本發(fā)明涉及一種提取物的制備方法和應(yīng)用，具體地涉及一種仙茅皂苷提取物的制備及其在提高機(jī)體免疫力中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
仙茅，石蒜科多年生草本植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn的干燥根莖。始載于《海藥本草》，其葉似茅，根狀莖久服益精補(bǔ)髓，增添精神，故有仙茅之稱。其味辛，性溫，歸腎，肝經(jīng)。具有消散癰腫、補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛寒濕、益精血等功效，用于癰疽腫痛、腎陽不足、陽痿精冷、筋骨痿軟、腰膝冷痹、陽虛冷瀉、帶下、小便頻數(shù)等病癥?，F(xiàn)代研究表明仙茅主要含有仙茅皂苷A-M（此類物質(zhì)的母核主要以環(huán)阿爾廷醇型三萜為主）、酚及酚苷類和降新木脂素類等成分，其中仙茅總皂苷的含量約為1.3%。
有關(guān)仙茅增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用的研究多集中在仙茅苷、仙茅苷B和苔黑酚葡萄糖苷等酚苷類成分上，徐任生等（Glyosides of a cycloaltane sapogenin from Curculigo orehioides. Phytoehemistry, 1992, 31(1): 233-236）曾報(bào)道小鼠胸腺的重量以及脾淋巴細(xì)胞的增殖能被環(huán)阿爾廷醇型三萜皂苷類單體化合物所促進(jìn)，有提高免疫作用，但有關(guān)仙茅三萜皂苷對機(jī)體免疫方面的作用未見有報(bào)道。
目前有關(guān)仙茅總皂苷的制備多采用正丁醇萃取的方法，此方法需消耗大量的有機(jī)試劑，且回收比較困難；張梅等（大孔樹脂富集、純化仙茅總皂苷，華西藥學(xué)雜志, 2005, 20(4): 295-298）利用大孔樹脂對仙茅總皂苷進(jìn)行富集，但未進(jìn)一步精制所得的仙茅總皂苷，因此使得總皂苷的含量很低，最高含量只能達(dá)到20%左右。雜質(zhì)含量過高對人體產(chǎn)生一定的毒副作用，同時(shí)也給制劑帶來一定的難度，使得制劑的質(zhì)量不易控制，有效成分的含量也不穩(wěn)定。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種以仙茅三萜皂苷為活性成分的藥物在提高機(jī)體免疫中的應(yīng)用，并提供一種制備仙茅三萜皂苷的制備方法，該方法操作簡單、雜質(zhì)含量少。
本發(fā)明具體的技術(shù)方案：
本發(fā)明中仙茅三萜皂苷的制備方法如下：
取仙茅藥材粉碎，加入溶劑，采用加熱回流提取1-5次，每次0.5h-3h，過濾，合并，減壓濃縮至無醇味。將提取濃縮液上樣于大孔樹脂柱，先以水洗脫雜質(zhì)，再以低醇（5-20%）去雜，40%-50%的乙醇洗脫得目標(biāo)物洗脫液。然后將洗脫液減壓濃縮至小體積，加入丙酮，攪拌，至丙酮濃度為60-90%，靜置過夜，過濾，濾液減壓濃縮，干燥即得所述的仙茅三萜皂苷。
本發(fā)明提取方法中所用溶劑為：水、乙醇、甲醇中的一種或其混合溶劑，優(yōu)選為水或乙醇-水；加熱溫度為40-100℃。減壓濃縮真空度低于0.09Mpa、溫度為40~55℃。大孔樹脂型號為D101、AB-8、NKA-Ⅱ和 NKA-9，優(yōu)選為D101， 上樣液流速為0.50-1BV柱體積。
本發(fā)明一種仙茅三萜皂苷及其在機(jī)體免疫方面的應(yīng)用，其可與藥學(xué)上可接受的載體（輔料）混合，制成各種劑型，用于制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力及相關(guān)藥物。
本發(fā)明所述的一種仙茅三萜皂苷提取物可單獨(dú)、或與其它藥物或其它中藥提取物組配，用于制備增強(qiáng)機(jī)體免疫力及相關(guān)藥物。
本發(fā)明利用大孔樹脂先對仙茅三萜皂苷進(jìn)行富集，然后利用沉淀法進(jìn)一步純化，大大提高了提取物中仙茅三萜皂苷的含量，不僅降低其毒副作用，而且方便制劑，從而使其具有較好的提高機(jī)體免疫作用。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明中仙茅三萜皂苷的制備方法，運(yùn)用大孔樹脂和沉淀等技術(shù)，此方法操作簡單，而且成本較低，制備的仙茅三萜皂苷的含量不低于50%，適合工業(yè)化生產(chǎn)；
