本發(fā)明屬于納米藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

臨床癌癥治療的主要手段是手術(shù)治療、放療、化療以及一些其他的輔助治療，而根據(jù)近年來(lái)的數(shù)據(jù)顯示，不超過(guò)30％的癌癥病人有進(jìn)行手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，因此，對(duì)于大部分癌癥病人來(lái)說(shuō)放化療成為主要的治療手段。由于放化療過(guò)程中給病人帶來(lái)的毒副作用特別大，因此尋求新的腫瘤治療手段成為科研工作者的首要任務(wù)。隨著納米醫(yī)學(xué)的飛快發(fā)展，納米藥物由于其特有的小尺寸效應(yīng)，在腫瘤治療方面顯現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它能夠在腫瘤部位大量富集，高效殺死腫瘤細(xì)胞，大大降低給藥劑量的同時(shí)，降低非特異性釋放，從而降低化療藥物的毒副作用。納米藥物是指藥物與納米載體形成的尺寸介于1-200nm的藥物輸送系統(tǒng)，包括聚合物納米藥物、無(wú)機(jī)納米藥物、納米脂質(zhì)體藥物，及其它一些特殊納米化藥物如核酸納米藥物等。其具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：1)改善藥物水溶性，提高藥物的透膜能力和生物利用度。2)提高藥物的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)可控釋放，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期。3)引入具有不同刺激敏感的生物材料，例如pH、溫度、酶等，實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的可控釋放，減輕藥物的副作用。4)實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的富集：由于腫瘤部位新生血管的不完整性，以及缺乏淋巴管的清除作用，導(dǎo)致納米載體具有被動(dòng)腫瘤靶向效應(yīng)，即EPR(enhanced permeability and retention)效應(yīng)；已經(jīng)有多種納米化藥物被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，如阿霉素脂質(zhì)體納米顆粒，白蛋白紫杉醇等。

EPR(EnhancedPermeation Retention effect)效應(yīng)是當(dāng)代納米醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)，但是有限的瘤內(nèi)灌注和滯留是限制納米醫(yī)藥發(fā)展的主要障礙。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，藥物納米化對(duì)于提高藥物在腫瘤部位的富集的程度不超過(guò)30％。與此同時(shí)，小尺寸納米顆粒由于其有限的載藥效率及復(fù)雜的制備工藝也在一定程度上限制了它在臨床藥物開發(fā)中的應(yīng)用。

CN103893123A公開了一種脂質(zhì)體-聚合物雜化納米粒子，包括兩親性聚合物納米粒子和包覆于所述兩親性聚合物納米粒子表面的磷脂雙分子層，以及包埋于兩親性聚合物納米粒子與磷脂雙分子層之間的水溶性不同的藥物。雖然該發(fā)明的脂質(zhì)體-聚合物雜化納米粒子在血液中具有長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，可以提高藥物的療效，降低毒副作用等，但是其最外層包覆的磷脂雙分子層對(duì)于腫瘤組織的特異性識(shí)別作用較低，其靶向性僅僅是依靠納米材料的納米效應(yīng)。

因此，在本領(lǐng)域中，期望得到一種具有特異性腫瘤組織識(shí)別作用并能夠提高在腫瘤組織的滲透滯留效應(yīng)的載藥納米粒子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子及其制備方法和應(yīng)用。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子，所述脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子包括三層結(jié)構(gòu)，最內(nèi)層為以兩親性陽(yáng)離子聚合物作為載體包裹化療藥物形成的載藥納米粒子，中間層為吸附在所述載藥納米粒子表面的血小板抑制劑層，最外層為連接有腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性多肽的脂質(zhì)雙分子層。

在本發(fā)明中，所述脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子能夠在腫瘤微環(huán)境中特異性響應(yīng)腫瘤局部高表達(dá)的酶，增強(qiáng)脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的腫瘤靶向性，釋放血小板抑制劑，誘導(dǎo)腫瘤血管通透性增加，同時(shí)使得釋放出來(lái)的最內(nèi)層即載藥納米粒子可以大量的穿透腫瘤血管內(nèi)皮進(jìn)入腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)載藥納米粒子的抗腫瘤效應(yīng)的目的。

優(yōu)選地，所述兩親性陽(yáng)離子聚合物為聚醚酰亞胺-聚乳酸共聚物(PEI-PLA)、聚醚酰亞胺-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PEI-PLGA)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)或聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA)中的任意一種或至少兩種的組合物。

