本申請要求2009年7月28日提交的美國臨時申請序列號61/229,191的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，該申請的內(nèi)容出于所有目的通過引用全文納入本文。

領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化合物、其前藥、鹽和含有它們的藥物組合物以及利用這些化合物、其前藥和組合物治療眼睛疾病和/或病癥的方法。

背景

JAK激酶(JAnus激酶)是胞質(zhì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的一個家族，包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。各JAK激酶對某些細(xì)胞因子的受體具有選擇性，但多種JAK激酶可能受特定細(xì)胞因子或信號傳導(dǎo)途徑的影響。研究顯示，JAK3與各種細(xì)胞因子受體的共有γ(γc)鏈相關(guān)。JAK3尤其選擇性結(jié)合IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的受體并且是這些細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)途徑的一部分。JAK1與細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-21的受體相互作用，而JAK2與IL-9和TNF-α的受體相互作用。某些細(xì)胞因子與它們的受體結(jié)合之后(例如，IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21)，受體發(fā)生寡聚化，導(dǎo)致相關(guān)JAK激酶的胞質(zhì)尾相互靠近從而有助于JAK激酶上的酪氨酸殘基發(fā)生反式磷酸化。這種反式磷酸化導(dǎo)致JAK激酶被激活。

磷酸化的JAK激酶結(jié)合各種STAT(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子)蛋白。STAT蛋白是一種由酪氨酸殘基磷酸化激活的DNA結(jié)合蛋白，其功能為信號傳導(dǎo)分子和轉(zhuǎn)錄因子，并最終結(jié)合存在于細(xì)胞因子效應(yīng)基因啟動子內(nèi)的特定DNA序列。JAK/STAT信號傳導(dǎo)參與介導(dǎo)許多異常免疫應(yīng)答，如過敏反應(yīng)，哮喘，自身免疫性疾病如移植物(同種異體移植物(allograft))排斥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌萎縮側(cè)索硬化和多發(fā)性硬化，眼科病癥和疾病，以及實(shí)體惡性腫瘤和血液惡性腫瘤如白血病和淋巴瘤。

干眼綜合征(干燥性角膜炎)代表了特別廣泛的臨床問題。干眼疾病通常由蒸發(fā)機(jī)能障礙或淚液缺乏所致。蒸發(fā)機(jī)能障礙可在正常淚腺功能存在下發(fā)生，但可由瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction)、正常的眼瞼功能喪失或眼睛表面原因(例如，使用隱形眼鏡或眼睛過敏)所致。淚水缺乏通常由舍格倫綜合征或非舍格倫疾病所致。雖然干眼的誘因各有不同，但最終的病理學(xué)機(jī)理是眼前淚膜(pre-ocular tear film)破壞伴有暴露的角膜表面脫水，后者導(dǎo)致角膜的不適和刺激。臨床檢查后，干眼的跡象可包括球結(jié)膜血管擴(kuò)張(bulbar conjunctival vascular dilation)、結(jié)膜松弛、淚半月板減少(decreased tear meniscus)、角膜表面不規(guī)則和淚膜中碎片增加。用孟加拉玫瑰紅(bengal rose)或熒光素染色劑常觀察到彌散性角膜染色，在更嚴(yán)重的病例中可見到細(xì)絲或粘斑。

現(xiàn)已采用了各種臨床檢驗(yàn)來診斷干眼。這些檢驗(yàn)包括觀察淚半月板的深度、淚崩解時間減少和席氏檢驗(yàn)(Schirmer test)。

