本發(fā)明屬于藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及靶向SCNN1A的腫瘤治療藥物及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤是危害人類健康的殺手，目前主要的治療手段是手術(shù)切除、放化療，但治療效果和預(yù)后并不理想。分子靶向藥物是一種新的治療手段，主要因?yàn)槟[瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多基因參與的過程。一系列致癌基因和抑癌基因（β-catenin，F(xiàn)orkheadBox，p53等）在腫瘤中表達(dá)失調(diào)，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞侵襲遷移、抑制細(xì)胞凋亡等多種信號通路參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。這些異常表達(dá)基因是治療腫瘤的潛在靶向分子。ENaC是非電壓依賴性的離子通道，包括α、β、γ三個(gè)亞基，其基本的生理功能是對鈉離子進(jìn)行定向垂直跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這對維持上皮細(xì)胞兩側(cè)的水電平衡具有重要作用。SCNN1A是ENaC的α亞基，對ENaC功能起主導(dǎo)作用，其廣泛分布于甲狀腺、腎臟、結(jié)腸、肺臟和肝臟等組織。SCNN1A表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本發(fā)明通過大量生物樣本比較分析，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、肺癌、肝癌中SCNN1A的表達(dá)量顯著降低，進(jìn)一步通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的增殖、侵襲密切相關(guān)，是治療腫瘤的分子靶標(biāo)之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供靶向SCNN1A的腫瘤治療藥物及應(yīng)用的技術(shù)方案。所述的用于治療腫瘤的藥物，其特征在于該藥物靶向SCNN1A基因。所述的用于治療腫瘤的藥物，其特征在于所述的腫瘤包括肝癌、結(jié)腸癌和肺癌。所述的用于治療腫瘤的藥物，其特征在于該藥物能夠提高SCNN1A的表達(dá)量。所述的用于治療腫瘤的藥物，其特征在于包括SCNN1A基因藥物和/或SCNN1A激動劑。所述的用于治療腫瘤的藥物，其特征在于所述的SCNN1A基因藥物包含SCNN1A基因cDNA，所述的SCNN1A基因不限物種，優(yōu)選人源或者鼠源SCNN1A，所述的SCNN1A基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述的用于治療腫瘤的藥物，其特征在于所述的SCNN1A基因藥物為強(qiáng)啟動子啟動表達(dá)SCNN1A蛋白。所述的用于治療腫瘤的藥物，其特征在于所述的SCNN1A基因藥物為含有SCNN1A基因cDNA的核苷酸的表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)、慢病毒系統(tǒng)和腺病毒系統(tǒng)。所述的用于治療腫瘤的藥物，其特征在于所述的SCNN1A激動劑為特布他林。所述的SCNN1A基因藥物和/或SCNN1A激動劑在制備肝癌、結(jié)腸癌和肺癌中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用，其特征在于所述的SCNN1A基因藥物包含SCNN1A基因cDNA，所述的SCNN1A激動劑為特布他林。本發(fā)明第一方面提出一類有效治療腫瘤的藥物，該藥物能夠靶向分子SCNN1A，本發(fā)明第二方面提出了SCNN1A基因藥物和/或SCNN1A激動劑在腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明為治療腫瘤提供了一種新的思路。附圖說明圖1SCNN1A在腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平,其中A：SCNN1A在人結(jié)腸癌、肝癌、肺癌及癌旁的比較分析，B：SCNN1A在人肝細(xì)胞系及肝癌細(xì)胞系中的定量表達(dá)結(jié)果，C:SCNN1A在臨床病人的組織切片中的免疫熒光檢測結(jié)果，D：SCNN1A在小鼠肝臟和肝癌細(xì)胞系Hepa1-6中的定量表達(dá)結(jié)果；圖2SCNN1A體外抑制Hepa1-6細(xì)胞增殖和侵襲結(jié)果，其中A:SCNN1A轉(zhuǎn)染Hepa1-6獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株的SCNN1A定量表達(dá)結(jié)果，B-E組為體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