明，該差異不是顯著的(圖38)。從脾純化的treg仍然能夠抑制抗原特異性和非特異性激活的應答t細胞的分裂。lm處理對脾treg的抑制能力沒有影響(圖39)。不論應答細胞是抗原特異性還是非特異性激活的，tcon細胞都不能抑制t細胞的分裂，這與這些細胞不具有抑制性的事實一致。lm對這些細胞沒有影響，如果從小鼠的腫瘤或脾純化這些細胞，則不存在差異(圖40-41)。實例20：施用具有抗ox40或抗gitr抗體的基于李斯特菌的組合疫苗增加小鼠存活材料和方法動物、細胞系、疫苗和其他試劑六至八周齡雌性c57bl6小鼠購自jacksonlaboratories并保持在無病原體的條件下。小鼠根據gruanimalcareandusecommittee批準的方案按照nih指導原則管理。通過將人乳頭瘤病毒株16(hpv16)早期蛋白6和7(e6和e7)以及活化的ras癌基因共轉染到原代c57bl/6小鼠肺上皮細胞而得到的tc-1細胞得自atcc(manassas,va)，并使細胞在補充了10％fbs、青霉素和鏈霉素(各100u/ml)以及l(fā)-谷氨酰胺(2mm)的rpmi1640中在37℃和具有5％co2的條件下生長。如上文實例1中所述并如上文具體實施方式中所公開生成具有或不具有由advaxisinc.提供的人乳頭瘤病毒-16(hpv-16)e7的李斯特菌疫苗載體(lm-llo-e7、lmdda-llo和xfl7)。將lm-llo-e7、lmdda-llo和xfl7以1×108個cfu/小鼠的劑量經腹膜內(i.p.)注射。gitr和ox40抗體得自astrazeneca/medimmune并以50μg/小鼠(對于抗ox40ab)和250μg/小鼠(對于抗gitrab)的劑量靜脈內注射，如圖42a和圖42b中所示。腫瘤植入和處理如下開展了目的在于分析腫瘤生長和存活的治療性實驗。簡而言之，第0天在小鼠的右脅腹皮下(s.c.)每只小鼠植入70,000個tc-1腫瘤細胞。在第10天(腫瘤大小為直徑約4-5mm)，將來自適當組(每組10只小鼠)的動物用具有或不具有抗gitrab或抗ox40ab的lm-llo-e7、lmdda-llo和xfl7腹膜內注射，或不接受處理(nt)。(圖42c)在整個實驗過程中，接受抗ox40ab的小鼠一周兩次用疫苗和抗ox40ab處理(圖42，第10天、第13天、第17天、第20天等)。接受抗gitrab的小鼠一周兩次用總共3劑處理(圖42b，第10天、第13天和第17天)。另一組小鼠保持不處理。結果圖43a-b顯示當施用單獨的基于李斯特菌的疫苗adxs11-001時，經處理的小鼠的存活時間是未經處理或對照處理小鼠的至少兩倍，用adxs11-001處理和施用抗gitrab的組合不僅延長該群體的存活時間還提高存活百分比。增加百分比為約40％。adxs11-001與抗gitrab的組合導致在60％的經處理的小鼠中現有腫瘤完全消退(圖43a)。有趣的是，抗gitr抗體還顯示用lmdda-llo/抗gitr處理的小鼠相較于僅接受lmdda-llo的小鼠而言存活時間增加(圖43b)。圖44a-b顯示當施用單獨的基于李斯特菌的疫苗adxs11-001時，經處理的小鼠的存活時間是未經處理或對照處理小鼠的至少兩倍，用adxs11-001處理和施用抗ox40ab的組合不僅延長該群體的存活時間還提高存活百分比(圖44b)。增加百分比為約20％。因此，adxs11-001與抗ox40ab的組合導致在40％的經處理的小鼠中現有腫瘤完全消退(圖44a)。這些結果顯示使用抗ox40和抗gitr抗體提高了基于李斯特菌的疫苗的治療潛能。實例21：使用針對共刺激分子gitr和ox40的激動劑抗體顯著增強基于李斯特菌的免疫療法的抗腫瘤功效在實例20中提出的結果顯示激動劑抗體抗ox40和抗gitr增強基于李斯特菌的疫苗的治療潛能之后，分析了針對此提高的存活率的免疫應答。材料和方法動物、細胞系、疫苗和其他試劑六至八周齡雌性c57bl6小鼠購自jacksonlaboratories并保持在無病原體的條件下。小鼠根據gruanimalcareandusecommittee批準的方案按照nih指導原則管理。通過將人乳頭瘤病毒株16(hpv16)早期蛋白6和7(e6和e7)以及活化的ras癌基因共轉染到原代c57bl/6小鼠肺上皮細胞而得到的tc-1細胞得自atcc(manassas,va)，并使細胞在補充了10％fbs、青霉素和鏈霉素(各100u/ml)以及l(fā)-谷氨酰胺(2mm)的rpmi1640中在37℃和具有5％co2的條件下生長。如上文實例1中所述并如上文具體實施方式中所公開生成具有或不具有由advaxisinc.提供的人乳頭瘤病毒-16(hpv-16)e7的李斯特菌疫苗載體(lm[xfl7]、lm-llo[lmdda-llo]、lm-llo-e7[adxs11-001])?；诶钏固鼐寞煼ㄅc對照一起顯示在表3中。