干眼的共有原因是舍格倫綜合征，其是免疫細(xì)胞攻擊和損傷產(chǎn)生淚液和唾液的腺體的自身免疫疾病。該疾病的標(biāo)志癥狀是口干和眼干。在美國，舍格倫綜合征影響1-4百萬人，其中婦女產(chǎn)生該疾病的可能性高9倍。舍格倫綜合征可作為原發(fā)性疾病或與其它自身免疫疾病，例如全身性紅斑狼瘡(“狼瘡”)或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)而作為繼發(fā)性疾病產(chǎn)生。常見到干眼與其它常見疾病，例如紅斑痤瘡相關(guān)。干眼還是許多藥物，例如異維甲酸、利尿劑、三環(huán)類抗抑郁藥、鎮(zhèn)靜劑、抗高血壓藥物、口服避孕藥、抗組胺、鼻部解充血劑和許多其它藥物的共有副作用。

雖然干眼情況很普遍，但主要治療仍是利用人工淚液(例如，羧甲基纖維素、羥甲基纖維素或羥丙基纖維素)以潤濕角膜和提供臨時的癥狀緩解。另一常見治療是定時阻塞(punctual occlusion)，通過封閉通常用于排出淚水的管道來部分中斷淚水自眼睛流出。通過，例如利用合適的抗生素治療紅斑痤瘡，對潛在疾病的治療也能改善干眼的癥狀。然而，提供緩解各種干眼疾病，例如(但不限于)免疫介導(dǎo)的干燥性角膜炎的治療方法是理想的。

概述

對于可通過包括調(diào)節(jié)JAK途徑的治療獲益的許多病癥，目前認(rèn)為能調(diào)節(jié)JAK途徑的化合物和利用這些化合物的方法應(yīng)能為廣大患者提供充分的治療益處。

本發(fā)明公開了化合物、前藥、相應(yīng)的鹽形式和利用這些化合物、前藥和鹽形式來治療眼睛疾病和/或病癥的方法。

一個實(shí)施方式提供化合物I及其溶劑化物、前藥和藥學(xué)上可接受的鹽：

一個實(shí)施方式提供化合物I的特定前藥及其藥學(xué)上可接受的鹽形式，為化合物II：

一方面，利用有效量的化合物I和/或II及其鹽形式和包含一種或多種所述化合物的藥物組合物治療眼睛疾病。一個實(shí)施方式提供治療眼睛疾病和/或病癥的方法，包括給予對象治療所述眼睛疾病和/或病癥有效量的化合物I和/或化合物II。利用本文公開的化合物治療的眼睛疾病和病癥包括但不限于：干眼綜合征、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性(例如，衰老相關(guān)的黃斑變性)、葡萄膜炎、過敏性結(jié)膜炎、青光眼和紅斑痤瘡。在具體的例子中，所述疾病是干眼疾病，例如角膜炎或干燥性角膜結(jié)膜炎，例如淚水產(chǎn)生不足或淚水組成異常所致疾病，如淚腺疾病。在特定的非限制性實(shí)施例中，所述疾病是自身免疫疾病或免疫介導(dǎo)疾病，如舍格倫綜合征。在其它實(shí)施例中，所述疾病是干燥性特發(fā)性角膜炎或紅斑痤瘡。

在治療眼睛疾病的所述方法的一方面，與未治療的淚水產(chǎn)生體積相比，給予一種或多種本文公開的2,4-嘧啶二胺化合物能有效增加淚水產(chǎn)生體積，從而緩解干眼綜合征的癥狀。在一方面，淚水產(chǎn)生體積在5天內(nèi)增加，例如不到4天，在一些實(shí)施例中，不到2天。在一個實(shí)施方式中，在用本文公開的2,4-嘧啶二胺化合物開始治療的兩天內(nèi)，淚水產(chǎn)生體積相比于初始淚水產(chǎn)生增加至少約25％。在其它實(shí)施方式中，在不到兩天，淚水產(chǎn)生相比于初始淚水產(chǎn)生增加至少約30％，例如至少約50％。在一些情況中，給予本發(fā)明化合物后，淚水產(chǎn)生的增加導(dǎo)致淚水產(chǎn)生體積與正常淚水產(chǎn)生相當(dāng)。

