本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種偽狂犬病滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病，被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類傳染病。臨床癥狀為發(fā)熱、奇癢、紅腫、出血；全身陣發(fā)性痙攣；磨牙、鳴叫；四肢麻痹、倒地不起和腦脊髓炎等。其宿主范圍非常廣泛，豬是該病原的天然宿主和傳染源，此病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大，蛀牙引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率及種豬不育。該病最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，目前分布于全世界50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，已引起世界各國(guó)的高度重視。該病在我國(guó)的發(fā)生也已比較嚴(yán)重，是現(xiàn)在危害我國(guó)規(guī)模養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一。疫苗是預(yù)防、控制甚至消滅偽狂犬病最主要的措施之一。國(guó)內(nèi)外已研制出常規(guī)弱毒疫苗、滅活疫苗、基因缺失疫苗等。但PRV是一種皰疹病毒，可在感染豬體內(nèi)形成持續(xù)感染，終身帶毒，常規(guī)弱毒苗免疫可以控制發(fā)病，但不能清除病毒。目前，在國(guó)外，弱毒疫苗的應(yīng)用比較普遍，但是未經(jīng)充分致弱的弱毒疫苗的毒力可能返強(qiáng)而導(dǎo)致疾病流行，從而建立潛伏感染，并存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)；采用PRV基因缺失弱毒苗進(jìn)行防控PR，這為偽狂犬病的根除計(jì)劃打下了基礎(chǔ)，但這種疫苗生產(chǎn)方式操作較為復(fù)雜，且需要操作熟練的研究人員；傳統(tǒng)滅活疫苗生產(chǎn)方式不能滿足未來(lái)我國(guó)對(duì)偽狂犬病的預(yù)防與控制需求，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)生產(chǎn)周期長(zhǎng)，難以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模疫苗生產(chǎn)；(2)生產(chǎn)工藝落后，勞動(dòng)力密集，生產(chǎn)成本高。鑒于偽狂犬病病毒滅活疫苗在我國(guó)豬病防控過(guò)程中的重要作用，亟待開(kāi)發(fā)一種制備偽狂犬病滅活疫苗的新工藝。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種偽狂犬病滅活疫苗及其制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的偽狂犬病滅活疫苗的制備方法，用偽狂犬病病毒接種BHK細(xì)胞，在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，收獲病毒液，經(jīng)甲醛滅活后，加入吐溫-80制成水相，然后與油佐劑或水佐劑混合乳化制成偽狂犬病滅活疫苗。
本發(fā)明中涉及的偽狂犬病病毒為Bartha-K61株，所述BHK細(xì)胞為BHK-21。
前述的方法，按病毒與細(xì)胞總數(shù)之比1:1000-1:100進(jìn)行接種。
前述的方法，病毒接種的BHK細(xì)胞為懸浮培養(yǎng)的BHK細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)液中BHK細(xì)胞密度達(dá)3.0×106/ml-8.0×106/ml后接種病毒。
前述的方法，在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的條件為：37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，搖床轉(zhuǎn)速120-130rpm，培養(yǎng)24-72h；
本發(fā)明使用的生物反應(yīng)器為&CELLIGEN 310Fermentor/Bioreactor。
本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)液為BS-SFM V液體培養(yǎng)基(購(gòu)自蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司，商品編號(hào)BSS20314-2)，pH值7.0-7.4。
前述的方法，待細(xì)胞完全病變后，停止培養(yǎng)，凍融，離心，取上清，測(cè)定TCID50值，在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范圍為檢驗(yàn)合格的病毒液，向病毒液中加入終濃度0.1％-0.15％的甲醛(優(yōu)選甲醛終濃度0.15％)，37℃滅活24h-36h(優(yōu)選24h)。