表3命名李斯特菌菌株描述lmxfl7lm-llolmdda-llolm-llo-e7adxs11-001從第13天開始每7天以1×108個cfu/小鼠的劑量經腹膜內(i.p.)注射lm、lm-llo和lm-llo-e7(圖45和圖51a)。gitr和ox40抗體得自astrazeneca/medimmune并靜脈內(i.v.)注射,如圖45、圖51中所示。腫瘤植入和處理治療性實驗分析腫瘤生長和免疫應答，并如下進行。簡而言之，第0天在小鼠的右脅腹皮下(s.c.)每只小鼠植入70,000個tc-1腫瘤細胞。在第13天(腫瘤大小為直徑約4-5mm)，將來自適當組(每組5只小鼠)的動物腹膜內注射具有或不具有抗gitrab(圖45，表4)或抗ox40ab(圖51，表5)的lm、lm-llo或lm-llo-e7，或不接受處理(nt)。第13天(d13)開始，接受抗ox40ab的小鼠以3-4天的間隔用疫苗和抗ox40ab處理，總共四次1mg/kg小鼠體重(mpk)劑量(圖51)。第13天(d13)開始，接受抗gitrab的小鼠以3-4天的間隔用疫苗和抗gitrab處理，總共四次5mg/kg小鼠體重(mpk)劑量(圖45)。另一組小鼠保持不用激動劑抗體處理(pbs列，如圖42c中所述)。在小鼠亞組中，每3-4天使用數顯卡尺測量腫瘤，并將使用公式v＝(w2×l)/2計算腫瘤體積，其中v是體積，l是長度(較長的直徑)，且w是寬度(較短的直徑)。在這些實驗中，當小鼠瀕死、腫瘤潰爛或腫瘤體積達到1.5cm3時，將小鼠處死。一個存在8個實驗組。在第26天(d26)，處死全部動物，采集脾臟和腫瘤且篩選浸潤性總cd4、treg(cd4+foxp3+)、非treg(cd4+foxp3-)、cd8+、cd8+e7+、髓源性抑制細胞(mdsc)、cd8+/treg、cd8+e7+/treg、cd8+/mdsc、cd8+e7+/mdsc。分析外周和腫瘤中的抗原特異性細胞免疫應答(asir)、treg、mdsc。將elispot用于檢測在得自經處理的小鼠和對照小鼠的e7再刺激(10μg/ml)脾細胞培養(yǎng)物中的ifnγ生成，如制造商(bdbiosciences,sanjose,ca)所建議的那樣。ctl免疫斑點分析儀(cellulartechnologyltd.,shakerheights,oh)將用于分析斑點。得自不相關肽(hgp10025–33-kvprnqdwl-celtekbioscience,nashville,tn)再刺激的脾細胞的斑點數將從e7再刺激的培養(yǎng)物中減去。此外，瘤內asir在圖48b和54b中示為抗原特異性腫瘤浸潤cd8+t細胞(cd8+e7+細胞)的數量。使用gentlemacs分離器和實體瘤勻化方案處理腫瘤樣品，如制造商(miltenyibiotec,auburn,ca)所建議的那樣。使用流式細胞術分析法分析cd45+造血細胞群中腫瘤浸潤性cd8+、cd4+foxp3+(treg)和cd11b+gr-1+(mdsc)細胞的數量。使用相同的流式細胞術分析法在荷瘤的經處理小鼠和對照小鼠的脾臟中評價了treg細胞和mdsc的水平。統計學分析所有統計參數均使用graphpadprism軟件(sandiego,ca)計算。組之間的統計顯著性通過tukey多重比較事后檢驗的單因素anova確定(p<0.05被視為統計顯著性)。結果與gitr激動劑抗體的組合在組合療法后，浸潤性cd4+t細胞的總數增多。圖46a顯示施用lm-llo-e7與gitr激動劑抗體的組合甚至相較于單獨的單一療法顯著增加腫瘤浸潤性總cd4+t細胞。重要的是，施用lm-llo-e7與gitr激動劑抗體的組合對treg細胞(cd4+foxp3+)總數不具有顯著作用(圖46b)。組合療法后，非tregcd4+t細胞的總數增加。圖47a顯示施用lm-llo-e7與gitr激動劑抗體的組合顯著增加非treg(cd4+foxp3-)cd4+t細胞的總數。有趣的是，施用基于李斯特菌的疫苗本身顯著降低了總cd4中的foxp3細胞的整體百分比，并且在與fitr激動劑抗體的組合中，該降低甚至顯著高于單獨的pbs或激動劑組(圖47b)組合療法還導致總cd8+t細胞的增強的腫瘤浸潤。觀測到施用lm-llo和lm-llo-e7與抗gitr激動劑抗體(ab)的組合顯著增加腫瘤浸潤性cd8+t細胞。(圖48a)有趣的是，觀測到lm-llo-e7與抗gitrab一起顯著增加腫瘤浸潤性抗原特異性cd8+e7+t細胞。(圖48b)組合療法提高腫瘤中的cd8/treg比率。據發(fā)現，組合gitrab組中的瘤內cd8/treg比率相較于單獨的pbs或抗體組顯著提高。(圖49a)觀測到lm-llo-e7和抗gitr組合組中的e7-cd8/treg比率未顯著提高。(圖49b)通過激動劑gitr抗體誘導mdsc。觀察到針對gitr的激動劑ab相較于pbs組顯著誘導mdsc。