本發(fā)明涉及藥物制劑領域，具體涉及一種用mPEG-PCL、mPEG-PLA、mPEG-PLGA、mPEG-DSPE、mPEG-Chol、SPC、Tween80、BSA、TPGS等兩親性穩(wěn)定劑制備的番荔素類藥物的納米混懸劑，及其制備方法及應用。

背景技術：

番荔素包括番荔素內(nèi)酯(簡稱ACGs)及其單體bullatacin、squamostatin、annosquacin等。番荔素是從番荔枝科植物種子中提取的一系列含有35或37個碳的長鏈脂肪酸，并含有0到3個四氫呋喃(THF)環(huán)類似的結構。番荔枝總內(nèi)酯和單體大多數(shù)展示出來很強的抗腫瘤活性，其中活性最好的單體bullatacin對肺癌A549細胞、人肝癌HepG2細胞、人宮頸癌HeLa細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、人結腸癌Lovo細胞、肉瘤S180細胞等具有顯著療效。同時，ACGs對多藥耐藥的腫瘤細胞株也有較好活性。

ACGs水溶性差，小于1ug/mL，難于給藥，導致體內(nèi)研究大大受限。已有的體內(nèi)研究多采用懸浮灌胃，或者分散在植物油中口服給藥，由于生物利用度低導致其療效難以最大程度發(fā)揮。并且ACGs毒副作用大，治療窗口窄，對大鼠的肝和腎有一定毒性。

納米粒是將藥物通過不同的方法制備成納米大小的顆粒，包括膠束、聚合物納米粒、納米混懸劑等。由于具有較大的表面積，藥物溶出速度和程度均較高，納米粒已成為解決難溶性藥物的給藥問題的主要方法之一。同時，藥物多包封在納米粒內(nèi)部，進入體內(nèi)之后可以在一定時間內(nèi)與外界環(huán)境隔離，從而在一定程度上保護不穩(wěn)定的藥物，延緩代謝。如果納米粒的粒徑較小(如300nm以內(nèi))，還可由于EPR(enhanced permeation and retention)效應而被動靶向腫瘤。因此，納米給藥系統(tǒng)是解決難溶性藥物，尤其是難溶性抗腫瘤藥物的臨床應用的有效手段。

納米混懸劑是納米給藥系統(tǒng)的重要分支，是用合適的技術將藥物直接制備成納米大小的微粒，并借助于穩(wěn)定劑對其進行穩(wěn)定而得到的給藥系統(tǒng)，是納米粒的一種。和使用了大量輔料的其他納米給藥系統(tǒng)相比，納米混懸劑具有許多優(yōu)點：(1)理論上，納米混懸劑是近乎純藥物的納米粒，具有最大限度的載藥量和藥物傳輸效率，特別適合大劑量難溶性藥物的口服和注射給藥；(2)適用范圍廣，無論是難溶于水的藥物，還是水、油都難溶的藥物，都可利用一定的方法制得相應的納米混懸劑，且可通過相應技術實現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。納米混懸劑處方組成簡單、工藝簡單、制備快速，干燥后所得粉末作為中間體進一步制備成口服、注射、外用等不同的劑型，方便攜帶，提高病人順應性。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種制備方法簡便、載藥量高、穩(wěn)定性高，能實現(xiàn)番荔素內(nèi)酯或其單體的體內(nèi)外緩釋、改善其體內(nèi)分布、增強抗癌療效的納米混懸劑。

一種番荔素類藥物的納米混懸劑，由番荔素類藥物和穩(wěn)定劑組成，藥物與穩(wěn)定劑的質(zhì)量比為1∶0.02～10。

一種番荔素類藥物的納米混懸劑，選用的穩(wěn)定劑為mPEG-PCL、mPEG-PLA、mPEG-PLGA、mPEG-DSPE、mPEG-Chol、SPC、Tween80、BSA、TPGS等兩親性穩(wěn)定劑中的一種或多種聯(lián)合運用。