優(yōu)選地，所述化療藥物為親水性化療藥物和/或疏水性化療藥物。

優(yōu)選地，所述親水性化療藥物為阿霉素鹽酸鹽和/或奧沙利鉑。

優(yōu)選地，所述疏水性化療藥物為阿霉素和/或紫杉醇。

在本發(fā)明中所述化療藥物包裹在兩親性陽(yáng)離子聚合物中，例如親水性化療藥物可以在包裹在兩親性陽(yáng)離子聚合物形成的親水內(nèi)核中，而疏水性藥物可以包裹在兩親性陽(yáng)離子聚合物形成的疏水層中。

優(yōu)選地，所述血小板抑制劑為但不限于氯吡格雷和/或血小板去除抗體R300，即也可以應(yīng)用其他能夠?qū)ρ“迤鸬揭种苹蛉コ饔?，提高腫瘤部位血管通透性的血小板抑制劑。

優(yōu)選地，所述脂質(zhì)雙分子層為由磷脂和/或聚乙二醇修飾的磷脂與膽固醇構(gòu)成的脂質(zhì)雙分子層。在本發(fā)明中脂質(zhì)雙分子層模擬細(xì)胞膜，增強(qiáng)脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的生物相容性，減少被機(jī)體清除的概率。

優(yōu)選地，所述磷脂為大豆卵磷脂和/或腦磷脂。

優(yōu)選地，所述腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性多肽為腫瘤部位酶響應(yīng)性多肽。

在本發(fā)明中，所述腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性多肽特異性地響應(yīng)腫瘤部位微環(huán)境，例如響應(yīng)于腫瘤部位高表達(dá)的酶，從而釋放血小板抑制劑，提高腫瘤部位血管通透性，而對(duì)于正常組織或細(xì)胞部位的血管的功能不產(chǎn)生影響。

優(yōu)選地，所述酶響應(yīng)性多肽為基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)響應(yīng)性多肽和/或基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)響應(yīng)性多肽。

優(yōu)選地，所述酶響應(yīng)性多肽為DSK[C18]DSGPLGIAGQDSK[C18]DS。該酶響應(yīng)性多肽具有C18鏈構(gòu)成的疏水片段和DSGPLGIAGQDSK的多肽片段構(gòu)成的親水片段，其中[C18]為鏈長(zhǎng)為18個(gè)碳原子的脂肪烴鏈。

酶響應(yīng)性多肽在腫瘤微環(huán)境中特異性響應(yīng)腫瘤局部高表達(dá)的酶，增強(qiáng)脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的腫瘤靶向性，并且可以在響應(yīng)腫瘤局部高表達(dá)的酶后，使脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子釋放出血小板抑制劑，誘導(dǎo)腫瘤血管通透性增加，同時(shí)使得釋放出來(lái)的最內(nèi)層即載藥納米粒子可以大量的穿透腫瘤血管內(nèi)皮進(jìn)入腫瘤組織，提高載藥納米粒子的抗腫瘤效果。

此外，還可以對(duì)本發(fā)明中所用的磷脂材料進(jìn)行特定選擇使其具備pH響應(yīng)性，以使得得到pH響應(yīng)性的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子，以響應(yīng)于腫瘤部位的微酸性pH環(huán)境。

優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的粒徑為80-120nm，例如80nm、83nm、85nm、88nm、90nm、93nm、95nm、98nm、100nm、105nm、108nm、110nm、115nm、118nm或120nm。

第二方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將兩親性陽(yáng)離子聚合物溶于有機(jī)溶劑中，向有機(jī)相中加入水，任選地加入親水性化療藥物的水溶液，超聲，形成初乳；

(2)向步驟(1)得到的初乳中加入表面活性劑水溶液，任選地加入疏水性化療藥物溶液，超聲，形成復(fù)乳；

(3)在攪拌下，將步驟(2)得到的復(fù)乳加入到表面活性劑水溶液中，繼續(xù)攪拌，而后除去有機(jī)溶劑，得到納米粒子懸液；

(4)將步驟(3)得到的納米粒子懸液與血小板抑制劑混合攪拌，然后離心得到表面吸附有血小板抑制劑的載藥納米粒子；

(5)將磷脂和/或聚乙二醇修飾的磷脂、環(huán)境響應(yīng)性多肽和膽固醇溶于有機(jī)溶劑中，而后去除有機(jī)溶劑，在容器底部自組裝得到脂質(zhì)雙分子層薄膜，向該容器中加入步驟(4)得到的表面吸附有血小板抑制劑的載藥納米粒子懸液，水化，超聲得到脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子溶液體系，離心得到脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子；