(圖50a)此外，使用抗gitrab與lm-llo-e7的組合顯著提高了cd8/mdsc比率。(圖50b)有趣的是，抗gitrab與lm-llo-e7的組合顯著提高了e7+cd8+/mdsc比率。(圖50c)與ox40激動劑抗體的組合有趣的是，ox40激動劑ab本身相較于pbs組顯著增加了總cd4+t細胞。基于李斯特菌的lm-llo-e7與ox40激動劑ab的組合僅比pbs組但不比單獨的單一療法顯著增加腫瘤浸潤性總cd4+t細胞。(圖52a)與基于李斯特菌的lm-llo和lm-llo-e7的組合顯著減少ox40ab誘導的treg細胞(cd4+foxp3+)。(圖52b)分析了腫瘤浸潤性總非treg(cd4+foxp3-)數量和總cd4+t細胞的treg百分比?；诶钏固鼐膃7疫苗與ox40激動劑ab的組合顯著增加了非treg(cd4+foxp3-)t細胞的總數。(圖53a)基于李斯特菌的疫苗本身顯著降低總cd4中foxp3細胞的整體百分比，并且在與ox40激動劑ab的組合中，該降低比所有組甚至明顯更高。(圖53b)組合療法后，總cd8+t細胞以及抗原特異性cd8+e7+細胞的數量增加。lm-llo-e7與抗ox40ab的組合導致cd8+t細胞總數相較于pbs組顯著提高。(圖54a)另外，當與抗ox40激動劑ab的施用組合時，觀察到lm-llo-e7顯著增加腫瘤浸潤性抗原特異性cd8+e7+t細胞。(圖54b)組合療法后，cd8/treg和e7cd8/treg的比率提高。據發(fā)現，抗ox40激動劑ab和lm-llo-e7組合組中相較于所有組，腫瘤中的cd8/treg比率顯著提高。(圖55a)據發(fā)現，抗ox40激動劑ab和lm-llo-e7組合組中相較于所有組，腫瘤中的e7cd8/treg比率提高。(圖55b)組合療法后誘導mdsc。觀察到激動劑ox40ab未顯著提高mdsc，而與lm-llo-e7的組合顯著降低此免疫抑制性mdsc。(圖56a)抗ox40ab與lm-llo-e7的組合顯著提高了cd8/mdsc比率。(圖56b)并且，抗ox40ab與lm-llo-e7的組合顯著提高了e7+cd8+/mdsc比率。(圖56c)結論：本文中呈現的結果顯示，與基于李斯特菌的e7疫苗組合時，存在抑制共刺激gitr和ox40通路的抗腫瘤和免疫應答。在lm-llo-e7腫瘤疫苗存在下共刺激gitr或ox40通路表現出提高的抗腫瘤活性和提高的存活率(實例20)。盡管抗gitr或抗ox40與基于肽的e7疫苗的組合顯著增加了總cd8以及抗原特異性cd8，但其對treg或mdsc群無作用。相反發(fā)現使用這些激動劑抗體的療法本身或與基于肽的e7疫苗的組合在tc1腫瘤模型中增加了腫瘤中的免疫抑制細胞。已知基于李斯特菌的疫苗減少免疫抑制細胞，包括treg和mdsc。這里觀察到在基于李斯特菌的疫苗存在下共刺激gitr或ox40通路提高了cd8t細胞與mdsc群的比率且增加cd8和抗原特異性cd8，從而整體提高與改善的抗腫瘤活性和存活率相關的效應細胞/免疫抑制細胞比率。材料與方法(實例22-27)寡核苷酸由invitrogen(carlsbad,ca)合成，dna測序由genewizinc,southplainfield,nj進行。流式細胞術試劑購自bectondickinsonbiosciences(bd,sandiego,ca)。除非另外指明，否則細胞培養(yǎng)基、補充劑和所有其他試劑均購自sigma(st.louise,mo)。由ezbiolabs(westfield,in)合成her2/neuhla-a2肽。完全rpmi1640(c-rpmi)培養(yǎng)基包含2mm谷氨酰胺、0.1mm非必需氨基酸和1mm丙酮酸鈉、10％胎牛血清、青霉素/鏈霉素、hepes(25mm)。之前描述了多克隆抗llo抗體，抗her2/neu抗體購自sigma。小鼠和細胞系所有動物實驗均根據universityofpennsylvania或rutgersuniversity的iacuc批準的方案進行。fvb/n小鼠購自jacksonlaboratories(barharbor,me)。在universityofpennsylvania的動物中心機構安置和飼養(yǎng)fvb/nher2/neu轉基因小鼠，其過表達大鼠her2/neu腫瘤蛋白。nt-2腫瘤細胞系表達高水平的大鼠her2/neu蛋白，源自這些小鼠中的自發(fā)性乳腺腫瘤，并按之前的描述生長。dhfr-g8(3t3/neu)細胞得自atcc并且根據atcc推薦方案生長。emt6-luc細胞系由johnohlfest博士(universityofminnesota,mn)慷慨贈送，并在完全c-rpmi培養(yǎng)基中生長。生物熒光工作在universityofpennsylvania(philadelphia,pa)的smallanimalimagingfacility(saif)的指導下進行。