本發(fā)明目的之二在于提供一種番荔素類藥物的納米混懸劑的制備方法，本發(fā)明采用的是溶劑沉淀-超聲或攪拌注入的方法制備納米混懸劑，技術方案如下：

(1)番荔素類藥物和穩(wěn)定劑溶于能與水混溶的有機溶劑中；

(2)超聲或攪拌條件下將含有藥物和穩(wěn)定劑的有機溶劑加入到水中；

(3)減壓旋轉蒸發(fā)或透析法除去有機溶劑；

上述制備方法，其特征在于：步驟(1)所述的穩(wěn)定劑選自mPEG-PCL、mPEG-PLA、mPEG-PLGA、mPEG-DSPE、mPEG-Chol、SPC、BSA、Tween80、TPGS等兩親性穩(wěn)定劑中的一種或多種。其中mPEG-PCL、mPEG-PLA、mPEG-PLGA、mPEG-DSPE、mPEG-Chol中PEG嵌段的分子量的范圍為500-20000。mPEG-PCL中PCL嵌段的分子量范圍為500-20000；mPEG-PLA中PLA嵌段的分子量范圍為500-20000；mPEG-PLGA中PLGA嵌段的分子量范圍為500-20000。

上述制備方法，其特征在于步驟(1)所述的有機溶劑選自DMSO、DMF、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、異丙醇、PEG400、PEG600中的一種或兩種或多種的混合體系；或者以上溶劑與乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等于水不相混溶的有機溶劑的混合體系，只要混合體系能和水混溶同時能很好滴溶解藥物和輔料即可。藥物在有機溶劑中的濃度為0.001％～20％(w/v)，穩(wěn)定劑的濃度為0.001％～50％(w/v)；步驟(2)中有機溶劑與水相的體積比為1∶2～100(v/v)；超聲時間為1-60min；攪拌的條件為100～1000rpm，攪拌溫度為0℃-60℃，攪拌時間1～60min。

步驟(3)還可以通過冷凍干燥等進一步固化，所用凍干保護劑可以是泊洛沙姆、甘露醇、HP-β-CD、海藻糖、麥芽糖、半乳糖中的一種或兩種及兩種以上的組合，優(yōu)選泊洛沙姆或甘露醇為凍干保護劑；凍干保護劑的用量為0.1％-20％(g/100mL)，優(yōu)選的凍干保護劑用量為0.5-5％(g/100mL)。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種番荔素納米混懸劑在制備注射劑中的應用，所述的注射劑包括注射液和無菌粉針。本發(fā)明的番荔素納米混懸劑水相分散介質(zhì)可用高濃度的氯化鈉或葡萄糖水溶液調(diào)成0.9％氯化鈉或者5％葡萄糖生理等滲體系，適應臨床應用。本發(fā)明的番荔素納米混懸劑凍干粉可加入適量的無菌藥用0.9％氯化鈉或者5％葡萄糖水溶液稀釋，重建成供靜脈給藥用的分散體系，適應臨床使用。

本發(fā)明的納米混懸劑的優(yōu)點在于：(1)處方簡單，最少可以只含有藥物和穩(wěn)定劑；(2)載藥量可高達90％，同時平均粒徑可小于200nm，具有非常高的藥物傳輸效率，同時易實現(xiàn)對腫瘤的被動靶向；(3)體外釋放沒有突釋，能緩慢釋放；(4)在人工胃腸液和血漿中穩(wěn)定，既可以口服給藥，也可注射、外用或腔道給藥；(5)載藥量可根據(jù)需要再很寬的范圍內(nèi)(9-90％)調(diào)整，在低載藥量時納米混懸劑以膠束的形式存在。

本發(fā)明的番荔素納米混懸劑經(jīng)體外細胞毒實驗表明，表現(xiàn)出較番荔素DMSO溶液有更高的腫瘤細胞抑制率。

本發(fā)明的番荔素納米混懸劑經(jīng)荷瘤小鼠實驗證明，能改善藥物的體內(nèi)組織分布，很大程度實現(xiàn)了對腫瘤的被動靶向，有助于提高藥效，降低毒副作用。

本發(fā)明的番荔素納米混懸劑經(jīng)荷瘤小鼠藥效實驗證明，表現(xiàn)出較市售喜樹堿注射液(陽性藥)以及傳統(tǒng)油溶液灌胃的給藥方式好得多的抗腫瘤藥效，用于腫瘤治療是一種很有前途的藥物遞送系統(tǒng)。

本發(fā)明的納米混懸劑工藝簡單，輔料經(jīng)濟安全易得，有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。