)分組為Hepa1-6組、pcDNA3.1組、SCNN1A-pcDNA3.1組，其中B：MMT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，C：流程檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，D：細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖3SCNN1A過表達(dá)Hepa1-6的裸鼠皮下荷瘤結(jié)果，分組為Hepa1-6組、pcDNA3.1組、SCNN1A-pcDNA3.1組，其中A：各組瘤形態(tài)及大小測量，B：各組瘤重測量結(jié)果，C：各組瘤體積計(jì)算結(jié)果。圖4SCNN1A瘤內(nèi)注射對裸鼠皮下荷瘤的抑制效果，分組為Hepa1-6組，空白腺病毒組、SCNN1A腺病毒組，其中A：各組瘤體積測量及腺病毒活體成像檢測結(jié)果，B：各組瘤體積計(jì)算結(jié)果。圖5尾靜脈注射SCNN1A對原位肝癌組織的抑制結(jié)果，分組為模型組，空白腺病毒組、SCNN1A腺病毒組。圖6尾靜脈注射SCNN1A對裸鼠皮下PDX的抑制結(jié)果，分組為模型組，空白腺病毒組、SCNN1A腺病毒組。圖7SCNN1A激動劑對對肝癌皮下荷瘤的抑制效果，分組為模型組，特布他林組，索菲拉尼組，聯(lián)合用藥組。圖8SCNN1A腺病毒對荷瘤小鼠皮下H1975肺癌組織的抑制結(jié)果。圖9SCNN1A腺病毒對荷瘤小鼠皮下SW620結(jié)腸癌組織的抑制結(jié)果。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的第二到第七實(shí)施例是以肝癌為代表說明靶向SCNN1A的治療藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用。實(shí)施例1SCNN1A在腫瘤組織中的表達(dá)分析采用PCR技術(shù)，分別檢測了人結(jié)腸癌及癌旁、肝癌及癌旁、肺癌及癌旁的SCNN1A表達(dá)量，各組病例分別為結(jié)腸癌組織355例，結(jié)腸癌旁組織19例；肝癌組織13例，肝癌旁組織7例；肺癌組織112例，肺癌旁組織10例。結(jié)果顯示，結(jié)腸癌、肝癌、肺癌組織的SCNN1A表達(dá)量均顯著低于癌旁組織，如圖1A。進(jìn)一步在人肝癌細(xì)胞驗(yàn)證：提取人正常肝細(xì)胞系LO2、肝癌細(xì)胞系Hep3B、Bel7407、Huh7、HepG2的mRNA，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SCNN1A的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Hep3B、Bel7407、Huh7等細(xì)胞系中SCNN1A表達(dá)顯著性低于正常肝細(xì)胞系LO2，如圖1B。免疫熒光檢測病人肝癌組織及癌旁組織切片中SCNN1A表達(dá)，也是同樣結(jié)果，如圖1C。提取小鼠肝組織、小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6的mRNA，實(shí)時(shí)定量檢測SCNN1A表達(dá)，得到和人源SCNN1A類似的結(jié)果,如圖1D。其中，SCNN1A基因cDNA具有SEQIDNO:1所示的序列。實(shí)時(shí)定量引物如表1：表1SCNN1A實(shí)時(shí)定量引物SCNN1A-FCTGCTGGCTACTCAAGATGGC（SEQIDNO:2所示）SCNN1A-RAGGAGGCTGACCATCGTGAC（SEQIDNO:3所示）GAPDH-FTGTGTCCGTCGTGGATCTGA（SEQIDNO:4所示）GAPDH-RTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG（SEQIDNO:5所示）實(shí)施例2SCNN1A對肝癌細(xì)胞Hepa1-6的體外抑制作用將鼠源SCNN1A基因的cDNA序列構(gòu)建到真核過表達(dá)骨架載體pcDNA3.1中，脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞系，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體作為對照。G418篩選獲得抗性克隆，然后通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測SCNN1A表達(dá)，選取選取肝組織SCNN1A表達(dá)水平接近的SCNN1A-pcDNA3.1#1克隆和與Hepa1-6表達(dá)水平接近的pcDNA3.1#1進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。其中，定量結(jié)果如圖2A.