李斯特菌構建體和抗原表達her2/neu-pgem7z由universityofpennsylvania的markgreene博士友好提供，并含有克隆進pgem7z質粒(promega,madisonwi)中的全長人her2/neu(hher2)基因。將該質粒用作模板，以使用表6所示的pfxdna聚合酶(invitrogen)和寡聚物，通過pcr擴增hher-2/neu的三個區(qū)段，即ec1、ec2和ic1。表6：用于克隆人her-2嵌合體的引物通過soeingpcr方法，并將每個單獨的hher-2/neu區(qū)段作為模板，通過直接融合產生her-2/neu嵌合構建體。引物顯示在表7中。表7用于擴增不同片段人her2區(qū)域的引物序列使用xhoi和spei限制性酶從padv138切下chher2基因，并與lmdd穿梭載體padv134中截短的llo非溶血片段在同一閱讀框內克隆。插入序列l(wèi)lo和hly啟動子通過dna測序分析確認。將該質粒電穿孔轉化至電感受態(tài)acta、dal、dat突變單核細胞增多性李斯特菌菌株，在包含鏈霉素(250μg/ml)的腦心浸液(bhi)瓊脂平板上選擇lmdda和陽性克隆。在一些實驗中，表達hher2/neu(lm-hher2)片段的類似李斯特菌菌株用于對比目的。在所有研究中，包括不相關李斯特菌構建體(lm-對照)，以考慮到李斯特菌對免疫系統的抗原非依賴性效應。lm對照基于與adxs31-164(lmdda-chher2)相同的李斯特菌平臺，但表達不同的抗原，諸如hpv16-e7或ny-eso-1。測試李斯特菌的融合蛋白的表達和分泌。每個構建體體內傳代兩次。細胞毒性分析以3-5只fvb/n小鼠為一組，使用1×108個集落形成單位(cfu)的lm-llo-chher2、adxs31-164、lm-hher2ici或lm-對照(表達不相關抗原)以一周為間隔免疫三次或保持未暴露的。使nt-2細胞體外生長，通過胰蛋白酶脫壁，并用絲裂霉素c(250μg/ml，溶于無血清c-rpmi培養(yǎng)基)在37℃下處理45分鐘。在洗滌5次后，將其與從免疫或未暴露的動物收集的脾細胞以1:5(刺激因子:應答細胞)的比率在37℃和5％co2下一起溫育5天。標準細胞毒性分析使用銪標記的3t3/neu(dhfr-g8)細胞作為靶標根據前述方法進行。在4小時溫育后使用分光光度計(perkinelmer，victor2)在590nm下測定從殺死的靶細胞釋放的銪。特異性裂解的百分比定義為(實驗組的裂解-自發(fā)性裂解)/(最大裂解-自發(fā)性裂解)。免疫小鼠的脾細胞分泌的干擾素-γ以3-5只fvb/n或hla-a2轉基因小鼠為一組，使用1×108個cfu的陰性李斯特菌對照adxs31-164(表達不相關抗原)以一周為間隔免疫三次或保持未暴露的。在最后免疫后一周分離fvb/n小鼠的脾細胞，并以5×106個細胞/孔在24孔板中的c-rpmi培養(yǎng)基中在存在絲裂霉素c處理的nt-2細胞的情況下共培養(yǎng)。在1μmhla-a2特異性肽或1μg/ml重組his-標記的chher2蛋白(大腸桿菌中產生并且通過基于鎳的親和色譜系統純化)存在下，溫育來自hla-a2轉基因小鼠的脾細胞。在24或72小時后從上清液獲得樣品，使用小鼠ifn-γ酶聯免疫吸附分析(elisa)藥劑盒根據制造商的推薦方案測試干擾素-γ(ifn-γ)的存在。her2轉基因動物中的腫瘤研究六周齡fvb/n大鼠her2/neu轉基因小鼠(9-14只/組)使用5×108個cfu的lm-llo-chher2、adxs31-164或lm對照免疫6次。每周觀察自發(fā)性乳腺腫瘤的出現兩次，使用電子卡尺測量腫瘤，最多52周。當平均直徑大小達到1cm2時切下逃逸的腫瘤，在-20℃下保存于rnalater中°。為了確定her2/neu蛋白中的突變對這些腫瘤逃逸的影響，使用基因組dna分離藥劑盒提取基因組dna并且測序。adxs31-164對脾臟和腫瘤中調節(jié)性t細胞的作用將小鼠皮下(s.c.)植入1×106個nt-2細胞。在第7、14和21天，使用1×108個cfu的adxs31-164、lmdda-對照對它們進行免疫或保持未暴露的。在第28天提取腫瘤和脾臟并通過facs分析測試cd3+/cd4+/foxp3+treg的存在。簡而言之，通過在c-rpmi培養(yǎng)基中勻化兩個載玻片之間的脾臟而分離脾細胞。使用無菌刀片切碎腫瘤，并用包含dna酶(12u/ml)和溶于pbs的膠原酶(2mg/ml)的緩沖液消化。在室溫下攪拌溫育60min后，通過猛烈吹打而分離細胞。用rbc裂解緩沖液裂解紅細胞，然后用包含10％fbs的完全rpmi-1640培養(yǎng)基洗滌多次。在通過尼龍網過濾后，將腫瘤細胞和脾細胞重懸于facs緩沖液(2％fbs/pbs)中，用抗cd3-percp-cy5.5、cd4-fitc、cd25-apc抗體染色，然后進行透化和抗foxp3-pe染色。