其中，步驟(1)和步驟(2)所述任選地操作步驟不能同時(shí)選擇不進(jìn)行。

由于所述脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子包裹化療藥物分為三種情況，分別為包裹疏水性化療藥物的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子、包裹疏水性化療藥物和親水性化療藥物的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子以及包裹親水性化療藥物的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子，因此所述制備方法分為三種情況，當(dāng)步驟(1)中不進(jìn)行任選地操作步驟，即不加入親水性化療藥物的水溶液，而進(jìn)行步驟(2)中任選地操作步驟，即加入疏水性化療藥物溶液，此時(shí)制備得到的是包裹有疏水性化療藥物的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子；當(dāng)步驟(1)中進(jìn)行任選地操作步驟，即加入親水性化療藥物的水溶液，而步驟(2)中不進(jìn)行任選地操作步驟，即不加入疏水性化療藥物溶液，此時(shí)制備得到的是包裹有親水性化療藥物的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子；當(dāng)步驟(1)和步驟(2)中均進(jìn)行任選地操作步驟時(shí)，制備得到的是包裹有疏水性化療藥物和親水性化療藥物的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子。在上述制備方法中，如果步驟(1)和步驟(2)所述任選地操作步驟均選擇不進(jìn)行的話，那么制備得到的是不包裹化療藥物的脂質(zhì)體-聚合物納米粒子，因此步驟(1)和步驟(2)所述任選地操作步驟不能同時(shí)選擇不進(jìn)行。

在本發(fā)明中，本發(fā)明所述兩親性陽(yáng)離子聚合物經(jīng)過(guò)雙乳化法進(jìn)行自組裝，在首次乳化自組裝時(shí)形成親水內(nèi)核，親水內(nèi)核外為疏水鏈段形成的疏水部分，而后在第二次乳化自組裝過(guò)程中，未進(jìn)行自組裝的部分兩親性陽(yáng)離子聚合物的疏水端在疏水作用下與首次乳化形成的粒子的疏水端相聚集，而親水端裸露在外層，因此兩親性陽(yáng)離子聚合物經(jīng)過(guò)雙乳化形成了具有親水內(nèi)核，親水內(nèi)核外為疏水部分，疏水部分之外為親水外殼的納米粒子。在首次乳化自組裝和第二次乳化自組裝過(guò)程中可以分別實(shí)現(xiàn)親水性化療藥物和疏水性化療藥物的包載。

優(yōu)選地，步驟(1)所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷和/或三氯甲烷。

優(yōu)選地，在步驟(1)中，相對(duì)于1mL有機(jī)溶劑，兩親性陽(yáng)離子聚合物的用量為10-40mg，例如10mg、13mg、15mg、18mg、20mg、23mg、25mg、28mg、30mg、33mg、35mg、38mg或40mg。

優(yōu)選地，在步驟(1)中，相對(duì)于1mL有機(jī)溶劑，水的加入量為100-250μL，例如100μL、130μL、150μL、180μL、200μL、220μL、240μL或250μL。

優(yōu)選地，在步驟(1)中，所述親水性化療藥物與兩親性陽(yáng)離子聚合物的質(zhì)量比為1:(5-20)，例如1:5、1:7、1:9、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18或1:20，優(yōu)選1:10。

優(yōu)選地，在步驟(1)中，相對(duì)于1mL有機(jī)溶劑，所述親水性化療藥物的水溶液的加入量為100-200μL，例如100μL、110μL、120μL、130μL、140μL、150μL、160μL、170μL、180μL、190μL或200μL。

優(yōu)選地，在步驟(1)中，所述超聲為利用超聲細(xì)細(xì)胞破碎儀在35％功率下超聲3-8min，例如3min、4min、5min、6min、7min或8min。

優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述表面活性劑為聚乙烯醇、吐溫或膽酸鈉中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述表面活性劑水溶液的濃度為1-4％，例如1％、1.3％、1.5％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％、3％、3.3％、3.5％、3.8％或4％。

優(yōu)選地，相對(duì)于步驟(1)中1mL有機(jī)溶劑，步驟(2)所述表面活性劑水溶液的加入量為2-5mL，例如2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL或5mL。

優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述疏水性化療藥物溶液為將疏水性化療藥物溶于有機(jī)溶劑中得到的溶液。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷和/或三氯甲烷。

