本發(fā)明屬于藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及從干燥的野馬追中分離得到的一種具有治療骨破壞性疾病作用的羊毛甾烷型三萜類化合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：野馬追是菊科植物輪葉澤蘭EupatoriumlindleyanumDC.的干燥地上部分，又名白鼓釘(《江蘇南部種子植物手冊》)、化食草(《杭州藥用植物志》)、毛澤蘭(《內(nèi)蒙古植物志》)，產(chǎn)于江蘇、甘肅、山東、湖南等地。其味苦，性平，歸肝、脾經(jīng)，具有化痰止咳、清熱解毒、利尿消腫、降壓的功能，用于治療感冒、咳嗽多痰、頭疼、扁桃體炎、細菌性痢疾、高血壓、慢性氣管炎、支氣管炎等。其枝葉入藥有解表祛濕、和中化濕之效，用于勞傷咳嗽、吐血咳血以及淋濁白帶、無名腫痛等證的治療。迄今為止，從野馬追植物中發(fā)現(xiàn)的化學成分類型主要包括倍半萜類、黃酮類、三萜類、揮發(fā)油類、有機酸類及其他類成分，其中以倍半萜類化合物的研究最多。迄今為止，已得到的倍半萜類化合物主要為愈創(chuàng)木烷型和吉馬烷型，此外還有少量的杜松烷型和桉烷型倍半萜類。藥理作用研究表明，野馬追提取物具有抗炎、抗菌、降血脂以及保護急性肺損傷、止咳、平喘等作用。野馬追廣泛應用于臨床，主要包括片劑、顆粒劑、糖漿劑等制劑品種，還有以野馬追為君藥的復方野馬追顆粒、膠囊等產(chǎn)品，主要用于治療慢性氣管炎、支氣管炎、高血壓等癥。通過對臨床應用的觀察發(fā)現(xiàn)，野馬追注射液治療鉤端螺旋體病具有退熱顯著、緩解癥狀快、治愈時間短的特點。同時，野馬追糖漿用于治療小兒咳喘性疾病也安全、有效。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種從干燥的野馬追中分離得到的一種具有治療骨破壞性疾病作用的羊毛甾烷型三萜類化合物及其制備方法。本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(Ⅰ)，所述的化合物(Ⅰ)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將干燥的野馬追粉碎，用80～90％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10％乙醇洗脫6個柱體積，再用80％乙醇洗脫8個柱體積，收集80％乙醇洗脫液，減壓濃縮得80％乙醇洗脫物浸膏；(c)步驟(b)中80％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、35:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(Ⅰ)。進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。進一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為85％。一種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物(Ⅰ)和藥學上可接受的載體。所述的化合物(Ⅰ)在制備治療骨破壞性疾病的藥物中的應用。所述的藥物組合物在制備治療骨破壞性疾病的藥物中的應用。本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物(Ⅰ)，其余為藥物學上可接受的、對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時，可制成滅菌的水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。附圖說明圖1為化合物(Ⅰ)結(jié)構(gòu)式；圖2為化合物(Ⅰ)理論ECD值與實驗ECD值比較。具體實施方式下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。實施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。