前述的方法，向滅活的病毒液中加入吐溫-80制成水相，其中，滅活的病毒液與吐溫-80的質(zhì)量比為9:1；然后將水相與油佐劑混合乳化制成偽狂犬病滅活疫苗，其中，水相與油佐劑的質(zhì)量比為3:7-9:1，優(yōu)選1:2；所述油佐劑是由白油、司盤(pán)-80和硬脂酸鋁按93:5:2的質(zhì)量比組成。
前述的方法，向滅活的病毒液中加入吐溫-80制成水相，其中，滅活的病毒液與吐溫-80的質(zhì)量比為9:1；然后將水相與水佐劑混合乳化制成偽狂犬病滅活疫苗，其中，所述水佐劑為聚丙烯酸，所述疫苗中聚丙烯酸的濃度為1％-10％，優(yōu)選1％-3％。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述偽狂犬病滅活疫苗按以下方法制備得到：
(1)接種所用病毒液的制備：用病毒生長(zhǎng)液將偽狂犬病病毒Bartha-K61株進(jìn)行倍比稀釋后，以1‰比例接種已長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-72h，待75％細(xì)胞出現(xiàn)病變后停止培養(yǎng)，反復(fù)凍融3次后收獲，12000r/min離心10min，取上清，測(cè)定病毒液的TCID50值，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>
(2)BHK-21細(xì)胞系的懸浮培養(yǎng)與傳代：將懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成一定濃度后，接種至生物反應(yīng)器內(nèi)，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，搖床轉(zhuǎn)速120-130rpm的條件下進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)24-72h，待細(xì)胞長(zhǎng)到密度達(dá)3.0×106/ml-8.0×106/ml后進(jìn)行傳代或接種病毒；
(3)病毒在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞上的增殖：用病毒生長(zhǎng)液將偽狂犬病病毒Bartha-K61株進(jìn)行倍比稀釋后，按照病毒與細(xì)胞總數(shù)之比1:1000-1:100進(jìn)行接種，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，搖床轉(zhuǎn)速120-130rpm的條件下振蕩培養(yǎng)24-72h，待細(xì)胞完全病變后，停止培養(yǎng)，反復(fù)凍融3次后收獲，12000r/min離心10min，取上清，測(cè)定病毒液的TCID50值，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>
(4)甲醛滅活：向檢驗(yàn)合格的病毒液中加入終濃度0.15％的甲醛，37℃滅活24h；
(5)偽狂犬病滅活疫苗的制備：
向滅活的病毒液中加入吐溫-80制成水相，其中，滅活的病毒液與吐溫-80的質(zhì)量比為9:1；然后將水相與油佐劑混合乳化制成偽狂犬病滅活疫苗，其中，水相與油佐劑的質(zhì)量比為1:2；所述油佐劑是由白油、司盤(pán)-80和硬脂酸鋁按93:5:2的質(zhì)量比組成；或者
向滅活的病毒液中加入吐溫-80制成水相，其中，滅活的病毒液與吐溫-80的質(zhì)量比為9:1；然后將水相與水佐劑混合乳化制成偽狂犬病滅活疫苗，其中，所述水佐劑為聚丙烯酸，所述疫苗中聚丙烯酸的濃度為1％-3％；
其中，步驟(1)和(3)中所用病毒生長(zhǎng)液為DMEM高糖液體培養(yǎng)基(購(gòu)自 by life technologiesTM，商品編號(hào)12800-058 1L)。
本發(fā)明首次采用BHK細(xì)胞系生產(chǎn)偽狂犬病病毒(Bartha-K61株)滅活疫苗，為偽狂犬疫病的防控提供了有效措施。采用BHK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生產(chǎn)方式具有無(wú)外源因子污染，易于規(guī)?；a(chǎn)，能較好的維持病毒抗原穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，并能縮短疫苗研發(fā)周期與生產(chǎn)周期，具備突發(fā)疫情中疫苗供應(yīng)應(yīng)急的能力。通過(guò)偽狂犬滅活疫苗對(duì)豬的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的偽狂犬病滅活疫苗產(chǎn)品具有良好的安全性，免疫后可產(chǎn)生理想的免疫保護(hù)效果，可作為犬科動(dòng)物偽狂犬疫病防控的候選疫苗株。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“％”，若未特別說(shuō)明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指100ml溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)；液體之間的百分比，是指在20℃時(shí)容量的比例。若無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明中所述的“份”是指“重量份”。