優(yōu)選地，在步驟(2)中，相對(duì)于1mL表面活性劑水溶液，疏水性化療藥物溶液的加入量為80-150μL，例如80μL、90μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL或150μL。

優(yōu)選地，步驟(2)所述疏水性化療藥物與步驟(1)所述兩親性陽(yáng)離子聚合物的質(zhì)量比為1：(5-20)，例如1:5、1:7、1:9、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18或1:20，優(yōu)選1:10。

優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述超聲為利用超聲細(xì)細(xì)胞破碎儀在40％功率下超聲3-8min，例如3min、4min、5min、6min、7min或8min。

優(yōu)選地，在步驟(3)中，所述表面活性劑為聚乙烯醇、吐溫或膽酸鈉中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，在步驟(3)中，所述表面活性劑水溶液的濃度為0.6-1.0％，例如0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、或1.0％。

優(yōu)選地，相對(duì)于步驟(1)中1mL有機(jī)溶劑，步驟(3)所述表面活性劑水溶液的加入量為8-15mL，例如8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL或15mL。

優(yōu)選地，步驟(3)所述繼續(xù)攪拌的時(shí)間為3-10min，例如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。

在本發(fā)明中，步驟(3)所述除去有機(jī)溶劑利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀實(shí)現(xiàn)。

優(yōu)選地，在步驟(4)中，所述納米粒子懸液中與血小板抑制劑所述納米粒子懸液中所含納米粒子與血小板抑制劑的質(zhì)量比為(50-100):1，例如50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1，優(yōu)選80:1。

優(yōu)選地，在步驟(4)中，所述離心為在1000-1500rpm(例如1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm)下離心3-8min(例如3min、4min、5min、6min、7min或8min)。

優(yōu)選地，在步驟(5)中，所述磷脂和/或聚乙二醇修飾的磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為(50-70):1，例如50:1、55:1、60:1、65:1或70:1，優(yōu)選60:1。

優(yōu)選地，當(dāng)同時(shí)使用磷脂和聚乙二醇修飾的磷脂時(shí)，磷脂和聚乙二醇修飾的磷脂的質(zhì)量比為(45-65):1，例如45:1、48:1、50:1、53:1、55:1、58:1、60:1、63:1或65:1，優(yōu)選60:1。

優(yōu)選地，所述環(huán)境響應(yīng)性多肽與膽固醇的質(zhì)量比為1:(8-15)，例如1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10、1:10.5、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15，優(yōu)選1:10。

優(yōu)選地，在步驟(5)中，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷和/或三氯甲烷。

優(yōu)選地，在步驟(5)中，所述水化的溫度為30-37℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。

優(yōu)選地，在步驟(5)中，所述水化的時(shí)間為5-20min，例如5min、8min、10min、12min、14min、16min、18min或20min。

優(yōu)選地，在步驟(5)中，所述離心為在1000-1500rpm(例如1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm)下離心5-10min(例如5min、6min、7min、8min、9min或10min)。

第三方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子在制備抗腫瘤藥物的納米載藥體系中的應(yīng)用。本發(fā)明的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子通過(guò)干擾腫瘤局部血小板的功能，增強(qiáng)腫瘤血管通透性，使得載藥納米粒子可以大量的穿透腫瘤血管內(nèi)皮進(jìn)入腫瘤組織，提高腫瘤部位靶向性以及對(duì)腫瘤的治療效果。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子能夠特異性靶向腫瘤組織，具有腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性，可以實(shí)現(xiàn)腫瘤血管通透性增加，而不影響正常組織或細(xì)胞部位的血管的功能，增強(qiáng)載藥納米粒子向腫瘤細(xì)胞的滲透和滯留，增強(qiáng)EPR效應(yīng)，提高載藥納米粒子在腫瘤部位的富集，所述脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子中各成分協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的更強(qiáng)殺傷性。本發(fā)明的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子采用雙乳化法和薄膜超聲法制備得到，制備方法簡(jiǎn)單高效，既適合實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)用，又適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子制備過(guò)程示意圖；

圖2為實(shí)施例1制備的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的透射電鏡圖，其標(biāo)尺為100nm；

圖3為實(shí)施例1制備的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的粒度分布圖；

圖4為本發(fā)明制備的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子通過(guò)尾靜脈注入裸鼠乳腺癌腫瘤模型24小時(shí)后，腫瘤部位阿霉素富集情況的結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明制備的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的抗腫瘤效果測(cè)試結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。