在另一方面，將式I和/或II所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽形式與抗炎藥、抗組胺、抗生素、抗病毒和青光眼藥物組合或附加給予。在特定的例子中，抗炎劑可以是全身性(例如，口服或胃腸外)或局部(眼滴劑)給予的非甾體抗炎劑(NSAID)或皮質(zhì)類固醇(例如，潑尼松龍)或免疫抑制劑(例如，環(huán)孢菌素A)。還可利用單克隆抗體(例如，細(xì)胞因子阻斷劑)或抑制miR基因產(chǎn)物的試劑。在其它實(shí)施例中，治療與非藥物治療聯(lián)用，例如淚小點(diǎn)(punctal)阻塞或給對象佩戴在角膜上產(chǎn)生液體填充層的鞏膜或半鞏膜隱形眼鏡。還有其它組合治療可包括相伴或附加治療干眼相關(guān)的潛在疾病，例如用抗紅斑痤瘡藥物或方案，如四環(huán)素類抗生素(例如，米諾環(huán)素或多西環(huán)素)或激光外科手術(shù)治療紅斑痤瘡以減輕面部紅斑或肥大性酒糟鼻。

用于局部治療眼睛疾病時，公開的式I和/或II所示化合物通常至少每日給予一次，例如每日兩次。

在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含母體或鹽形式的化合物I和/或II和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑、防腐劑或穩(wěn)定劑或它們的混合物的藥物制劑。在另一實(shí)施例中，藥物制劑是還包含非甾體或甾體抗炎劑或干眼的其它療劑的組合制劑，包括用于治療促進(jìn)干燥性角膜炎的潛在病癥(例如,舍格倫疾病或紅斑痤瘡)的組合制劑。在另外的其它實(shí)施例中，將化合物I和/或II在潤滑劑組合物，特別是粘性組合物中給予，所述組合物為藥物的局部眼睛給藥以及緩解干眼癥狀提供載體。

下文更詳細(xì)描述了這些和其它實(shí)施方式。

詳述

定義

除非另有表述，本文所用的以下定義應(yīng)適用。

“皮質(zhì)類固醇”是腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生的類固醇激素。皮質(zhì)類固醇參與多種生理學(xué)系統(tǒng)，例如應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)節(jié)、碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)分解代謝、血液電解質(zhì)水平和行為。皮質(zhì)類固醇的例子包括皮質(zhì)醇、潑尼松和潑尼松龍。可通過口服、胃腸外(例如，注射)或用滴眼劑直接滴注入眼睛而給予皮質(zhì)類固醇，它們可與式I和/或II所示化合物組合在組合制劑中。

“干燥性角膜炎”或“干燥性角膜結(jié)膜炎”或“干眼綜合征”指與淚水產(chǎn)生減少或蒸發(fā)增加相關(guān)的干眼病癥，其具有各種病因?qū)W特征，例如炎性、非炎性、創(chuàng)傷性、醫(yī)源性、藥物誘導(dǎo)、紅斑痤瘡相關(guān)或特發(fā)性起源。干眼的一個特定原因是淚腺產(chǎn)生的淚水減少，例如由于損害淚腺或瞼板腺的正常功能的自身免疫相關(guān)病癥。病癥治療可用藥物或非藥物干預(yù)，如淚小點(diǎn)阻塞(例如在淚小點(diǎn)中引入塞子或利用電烙術(shù)切除或部分切除淚小點(diǎn)開口或淚管)。

“非甾體抗炎藥(NSAID)”是通過抑制前列腺素產(chǎn)生起作用的一類抗炎藥。NSAID施加抗炎、鎮(zhèn)痛和退熱作用。NSAID的例子包括布洛芬、酮洛芬、吡羅昔康、萘普生、舒林酸、阿司匹林、次水楊酸膽堿、二氟尼柳、非諾洛芬、依托度酸、甲氯滅酸、雙水楊酯、托美汀和水楊酸鎂。這些試劑可通過口服、胃腸外(例如，注射)或用滴眼劑直接滴注入眼睛而給予，它們可與式I和/或II所示化合物組合在組合制劑中。

