本發(fā)明涉及一種生物支架材料，具體涉及一種具有膠原結(jié)合區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料、其制備方法及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

骨組織是少數(shù)幾個(gè)具有自我再生能力的組織器官之一，這種再生能力不僅伴隨著個(gè)體的骨骼發(fā)育以及骨組織損傷修復(fù)過程，甚至在個(gè)體成熟后仍然可以有效的工作。然而,當(dāng)大面積的骨損傷發(fā)生時(shí)，骨組織就無法利用本身的再生能力進(jìn)行修復(fù)愈合。目前骨組織損傷后的重建主要依賴于移植治療,但會帶來多種并發(fā)癥以及產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。在臨床治療中，自體骨移植是比較理想的方法,但該方法也有許多的缺點(diǎn)，例如并發(fā)癥患病率高,需要多個(gè)手術(shù)位點(diǎn)和有限的自體骨組織。為了避免這些缺點(diǎn),許多種材料如金屬、塑料和化學(xué)分子聚合物等被用作為骨替代物，但是這些骨替代物材料都無法促進(jìn)內(nèi)源性骨再生,甚至可能引起免疫排斥反應(yīng)，會對患者造成二次傷害。

在骨損傷修復(fù)和新骨生成過程中，富含緩慢釋放生物活性因子的生物活性支架材料具有至關(guān)重要的作用。利用修飾了趨化因子的生物支架材料可以促進(jìn)新骨的生成和骨組織損傷處的修復(fù)。近年來研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍化生長因子1α(sdf1α，又稱為cxcl12)可以有效的募集間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等到骨損傷處。而研究表明在一定的微環(huán)境下，間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨損傷的修復(fù)。

但是，天然的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子在體內(nèi)維持的濃度較低，并且容易彌散。若利用化學(xué)交聯(lián)等方法將其交聯(lián)到支架材料上雖然會提高sdf1α的局部濃度，但也會引入有毒或有害的化學(xué)交聯(lián)分子進(jìn)入體內(nèi)。

因此，研究具有生物活性因子的生物支架材料作為骨替代物是亟待解決的難題，而如何在體內(nèi)控制生物活性因子的緩慢釋放、降低骨損傷移植的免疫排斥反應(yīng)是另一個(gè)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種促進(jìn)骨再生的活性支架材料、其制備方法及應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種促進(jìn)骨再生的脫鈣骨基質(zhì)支架材料，其包括：

趨化因子；

負(fù)載所述趨化因子的脫鈣骨基質(zhì)，所述脫鈣骨基質(zhì)具有疏松孔狀內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并主要由具有空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠原分子組成；

其中，所述趨化因子以共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵方式與所述脫鈣骨基質(zhì)中的膠原分子結(jié)合。

進(jìn)一步的，所述趨化因子包括基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(sdf1α)。

尤其優(yōu)選的，所述趨化因子還包括與所述基質(zhì)細(xì)胞衍生因子連接的膠原結(jié)合區(qū)。

即，所述趨化因子選自具有膠原結(jié)合區(qū)(cbd)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(cbd-sdf1α)

進(jìn)一步的，所述趨化因子以其膠原結(jié)合區(qū)與所述脫鈣骨基質(zhì)中的膠原分子結(jié)合。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了制備所述的促進(jìn)骨再生的脫鈣骨基質(zhì)支架材料的方法，其包括：