使用4色facscalibur(bd)進行流式細胞分析，使用cellquest軟件(bd)分析數據。統計學分析將對數秩卡方檢驗用于存活期數據，并將學生t-檢驗用于ctl和elisa分析，所述分析一式三份地進行。在這些分析中，小于0.05的p-值(以*標記)被視為具有統計學上的顯著性。所有統計學分析均使用prism軟件v.4.0a(2006)或spss軟件v.15.0(2006)進行。除非另有說明，否則對于所有的fvb/n大鼠her2/neu轉基因研究，我們均使用8-14只小鼠/組，對于所有野生型fvb/n研究，我們均使用至少8只小鼠/組。除了在her2/neu轉基因小鼠模型中的長期腫瘤研究以外，所有研究重復至少一次。實例21：分泌與her-2片段融合的llo片段的單核細胞增多性李斯特菌菌株的制備：adxs31-164的構建嵌合的her2/neu基因(chher2)的構建如下文所述。簡而言之，通過soeingpcr方法，通過直接融合her2/neu蛋白的兩個胞外片段(氨基酸40-170和氨基酸359-433)和一個胞內片段(氨基酸678-808)，制備chher2基因。嵌合蛋白具有蛋白的大部分已知的人mhci類表位。從質粒padv138(其用于構建lm-llo-chher2)切離chher2基因，并克隆進lmdda穿梭質粒，從而產生質粒padv164(圖57a)。這兩個質粒骨架之間有兩個主要差異。1)padv138使用氯霉素抗性標記(cat)進行重組細菌的體外選擇，而padv164具有枯草芽孢桿菌的d-丙氨酸消旋酶基因(dal)，它使用缺乏dal-dat基因的lmdda菌株中的體外選擇和體內質粒保持的代謝互補途徑。此疫苗平臺被設計和開發(fā)成解決fda對工程化李斯特菌疫苗株的抗生素抗性的關注。2)與padv138不同，padv164不具有質粒中的prfa基因拷貝(參見以下序列和圖57a)，因為這不是lmdd菌株的體內互補必需的。lmdda疫苗株還缺乏acta基因(負責李斯特菌的胞內移動和細胞間播散)，因此來源于此骨架的重組疫苗株的毒性比來源于其親代菌株lmdd的那些小100倍?；趌mdda的疫苗從免疫小鼠脾臟的清除也比基于lmdd的疫苗快(在不到48小時內)。體外生長8小時之后經tca沉淀的細胞培養(yǎng)物上清液中，來自該菌株的融合蛋白tllo-chher2的表達和分泌與lm-llo-chher2的表達和分泌相當(圖57b)，因為使用western印跡分析通過抗llo抗體檢測到～104kd的帶。僅表達tllo的李斯特菌骨架菌株用作陰性對照。padv164序列(7075個堿基對)(參見圖57a和57b)：(sedidno:87)實例22：adxs31-164的免疫原性與lm-llo-chher2一樣在標準ctl測定中，將adxs31-164在產生抗her2/neu特異性細胞毒性t細胞方面的免疫原性性質與lm-llo-chher2疫苗的進行比較。兩種疫苗引起對由3t3/neu靶細胞表達的her2/neu抗原強烈的但是相當的細胞毒性t細胞應答。因此，使用僅表達融合到llo的her2胞內片段的李斯特菌免疫的小鼠顯示出比包含多個mhci類表位的嵌合體更低的裂解活性。在未暴露的動物或不相關李斯特菌疫苗注射的小鼠中未檢測到ctl活性(圖58a)。adxs31-164也能夠刺激得自野生型fvb/n小鼠的脾細胞分泌ifn-γ(圖58b)。這在與經絲裂霉素c處理的表達高水平的her2/neu抗原的nt-2細胞共培養(yǎng)的這些細胞的培養(yǎng)物上清液中檢測到(圖58c)。在hla-a2小鼠中測試了adxs31-164免疫后人mhci類表位的適當處理和呈遞。將來自經免疫的hla-a2轉基因動物的脾細胞與對應于標繪的hla-a2限制性表位的肽一起溫育72小時，所述hla-a2限制性表位位于her2/neu分子的胞外(hlyqgcqvvseqidno:88或kifgslaflseqidno:89)或胞內(rllqetelvseqidno:90)域(圖58c)。重組chher2蛋白用作陽性對照，不相關肽或無肽作為陰性對照。來自該實驗的數據表明：adxs31-164能夠引起針對位于靶抗原的不同域處的人表位的抗her2/neu特異性免疫應答。實例23：adxs31-164在預防自發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)作中比lm-llo-chher2更有效對比了adxs31-164與lm-llo-chher2在her2/neu轉基因動物中的抗腫瘤效果，該轉基因動物在20-25周齡時產生緩慢生長的、自發(fā)性乳腺腫瘤。所有使用不相關李斯特菌對照疫苗免疫的動物在21-25周內患上乳腺腫瘤并且在第33周前處死。相比而言，李斯特菌-her2/neu重組疫苗導致乳腺腫瘤形成的明顯延遲。