實(shí)施例1

在本實(shí)施例中，通過(guò)以下方法制備脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子，具體包括以下步驟：

(1)將20mg的兩親性陽(yáng)離子聚合物PEI-PLGA溶于1mL二氯甲烷中，向有機(jī)相中加入200μL水，利用超聲細(xì)胞破碎儀在35％功率下超聲5min，形成初乳；

(2)向步驟(1)得到的初乳中加入2mL濃度為2％的聚乙烯醇(PVA)水溶液，并逐滴加入200μL阿霉素藥物的二氯甲烷溶液(含有阿霉素2mg)，利用超聲細(xì)胞破碎儀在40％功率下超聲用5min，形成復(fù)乳；

(3)在攪拌下，將步驟(2)得到的復(fù)乳加入到10mL濃度為0.6％的PVA水溶液中，繼續(xù)攪拌3min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，得到納米粒子懸液；

(4)將步驟(3)得到的納米粒子懸液(含200μg納米粒子)與血小板去除抗體R300(2.5μg)混合攪拌，然后離心得到表面吸附有抗體R300的載藥納米粒子；

(5)將質(zhì)量比為60:1:1:10的卵磷脂和聚乙二醇修飾的卵磷脂、MMP-2響應(yīng)性多肽和膽固醇溶于有機(jī)溶劑中，而后去除有機(jī)溶劑，在容器底部自組裝得到脂質(zhì)雙分子層薄膜，向該容器中加入步驟(4)得到的表面吸附有抗體R300的載藥納米粒子懸液，在37℃下水化10min，超聲得到脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子溶液體系，1200rpm下離心5min得到脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子。

用醋酸雙氧鈾對(duì)本實(shí)施例制備得到的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的電鏡樣進(jìn)行負(fù)染，利用透射電鏡(美國(guó)FEI-Tecnai G² 20S-TWIN(200kV))對(duì)納米顆粒的形貌進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1所示，粒徑約90nm左右。

利用激光粒度儀(英國(guó)Malvern-Zetasizer Nano ZS90)測(cè)得納米粒子的平均粒徑為156.3±10.3nm(圖2)，分散度為0.21，zeta電位為-19.4±0.9，表明該溶液穩(wěn)定性較好。

實(shí)施例2

在本實(shí)施例中，通過(guò)以下方法制備脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子，具體包括以下步驟：

(1)將10mg的兩親性陽(yáng)離子聚合物PEI-PLGA溶于1mL二氯甲烷中，向有機(jī)相中加入100μL水，利用超聲細(xì)胞破碎儀在35％功率下超聲3min，形成初乳；

(2)向步驟(1)得到的初乳中加入5mL濃度為3％的聚乙烯醇(PVA)水溶液，并逐滴加入400μL阿霉素藥物的二氯甲烷溶液(含有阿霉素2mg)，利用超聲細(xì)胞破碎儀在40％功率下超聲用8min，形成復(fù)乳；

(3)在攪拌下，將步驟(2)得到的復(fù)乳加入到8mL濃度為1％的PVA水溶液中，繼續(xù)攪拌5min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，得到納米粒子懸液；

(4)將步驟(3)得到的納米粒子懸液(含200μg納米粒子)與血小板抑制劑氯吡格雷(2.5μg)混合攪拌，然后離心得到表面吸附有血小板抑制劑的載藥納米粒子；

(5)將質(zhì)量比為50:1:1:10的卵磷脂和聚乙二醇修飾的卵磷脂、MMP-9酶響應(yīng)性多肽和膽固醇溶于有機(jī)溶劑中，其中而后去除有機(jī)溶劑，在容器底部自組裝得到脂質(zhì)雙分子層薄膜，向該容器中加入步驟(4)得到的表面吸附有血小板抑制劑的載藥納米粒子懸液，在37℃下水化5min，超聲得到脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子溶液體系，1000rpm下離心10min得到脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子。

用醋酸雙氧鈾對(duì)本實(shí)施例制備得到的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的電鏡樣進(jìn)行負(fù)染，利用透射電鏡對(duì)納米顆粒的形貌進(jìn)行表征，粒徑約120nm左右。

利用激光粒度儀測(cè)得納米粒子的粒徑為138.2±4.3nm，分散度為0.22，zeta電位為-18.1±0.4，表明該溶液穩(wěn)定性較好。

實(shí)施例3

在本實(shí)施例中，通過(guò)以下方法制備脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子，具體包括以下步驟：