提供具有疏松孔狀內(nèi)部結(jié)構(gòu)的脫鈣骨基質(zhì)；

使所述脫鈣骨基質(zhì)與趨化因子溶液接觸，從而使所述脫鈣骨基質(zhì)負(fù)載趨化因子，形成所述脫鈣骨基質(zhì)支架材料。

進(jìn)一步的，所述的制備方法包括：采用點(diǎn)基因融合表達(dá)的方法將膠原結(jié)合區(qū)結(jié)合至基質(zhì)細(xì)胞衍生因子上，從而形成所述趨化因子。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了所述的促進(jìn)骨再生的脫鈣骨基質(zhì)支架材料的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過將膠原結(jié)合區(qū)與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子融合表達(dá)，從而獲得的具有膠原結(jié)合區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(cbd-sdf1α)，該具有膠原結(jié)合區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子不僅可與膠原分子結(jié)合，且具有天然(nat-sdf1α)的生物活性，引入的膠原結(jié)合區(qū)是一個(gè)可與膠原分子結(jié)合的小分子肽段，具有良好的生物相容性和生物可降解性；進(jìn)而，采用具有膠原結(jié)合區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子修飾脫鈣骨基質(zhì)而形成的生物活性支架材料緩慢釋放生物活性因子的穩(wěn)定性好，極大的提高了損傷處趨化分子的局部濃度，可迅速的動(dòng)員體內(nèi)的干細(xì)胞到骨損傷處，同時(shí)釋放持續(xù)時(shí)間長，而且此生物活性支架材料具有疏松孔狀的內(nèi)部構(gòu)造可以提供細(xì)胞粘附、生長、分化的環(huán)境，同時(shí)此生物活性支架材料整體又具有一定的硬度，可以在移植早期局部代替骨支撐身體的作用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明結(jié)構(gòu)特征和技術(shù)要點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中一種sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料的制備工藝原理圖；

圖2a-2b分別為本發(fā)明實(shí)施例1中一種具有疏松孔狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的脫鈣骨基質(zhì)的宏觀及微觀結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中一種sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料緩慢釋放sdf1α的統(tǒng)計(jì)圖；

圖4a-4b為本發(fā)明實(shí)施例1中一種sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料用于大鼠股骨損傷移植的照片；

圖5a為本發(fā)明實(shí)施例1中利用cd34及c-kit免疫熒光染色顯示sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料在體內(nèi)募集干細(xì)胞情況的熒光顯微照片；

圖5b為本發(fā)明實(shí)施例1中一種sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材募集干細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖；

圖6a為本發(fā)明實(shí)施例1中一種sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料移植4周后的骨礦化密度值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果的示意圖；

圖6b為本發(fā)明實(shí)施例1中一種sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料移植8周后的骨礦化密度值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果的示意圖；

圖7a為本發(fā)明實(shí)施例2中一種cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料的制備工藝原理圖；

圖7b為本發(fā)明實(shí)施例2中一種脫鈣骨基質(zhì)支架材料緩慢釋放細(xì)胞因子的統(tǒng)計(jì)圖；

圖7c為本發(fā)明實(shí)施例2中一種脫鈣骨基質(zhì)支架材料可以為細(xì)胞的生長提供良好的微環(huán)境的sem圖，其中*p<0.05,**p<0.01；

圖8a為本發(fā)明實(shí)施例2中脫鈣骨基質(zhì)在礦化液中逐步被礦化的sem圖；

圖8b為本發(fā)明實(shí)施例中礦化后的脫鈣骨基質(zhì)材料的元素分析統(tǒng)計(jì)圖；

圖9a為本發(fā)明實(shí)施例2中反映cbd-sdf1α和nat-sdf1α具有相同的生物活性的結(jié)晶紫染色圖；

圖9b為本發(fā)明實(shí)施例2中反映cbd-sdf1α和nat-sdf1α具有相同的生物活性的結(jié)晶紫染色統(tǒng)計(jì)圖；

圖10a為本發(fā)明實(shí)施例2中cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料用于大鼠股骨損傷移植的照片(大鼠股骨缺損模型的建立)；

圖10b為本發(fā)明實(shí)施例2中microct的二體積分析法的示意圖；

圖10c為本發(fā)明實(shí)施例2中修飾了cbd-sdf-1α的脫鈣骨基質(zhì)在體內(nèi)短期募集干細(xì)胞的情況的熒光顯微照片；

圖10d為本發(fā)明實(shí)施例中修飾了cbd-sdf-1α的脫鈣骨基質(zhì)在體內(nèi)短期募集干細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，*p<0.05；

圖11a為本發(fā)明實(shí)施例中大鼠股骨樣品的ct掃描軸狀圖；

圖11b為本發(fā)明實(shí)施例中大鼠股骨樣品的ct掃描冠狀圖；

圖12a為本發(fā)明實(shí)施例中h&e染色的樣品在50倍放大鏡下的觀察圖；

圖12b為本發(fā)明實(shí)施例中h&e染色樣品在200倍放大鏡下的觀察圖；

圖12c為本發(fā)明實(shí)施例中masson染色的樣品在50倍放大鏡下的觀察圖；

圖12d為本發(fā)明實(shí)施例中骨組織樣品中成骨細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)圖；