以下實(shí)施例中所用病毒生長(zhǎng)液為DMEM高糖液體培養(yǎng)基(購(gòu)自 by life technologiesTM，商品編號(hào)12800-058 1L)。所用細(xì)胞培養(yǎng)液為BS-SFM V液體培養(yǎng)基(購(gòu)自蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司，商品編號(hào)BSS20314-2)，pH值7.0-7.4。所用生物反應(yīng)器為&CELLIGEN 310 Fermentor/Bioreactor。
實(shí)施例1偽狂犬病病毒(Bartha-K61株)的接種與繁殖
包括以下步驟：
1、用病毒生長(zhǎng)液將偽狂犬病病毒Bartha-K61株進(jìn)行倍比稀釋后，以1‰比例接種已長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-72h，待75％細(xì)胞出現(xiàn)病變后停止培養(yǎng)，反復(fù)凍融3次后收獲，12000r/min離心10min，取上清，測(cè)定病毒液的TCID50值，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
2、BHK-21細(xì)胞系的懸浮培養(yǎng)與傳代：將懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成一定濃度后，接種至生物反應(yīng)器內(nèi)，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，搖床轉(zhuǎn)速120-130rpm的條件下進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)24-72h，待細(xì)胞長(zhǎng)到密度達(dá)3.0×106/ml-8.0×106/ml后進(jìn)行傳代或接種病毒。
3、病毒在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞上的增殖：用病毒生長(zhǎng)液將偽狂犬病病毒Bartha-K61株進(jìn)行倍比稀釋后，按照病毒與細(xì)胞總數(shù)之比1:1000進(jìn)行接種，于37℃，5％CO2，pH值7.0-7.2，溶氧50％-60％，搖床轉(zhuǎn)速120-130rpm的條件下振蕩培養(yǎng)24-72h，待細(xì)胞完全病變后，停止培養(yǎng)，反復(fù)凍融3次后收獲，12000r/min離心10min，取上清，測(cè)定病毒液的TCID50值，在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范圍內(nèi)檢驗(yàn)合格，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2偽狂犬病病毒(Bartha-K61株)的接種與繁殖
步驟3：按照病毒與細(xì)胞總數(shù)之比1:100進(jìn)行接種，于37℃恒溫振蕩懸浮培養(yǎng)24h，其余操作同實(shí)施例1。
所得病毒液的TCID50值在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范圍內(nèi)為檢驗(yàn)合格，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例3偽狂犬病病毒(Bartha-K61株)的接種與繁殖
步驟3：按照病毒與細(xì)胞總數(shù)之比1:500進(jìn)行接種，于37℃恒溫振蕩懸浮培養(yǎng)48h，其余操作同實(shí)施例1。
所得病毒液的TCID50值在106TCID50/0.1ml-108TCID50/0.1ml范圍內(nèi)為檢驗(yàn)合格，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例4偽狂犬病滅活疫苗的制備
1、油佐劑疫苗的制備：向檢驗(yàn)合格的病毒液中加入終濃度0.15％的甲醛，37℃滅活24h。經(jīng)檢測(cè)抗原完全滅活后，向滅活的病毒液中混入吐溫-80后制成水相，與油相一同乳化，分裝后制成成品疫苗。其中水相包含90份滅活病毒液和10份吐溫-80；油相包含93份白油、5份司盤(pán)-80和2份硬脂酸鋁。
疫苗A：對(duì)應(yīng)于實(shí)施例1的病毒液。乳化時(shí)水相1份，油相2份。
疫苗B：對(duì)應(yīng)于實(shí)施例2的病毒液。乳化時(shí)水相3份，油相7份。
疫苗C：對(duì)應(yīng)于實(shí)施例1的病毒液。乳化時(shí)水相9份，油相1份。
2、水佐劑疫苗的制備：向檢驗(yàn)合格的病毒液中加入終濃度0.15％的甲醛，37℃滅活24h。經(jīng)檢測(cè)抗原完全滅活后，向滅活的病毒液中混入吐溫-80后制成水相，與水佐劑--聚丙烯酸一同乳化，分裝后制成成品疫苗。
疫苗D：對(duì)應(yīng)于實(shí)施例1的病毒液。所述疫苗中聚丙烯酸的濃度為1％。
疫苗E：對(duì)應(yīng)于實(shí)施例2的病毒液。所述疫苗中聚丙烯酸的濃度為2％。
疫苗F：對(duì)應(yīng)于實(shí)施例3的病毒液。所述疫苗中聚丙烯酸的濃度為3％。