制備方法：(a)將干燥的野馬追(8kg)粉碎，用85％乙醇熱回流提取(25L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(359g)和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10％乙醇洗脫6個柱體積，再用80％乙醇洗脫8個柱體積，收集80％乙醇洗脫液，減壓濃縮得80％乙醇洗脫物浸膏(138g)；(c)步驟(b)中80％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個柱體積)、50:1(8個柱體積)、35:1(6個柱體積)、15:1(8個柱體積)和1:1(5個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；(d)步驟(c)中組分4(32g)用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為25:1(8個柱體積)、15:1(10個柱體積)和5:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2(17g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(Ⅰ)(29mg)。結(jié)構(gòu)確證：白色針狀結(jié)晶；HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z535.2712，結(jié)合核磁特征可得分子式為C30H40O7，不飽和度為11。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δH(ppm，DMSO-d6，600MHz)：H-1(1.57，m)，H-1(1.85，m)，H-2(2.21，m)，H-2(2.37，m)，H-5(1.79，m)，H-6(2.74，m)，H-6(3.02，m)，H-12(2.71，m)，H-12(2.89，m)，H-15(5.63，m)，H-16(6.25，m)，H-17(1.90，m)，H-18(1.11，s)，H-19(1.26，s)，H-20(1.78，m)，H-21(0.98，d，J＝6.3)，H-22(2.27，m)，H-22(2.61，m)，H-24(2.52，m)，H-24(3.15，m)，H-25(3.24，m)，H-27(1.26，d，J＝7.2)，H-28(3.61，d，J＝10.5)，H-28(3.78，d，J＝10.5)，H-29(1.17，s)，H-30(1.21，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δC(ppm，DMSO-d6，150MHz)：37.1(CH2，1-C)，34.3(CH2，2-C)，215.9(C，3-C)，52.5(C，4-C)，43.8(CH，5-C)，37.7(CH2，6-C)，202.6(C，7-C)，151.4(C，8-C)，149.2(C，9-C)，38.7(C，10-C)，201.8(C，11-C)，52.5(CH2，12-C)，46.2(C，13-C)，57.1(C，14-C)，135.2(CH，15-C)，133.8(CH，16-C)，50.5(CH，17-C)，18.7(CH3，18-C)，18.5(CH3，19-C)，33.1(CH，20-C)，19.8(CH3，21-C)，49.8(CH2，22-C)，209.1(C，23-C)，47.0(CH2，24-C)，35.3(CH，25-C)，178.7(C，26-C)，18.1(CH3，27-C)，68.2(CH2，28-C)，17.4(CH3，29-C)，24.1(CH3，30-C)；碳原子標記參見圖1。IR譜表明該化合物含有羥基(3425cm-1)和α,β-不飽和羰基(1697cm-1)基團。此外，化合物在268和226nm處有最大紫外吸收。1HNMR譜顯示四個單峰甲基信號δH1.11，1.17，1.21和1.26，兩個雙峰甲基信號δH0.98(d，J＝6.3Hz，H-21)和1.26(d，J＝7.2Hz，H-27)，一個含氧亞甲基信號δH3.61(d，J＝10.5Hz，H-28)和3.78(d，J＝10.5Hz，H-28)，以及兩個烯屬次甲基信號δH5.63(m，H-15)和6.25(m，H-16)。13CNMR譜顯示30個共振碳信號，六個甲基，七個亞甲基(一個含氧亞甲基)，六個次甲基(兩個烯屬次甲基)，十二個季碳(五個羰基碳，兩個烯烴季碳)。其中，共振信號δC202.6(C-7)，151.4(C-8)，149.2(C-9)和201.8(C-11)為共軛系統(tǒng)(C-7/C-8/C-9/C-11)的標志。