圖12e為本發(fā)明實(shí)施例中骨組織樣品中破骨細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)圖，其中黑色的尖箭頭指示的是破骨細(xì)胞，黑色鈍箭頭指示的是成骨細(xì)胞，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；

圖13a為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療4周后的骨組織樣品的opg染色圖；

圖13b為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療4周后骨組織樣品的opn染色分析圖；

圖13c為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療12周后骨組織樣品的ocn染色分析圖，其中黑色箭頭指示的是褐色的陽性染色區(qū)域；

圖14a為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療4周的股骨缺損處活體ct掃描冠狀圖；

圖14b為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療8周的股骨缺損處活體ct掃描冠狀圖；

圖14c為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療4周的股骨缺損處(v1及v2)骨礦化密度值統(tǒng)計(jì)圖；

圖14d為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療8周的股骨缺損處(v1及v2)骨礦化密度值統(tǒng)計(jì)圖；

圖14e為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療4周的股骨缺損處(v1)新生骨體積值統(tǒng)計(jì)圖；

圖14f為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療4周的股骨缺損處(v2)新生骨體積值統(tǒng)計(jì)圖,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；

圖15a為本發(fā)明實(shí)施例中三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)示意圖；

圖15b為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療4周的股骨樣品三點(diǎn)彎曲測試結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；

圖15c為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療8周的股骨樣品三點(diǎn)彎曲測試結(jié)統(tǒng)計(jì)圖；

圖15d為本發(fā)明實(shí)施例中移植治療12周的股骨樣品三點(diǎn)彎曲測試結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，其中*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明：

本發(fā)明實(shí)施例提供的一種促進(jìn)骨再生的脫鈣骨基質(zhì)支架材料包括：

趨化因子；

負(fù)載所述趨化因子的脫鈣骨基質(zhì)，所述脫鈣骨基質(zhì)具有疏松孔狀內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并主要由具有空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠原分子組成；

其中，所述趨化因子以共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵方式與所述脫鈣骨基質(zhì)中的膠原分子結(jié)合。

進(jìn)一步的，所述趨化因子包括基質(zhì)細(xì)胞衍生因子。

優(yōu)選的，所述趨化因子還包括與所述基質(zhì)細(xì)胞衍生因子連接的膠原結(jié)合區(qū)。

進(jìn)一步的，所述趨化因子以其膠原結(jié)合區(qū)與所述脫鈣骨基質(zhì)中的膠原分子結(jié)合。

進(jìn)一步的，所述脫鈣骨基質(zhì)內(nèi)的至少部分孔洞中修飾有所述趨化因子。

本發(fā)明提供的修飾了具有膠原結(jié)合能力的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子的脫鈣骨基質(zhì)支架材料，即前述的脫鈣骨基質(zhì)支架材料可以通過募集內(nèi)源間充質(zhì)干細(xì)胞來促進(jìn)新骨生成，并可用于體內(nèi)移植治療。

將修飾具有膠原結(jié)合能力的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子的脫鈣骨基質(zhì)生物活性支架材料作為骨移植替代物移植到大鼠股骨損傷處可動(dòng)員內(nèi)源干細(xì)胞到損傷部位。術(shù)后檢查其恢復(fù)情況可發(fā)現(xiàn)，這種生物活性的支架材料促進(jìn)新骨的生成及骨組織功能的恢復(fù)。

本發(fā)明具有顯著優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的復(fù)合趨化因子的脫鈣骨基質(zhì)支架材料緩慢釋放生物活性因子的穩(wěn)定性好，極大的提高了損傷處趨化分子的局部濃度，可迅速的動(dòng)員體內(nèi)的干細(xì)胞到骨損傷處，同時(shí)釋放持續(xù)時(shí)間長；另外，此復(fù)合的生物活性支架材料具有疏松孔狀的內(nèi)部構(gòu)造可以提供細(xì)胞粘附、生長、分化的環(huán)境。而生物活性支架材料整體又具有一定的硬度，可以在移植早期局部代替骨支撐身體的作用。

