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      一種制備膠原蛋白海綿的方法與流程

      文檔序號(hào):11665840閱讀:918來源:國知局
      一種制備膠原蛋白海綿的方法與流程

      本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種制備膠原蛋白海綿的方法。



      背景技術(shù):

      膠原是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix)的主要成分,是動(dòng)物體內(nèi)最多的蛋白質(zhì)。膠原具有抗原性低、與細(xì)胞親合力強(qiáng)、與血小板產(chǎn)生凝血作用等特點(diǎn),因而在醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。膠原蛋白海綿的主要成份是膠原蛋白,它與人體膠原蛋白結(jié)構(gòu)相似,很適合人體器官的修復(fù)和再生。膠原蛋白能促進(jìn)傷口愈合和肉芽組織的生長,具有良好的止血和填充作用,可用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合、止血、手術(shù)殘腔填充等。然而,單獨(dú)以膠原制備的膠原蛋白海綿的力學(xué)性能、熱穩(wěn)定性、抗酶降解能力等方面還常常不能滿足應(yīng)用的要求;特別是膠原的低力學(xué)性能,通常會(huì)使它用于制備的組織工程支架無法在較長的時(shí)間內(nèi)維持較為固定的形態(tài)。膠原蛋白改性的方法很多,例如中國發(fā)明專利公開號(hào)第cn101234216a報(bào)道膠原–殼聚糖共混改性雖然能夠提高膠原的力學(xué)強(qiáng)度和熱學(xué)性能,但由于是氫鍵等次價(jià)鍵相互作用的結(jié)果,改善程度有限。又如中國發(fā)明專利公開號(hào)第cn104558675a號(hào),公開了一種止血膠原蛋白海綿的制造工藝,其制備方式為調(diào)節(jié)膠原蛋白溶液的ph、溫度、鹽濃度,使膠原分子間通過電荷作用聚集,所得組裝膠原再經(jīng)冷凍干燥后制成膠原蛋白海綿,再經(jīng)熱交聯(lián)即得微纖維止血膠原海綿。但其在體內(nèi)降解周期較長,需15到30周的降解時(shí)間,且制備工藝繁瑣,安全性不高。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于:提供一種制備膠原蛋白海綿的方法,采用化學(xué)交聯(lián),但在透析過程中就及時(shí)有效地將游離交聯(lián)劑洗脫,改性膠原蛋白能獲得均勻一致的交聯(lián),可有效調(diào)節(jié)、改進(jìn)膠原的性質(zhì),提高其交聯(lián)度、力學(xué)性能及生物相容性;同時(shí)有效避免交聯(lián)劑所帶來的生物毒性,在海綿凍干后無需再進(jìn)行交聯(lián)劑清洗再凍干等復(fù)雜工藝。此技術(shù)克服現(xiàn)有傳統(tǒng)膠原蛋白海綿力學(xué)性能差、在應(yīng)用過程中容易塌陷,難以維持其固有形態(tài)等缺陷,以及現(xiàn)有改性的膠原蛋白海綿在體內(nèi)降解周期較長,制備工藝繁瑣,安全性不高等缺陷。

      本發(fā)明的技術(shù)方案:提供一種制備膠原蛋白海綿的方法,包括以下步驟:

      步驟1:取膠原蛋白透析液與交聯(lián)劑混合形成透析外液,將膠原蛋白置于透析外液中進(jìn)行透析同時(shí)對(duì)膠原進(jìn)行交聯(lián),得到均勻的膠原凝膠;

      步驟2:以膠原蛋白透析液清洗所述第1步驟獲得的膠原凝膠,洗脫殘余交聯(lián)劑,以獲得純凈的膠原凝膠;

      步驟3:對(duì)所述純凈的膠原凝膠進(jìn)行均質(zhì)勻漿,使之乳化發(fā)泡,形成多孔狀膠原凝膠;

      步驟4:注模成型,冷凍干燥后獲得膠原海綿。

      優(yōu)選地,所述步驟1中,所述膠原蛋白透析液是注射用水;所述交聯(lián)劑為尼京平、戊二醛、甲醛、碳化二亞胺、改性戊二醛中的一種或幾種的混合物;所述交聯(lián)劑在透析外液中的初始體積比濃度為0.005%~0.5%。

      優(yōu)選地,所述步驟1中,將膠原蛋白按膠原凝膠與透析外液體積比為1:5~1:20的用量置于透析外液中進(jìn)行透析同時(shí)對(duì)膠原進(jìn)行交聯(lián);在4~10℃下靜置孵化12~48h,每6~8h更換透析外液,得到均勻的膠原凝膠。

      作為優(yōu)選,所述的膠原凝膠濃度為0.05%~2%。

      優(yōu)選地,所述步驟2中,利用膠原蛋白透析液進(jìn)行清洗;更換純透析液洗脫4~8次,每6~8h更換透析液,更換的新透析液不含交聯(lián)劑,多次置換以利于洗脫去除游離的交聯(lián)劑。