附圖說明

圖1為實施例1中ACGs納米混懸劑的平均粒徑分布圖

圖2為實施例1中透射電鏡照片(×19000)

圖3為實施例1中ACGs納米混懸劑在人工胃腸液中的穩(wěn)定性考察(n＝3)

圖4為實施例1中ACGs納米混懸劑的溶血考察(n＝3)

圖5為實施例1中ACGs納米混懸劑在PBS中的體外釋放曲線(n＝3)

圖6為實施例1中ACGs納米混懸劑對MCF-7、Hela細胞毒考察(n＝6)

圖7為實施例1中ACGs納米混懸劑在4T1荷瘤小鼠中的組織分布(n＝5)

圖8為實施例1中ACGs納米混懸劑在離體組織臟器中的組織分布(n＝5)

圖9為實施例1中4T1荷瘤小鼠體重隨時間變化曲線(n＝10)

圖10為實施例1中4T1荷瘤小鼠腫瘤體積隨時間變化曲線(n＝10)

具體實施方式

下面將描述本發(fā)明的幾個實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。

實施例1

稱取番荔素內(nèi)酯9mg，mPEG2000-PCL2000 3mg溶于0.5mL丙酮中，常溫，250HZ超聲條件下將上述丙酮溶液緩慢滴注至4mL去離子水中。繼續(xù)超聲15min后，隨后旋蒸除去丙酮，即得ACGs納米混懸劑。平均粒徑為123.2nm(圖1)，多分散性指數(shù)(PDI)為0.134，電位值-20.17mV。

實施例2

稱取番荔素內(nèi)酯9mg，mPEG2000-PCL1140 3mg溶于0.5mL丙酮中，常溫，250HZ超聲條件下將上述丙酮溶液緩慢滴注至4mL去離子水中。繼續(xù)超聲15min后，隨后旋蒸除去丙酮，即得ACGs納米混懸劑。平均粒徑為136.4nm，多分散性指數(shù)(PDI)為0.06，電位值-19.9mV。

實施例3

稱取番荔素內(nèi)酯9mg，mPEG5000-PCL1000 3mg溶于0.5mL丙酮中，常溫，250HZ超聲條件下將上述丙酮溶液緩慢滴注至4mL去離子水中。繼續(xù)超聲15min后，隨后旋蒸除去丙酮，即得ACGs納米混懸劑。平均粒徑為163.7nm，多分散性指數(shù)(PDI)為0.09，電位值-17mV。

實施例4

稱取番荔素內(nèi)酯9mg，mPEG5000-PCL2000 3mg溶于0.5mL丙酮中，常溫，250HZ超聲條件下將上述丙酮溶液緩慢滴注至4mL去離子水中。繼續(xù)超聲15min后，隨后旋蒸除去丙酮，即得ACGs納米混懸劑。平均粒徑為148.3nm，多分散性指數(shù)(PDI)為0.101，電位值-20mV。

實施例5

稱取番荔素內(nèi)酯9mg溶于0.5mL丙酮中，常溫，250HZ超聲條件下將上述丙酮溶液緩慢滴注至含有9mg Tween80的4mL去離子水中。繼續(xù)超聲15min后，隨后旋蒸除去丙酮，即得ACGs納米混懸劑。平均粒徑為145.3nm，電位值-17.5mV。

實施例6

稱取番荔素內(nèi)酯9mg，TPGS 9mg溶于0.5mL丙酮中，常溫，250HZ超聲條件下將上述丙酮溶液緩慢滴注至4mL去離子水中。繼續(xù)超聲15min后，隨后旋蒸除去丙酮，即得ACGs納米混懸劑。平均粒徑為165.3nm，電位值-19.3mV。

實施例7

稱取番荔素內(nèi)酯9mg，SPC 9mg溶于0.5mL丙酮中，常溫，250HZ超聲條件下將上述丙酮溶液緩慢滴注至4mL去離子水中。繼續(xù)超聲15min后，隨后旋蒸除去丙酮，即得ACGs納米混懸劑。平均粒徑為168.4nm，電位值-14.0mV。

實施例8

稱取番荔素內(nèi)酯9mg溶于0.5mL丙酮中，常溫，250HZ超聲條件下將上述丙酮溶液緩慢滴注至含有9mg BSA 3mg4mL去離子水中。繼續(xù)超聲15min后，隨后旋蒸除去丙酮，即得ACGs納米混懸劑。平均粒徑為177.8nm，電位值-1.0mV。