HMBC譜中H2-1，H2-2，H-5，H2-28和Me-29與C-3，Me-29和H-5與C-28的相關(guān)性，以及ROESY譜中H2-28和H-5的相關(guān)性表明C-3為酮羰基，C-28為羥基亞甲基。兩個烯屬次甲基質(zhì)子信號[δH5.63(m，H-15)和6.25(m，H-16)]和碳信號[135.2(C-15)，133.8(C-16)]表明C-15和C-16之間為雙鍵。HMBC譜中Me-21與C-17，C-20和C-22，H-20與C-22和C-23，H2-22與C-23和C-24，H-25與C-24和C-26，以及Me-27與C-24，C-25和C-26的相關(guān)性表明C-23為酮羰基，C-26為羧基基團。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致(圖2)。實施例2：化合物(Ⅰ)藥理作用試驗一、材料和儀器SD雄性大鼠(4周齡)購于河北醫(yī)科大學動物實驗中心，清潔級，體重150g。化合物(Ⅰ)自制，HPLC歸一化純度大于98％。1α,25(OH)2D3購于英國普利茅斯生物研究實驗室。α-MEM培養(yǎng)基購于美國GIBCOBRL。SolubleRANKL購于英國PeprotecScience。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)試劑盒購于美國Sigma公司。葡聚糖凝膠購于上海如吉科技發(fā)展有限公司。標準胎牛血清購于山東銀香偉業(yè)生物有限公司。注射用青霉素鈉購于華北制藥有限公司。注射用硫酸鏈霉素購于深圳華藥南方制藥有限公司。丙酮、甲醛溶液購于石家莊市有機化工廠。異氟烷購于魯南貝特制藥有限公司。二甲基亞砜購于天津市光復精細化工研究所。BB5060/BB16二氧化碳培養(yǎng)箱(上海Heraeus公司)，VD-650型桌上式細胞培養(yǎng)超凈操作臺(蘇州凈化設備有限公司)，BFX5-320型低速離心機(中國上海瀘南科學儀器聯(lián)營廠)，XD-1019810倒置顯微鏡(江南公司)，CX-21光學顯微鏡(日本OLYMPUS)，微量加樣器(法國GILSON)，2510型變頻振蕩儀(上海新波生物技術(shù)有限公司)，GF-300型電子天(JapanA&DCompany，limited)，725型超低溫冰箱(FormaScientific.Inc)。未提到的材料和儀器均為常規(guī)儀器。未提到的溶液配制均采用本領(lǐng)域常規(guī)溶液配制方法配制即可。藥液配制及葡聚糖凝膠柱的制備：1、α-MEM培養(yǎng)液的制備：(1)α-MEM粉一袋+超純水800ml，完全溶解；(2)加碳酸氫鈉3.02g待完全溶解后加鹽酸測PH達7.2；(3)再次加超純凈水至1000ml；(4)加抗生素(青霉素及鏈霉素)；(5)濾過滅菌(0.22微米微孔濾膜過濾)(6)500ml滅菌瓶分裝，4℃儲藏備用。2、1α,25(OH)2D3儲存液的分裝(1)取1α,25(OH)2D3原液50微升(50微升一支)，加入無水乙醇1150微升，使總量至1200微升(即24倍稀釋)(2)以100微升/只分裝于12支滅菌試管內(nèi)，-30℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆茫?3)應用前再次稀釋1000倍，使最終濃度為1×10-8M。3、SolubleRANKL儲存液分裝(1)取RANKL凍干粉一支(10微克)；(2)0.1Mtris-HClbuffer50微升溶解RANKL；(3)以5微升/只分裝于10支滅菌冷凍管內(nèi)，-30℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆茫?4)使用前取出一支，先用含10％FBSα-MEM培養(yǎng)液495微升溶解(即稀釋100倍)；添加前再次稀釋100倍，使終濃度為20ng/ml。4、0.1Mtris-HClbuffer的制備(1)tris-HCl12.11g(0.1M)；(2)超純水800ml(添加溶解后，調(diào)節(jié)pH至8.2)；(3)加超純水至1000ml備用。5、化合物(Ⅰ)儲存液的制備(1)儲存液的濃度：1mg/ml及100ug/ml。(2)儲存液的配制：稱取化合物(Ⅰ)1mg放于滅菌冷凍管內(nèi)，加入二甲基亞砜1ml完全溶解，配成1mg/ml的儲存液。