      優(yōu)選地,所述步驟3中,使用均質(zhì)勻漿機(jī)進(jìn)行均質(zhì)勻漿,轉(zhuǎn)速為9000~15000rpm,使之充分機(jī)械乳化發(fā)泡,然后再用攪拌器進(jìn)行低速機(jī)械攪拌1~4小時(shí),攪拌速度為700~1500rpm。

      優(yōu)選地,所述步驟4中,將發(fā)泡后的膠原蛋白乳化液注入模具,將模具注滿為止,然后震蕩使之表面平滑,在室溫放置20~80min后,再放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥,所述冷凍干燥時(shí)間為24h-48h。

      本發(fā)明的制備膠原蛋白海綿的方法,進(jìn)一步包括步驟5:對(duì)膠原海綿進(jìn)行輻照滅菌。

      本發(fā)明還提供一種膠原蛋白海綿,產(chǎn)品純度高達(dá)99%以上,灰分含量低于0.5%,具有均勻的多孔結(jié)構(gòu),吸水率達(dá)50~80倍,止血時(shí)間在5分鐘以內(nèi),在機(jī)體內(nèi)4~8周能完全降解。

      所述的膠原蛋白海綿,是由上述的制備方法制成的。

      本發(fā)明的技術(shù)效果:本發(fā)明在透析過程中進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)處理,不僅達(dá)到了交聯(lián)的目的,而且將游離的交聯(lián)劑及時(shí)清除,減少游離交聯(lián)劑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的生物毒性,有效克服了化學(xué)交聯(lián)缺點(diǎn),并且簡(jiǎn)化了海綿制備工藝。膠原凝膠經(jīng)均質(zhì)勻漿,機(jī)械乳化發(fā)泡后,注入適合的模具,再通過冷凍干燥制得膠原蛋白海綿。將此交聯(lián)方式與冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合,改善膠原材料的機(jī)械強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性及降解性能,獲得外觀形貌良好,且有較合適的體內(nèi)降解時(shí)間,安全有效的膠原蛋白海綿。本發(fā)明的制備方法產(chǎn)能高、工藝穩(wěn)定,制得的膠原蛋白海綿可廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、外科手術(shù)創(chuàng)口的止血和修復(fù),具有良好的應(yīng)用前景。

      附圖說明

      圖1是本發(fā)明實(shí)施例的制備膠原海綿的流程圖。

      圖2是本發(fā)明實(shí)施例的膠原蛋白海綿的微觀結(jié)構(gòu),圖2-1和圖2-2分別對(duì)應(yīng)放大倍數(shù)為500倍和100倍的sem電鏡掃描圖。

      圖3是本發(fā)明實(shí)施例的膠原蛋白海綿在動(dòng)物體內(nèi)降解對(duì)比圖:其中圖3-1是本發(fā)明實(shí)施例所制備的膠原蛋白海綿植入動(dòng)物體內(nèi)降解7天10×5he染色;圖3-2是植入動(dòng)物體內(nèi)降解15天10×20三色染;圖3-3是植入動(dòng)物體內(nèi)降解60天10×10三色染。

      具體實(shí)施方式

      為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白,以下結(jié)合附圖及實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解,此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。

      為了說明本發(fā)明所述的技術(shù)方案,下面通過具體實(shí)施例來進(jìn)行說明。

      本發(fā)明涉及一種膠原蛋白海綿的制備方法(參照?qǐng)D1)。本發(fā)明膠原蛋白海綿原料在透析過程中進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)改性,形成膠原凝膠,這個(gè)過程不僅完成了膠原的透析、交聯(lián)過程,而且能將游離交聯(lián)劑洗脫出來,最后將得到的凝膠經(jīng)均質(zhì)勻漿后,注入適合的模具,進(jìn)行冷凍干燥。該工藝所得產(chǎn)品純度高達(dá)99%以上,灰分含量低于0.5%,具有均勻的多孔結(jié)構(gòu)(參照?qǐng)D2-1、2-2),親水性強(qiáng)、吸水率可達(dá)50~80倍,能及時(shí)有效止血,止血時(shí)間在5分鐘以內(nèi),降解時(shí)間適中,在機(jī)體內(nèi)4~8周能完全降解(參照?qǐng)D3)。解決了傳統(tǒng)膠原蛋白海綿力學(xué)性能差、在應(yīng)用過程中容易塌陷,難以維持其固有形態(tài)等缺陷。該制備方法產(chǎn)能高、工藝穩(wěn)定,制得的膠原蛋白海綿可廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、外科手術(shù)創(chuàng)口的止血和修復(fù),具有良好的應(yīng)用前景。

      本發(fā)明實(shí)施例所獲得的膠原蛋白海綿,其具備多孔結(jié)構(gòu),參照?qǐng)D2-1、2-2,此兩圖為海綿的切面圖,可以看出海綿為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),空間分布均勻,孔隙分布均勻,經(jīng)檢測(cè)分析得出孔徑大小為100~300μm。其這種多孔結(jié)構(gòu)具有較好的力學(xué)性能及有效的止血功能。若海綿孔徑過大,會(huì)導(dǎo)致其機(jī)械性能降低,容易形成二次出血;孔徑過小,使其單位體積內(nèi)材料增多,不利于后期止血材料的體內(nèi)降解。