在第45周，超過50％的adxs31-164疫苗接種的小鼠(9只中的5只)仍無腫瘤，相比之下，使用lm-llo-chher2免疫的小鼠只有25％。在第52周，8只經adxs31-164免疫的小鼠中的2只仍保持無腫瘤，而來自其他實驗組的所有小鼠均已死于它們的疾病(圖59)。這些結果指出：盡管adxs31-164更加減毒，但是其在her2/neu轉基因動物中預防自發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)作方面比lm-llo-chher2更有效。實例24：經adxs31-164免疫后her2/neu基因的突變her2/neu的mhci類表位中的突變已被認為是造成以小片段疫苗或曲妥珠單抗(赫賽汀，一種靶向her2/neu的胞外域中的表位的單克隆抗體)免疫后的腫瘤逃逸的原因。為評估該作用，從轉基因動物中的逃逸腫瘤提取基因組物質，并對嵌合或對照疫苗免疫的腫瘤中neu基因的對應片段進行測序。在任何接種疫苗的腫瘤樣品的her-2/neu基因中均未觀察到突變，這提示替代性逃逸機制(數據未顯示)。實例25：adxs31-164引起腫瘤內調節(jié)性t細胞的明顯下降為闡明adxs31-164對脾臟和腫瘤中調節(jié)性t細胞頻率的影響，將nt-2腫瘤細胞植入小鼠。在三次免疫后分離脾細胞和腫瘤內淋巴細胞并對treg染色，treg定義為cd3+/cd4+/cd25+/foxp3+細胞，但是當單獨分析時，foxp3或cd25標記獲得了類似的結果。結果指出：與不相關李斯特菌或未暴露的動物相比，adxs31-164免疫對脾中treg的頻率沒有影響(圖60)。相比之下，李斯特菌疫苗免疫對腫瘤中treg的存在產生很大的影響(圖61a)。然而在未處理腫瘤中所有cd3+t細胞中平均19.0％是treg，該頻率對于不相關疫苗而言下降至4.2％，并且對于adxs31-164而言下降至3.4％，腫瘤內treg的頻率下降了5倍(圖61b)。任一lmdda疫苗治療的小鼠中腫瘤內treg的頻率降低不能歸因于腫瘤大小的差異。在代表性實驗中，adxs31-164免疫的小鼠的腫瘤顯著小于[平均直徑(mm)±sd，6.71±0.43，n＝5]未治療的小鼠(8.69±0.98,n＝5,p<0.01)或不相關疫苗治療的小鼠(8.41±1.47,n＝5,p＝0.04)的腫瘤，而最后兩組的比較未顯示出腫瘤大小的統計學上的顯著差異(p＝0.73)。lmdda疫苗處理的腫瘤中treg頻率的下降使腫瘤內cd8/treg比率升高，暗示在lmdda疫苗免疫后可獲得更有利的腫瘤微環(huán)境。然而，只有表達靶抗原h(huán)er2/neu的疫苗(adxs31-164)能夠減緩腫瘤生長，表明treg的減少僅在腫瘤中存在抗原特異性應答的情況下具有作用。實例26：adxs31-164的外周免疫可延緩腦中轉移性乳腺癌細胞系的生長使用adxs31-164或不相關lm-對照疫苗ip免疫小鼠，然后顱內植入5,000個表達熒光素酶和低水平her2/neu的emt6-luc腫瘤細胞(圖62a)。在接種后的不同時間通過麻醉小鼠的離體成像監(jiān)測腫瘤。在腫瘤接種后第8天，檢測所有對照動物中的腫瘤，但adxs31-164中的小鼠均未顯示出任何可檢測的腫瘤(圖62a和62b)。adxs31-164可明顯延緩這些腫瘤的發(fā)病，因為在腫瘤接種后第11天陰性對照組中的所有小鼠已死于腫瘤，但adxs31-164組中的所有小鼠仍然存活，并且僅顯示出少量腫瘤生長的跡象。這些結果強烈暗示，adxs31-164的外周施用得到的免疫應答可能到達中樞神經系統，并且基于lmdda的疫苗可具有治療cns腫瘤的潛在用途。實例27：基于lm的her2/neu疫苗、gitr激動劑抗體和檢查點抑制劑pd-1ab的三重組合在her2/neu陽性bc小鼠模型中的治療功效和免疫調節(jié)作用實驗設計：小鼠腫瘤模型：使用了兩個小鼠腫瘤模型：大鼠her-2/fvb/n小鼠模型和fvb/nher-2/neu轉基因小鼠模型?？贵w：抗pd1(rmp-14克隆，大鼠igg2a)和抗gitr(dta-1克隆)。兩種抗體均一周兩次i.p注射。抗pd-1ab在整個實驗期間均以1mg/kg體重的劑量給予。對于激動劑gitrab，以5mg/kg體重的劑量給予總共4劑。使用大鼠her-2/fvb/n小鼠模型的實驗：因為大鼠和人類her-2/neu蛋白高度同源，所以使用大鼠her-2/fvb/n小鼠模型測試基于lm的her-2/neu疫苗與gitr激動劑和抗pd-1ab的組合的治療性腫瘤作用。通過在右脅腹注射1×106個表達高水平的大鼠her2/neu蛋白的nt-2腫瘤細胞在雌性fvb/n小鼠(8-10周大；5只/組)中皮下植入腫瘤。當腫瘤體積達到約0.5cm3時，將小鼠隨機分成16組(表8)且用高度減毒的基于lm的疫苗載體處理(i.p.