分別對Hepa1-6、pcDNA3.1-Hepa#1(簡稱pcDNA3.1)、SCNN1A-pcDNA3.1-Hepa#1（簡稱SCNN1A-pcDNA3.1)細(xì)胞系進(jìn)行MTT、細(xì)胞劃痕、集落和流式周期檢測檢測SCNN1A對Hepa1-6細(xì)胞系的生長抑制。連續(xù)測5天對各組進(jìn)行MTT染色，圖2B結(jié)果顯示從第二天開始SCNN1A-pcDNA3.1組細(xì)胞量就比兩組對照少，到第五天只有對照組的60%左右，具有顯著性差異，說明SCNN1A能夠抑制肝癌細(xì)胞系Hepa1-6的生長。集落實(shí)驗(yàn)對MTT結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，如圖2D結(jié)果。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，在0時(shí)無區(qū)別的三組，24h后SCNN1A-pcDNA3.1組劃痕的間距明顯增大，這說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Scnn1α的Hepa1-6細(xì)胞的爬行運(yùn)動能力明顯減弱，從而驗(yàn)證了SCNN1A能夠抑制Hepa1-6細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞流式周期檢測結(jié)果顯示，SCNN1A-pcDNA3.1組與兩組對照相比，S期細(xì)胞數(shù)量減少，G1期和G2期細(xì)胞數(shù)量增多（如圖2C），這表明Scnn1α過表達(dá)將肝癌細(xì)胞Hepa1-6生長阻滯在G1/S期，從而抑制細(xì)胞增殖。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCNN1A在體外可以通過阻滯Hepa1-6細(xì)胞在在G1/S期，抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)也能夠抑制細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)施例3SCNN1A過表達(dá)Hepa1-6的裸鼠皮下荷瘤結(jié)果將15只雄性裸鼠隨機(jī)分成3組，每組5只，按照每只接種6×106個(gè)細(xì)胞量，分別將SCNN1A-pcDNA3.1、pcDNA3.1、Hepa1-6三組細(xì)胞系接種到裸鼠左上肢皮下。接種后每天觀察有無腫瘤形成。在注射接種后的第7天開始，按規(guī)定時(shí)間測量腫瘤體積大小。以腫瘤直徑3mm視為成瘤，記錄腫瘤大小。用游標(biāo)卡尺測量移植腫瘤最長徑及最短徑，每3天1次，腫瘤體積計(jì)算按照公式“腫瘤體積V=長徑×短徑×短徑/2”計(jì)算腫瘤的體積大小。根據(jù)腫瘤的平均體積，繪制腫瘤生長曲線。第15天測量腫瘤的大小后處死裸鼠，瘤組織剝離稱重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Scnn1α過表達(dá)Hepa1-6細(xì)胞組裸鼠移植瘤的體積明顯高于空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組（P<0.01），空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖3。由此說明,SCNN1A不僅可以體外抑制肝癌細(xì)胞Hepa1-6的增殖侵襲，在皮下荷瘤模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了SCNN1A對肝癌模型的抑制作用。實(shí)施例4SCNN1A抑制裸鼠皮下荷瘤的肝癌治療效果將SCNN1A構(gòu)建到帶綠色熒光的腺病毒載體中，并包裝成病毒液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4-8周齡雄性裸鼠40只，動物房集中飼養(yǎng)，充分給食，小鼠生長良好。將Hepa1-6細(xì)胞消化后調(diào)整濃度為1×107/ml，接種到裸鼠左上肢皮下。按成瘤大小均一性原則，選30只用隨機(jī)數(shù)字表分成三組，每組10只，分組為模型組、空白腺病毒組、SCNN1A腺病毒組。在第7天和第11天進(jìn)行瘤內(nèi)注射腺病毒。其中，空白腺病毒和SCNN1A腺病毒組注射劑量為1×1012VP/ml各15ul，模型組注射15ul生理鹽水。注射后每4天測量腫瘤大小，記錄3次，計(jì)算按公式：長徑×寬徑×寬徑/2計(jì)算腫瘤體積。15天后處死裸鼠，解剖剝離腫瘤，肉眼觀察腫瘤組織情況，并用小動物活體成像檢測瘤內(nèi)熒光強(qiáng)度。與模型組和空白腺病毒組進(jìn)行對比，Scnn1α瘤內(nèi)給藥后腫瘤的生長明顯受到抑制，如圖4。其中，腺病毒注射劑量選自1×103VP/ml到1×1016VP/ml之間任選，優(yōu)選地，注射劑量為1×1012VP/ml。實(shí)施例5SCNN1A對肝癌原位瘤的抑制效果4-8周齡雄性裸鼠15只，將5×105/ml的Hepal-6細(xì)胞懸液2ml通過尾靜脈快速注射，5s內(nèi)完成。第15天，將小鼠分成三組，每組3只，分別為模型組、空白腺病毒組、Scnn1α腺病毒組。