本發(fā)明實(shí)施例提供的一種制備所述的促進(jìn)骨再生的脫鈣骨基質(zhì)支架材料的制備方法包括：

提供具有疏松孔狀內(nèi)部結(jié)構(gòu)的脫鈣骨基質(zhì)；

使所述脫鈣骨基質(zhì)與趨化因子溶液接觸，從而使所述脫鈣骨基質(zhì)負(fù)載趨化因子，形成所述脫鈣骨基質(zhì)支架材料。

進(jìn)一步的，所述的制備方法包括：采用點(diǎn)基因融合表達(dá)的方法將膠原結(jié)合區(qū)結(jié)合至基質(zhì)細(xì)胞衍生因子上，從而形成所述趨化因子。

進(jìn)一步的，所述的制備方法包括：將所述趨化因子溶液緩慢施加在所述脫鈣骨基質(zhì)上，從而使所述脫鈣骨基質(zhì)負(fù)載趨化因子。

進(jìn)一步的，所述趨化因子溶液的濃度在10nm以上。

進(jìn)一步的，所述的制備方法包括：提供異體來源的長骨骨組織，先剪切成合適大小，然后在有機(jī)溶劑中充分浸泡，去除骨組織表面的雜質(zhì)，之后以水充分清洗，再以鹽酸溶液處理脫鈣，最后以水清洗、凍干、輻射滅菌，獲得脫鈣骨基質(zhì)，備用。

進(jìn)一步的，所述有機(jī)溶劑可采用丙酮，但不限于此。

較為優(yōu)選的，所述鹽酸溶液的濃度可以為0.6mol/l。

進(jìn)一步的，所述的制備方法包括：在無菌條件下，將趨化因子溶于磷酸鹽緩沖液中而形成所述趨化因子溶液，之后將所述趨化因子溶液逐滴、多點(diǎn)地滴加到所述脫鈣骨基質(zhì)上，并在37℃孵育30min以上,使趨化因子被修飾到所述脫鈣骨基質(zhì)上，形成所述脫鈣骨基質(zhì)支架材料。

本發(fā)明可采用酸堿的方法制備脫鈣骨基質(zhì)，使得獲得的脫鈣骨基質(zhì)具有疏松孔狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、具有一定的硬度同時(shí)也極大的降低了免疫原性。同時(shí)還可采用點(diǎn)基因融合表達(dá)的方法獲得具有膠原結(jié)合能力的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(cbd-sdf1α)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了趨化因子的生物活性的保存和與脫鈣骨基質(zhì)材料的有效結(jié)合。同時(shí)，所述cbd-sdf1α不僅可與膠原分子結(jié)合并且具有天然(nat-sdf1α)的生物活性，而且引入膠原結(jié)合區(qū)是可與膠原分子結(jié)合的小分子肽段，具有良好的生物相容性和生物可降解性。

相應(yīng)的，本發(fā)明實(shí)施例還提供了所述的促進(jìn)骨再生的脫鈣骨基質(zhì)支架材料于制備活性支架材料中的用途，所述活性支架材料至少能夠通過募集內(nèi)源性干細(xì)胞而促進(jìn)骨再生。

相應(yīng)的，本發(fā)明實(shí)施例還提供了所述的促進(jìn)骨再生的脫鈣骨基質(zhì)支架材料在制備骨缺損移植治療產(chǎn)品中的用途。

如下結(jié)合附圖和若干實(shí)施例對該技術(shù)方案、其實(shí)施過程及原理等作進(jìn)一步的解釋說明。

實(shí)施例1

(一)修飾趨化因子的脫鈣骨基質(zhì)支架材料的制備方法

1)首先，利用業(yè)界已知的基因工程方法構(gòu)建趨化因子的大腸桿菌表達(dá)載體，純化表達(dá)出高純度的趨化因子，其中趨化因子采用sdf1α；

2)其次，利用酸堿的方法處理脫鈣骨基質(zhì)材料，具體的，提供異體來源的長骨骨組織，先剪切成合適大小，然后在丙酮中處理48小時(shí)去除表面的軟組織、脂肪等物質(zhì)，隨后用雙蒸水清洗數(shù)次再用0.6mhci溶液處理脫鈣，最后雙蒸水清洗后凍干；再輻照滅菌后備用，獲得的脫鈣骨基質(zhì)具有疏松孔狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(如圖2a-圖2b所示)，可以提供細(xì)胞粘附、生長、分化的環(huán)境，而脫鈣骨基質(zhì)支架材料整體又具有一定的硬度，可以在移植早期局部代替骨支撐身體的作用；