      本發(fā)明實(shí)施例所指灰分是指膠原蛋白海綿經(jīng)高溫煅燒后殘留的無機(jī)鹽成分。

      如圖1的所示,本發(fā)明實(shí)施例的制備膠原蛋白海綿的方法,包括下列步驟1~5。

      步驟1:進(jìn)行透析同時(shí)交聯(lián)的工藝,得到均勻的膠原凝膠。

      該步驟1具體為:取膠原蛋白透析液與交聯(lián)劑混合形成透析外液。其中膠原蛋白透析液為注射用水,用量為透析內(nèi)液體積的5~20倍。透析內(nèi)液即為要進(jìn)行透析工藝的膠原蛋白原液。交聯(lián)劑為尼京平、戊二醛、甲醛、碳化二亞胺、改性戊二醛中的一種或幾種的混合物。交聯(lián)劑在透析外液中的初始質(zhì)量體積比濃度為0.005%~0.5%。將膠原蛋白按膠原凝膠與透析外液體積比為1:5~1:20的用量置于透析外液中進(jìn)行透析同時(shí)對(duì)膠原進(jìn)行交聯(lián);在4~10℃下靜置孵化12~48h,每6~8h更換透析外液,得到均勻的膠原凝膠。所述的膠原凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%~2%。

      步驟2:洗脫游離交聯(lián)劑,獲得不含游離交聯(lián)劑的膠原蛋白。具體地,利用膠原蛋白透析液進(jìn)行清洗,具體是更換純透析液洗脫4~8次,每6~8h更換透析液,更換的新透析液不含交聯(lián)劑,多次置換以利于洗脫去除游離的交聯(lián)劑。

      步驟3:使用均質(zhì)勻漿機(jī)進(jìn)行均質(zhì)勻漿,轉(zhuǎn)速為9000~15000rpm,使之充分機(jī)械乳化發(fā)泡,然后再用攪拌器進(jìn)行低速機(jī)械攪拌1~4小時(shí),速度為700~1500rpm。

      步驟4:注模成型,從而獲得所需要的膠原蛋白海綿。具體是將發(fā)泡后的膠原蛋白乳化液注入模具,將模具注滿為止,然后震蕩使之表面平滑,在室溫放置20~80min后,再放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥,所述冷凍干燥時(shí)間為24h-48h。

      步驟5:包裝滅菌。具體是密封包裝后,進(jìn)行輻照滅菌。

      本發(fā)明實(shí)施例的制備膠原蛋白海綿的方法,是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足和缺陷,在透析過程中進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)處理,不僅達(dá)到了交聯(lián)的目的,而且將游離的交聯(lián)劑及時(shí)清除,減少游離交聯(lián)劑對(duì)人體產(chǎn)生的副作用,并且簡(jiǎn)化了海綿制備工藝。膠原凝膠經(jīng)均質(zhì)勻漿,乳化發(fā)泡后,注入適合的模具,再通過冷凍干燥制得膠原蛋白海綿。將此交聯(lián)方式與冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合,改善了膠原材料的機(jī)械性、熱穩(wěn)定性及降解性能,獲得外觀形貌良好,且有較合適的體內(nèi)降解時(shí)間,安全有效的膠原蛋白海綿。

      實(shí)施例1

      生產(chǎn)膠原蛋白海綿,具體步驟如下:

      (1)膠原蛋白原液體積為200ml,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,將其裝入透析袋,將透析袋兩端密封,置于4~10℃4l的透析外液進(jìn)行透析24h,即可得已交聯(lián)的膠原凝膠。透析外液中含甲醛和戊二醛濃度均為0.5%;

      (2)清洗,以注射用水為透析液,水溫保持在4~10℃,更換4次,每次間隔6h;

      (3)均質(zhì)勻漿,均質(zhì)勻漿機(jī)轉(zhuǎn)速為9000rpm,乳化發(fā)泡后,然后再用攪拌器進(jìn)行低速機(jī)械攪拌1小時(shí),速度為7000rpm,即可得乳化的膠原濁液;

      (4)入模,將模具注滿為止,然后震蕩使之表面平滑,在室溫放置30min后,再放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥48h;

      (5)用鋁箔袋密封包裝后,進(jìn)行輻照滅菌。

      實(shí)施例2

      (1)膠原蛋白原液體積為200ml,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%,將其裝入透析袋,將透析袋兩端密封,置于4~10℃1l的透析外液進(jìn)行透析24h,即可得已交聯(lián)的膠原凝膠。透析外液中甲醛和戊二醛濃度均為0.005%。

      (2)清洗,以注射用水為透析液,水溫保持在4~10℃,更換8次,每次間隔8h;

      (3)均質(zhì)勻漿,均質(zhì)勻漿機(jī)轉(zhuǎn)速為15000rpm,乳化發(fā)泡后,然后再用攪拌器進(jìn)行低速機(jī)械攪拌4小時(shí),速度為1500rpm,即可得乳化的膠原濁液;

      (4)入模,將模具注滿為止,然后震蕩使之表面平滑,在室溫放置80min后,再放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥24h;

      (5)用鋁箔袋密封包裝后,進(jìn)行輻照滅菌。

      以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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