制備過程中避免了高沸點(diǎn)溶劑正丁醇的使用，減少了對環(huán)境的污染；本發(fā)明中的仙茅三萜皂苷提取物，可以與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合，制成含有上述仙茅三萜皂苷為主要活性成分的口服制劑，如膠囊、片劑、軟膠囊、口服液等，具有顯著的療效。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 仙茅三萜皂苷的制備
仙茅藥材20Kg，粉碎，分別以200L、160L、160L 的水加熱回流提取3次，每次0.5h，合并三次提取液，減壓至無醇味（相對密度約為1.12）。上樣于D101大孔樹脂柱，分別以水和10%乙醇洗脫3倍柱體積，棄掉洗脫液，然后以40%乙醇洗脫3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮至無乙醇。然后加入丙酮，攪拌，使得丙酮濃度為60%，靜置過夜后，過濾，濾液減壓濃縮，干燥即得仙茅三萜皂苷。HPLC檢測，仙茅三萜皂苷的含量為54%。
實(shí)施例2 仙茅三萜皂苷的制備
仙茅藥材20Kg，粉碎，分別以200L、160L、160L 的70%乙醇加熱回流提取3次，每次0.5h，合并三次提取液，減壓至無醇味（相對密度約為1.06）。上樣于D101大孔樹脂柱，分別以水和20%乙醇洗脫3倍柱體積，棄掉洗脫液，然后以50%乙醇洗脫3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮至無乙醇。然后加入丙酮，攪拌，使得丙酮濃度為80%，靜置過夜后，過濾，濾液減壓濃縮，干燥即得仙茅三萜皂苷。HPLC檢測，仙茅三萜皂苷的含量為65%。
實(shí)施例3：固體片劑制備：
處方：
仙茅三萜皂苷提取物 100g
淀粉 250g
羧甲基淀粉鈉 50g
微晶纖維素 80g
硬脂酸鎂 10g
50％乙醇 適量
制成1000片
制法：
按處方量取合歡莢果提取物 100g，淀粉250g，羧甲基淀粉鈉50g，微晶纖維素80g，硬脂酸鎂10g，混和，加入50％乙醇適量制粒，干燥，整粒，壓片，檢查合格后，包裝。
藥理實(shí)施例：仙茅三萜皂苷提取物對小鼠非特異性免疫作用的影響。
實(shí)驗(yàn)材料1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ICR小鼠，雌雄各半，體重18-22g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。
1.2 受試樣品：仙茅三萜皂苷提取物（以下簡稱提取物），天津中新藥業(yè)研究中心制劑室提供。
1.3 試劑：印度墨汁，上海銘博生物科技有限公司；碳酸氫鈉（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
1.4 儀器：半自動(dòng)生化分析儀，KHB L-3180，上?？迫A試驗(yàn)系統(tǒng)有限公司。
實(shí)驗(yàn)方法
ICR小鼠30只，雌雄各半，按體重均衡分為3組：模型對照組、提取物低劑量組（25mg/kg）、 提取物高劑量組（50mg/kg）。各組小鼠灌胃給藥（20mL/kg），模型對照組給予等體積純凈水，連續(xù)5天。于末次給藥后1小時(shí)，每只鼠尾靜脈注入印度墨汁溶液（取印度墨汁2mL加生理鹽水至10mL），給藥體積為0.1mL/10g，于注射后2分鐘、10分鐘分別從眼眶靜脈取血0.02mL，加入0.1%N仙茅三萜皂苷提取物CO3溶液4mL，置半自動(dòng)生化分析儀，波長在680nm處比色，按下式計(jì)算廓清指數(shù)K值及吞噬指數(shù)仙茅三萜皂苷提取物值，做組間比較。
廓清指數(shù)K = logOD2-logOD10 / t10-t2 =（logOD2-logOD10 ）/ 8
吞噬指數(shù)仙茅三萜皂苷提取物 =體重/ (肝重+脾重)×
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表1 仙茅三萜皂苷提取物對小鼠非特異性免疫作用的影響 ()
與模型對照組比較，*P<0.05, **P<0.01.
試驗(yàn)結(jié)果表明，提取物兩個(gè)劑量組連續(xù)給藥5天，對小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)有明顯的促進(jìn)作用，與模型對照組比較均有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）。提示仙茅三萜皂苷提取物對小鼠非特異性免疫功能有一定促進(jìn)作用。