病毒組尾靜脈注射劑量為3×1010VP/ml的腺病毒2ml，模型組注射2ml生理鹽水。第20天再注射一次。第23天處死小鼠。解剖各組小鼠，觀察發(fā)現(xiàn)，模型組和空白腺病毒組肝上有多處腫瘤組織，而Scnn1α腺病毒組肝上的腫瘤組織塊少且小，如圖5。結(jié)果說明，SCNN1A對原位肝癌也有較好的抑制效果。實(shí)施例6SCNN1A對PDX的抑制效果取臨床手術(shù)切取的新鮮無菌肝癌組織標(biāo)本，選擇腫瘤活力較好的組織，用組織剪將腫瘤組織剪成約1mm×2mm×2mm的小塊，與Matrigel混好后裝入接種裸鼠左上肢皮下。第15天，將小鼠分成三組，每組3只，分別為模型組、空白腺病毒組、SCNN1A腺病毒組。病毒組尾靜脈注射劑量為3×1010VP/ml的腺病毒2ml，模型組注射2ml生理鹽水。第20天再注射一次。第24天處死小鼠。與模型組和空白腺病毒組相比，SCNN1A腺病毒組的皮下瘤生長緩慢，瘤體積明顯較小，如圖6，表明SCNN1A能抑制PDX小鼠肝癌組織的生長。實(shí)施例7SCNN1A激動劑對皮下荷瘤肝癌模型的治療效果4-8周齡雌性裸鼠40只，動物房集中飼養(yǎng)，充分給食，小鼠生長良好。將Hepa1-6細(xì)胞消化后調(diào)整濃度為1×107/ml，接種到裸鼠左上肢皮下。第7天按成瘤大小均一性原則分為4組，每組10只，分別是模型組，特布他林組，索菲拉尼組，聯(lián)合用藥組。根據(jù)分組分別開始腹腔給藥，特布他林12.5ug/只，索拉菲尼2mg/只，聯(lián)合都給，模型給予等體積的生理鹽水。每天給藥1次，連續(xù)給藥5天，第11天處理。比較各組瘤體積及瘤重，特布他林、索拉菲尼和聯(lián)合用藥組瘤組織比較緩慢，如圖7，表明SCNN1A激動劑抑制小鼠肝癌組織的生長。同樣，對結(jié)腸癌和肺癌進(jìn)行如實(shí)施例2-7相同的試驗(yàn)，最后也能驗(yàn)證得到靶向SCNN1A的治療藥物在結(jié)腸癌和肺癌治療中的應(yīng)用。實(shí)施例8SCNN1A抑制裸鼠皮下荷瘤的肺癌治療效果將SCNN1A構(gòu)建到帶綠色熒光的腺病毒載體中，并包裝成病毒液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4-8周齡雄性裸鼠40只，動物房集中飼養(yǎng)，充分給食，小鼠生長良好。將H1975肺癌細(xì)胞消化后調(diào)整濃度為1×107/ml，接種到裸鼠左上肢皮下。按成瘤大小均一性原則，選30只用隨機(jī)數(shù)字表分成三組，每組10只，分組為模型組、空白腺病毒組、SCNN1A腺病毒組。在第7天和第11天進(jìn)行瘤內(nèi)注射腺病毒。其中，空白腺病毒和SCNN1A腺病毒組注射劑量為1×1012VP/ml各15ul，模型組注射15ul生理鹽水。注射后第15天處死裸鼠，解剖剝離腫瘤，肉眼觀察腫瘤組織情況，并稱量瘤重。與模型組和空白腺病毒組相比，SCNN1A腺病毒組的皮下瘤生長緩慢，瘤體積明顯較小，如圖8，表明SCNN1A能抑制荷瘤裸鼠皮下肺癌組織的生長。實(shí)施例9SCNN1A抑制裸鼠皮下荷瘤的結(jié)腸癌治療效果將SCNN1A構(gòu)建到帶綠色熒光的腺病毒載體中，并包裝成病毒液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4-8周齡雄性裸鼠40只，動物房集中飼養(yǎng)，充分給食，小鼠生長良好。將SW620結(jié)腸癌細(xì)胞消化后調(diào)整濃度為1×107/ml，接種到裸鼠左上肢皮下。按成瘤大小均一性原則，選30只用隨機(jī)數(shù)字表分成三組，每組10只，分組為模型組、空白腺病毒組、SCNN1A腺病毒組。在第7天和第11天進(jìn)行瘤內(nèi)注射腺病毒。其中，空白腺病毒和SCNN1A腺病毒組注射劑量為1×1012VP/ml各15ul，模型組注射15ul生理鹽水。注射后第15天處死裸鼠，解剖剝離腫瘤，肉眼觀察腫瘤組織情況，并稱量瘤重。與模型組和空白腺病毒組相比，SCNN1A腺病毒組的皮下瘤生長緩慢，瘤體積明顯較小，如圖9，表明SCNN1A能抑制荷瘤裸鼠皮下結(jié)腸癌組織的生長。SEQUENCELISTING<110>浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院<120>靶向SCNN1A的腫瘤治療藥物及應(yīng)用<130>1<160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>2103<212>DNA<213>人或鼠<400>1atgatgctggaccacaccagagcccctgagctcaaccttgacctagaccttgacgtctcc60aactcaccgaagggatccatgaagggcaacaatttcaaggagcaagacctttgtcctcct120ctgcccatgcaaggactgggcaagggggacaagcgtgaagaacaggcgctgggcccggaa180ccctcagagccccggcagcccaccgaggaggaggaggcactgatcgagttccaccgctcc240taccgggagctcttccagttcttctgcaacaataccaccatccacggtgccatccgcctg300gtgtgctccaagcacaaccgcatgaagacggccttctgggcggtgctctggctctgcacc360ttcggcatgatgtactggcagtttgctttgctgttcgaggaatacttcagctaccccgtg420agtctcaacatcaacctcaattcggacaagctggtcttccctgccgtcactgtgtgcacc480cttaatccttacagatacactgaaattaaagaggatctggaagagctggaccgcatcacg540gaacagacgctttttgacctgtacaaatacaactcttcctacactcgccaggctgggggc600cgccgccgcagcacccgcgacctccggggtgctctcccacaccccctgcagcgcctgcgc660acaccacctccgcccaatcccgcccgctcggcgcgcagcgcgtcctccagtgtacgcgac720aacaatccccaagtggacaggaaggactggaaaatcggcttccaactgtgcaaccagaac780aaatcagactgcttctaccagacatactcatccggggtggatgccgtgagagaatggtac840cgcttccattacatcaacattctgtccagactgcccgacacctcgcctgctctagaggaa900gaagccctgggcagcttcatctttacctgtcgtttcaaccaggccccctgcaatcaggcg960aattattctcagttccaccaccccatgtatgggaactgctacactttcaacaacaagaac1020aactccaatctctggatgtcttccatgcctggagtcaacaatggtttgtccctgacactg1080cgcacagagcagaatgacttcatccccctgctgtccacagtgacgggggccagggtgatg1140gtgcacggtcaggatgagcctgcttttatggatgatggtggcttcaacgtgaggcctggt1200gtggagacctccatcagtatgagaaaggaagccctggacagcctcggaggcaactacgga1260gactgcactgagaatggcagtgatgtccctgtcaagaacctttacccctccaagtacaca1320cagcaggtgtgcattcactcctgcttccaggagaacatgatcaagaagtgtggctgtgcc1380tacatcttctaccctaagcccaagggtgtagagttctgtgactacctaaagcagagctcc1440tggggctactgctactataaactgcaggctgccttctccttggatagcctgggctgcttc1500tccaagtgcaggaagccgtgcagtgtgaccaactacaagctctctgctggctactcaaga1560tggccgtctgtgaagtcccaggattggatcttcgagatgctatccttgcagaataattac1620acgatcaacaacaaaagaaacggagttgctaaactcaacatcttcttcaaagagctgaac1680tataaaactaattcggagtctccctctgtcacgatggtcagcctcctgtccaacctgggc1740agccagtggagcctgtggttcggctcatctgtgctgtccgtggtggaaatggcggagctc1800atcttcgacctcctggtcatcacactcatcatgttactgcacaggttccggagccggtac1860tggtctccaggacgaggggccaggggtgccagggaggtggcctctaccccagcttcctcc1920ttcccttcccgtttctgtccccaccctacatccccgccaccttctttgccccagcagggc1980acgacccctcccctggccctgacagcccctccacctgcctatgctaccctaggcccctct2040gcctctccactggactcggctgtgcctggctcttctgcctgtgctccggccatggcactc2100tga2103<210>2<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>2ctgctggctactcaagatggc21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3aggaggctgaccatcgtgac20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4tgtgtccgtcgtggatctga20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5ttgctgttgaagtcgcaggag21當(dāng)前第1頁1 2 3