從1mg/ml的儲存液中取出100微升放于另一支滅菌冷凍管內(nèi)，加入二甲基亞砜900微升即配成100微克/毫升的儲存液，儲存于4℃恒溫冰箱，使用時間不超過兩周。1mg/ml的儲存液冷凍保存。6、TRAP固定液的制備在染色之前，按產(chǎn)品說明書配制。首先取無菌20ml試管一支，按以下順序依次加入試劑：丙酮6.5ml、枸櫞酸2.5ml、甲醛0.8ml，充分混勻，計9.8ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。7、TRAP染色液的制備同樣是在染色之前配制，按產(chǎn)品說明制備，現(xiàn)配現(xiàn)用。8、葡聚糖凝膠柱的制備(1)消毒后50ml注射器一個，除去內(nèi)芯；(2)注射筒與注射頭交接處置消毒后的脫脂棉球一個；(3)固定架固定針筒，針頭處接關(guān)閉狀的三通；(4)將滅菌的葡聚糖凝膠混勻，抽取30ml注入針筒內(nèi)，打開三通，緩慢過濾沉淀，待凝膠沉淀液面至15ml時為止；關(guān)閉三通，放入4℃恒溫冰箱過夜；(5)實驗前1小時用含有15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液50ml緩慢注入凝膠柱內(nèi)，打開三通，自然過濾洗滌凝膠柱后待用。二、試驗方法1、全骨髓細胞培養(yǎng)1.1全骨髓細胞提取實驗開始前30分鐘將標準胎牛血清放入37℃水浴箱內(nèi)解凍；取50mL無菌離心管一個，裝入40mL不含胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，以備沖洗全骨髓細胞用。(1)選4周齡SD雄性大鼠1只，75％乙醇消毒后，采用異氟烷吸入麻醉；(2)待麻醉起效后，無菌條件下取大鼠兩側(cè)脛骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔；(3)用10mL注射器抽取不含血清的α-MEM培養(yǎng)液，換用25號針頭后自骨髓腔內(nèi)沖出骨髓細胞至50mL無菌離心管內(nèi)；(4)將所提取的細胞懸液充分吹打，待沒有團塊后，將盛有細胞的離心管與平衡管一起放入離心機內(nèi)離心，調(diào)整轉(zhuǎn)速(2000轉(zhuǎn)/分)，離心5分鐘；離心過程中配制含有15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液50mL(7.5mL胎牛血清加入42.5mLα-MEM培養(yǎng)液中)備用；(5)離心結(jié)束后棄去上清液，加入含15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液20mL，充分吹打混勻，形成細胞懸液，此液簡稱為細胞原液。1.2細胞數(shù)的計算(原液濃度及稀釋倍數(shù))(1)取以上提取的細胞懸液25μL放入試管內(nèi)，然后加入5％醋酸475μL，即形成20倍稀釋的細胞懸液；將試管放在振蕩器上，振蕩20秒鐘，目的是去除紅細胞；(2)計算細胞數(shù)：取振蕩后細胞懸液滴入細胞計數(shù)盤，勿超過邊緣，蓋玻片覆蓋，倒置顯微鏡下計算細胞數(shù)，計數(shù)盤4個大格內(nèi)所有細胞均計入。本實驗計算細胞數(shù)為537個，根據(jù)公式(細胞數(shù)/4)×20×104cells/mL推算細胞原液的濃度，本實驗計算如下(537/4)×20×104＝26.85×106cells/mL即本實驗細胞原液濃度為26.85×106cells/mL，而我們需要的目的濃度是2×106cells/mL，所以細胞原液需要稀釋。(3)稀釋倍數(shù)計算如下：稀釋倍數(shù)＝原液濃度/目的濃度；本實驗稀釋倍數(shù)＝26.85×106cells/mL/2×106cells/mL＝13.425，即原液需要稀釋13.425倍才能達到需要的目的濃度。本實驗需要2×106cells/mL的細胞懸液40mL，簡稱為目的量。(4)達到目的濃度所需原液的量，計算如下：達到目的濃度所需原液的量＝目的量/稀釋倍數(shù)。本實驗計算如下：達到目的濃度所需原液的量＝40mL/13.425≌2.98mL。