3)最后，在無菌條件下，用20μl的pbs溶解10nm的sdf1α，再逐滴、多點(diǎn)地滴加到剪切好的脫鈣骨基質(zhì)材料上，注意此步操作時(shí)要緩慢，從而保證生物活性因子sdf1α充分的負(fù)載到脫鈣骨基質(zhì)支架材料上，參閱圖1展示了sdf1α修飾到脫鈣骨基質(zhì)支架材料的情況。

(二)修飾趨化因子的脫鈣骨基質(zhì)支架材料緩慢釋放趨化因子的檢測方法

1)在無菌條件下，選取一個(gè)48孔板，在每個(gè)孔內(nèi)均放置一塊sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料，并在每個(gè)孔內(nèi)添加500μl的pbs；

2)將48孔板放入水平轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘的小搖床上，再整體放入到溫度恒定為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔12小時(shí)更換一次pbs溶液，并且每次收取更換掉的溶液凍存于-20℃冰箱中，一直延續(xù)此動(dòng)作至84小時(shí)；

3)利用sdf的elisa試劑盒檢測收集的凍存的溶液中的sdf1α的含量，如圖3所示，體現(xiàn)了sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料緩慢釋放sdf1α的情況，從圖中可以看出，sdf1α從脫鈣骨基質(zhì)支架材料上的釋放是一個(gè)均勻的、緩慢的過程，一直到測試開始的84小時(shí)后，sdf1α在脫鈣骨基質(zhì)支架材料上的濃度仍然維持在一個(gè)相對較高的水平上(30％以上)。

(三)sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料在大鼠體內(nèi)短期募集干細(xì)胞的表征

1)首先，構(gòu)建一個(gè)大鼠股骨損傷的模型，如圖4a展示了，大鼠股骨滑車處手術(shù)處理形成一個(gè)3×3mm的缺損；

2)然后，將sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料填充到骨損傷部位(如圖4b)，移植手術(shù)三天后，用4％的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠處死，而后取出移植的sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料。

3)將取出的sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料包埋后進(jìn)行冰凍切片，選取cd34和c-kit作為干細(xì)胞的標(biāo)記，進(jìn)行染色處理，利用dapi進(jìn)行細(xì)胞核染色，所有染色處理完成后在激光共聚焦顯微鏡下觀察cd34和c-kit陽性細(xì)胞的數(shù)量。

4)設(shè)計(jì)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：對照組、dbm材料組(脫鈣骨基質(zhì)支架材料組)及sdf1α修飾的dbm支架材料組。在圖5a的共聚焦圖片中可以看出，sdf1α修飾的dbm支架材料組可以募集到更多的干細(xì)胞，而在圖5b的統(tǒng)計(jì)圖中也可以表明sdf1α修飾的dbm支架材料組的募集細(xì)胞數(shù)量更多，這在骨移植治療中更有利于新骨的生成。

(四)sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料移植后骨損傷恢復(fù)的表征

在移植手術(shù)進(jìn)行之后，依賴microct的技術(shù)，可以檢測到骨的礦化程度，新骨生成的情況以及直觀的看到松質(zhì)骨愈合情況。在移植手術(shù)進(jìn)行4周、8周后分別進(jìn)行了microct的檢測。圖6a、6b展示了移植手術(shù)進(jìn)行4周、8周后各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的骨礦化密度值的統(tǒng)計(jì)，其清晰地表明在相同的恢復(fù)時(shí)間內(nèi)，sdf1α修飾的dbm支架材料組的骨礦化密度值更高，且相對其他有顯著性差異。

實(shí)施例2

1.cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料的制備及宏觀、微觀結(jié)構(gòu)的表征

首先，利用基因工程的方法構(gòu)建cbd-sdf1α/nat-sdf1α的大腸桿菌表達(dá)載體，純化表達(dá)出高純度的cbd-sdf1α/nat-sdf1α。其次，是利用酸堿的方法獲得脫鈣骨基質(zhì)材料(dmb支架)，輻照滅菌后備用(與實(shí)施例1相同，形貌可參閱圖2a-圖2b)。無菌條件下，用20μl的pbs溶解10nm的cbd-sdf1α/nat-sdf1α，逐滴、多點(diǎn)地滴加到剪切好的材料上，注意此步操作時(shí)要緩慢，保證生物活性因子充分的負(fù)載到脫鈣骨基質(zhì)支架材料上，如圖7a展示了cbd-sdf1α/nat-sdf1α負(fù)載到脫鈣骨基質(zhì)支架材料的情況。

2.cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料緩慢釋放的表征

制備含有10nm的cbd-sdf1α/nat-sdf1α的脫鈣骨基質(zhì)支架材料，檢測在模擬體內(nèi)條件下，這種具有生物活性因子的支架材料緩慢釋放生物活性因子cbd-sdf1α/nat-sdf1α的能力。無菌條件下，選取一個(gè)48孔板，在每個(gè)孔都放置一塊含有cbd-sdf1α/nat-sdf1α的dbm支架材料，然后每個(gè)孔都添加500μl的pbs。將48孔板放入水平轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘的小搖床上，再整體放入到溫度恒定為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中。每12小時(shí)換一次pbs，收取的液體凍存于-20℃的冰箱中，一直檢測到84小時(shí)。然后利用sdf1α的elisa試劑盒檢測收集的樣品中sdf1α的含量。圖7b展示了cbd-sdf1α/nat-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料緩慢釋放cbd-sdf1α的情況。在統(tǒng)計(jì)的圖中可以看到，cbd-sdf1α從脫鈣骨基質(zhì)上的釋放是一個(gè)均勻的、緩慢的過程。一直到釋放實(shí)驗(yàn)開始的84小時(shí)后，cbd-sdf1α在脫鈣骨基質(zhì)支架材料上的濃度仍然維持在一個(gè)相對較高的水平上(30％)。而nat-sdf1α在釋放實(shí)驗(yàn)12小時(shí)后快速被釋放，到36小時(shí)其濃度僅為初始值的一半左右。

3.脫鈣骨基質(zhì)支架材料培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的表征

檢測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在脫鈣骨基質(zhì)材料上的生長情況具體是將含有間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液逐滴滴加到脫鈣骨基質(zhì)支架材料上，置于37℃恒溫的5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)2-3天后，將含有間充質(zhì)干細(xì)胞的脫鈣骨基質(zhì)材料浸沒于4％的多聚甲醛中于室溫條件下固定2小時(shí)。對固定后的樣品采用梯度濃度酒精進(jìn)行脫水處理，最后置于真空干燥箱中干燥處理3小時(shí)。圖7c展示的為場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察下的間充質(zhì)干細(xì)胞可以在脫鈣骨基質(zhì)材料上的很好的粘附和生長。

4.脫鈣骨基質(zhì)支架材料礦化活性的分析

本研究采用10倍濃度的模擬體液(10×sbf)作為研究脫鈣骨基質(zhì)材料礦化活性的礦化液。在礦化實(shí)驗(yàn)前，利用nahco3調(diào)節(jié)10×sbf的ph到6.5，然后將脫鈣骨基質(zhì)材料完全浸沒在礦化液中，分別于1，2，3小時(shí)取出脫鈣骨基質(zhì)材料。將礦化后的材料進(jìn)行梯度濃度的酒精脫水處理，然后置于真空干燥箱內(nèi)干燥處理3小時(shí)，最后利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察。如圖8a和圖8b，脫鈣骨基質(zhì)材料可以很好的被礦化，礦化實(shí)驗(yàn)3小時(shí)基本可以將材料完全礦化。元素分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在礦化實(shí)驗(yàn)中，材料中的鈣離子濃度逐漸提高，材料表面被逐步的礦化。

5.cbd-sdf1α和nat-sdf1α活性比較

采用boyden小室的方法對cbd-sdf1α和nat-sdf1α活性進(jìn)行比較。首先，在48孔板的每個(gè)孔中分別加入600μl含有500ng的cbd-sdf1α/nat-sdf1α的細(xì)胞培養(yǎng)基，然后把小室放入到24孔板中并向小室上部加入200μl細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml間充質(zhì)干細(xì)胞的懸液。然后將24孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，取出小室。將小室的內(nèi)部用棉簽擦拭干凈后浸沒于4％的多聚甲醛固定1小時(shí)，最后對小室進(jìn)行結(jié)晶紫染色。染色的結(jié)果可通過光學(xué)顯微鏡觀察，如圖9a所示。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，cbd-sdf1α和nat-sdf1α組誘導(dǎo)遷移的細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)。隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞獲得細(xì)胞遷移率如圖9b，進(jìn)一步驗(yàn)證了cbd-sdf1α和nat-sdf1α組誘導(dǎo)遷移的細(xì)胞能力相似，不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