實施例9

制備2mg/mL濃度的實例1中ACGs混懸劑，吸取6μL滴到300目的銅網(wǎng)上，空氣中自然晾干，后用0.1％醋酸鈾染色10min，透射電鏡下觀察粒子的形態(tài)(圖2)。

實施例10

實例1中ACGs納米混懸劑在0.9％NaCl、5％Glu、PBS中的穩(wěn)定性考察

配置1.8％NaCl、10％Glu的溶液，隨后將此溶液和PBS分別與實例一中的ACGs納米混懸劑(2mg/mL)1∶1等體積混合，37℃孵育并在特定的時間點測其粒徑的變化。

結果：ACGs納米混懸劑在0.9％NaCl、5％Glu、PBS基本穩(wěn)定，孵育12h之內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯沉淀或粒徑增大的現(xiàn)象(下表所示)。

實施例11

ACGs納米混懸劑在人工胃腸液中的穩(wěn)定性考察

人工胃液的配置：取濃度為1mol/L的稀鹽酸16.4mL，加800mL蒸餾水，10g胃蛋白酶，混勻，加水稀釋至1000mL。

人工腸液的配置：6.8g磷酸二氫鉀，加水500mL，用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH6.8，另取胰蛋白酶10g，加水溶解，兩液混合后加水稀釋至1000mL。

取0.5mL過膜后的配置好的人工胃腸液，與實例1中的ACGs納米混懸劑等體積混合，37℃孵育，并在特定時間點測其粒徑的變化。

結果：在人工胃腸液中，ACGs納米混懸劑在12h之內(nèi)粒徑變化幾乎不大(圖3)，說明ACGs納米混懸劑在人工胃腸液中基本穩(wěn)定，能夠口服給藥。

實施例12

ACGs納米混懸劑在血漿中的穩(wěn)定性考察

ACGs納米混懸劑與大鼠血漿混合后(1∶4，v/v)，37℃孵育并在特定的時間點測其粒徑的變化。

結果：ACGs納米混懸劑與血漿孵育后，24h之內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)沉淀或者粒徑變化(下表所示)，說明ACGs納米混懸劑在血漿中基本穩(wěn)定。

實施例13

ACGs納米混懸劑的溶血考察

大鼠眼眶取血后，于5000rpm離心10min，收集沉淀。隨后用0.9％的NaCl溶于洗滌幾遍，直至上清無明顯紅色。隨后血細胞沉淀用0.9％的NaCl的溶液稀釋至4％紅細胞懸浮液(v/v)。取此懸浮液0.5mL與0.5mL的已調(diào)等滲的納米混懸劑混合，37℃孵育4h后，5000rpm離心10min，取上清于酶標儀540nm處測吸光值。同時將4％的紅細胞懸浮液與0.9％的NaCl混合作為陰性對照，4％的紅細胞懸浮液與去離子水混合作為陽性對照。

溶血率(％)＝(OD_樣品-A_陰性對照)/(A_陽性對照-A_陰性對照)×100

結果：ACGs納米混懸劑的溶血率很降低，1mg/mL的ACGs納米混懸劑溶血率約10％(圖4)，體內(nèi)靜脈給藥時所需的濃度完全不溶血，滿足靜脈注射的條件。

實施例14

ACGs納米混懸劑的體外釋放實驗

方案：取制備好的實例1中的ACGs納米混懸劑4mL(1mg/mL，平行三份)，于即用型透析袋(MWCO＝20000，Spectra/Por，USA)中，分別置于1L釋放介質(zhì)PBS中，37℃下100rpm攪拌，定時從透析袋內(nèi)吸取50μL釋放內(nèi)液，加950μL甲醇溶解納米混懸劑和未釋放的藥物，HPLC測定ACGs的含量，計算累積釋放率。