即取26.85×106cells/mL的細胞原液2.98mL放入滅菌的50mL離心管內(nèi)，然后加入37.02mL(40-2.98)含15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液即可配成2×106cells/mL的細胞懸液40mL，然后加入1α,25(OH)2D3儲存液40μL，操作過程應避光，即1α,25(OH)2D3終濃度為1×10-8M；再加入4μLsolubleRANKL儲存液，即solubleRANKL終濃度為20ng/mL；加液過程在超凈工作臺上操作，至此，所需2×106cells/mL的細胞懸液目的量配置完成。1.3培養(yǎng)細胞、加藥(1)細胞接種：取4行6列24孔培養(yǎng)板一塊，每孔加入2×106cells/mL的細胞懸液0.5mL(1×106cells)。(2)加入化合物(Ⅰ)：取100μg/mL化合物(Ⅰ)分裝液一支于培養(yǎng)板的第2列分別加入2.5μL，每加一孔均需換一個吸頭；第3列每孔加入5μL；第4列每孔加入10μL。加完第4孔后，將此液放入4℃恒溫冰箱保存，取1mg/mL化合物(Ⅰ)儲存液一支。第5列每孔加入1mg/mL化合物(Ⅰ)儲存液2.5μL；第6列每孔加入5μL。加完后剩余藥液放入4℃恒溫冰箱保存。第一列不加藥物，作為對照組。至此在24孔培養(yǎng)板中化合物(Ⅰ)每行都有6個濃度，分別為0、0.5、1、2、5、10μg/mL，每個濃度每列4孔(n＝4)，第一列為對照組。(3)培養(yǎng)細胞：加完藥后，將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃、5％CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)7天。培養(yǎng)至第4天時換培養(yǎng)液一次，按上述方法配制含有15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液40m(l6mL胎牛血清加入34mLα-MEM培養(yǎng)液中)，內(nèi)含10μL青霉素8μL鏈霉素(80萬u青霉素，100萬鏈霉素分別用2mL滅菌蒸餾水溶解)，加入4μLsolubleRANKL儲存液，然后取1α,25(OH)2D3儲存液40μL加入。從培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)板后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每孔吸出舊培養(yǎng)液300μL，加入新培養(yǎng)液400μL，每吸出一列更換一次吸頭，每加一孔更換一次吸頭。換液完成后，將培養(yǎng)板繼續(xù)放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃、5％CO2及飽和濕度條件下，再培養(yǎng)3天。2、破骨前驅(qū)細胞(POC)培養(yǎng)2.1全骨髓細胞的提?。喝缤陨纤龇椒?，制備全骨髓細胞懸液1.5mL。2.2非附著骨髓細胞的提取(1)把用培養(yǎng)液沖洗過的凝膠柱，固定在固定架上；(2)緩慢向凝膠柱內(nèi)注入全骨髓細胞1.5mL，打開三通，緩慢過濾；待1.5mL全骨髓細胞滲入凝膠柱內(nèi)后，再緩慢注入含15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液10mL。(3)收集含有非附著骨髓細胞的培養(yǎng)液共計12-15mL，此液稱為非附著骨髓細胞原液。2.3細胞數(shù)的計算(原液濃度及稀釋倍數(shù))及達到目的濃度所需原液的量如同以上所述方法，計算細胞數(shù)，稀釋倍數(shù)，達到目的濃度所需原液的量。本實驗計算細胞數(shù)為337個，推算細胞原液的濃度為16.85×106cells/mL；稀釋倍數(shù)為8.425，即細胞原液需稀釋8.425倍才能達到需要的目的濃(2×106cells/mL)；達到目的濃度所需原液的量40mL/8.425≌4.75mL，即取4.75mL細胞原液放入滅菌的50mL離心管內(nèi)，然后加入35.25mL(40-4.75)含15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液即可配成2×106cells/mL的目的細胞懸液40mL，然后加入1α,25(OH)2D3儲存液40ul，操作過程應避光，即1α,25(OH)2D3終濃度為1×10-8M；加入solubleRANKL儲存液4uL，即solubleRANKL終濃度為20ng/mL；加液過程均在超凈工作臺上操作，至此，未附著骨髓細胞懸液目的量配置完成。