；通過體內毒性分析法測定為1至5×108個集落形成單位)，這些載體具有或不具有l(wèi)lo和her2/neu(lm、lm-llo和adxs31-164)、抗pd1ab和激動劑抗gitrab。疫苗的初免劑量之后為間隔7天的兩次強化。表8：在用于治療、免疫應答和腫瘤預防研究的16個組中的小鼠分布。與疫苗同一天開始施用激動劑gitrab，總共4劑。因為pd1在早期活化和t細胞耗盡中發(fā)揮作用，所以在疫苗后施用抗pd-1可使正在耗盡的t細胞復興。因此，在第二次疫苗接種后3天注射抗pd1ab以確定是否可進一步增強抗原特異性應答。在對照組中，小鼠接受pbs。測量腫瘤生長和存活。使用數顯卡尺每周測量腫瘤兩次，并使用公式v＝(w2*l)/2計算腫瘤體積，其中v是體積，l是長度(較長的直徑)，且w是寬度(較短的直徑)。當瀕死或腫瘤體積達到1.5cm3時處死小鼠。一般治療計劃顯示在圖63中。實驗重復兩次。使用fvb/nher-2/neu轉基因小鼠模型的實驗：使用nt-2細胞系的可移植腫瘤鼠類模型是對her-2/neu抗原具有極低耐受性的快速生長腫瘤模型。對her-2/neu抗原的耐受性在降低疫苗的免疫治療功效中可起到重要作用的更具攻擊性腫瘤模型為大鼠her-2/neu轉基因小鼠模型。在此模型中，小鼠在20-25周齡之間產生自發(fā)性、緩慢生長的乳房腫瘤。通過使用該小鼠品系，因此我們能夠測試基于lm的her2/neu疫苗是否能克服對her-2/neu自身抗原的耐受性。這些小鼠的繁殖對由advaxis,inc.友情提供。如表8中所示將小鼠分成16組。小鼠從第6周開始以3周為間隔總共免疫六劑(1至5×108個集落形成單位)。相較于上文闡述的快速生長模型，疫苗在此模型中可能更具免疫性，因為該模型是預防性模型且自發(fā)性腫瘤直至約第20周才開始出現。激動劑gitrab與總共6劑疫苗在同一天開始施用且與疫苗的每個劑量一起給予。在最后一次疫苗接種后3-4天開始用抗pd1ab處理且在整個實驗期間繼續(xù)。一周兩次觀察小鼠的自發(fā)性乳房腫瘤的出現和生長，持續(xù)長達52周。通過觸診上部和下部小鼠乳腺體來檢測自發(fā)腫瘤形成，確定腫瘤直徑小至1至2mm。一般治療計劃顯示在圖5中。免疫應答和調節(jié)研究：另外，在腫瘤、脾臟和腫瘤引流淋巴結(tdln)中研究對腫瘤生長和存活率起作用的免疫調節(jié)的詳細機制。對于這些實驗，將小鼠分組(4只小鼠/組)且與上文類似地進行處理并在第二次免疫后六天和第三次免疫后一周時處死。采集腫瘤、脾臟、tdln且執(zhí)行以下分析：雖然本文已示出和描述了本發(fā)明的某些特征，但現在本領域的普通技術人員將想到許多修改、置換、變化和等同形式。因此，應當理解，所附權利要求書旨在涵蓋落在本發(fā)明的真實精神范圍內的所有此類修改和變化。序列表<110>阿德瓦希斯公司s·卡赫里夫m·馬克里提齊安<120>基于李斯特菌的疫苗與抗ox40或抗gitr抗體的組合<130>p-78657-pc<150>62/094,472<151>2014-12-19<150>62/094,349<151>2014-12-19<150>62/147,463<151>2015-04-14<150>62/262,896<151>2015-12-03<160>89<170>patentin3.5版<210>1<211>32<212>prt<213>人工序列<220><223>pest序列<400>1lysgluasnserilesersermetalaproproalaserproproala151015serprolysthrproileglulyslyshisalaaspgluileasplys202530<210>2<211>529<212>prt<213>人工序列<220><223>genbank登錄號p13128<400>2metlyslysilemetleuvalpheilethrleuileleuvalserleu151015proilealaglnglnthrglualalysaspalaseralapheasnlys202530gluasnserilesersermetalaproproalaserproproalaser354045prolysthrproileglulyslyshisalaaspgluileasplystyr505560ileglnglyleuasptyrasnlysasnasnvalleuvaltyrhisgly65707580aspalavalthrasnvalproproarglysglytyrlysaspglyasn859095glutyrilevalvalglulyslyslyslysserileasnglnasnasn100105110alaaspileglnvalvalasnalaileserserleuthrtyrprogly115120125alaleuvallysalaasnsergluleuvalgluasnglnproaspval130135140leuprovallysargaspserleuthrleuserileaspleuprogly145150155160metthrasnglnaspasnlysilevalvallysasnalathrlysser165170175asnvalasnasnalavalasnthrleuvalgluargtrpasnglulys180185190tyralaglnalatyrproasnvalseralalysileasptyraspasp195200205glumetalatyrsergluserglnleuilealalyspheglythrala210215220phelysalavalasnasnserleuasnvalasnpheglyalaileser225230235240gluglylysmetglnglugluvalileserphelysglniletyrtyr245250255asnvalasnvalasngluprothrargproserargphepheglylys260265270alavalthrlysgluglnleuglnalaleuglyvalasnalagluasn275280285proproalatyrileserservalalatyrglyargglnvaltyrleu290295300lysleuserthrasnserhisserthrlysvallysalaalapheasp305310315320alaalavalserglylysservalserglyaspvalgluleuthrasn325330335ileilelysasnserserphelysalavaliletyrglyglyserala340345350lysaspgluvalglnileileaspglyasnleuglyaspleuargasp355360365ileleulyslysglyalathrpheasnarggluthrproglyvalpro370375380ilealatyrthrthrasnpheleulysaspasngluleualavalile385390395400lysasnasnserglutyrilegluthrthrserlysalatyrthrasp405410415glylysileasnileasphisserglyglytyrvalalaglnpheasn420425430ilesertrpaspgluvalasntyraspprogluglyasngluileval435440445glnhislysasntrpsergluasnasnlysserlysleualahisphe450455460thrserseriletyrleuproglyasnalaargasnileasnvaltyr465470475480alalysglucysthrglyleualatrpglutrptrpargthrvalile485490495aspaspargasnleuproleuvallysasnargasnileseriletrp500505510glythrthrleutyrprolystyrserasnlysvalaspasnproile515520525glu<210>3<211>441<212>prt<213>人工序列<220><223>llo蛋白的n末端片段<400>3metlyslysilemetleuvalpheilethrleuileleuvalserleu151015proilealaglnglnthrglualalysaspalaseralapheasnlys202530gluasnserileserservalalaproproalaserproproalaser354045prolysthrproileglulyslyshisalaaspgluileasplystyr505560ileglnglyleuasptyrasnlysasnasnvalleuvaltyrhisgly65707580aspalavalthrasnvalproproarglysglytyrlysaspglyasn859095glutyrilevalvalglulyslyslyslysserileasnglnasnasn100105110alaaspileglnvalvalasnalaileserserleuthrtyrprogly115120125alaleuvallysalaasnsergluleuvalgluasnglnproaspval130135140leuprovallysargaspserleuthrleuserileaspleuprogly1451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