實(shí)施例5偽狂犬病滅活疫苗的免疫效力評(píng)價(jià)
1、免疫與攻毒：將13頭50日齡的PRV陰性仔豬隨機(jī)分成3組，第一組為免疫組(5只)，第二組為感染對(duì)照組(5只)，第三組為空白對(duì)照組(3只)。第一組肌肉注射實(shí)施例4制備的疫苗A，2ml/頭份，第二組肌肉注射PBS，2ml/頭份。7日后，第一組和第二組仔豬分別通過(guò)鼻腔進(jìn)行偽狂犬病病毒ZY-2014株(見(jiàn)潘文,馬良,張賀楠,邵葳,李曉冉,黃書(shū)林.豬偽狂犬病病毒ZY-2014株的分離與鑒定.中國(guó)獸藥雜志.2016(05):1-6.)BHK細(xì)胞毒液攻毒(攻毒劑量為107.0TCID50/ml)，第三組肌肉注射PBS(磷酸緩沖鹽溶液)各2ml，不攻毒。
按照相同的豬只數(shù)量和分組分別進(jìn)行疫苗B～F的免疫與攻毒試驗(yàn)，注射劑量、偽狂犬病病毒毒株及攻毒方法同上。
2、抗體水平監(jiān)測(cè)與臨床癥狀
①抗體水平監(jiān)測(cè)：分別觀察用疫苗A～F免疫后豬群的臨床癥狀，并用阻斷ELISA試驗(yàn)檢測(cè)免疫前和免疫7d后偽狂犬病病毒IgE的抗體水平。
②臨床癥狀：攻毒后每日監(jiān)測(cè)每頭豬只的體溫和臨床癥狀，并檢測(cè)鼻腔排毒情況。免疫前，所有試驗(yàn)豬只精神良好，采食正常，無(wú)偽狂犬病臨床癥狀，gE抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性。試驗(yàn)過(guò)程中，疫苗A～F的空白對(duì)照組(第三組)所有豬只均無(wú)臨床癥狀，體溫正常，鼻拭子檢測(cè)結(jié)果為陰性，無(wú)偽狂犬病病毒排毒；攻毒對(duì)照組(第二組)在攻毒3d后，所有豬只體溫開(kāi)始陸續(xù)升高到40.5℃以上，有些試驗(yàn)豬只高溫可持續(xù)7d，所有豬只攻毒后3～7d表現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、出現(xiàn)偽狂犬病典型臨床癥狀(咳嗽、打噴嚏、流膿性鼻分泌物和呼吸困難，共濟(jì)失調(diào)等)，并陸續(xù)出現(xiàn)死亡，鼻拭子檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。免疫山羊4只表現(xiàn)正常。
疫苗A和B：免疫豬5只表現(xiàn)正常，均無(wú)明顯偽狂犬病臨床癥狀。免疫保護(hù)組(第一組)在接種疫苗后7d，所有豬只gE抗體均為陰性，攻毒后并未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，體溫正常，2頭豬的鼻拭子檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，但與攻毒對(duì)照組相比，排毒量顯著降低，持續(xù)時(shí)間明顯較短。
疫苗C～F：免疫豬4只表現(xiàn)正常，均無(wú)明顯偽狂犬病臨床癥狀。免疫保護(hù)組(第一組)在接種疫苗后9d，所有豬只IgE抗體均為陰性，攻毒后并未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，體溫正常，3頭豬的鼻拭子檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，但與攻毒對(duì)照組相比，排毒量顯著降低，持續(xù)時(shí)間明顯較短。
3、豬只攻毒后的組織病理學(xué)檢測(cè)
疫苗A～F:于攻毒后1周分別在免疫保護(hù)組、攻毒對(duì)照組和空白對(duì)照組各取1只豬，取PRV易感部位的組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。通過(guò)病理學(xué)觀察，A～F疫苗的保護(hù)組和空白對(duì)照組豬只未觀察到異常組織變化。攻毒對(duì)照組豬只可見(jiàn)卡他性腸炎，肺充血、充血和壞死點(diǎn)，腦膜明顯充血，腦脊髓液過(guò)多。腦組織切片可見(jiàn)血管套及彌散性局部膠質(zhì)細(xì)胞壞死。
4、免疫組化檢測(cè)
疫苗A～F:采用ABC技術(shù)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，高免抗PRV病毒血清均未在A～F疫苗的保護(hù)組和空白對(duì)照組豬只的易感組織器官檢測(cè)到PRV抗原的分布。疫苗保護(hù)組和空白對(duì)照組的免疫組化無(wú)明顯差別，而攻毒對(duì)照組豬只的組織器官可見(jiàn)明顯的PRV抗原分布。
5、T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
疫苗A～F:于免疫后1周采集各免疫組、攻毒對(duì)照組、空白對(duì)照組豬只的外周血，分離淋巴細(xì)胞，分別用Bartha-K61疫苗毒和ConA進(jìn)行刺激，最后檢測(cè)淋巴細(xì)胞特異性與非特異性增殖情況。結(jié)果顯示，除空白對(duì)照組和攻毒對(duì)照組外，各疫苗免疫組T淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)較明顯的特異性和非特異性增殖反應(yīng)。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。