2.4培養(yǎng)細胞及加藥如同前述。3、倒置顯微鏡下觀察3.1倒置顯微鏡的調(diào)節(jié)(1)將顯微鏡合軸；(2)將視野光圈開大至與聚光器光闌邊緣一致；(3)將與物鏡放大倍數(shù)一致的相板放入聚光器中；(4)把調(diào)中目鏡換到目鏡筒中，旋動調(diào)中目鏡上的調(diào)焦環(huán)至相板相環(huán)的圖像清晰；(5)調(diào)節(jié)聚光器上的相環(huán)調(diào)中旋鈕，使兩個圓環(huán)圖像重疊成同心圓狀態(tài)；(6)用普通目鏡換下調(diào)中目鏡。3.2TRAP染色(1)培養(yǎng)7天后，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，棄去培養(yǎng)液；(2)加入固定液0.4mL/孔，固定1分鐘；(3)棄去固定液，蒸餾水沖洗四次；(4)加入染色液3-4滴/孔，用錫紙包裹培養(yǎng)板；(5)在37℃、5％CO2及飽和濕度條件下孵育30分鐘后，取出培養(yǎng)板，棄去染色液，蒸餾水沖洗四次，自然干燥。3.3觀察培養(yǎng)7天后將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，棄去培養(yǎng)液之前，在倒置顯微鏡下觀察不同藥物濃度下細胞的生長狀況及形態(tài)，決定是否染色。染色后帶染色液倒置顯微鏡下觀察染色效果。4、光鏡觀察帶染色液倒置顯微鏡下觀察后，棄去染色液，蒸餾水洗4次，自然干燥，普通光鏡下觀察計算破骨細胞數(shù)。5、統(tǒng)計學分析使用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行分析。數(shù)據(jù)處理采用mean±SD表示，對不同藥物濃度相同處理時間，各組與對照組之間比較，化合物(Ⅰ)對破骨細胞形成及分化的影響，得出的數(shù)據(jù)資料分析采用方差分析，從而得出藥效和藥物濃度的變化關(guān)系。三、結(jié)果及結(jié)論在全骨髓細胞培養(yǎng)系中，0.5、1、2μg/mL組與對照組比較，TRAP染色陽性細胞(3核以上)數(shù)僅為對照組的49.04％、28.85％、5.77％，經(jīng)統(tǒng)計學分析，加藥組對破骨細胞的形成有抑制作用，當藥物濃度為1μg/mL時與對照組相比，對破骨細胞形成有顯著抑制作用(P﹤0.01)。見表1。在破骨前驅(qū)細胞培養(yǎng)系中，0.5、1、2、5μg/mL組與對照組相比，TRAP染色陽性細胞(單核或2核)數(shù)僅為對照組的85.11％、65.79％、37.83％、2.21％，經(jīng)統(tǒng)計學分析，加藥組對破骨前驅(qū)細胞的形成有抑制作用，當藥物濃度為2μg/mL時與對照組相比，對破骨前驅(qū)細胞形成有顯著抑制作用(P﹤0.01)。見表2。結(jié)論，本研究結(jié)果表明化合物(Ⅰ)對破骨細胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在濃度依賴關(guān)系。應用化合物(Ⅰ)治療以破骨細胞活性增強為主的骨破壞性疾病有可能成為一種有前景的治療方法。表1全骨髓細胞培養(yǎng)系中TRAP染色陽性細胞(3核以上)數(shù)0(對照組)0.5μg/mL1μg/mL2μg/mL5μg/mL10μg/mL平行操作1835626520平行操作2814428400平行操作3812219400平行操作4673117502表2破骨前驅(qū)細胞培養(yǎng)系中TRAP染色陽性細胞(單核或2核)數(shù)實施例3片劑的制備：按實施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。實施例4口服液制備：按實施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服液。實施例5膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。實施例6注射液的制備：按實施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。實施例7無菌粉針的制備：按實施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。當前第1頁1 2 3