(1)將40mg的兩親性陽(yáng)離子聚合物PEI-PLGA溶于1mL二氯甲烷中，向有機(jī)相中加入250μL水，加入100μL阿霉素鹽酸鹽的水溶液(含有阿霉素鹽酸鹽2mg)，利用超聲細(xì)胞破碎儀在35％功率下超聲8min，形成初乳；

(2)向步驟(1)得到的初乳中加入2mL濃度為1％的聚乙烯醇(PVA)水溶液，并逐滴加入200μL紫杉醇的二氯甲烷溶液(含有紫杉醇2mg)，利用超聲細(xì)胞破碎儀在40％功率下超聲用3min，形成復(fù)乳；

(3)在攪拌下，將步驟(2)得到的復(fù)乳加入到15mL濃度為0.8％的PVA水溶液中，繼續(xù)攪拌10min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，得到納米粒子懸液；

(4)將步驟(3)得到的納米粒子懸液(含200μg納米粒子)與血小板去除抗體R300(4μg)混合攪拌，然后離心得到表面吸附有抗體R300的載藥納米粒子；

(5)將質(zhì)量比為50:1:1:8的卵磷脂和聚乙二醇修飾的卵磷脂、MMP-2響應(yīng)性多肽和膽固醇溶于有機(jī)溶劑中，而后去除有機(jī)溶劑，在容器底部自組裝得到脂質(zhì)雙分子層薄膜，向該容器中加入步驟(4)得到的表面吸附有抗體R300的載藥納米粒子懸液，在37℃下水化20min，超聲得到脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子溶液體系，1500rpm下離心5min得到脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子。

用醋酸雙氧鈾對(duì)本實(shí)施例制備得到的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的電鏡樣進(jìn)行負(fù)染，利用透射電鏡對(duì)納米顆粒的形貌進(jìn)行表征，平均粒徑約80nm左右。

利用激光粒度儀測(cè)得納米粒子的粒徑為120.3±7.3nm，分散度為0.25，zeta電位為-18.7±0.5，表明該溶液穩(wěn)定性較好。

實(shí)施例4

在本實(shí)施例中，考察脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子在腫瘤部位是富集情況，方法如下：

將實(shí)施例1制備的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的生理鹽水納米體系通過(guò)尾靜脈注入裸鼠乳腺癌腫瘤模型，24小時(shí)后觀察腫瘤部位阿霉素富集情況。實(shí)驗(yàn)分為四組：生理鹽水組(Saline)，阿霉素組(Dox)，聚合物納米顆粒載阿霉素組(PLP-D)，本發(fā)明制備的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子組(PLP-D-R)。

由圖4的結(jié)果可以看出，與生理鹽水組相比，阿霉素組有少量的藥物富集，而納米化的阿霉素在腫瘤組織的富集量進(jìn)一步增加，而本發(fā)明的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子組中阿霉素的富集量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它各組，說(shuō)明在本發(fā)明的載藥納米粒子各成分的相互配合下，可以顯著提高納米藥物在腫瘤部位的富集，同時(shí)也說(shuō)明腫瘤血管的通透性顯著增加。

實(shí)施例5

在本實(shí)施例中，考察脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的抗腫瘤效果，方法如下：

將實(shí)施例1制備的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的緩沖溶液體系通過(guò)尾靜脈注入裸鼠乳腺癌腫瘤模型MCF7中，每三天給藥一次，設(shè)置7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即生理鹽水組(Saline)，阿霉素組(Dox)，PEI-PLGA聚合物納米顆粒組(PLPNP)，PEI-PLGA聚合物納米顆粒載阿霉素組(PLP-D)，本發(fā)明制備的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子組(PLP-D-R，其中R代表R300)。除生理鹽水組和PEI-PLGA聚合物納米顆粒組之外，其他組中給藥標(biāo)準(zhǔn)為Dox：4mg/kg，R300：0.25mg/kg，每三天測(cè)一次腫瘤大小，結(jié)果如圖5所示。

由圖5的結(jié)果可知，與實(shí)施例4結(jié)果類似，與生理鹽水組比，阿霉素組對(duì)腫瘤具有一定的抑制效果，納米化的阿霉素組比單阿霉素組的治療效果好一些，而本發(fā)明的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子的治療效果大大高于其它各組，說(shuō)明本發(fā)明的載藥納米粒子可以大大提高納米藥物的抗腫瘤效果。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的脂質(zhì)體-聚合物載藥納米粒子及其制備方法和應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。