6.構(gòu)建大鼠股骨損傷模型及microct分析方法

建立大鼠股骨缺損模型如圖10a-10d所示。首先采用腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50mg/kg)的方法對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行麻醉。然后選取大鼠股骨的遠(yuǎn)端、滑車正對下方作為手術(shù)的位點(diǎn)，造成一個(gè)3×3的骨缺損模型，最后移植修飾了具有膠原結(jié)合區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子的脫鈣骨基質(zhì)材料并將打開的傷口進(jìn)行縫合處理。在建模一周后，采用ct活性掃描的方法檢測建模是否成功。如圖11a-圖11b所示，在大鼠股骨缺損模型造模一周后，無處理的對照組ct掃描顯示并未有新生骨的生成，骨缺損的尺寸基本沒變化。

為了全面細(xì)致的分析骨缺損的ct掃描數(shù)據(jù)，本研究采用兩體積分析的方法。如圖10b所示，將股骨樣品的表面以3mm圓面為截面向軸向縱深1.5mm為vi；同樣以3mm圓面為截面，沿股骨的軸向移動(dòng)1.5mm形成v2。通過利用v1、v2可以對骨組織樣品的礦化物密度值、新生骨體積值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，從而獲得不同方面的骨再生的情況。

7.cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料在大鼠體內(nèi)短期募集干細(xì)胞的表征

采用對常見干細(xì)胞標(biāo)記物cd34及c-kit染色的方法，研究cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料在大鼠體內(nèi)募集內(nèi)源性干細(xì)胞的情況。首先，麻醉處死移植治療3天的實(shí)驗(yàn)大鼠，收獲移植的生物樣品，用o.c.t.包埋后于-80℃冷凍處理1天。利用冰凍切片機(jī)將包埋好的樣品制備成6μm厚度的冰凍切片，然后浸沒于丙酮中固定30分鐘。將冰凍切片分別滴加mouse-anti-rat-anti-cd34和anti-c-kit-biotin并置于4℃過夜處理。取出切片，用pbs溶液清洗3次，然后再對切片分別在孵育rabbitanti-mouseigg-pe以及fitc-streptavidin中室溫孵育1小時(shí)。最后，采用dapi溶液對所有的切片進(jìn)行細(xì)胞核染色處理。如圖10c所示，共聚焦顯微鏡獲得的熒光圖表明，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組在大鼠股骨缺損治療后具有一定數(shù)量的干細(xì)胞被募集到損傷部位，其中cbd-sdf1α組的干細(xì)胞數(shù)量更為豐富。圖10d為利用image-proplus軟件對圖10c的熒光染色圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)一步表明cbd-sdf1α組比nat-sdf1α組及dbm組募集更多的干細(xì)胞。

8.cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料移植后骨損傷修復(fù)的表征

1)組織形態(tài)學(xué)分析cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料可以促進(jìn)骨的再生

采用常規(guī)組織化學(xué)染色-h&e、masson染色分析方法。首先，過量注射4％的戊巴比妥鈉溶液對移植治療4、8及12周的實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行安樂死，收集股骨組織樣品。用pbs溶液將骨組織樣品清洗3次，以洗凈骨樣品表面的細(xì)胞、血管等軟組織；再將骨組織樣品浸沒于15％的edta(ph7.4左右)溶液中，室溫條件下脫鈣12周(每3-4天更換一次脫鈣液且脫鈣液需現(xiàn)用現(xiàn)配)。用針刺法檢測骨組織樣品是否脫鈣完全。對于已經(jīng)完全脫鈣的骨組織樣品，用雙蒸水清洗后再利用梯度酒精溶液進(jìn)行脫水處理，然后用石蠟包埋并制備成石蠟切片。最后對各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的石蠟切片進(jìn)行h&e、masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察獲得圖12a-12e。如圖12a-12b所示，移植治療4周后不同實(shí)驗(yàn)組的骨缺損部位均有一定程度的愈合，其中cbd-sdf1α組的愈合效果最好且成骨細(xì)胞數(shù)量最多(箭頭所示)。在針對膠原染色的圖12c中可以觀察到，cbd-sdf1α組的新生膠原最多。通過對各組中成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)分析(圖12d-12e)可以進(jìn)一步證明cbd-sdf1α組具有更多數(shù)量的成骨細(xì)胞并且可以一定程度的抑制破骨細(xì)胞的數(shù)量。