結果：ACGs納米混懸劑能夠緩慢釋放96h(圖5)，整個過程無明顯突釋。

實施例15

ACGs納米混懸劑對HepG2、Hela的體外細胞毒考察

方案：用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液將Hela、MCF-7細胞配成單細胞懸液，以每孔5×10³個細胞左右接種到96孔板。5％CO₂、37℃細胞培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋ACGs納米混懸劑至不同濃度梯度，加入200uL繼續(xù)培養(yǎng)(同時以不含胎牛血清的培養(yǎng)基作為空白對照)，每個濃度6個復孔。孵育24h后，吸去樣品溶液，每孔加MTT溶液(5mg·mL-1，PBS配制)20μL；繼續(xù)孵育4h后，終止孵育，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加200μLDMSO，振蕩20min，使結晶物充分溶解。選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫熒光儀檢測OD值。

細胞抑制率(％)＝(空白對照組OD-實驗組OD)/空白對照組OD×100％。

結果：結果顯示，和番荔素DMSO溶液相比，納米混懸劑對Hela、MCF-7均具有更強的抑制作用(圖6)。孵育24h后，ACGs溶液和納米混懸劑的1C50值如下表(n＝6，mean±SD，^**p＜0.01vs.ACGs solution)：

實施例16

ACGs納米混懸劑在4T1荷瘤小鼠的組織分布

實驗方案：將篩選出來的腫瘤大小相近的BALB/c-nu小鼠15只，隨機分為3組，分別靜脈注射給予共包載DiR的番荔素納米混懸劑(藥物與DiR重量比40∶1，藥物劑量0.4mg·kg-1)、ACGs/DiR溶液(ACGs和DiR劑量同納米混懸劑)、DiR對照“溶液”(DiR劑量同納米混懸劑)，在不同時間用小動物活體成像儀(IVIS Spectrum CT)拍照監(jiān)測納米混懸劑熒光物質(zhì)在小鼠不同部位的分布。IVIS Spectra CT熒光探針的參數(shù)設置λEexcitation＝748nm；λEmission＝780nm，Binning factor：8；Exposure time：4s，F(xiàn)ield of view：14cm。96h最后一次拍照后處死動物，取出臟器在同樣條件下拍照，圖片處理和數(shù)據(jù)分析用IVIS Living Imaging軟件完成。

結果：由于納米的EPR效應，番荔素納米混懸劑在腫瘤部位有很明顯的熒光累積(圖7)，表明其在腫瘤中分布比較多。體外離體組織成像的結果與體內(nèi)基本一致(圖8)，表面番荔素納米混懸劑能夠在一定程度上實現(xiàn)被動靶向。

實施例17

ACGs納米混懸劑在4T1荷瘤小鼠的抗腫瘤藥效研究

給藥方案：將篩選出來的荷瘤小鼠隨機分為5組，每組10只，除正常飲食外，尾靜脈注射ACGs納米混懸劑(400ug/kg)，ACGs溶液組(400ug/kg)，灌胃給予ACGs油溶液(4mg/kg)，同時設立陽性藥對照組(尾靜脈注射給予市售HCPT注射液5mg/kg)，生理鹽水陰性對照組。隔天給藥，共實驗18天。

考察指標：每日上午9點至10點，用電子秤稱量小鼠體重；用游標卡尺測量腫瘤體積。實驗結束后，脫頸椎處死小鼠，完整剝離腋下腫瘤組織稱重，計算抑瘤率。

抑瘤率(％)＝(1-治療組平均瘤重/生理鹽水組平均瘤重)×100％。

結果：ACGs納米混懸劑給藥組的體重變化與生理鹽水組類似，有略微增加(圖9)，說明在給藥劑量范圍內(nèi)無明顯的嚴重毒性作用。ACGs納米混懸劑靜脈注射時表現(xiàn)出卓越的抗腫瘤治療，400ug/kg尾靜脈給藥的腫瘤抑制率較HCPT市售注射劑5mg/kg(78.46％vs.49.32％，P＜0.05)以及傳統(tǒng)番荔素油溶液灌胃4mg/kg(78.46％vs.45.53％，P＜0.05)有顯著性增強。表明ACGs納米混懸劑是一種很有前途的藥物遞送系統(tǒng)。ACGs納米混懸劑，ACGs油溶液及陽性藥對4T1荷瘤小鼠的抑瘤率如下表(n＝10，mean±SD)：

Notes：^#p＜0.05vs blank control，^##p＜0.01vs blank control，^*p＜0.05vs HCPT injections and ^&p＜0.05vs ACGs oil solution.^Δbased on four surviving mice，data limited for reference only.