2)cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料可以促進(jìn)具有骨誘導(dǎo)活性蛋白的表達(dá)

為了研究cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)材料是否具有骨誘導(dǎo)活性，我們針對骨誘導(dǎo)蛋白：骨保護(hù)素opg、骨橋蛋白o(hù)pn以及骨鈣蛋白o(hù)cn進(jìn)行染色。在制備獲得骨組織石蠟切片后，將切片分別與anti-osteoprotegerin、anti-osteopontin以及anti-osteocalcin在4℃條件下孵育過夜,隔天利用pbs溶液清洗3次后再分別與二抗溶液室溫共孵育1小時(shí)后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。圖13a-13b展示了cbd-sdf1α組在骨缺損治療4周后表達(dá)相對多的骨保護(hù)素及骨橋蛋白，并且在骨移植治療12周后累積表達(dá)的骨鈣蛋白的量也明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組(圖13c)。

3)cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料可以促進(jìn)骨礦化密度值和新生骨體積的增加

利用microct進(jìn)行骨組織樣品掃描檢測以及活體掃描檢測可以獲得移植治療后大鼠骨缺損處恢復(fù)的直觀圖以及缺損處骨礦化密度值和新生骨體積值。如圖14a-14b所示，在移植治療4周后，各個(gè)實(shí)驗(yàn)的骨缺損部位具有一定程度的愈合，其中以cbd-sdf1α組的愈合效果最好，nat-sdf1α組和dbm組的愈合程度相似；在移植治療8周后cbd-sdf1α組的骨缺損部位基本完全愈合，而其他實(shí)驗(yàn)組均還有一定程度的缺口未愈合。

為了進(jìn)一步比較各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的治療效果，我們對microct獲得的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。圖14c-14d分別展示了移植治療4周及8周的骨缺損樣品的礦化物密度值，cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)極大的促進(jìn)了骨缺損處的礦化物的累積，相對于其他實(shí)驗(yàn)組具有明顯的優(yōu)勢。圖14e-14f則表示移植治療4周后v1/v2處的新生骨體積的增長情況。cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)材料均可促進(jìn)v1/v2處的新生骨體積的增長，其對v2處的新生骨體積增長促進(jìn)效果更為顯著。

4)cbd-sdf1α修飾的脫鈣骨基質(zhì)支架材料可以促進(jìn)骨組織力學(xué)性能的恢復(fù)

力學(xué)性能是評價(jià)骨組織功能恢復(fù)的重要指標(biāo)，因此，采用三點(diǎn)彎曲對移植治療的骨缺損樣品進(jìn)行力學(xué)性能的檢測。如圖15a所示，三點(diǎn)測試的過程是：給待測的樣品兩端各一個(gè)支點(diǎn)且兩點(diǎn)之間的距離大于2cm，在兩支點(diǎn)的中間正上方給予一個(gè)具有恒定速度向下且不斷增加的壓力，檢測樣品斷裂時(shí)的最大負(fù)載力。通過對移植治療4、8以及12周的骨缺損樣品進(jìn)行三點(diǎn)彎曲測試，統(tǒng)計(jì)得到圖15b-15d。在移植治療4周后，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的骨組織樣品所能承受的最大負(fù)載力差別最大，其中cbd-sdf-1α組顯著高于nat-sdf-1α組；在移植治療8周和12周后，各組間能承受的最大負(fù)載力差距縮小，cbd-sdf-1α組雖然還高于nat-sdf-1α組但卻沒有顯著性差異。

應(yīng)當(dāng)理解，上述具體實(shí)施方式僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思和結(jié)構(gòu)特征，目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的相關(guān)人士能夠據(jù)以實(shí)施，但以上所述內(nèi)容并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是依據(jù)本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)所作的任何等效變化或修飾，均應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。