“對象”指人和非人對象。

“藥學(xué)上可接受的鹽”指化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，該鹽衍生自本領(lǐng)域熟知的各種有機(jī)和無機(jī)抗衡離子。

“藥學(xué)有效量”或“治療有效量”指足以治療特定病癥或疾病或其一種或多種癥狀和/或阻止該疾病或病癥發(fā)生的化合物用量。

短語“恢復(fù)正常淚水產(chǎn)生”指終止標(biāo)準(zhǔn)眼科實(shí)踐描述的干眼癥狀，例如McMonnies和Ho干眼問卷調(diào)查的反應(yīng)評分低于14.5、檢驗(yàn)結(jié)果(例如，眼科實(shí)踐技術(shù)人員已知的酚紅、熒光素等)或適應(yīng)癥的組合。

本文所用的短語“顯著增加淚水產(chǎn)生”表示標(biāo)準(zhǔn)眼科實(shí)踐檢測到的淚水產(chǎn)生有統(tǒng)計學(xué)顯著性(例如p<0.05)增加。例如，可通過席氏檢驗(yàn)、酚紅絲檢驗(yàn)(phenol red thread test)、淚水崩解時間(例如，熒光素染色)、孟加拉玫瑰紅染色等檢測淚水產(chǎn)生。

化合物

本發(fā)明公開了化合物、前藥、相應(yīng)的鹽形式和利用這些化合物、前藥和鹽形式來治療眼睛疾病和/或病癥的方法。

以下更詳細(xì)地描述了化合物I和II以及它們的鹽形式和含有它們的藥物組合物?；衔颕也稱為N2-(3-氨基磺?；?4-甲基苯基)-5-氟-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺?；衔颕I也稱為5-氟-N2-(4-甲基-3-丙酰基氨基磺?；交?-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。

出于簡潔描述的目的，對于專門指明化合物I和化合物II的任何實(shí)施方式，有利用鹽形式和/或含有化合物I和/或化合物II的藥物組合物的相應(yīng)實(shí)施方式。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該了解化合物II是化合物I的前藥，化合物II無需轉(zhuǎn)化成化合物I才有藥理學(xué)活性。丙酰基前基團(tuán)的代謝機(jī)理不重要，可通過，例如在胃部的酸性條件下和/或通過消化道和/或身體組織或器官中存在的酶，例如酯酶、酰胺酶、脂酶(lipolases)、磷酸酶(包括ATP酶和激酶)、肝臟的細(xì)胞色素P450等水解導(dǎo)致。在本文所述的具體實(shí)施方式中，利用化合物I和/或II治療眼科疾病，因此可直接給予眼睛。在一些實(shí)施方式中，給藥不僅包括局部給藥，還包括注射等。這些給藥方式不排除，例如化合物I和/或II通過全身性循環(huán)對眼睛的治療益處。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解，化合物I和II可表現(xiàn)出互變異構(gòu)、構(gòu)象異構(gòu)和/或幾何異構(gòu)現(xiàn)象。應(yīng)該理解，本發(fā)明包括所述化合物的任何互變異構(gòu)、構(gòu)象異構(gòu)和/或幾何異構(gòu)形式以及這些不同異構(gòu)體形式的混合物。阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體是由于圍繞單鍵的旋轉(zhuǎn)受到阻礙而產(chǎn)生的立體異構(gòu)體，其中旋轉(zhuǎn)的阻礙足夠高從而能夠分離構(gòu)象異構(gòu)體(Eliel，E.L.；Wilen，S.H。《有機(jī)化合物的立體化學(xué)》(Stereochemistry of Organic Compounds)；韋利父子公司(Wiley&Sons)：紐約，1994；第14章)。阻轉(zhuǎn)異構(gòu)是有意義的，因?yàn)樗茉诓淮嬖诹Ⅲw原性原子(stereogenic atom)時引入手性元素。例如當(dāng)圍繞2,4-嘧啶二胺核心結(jié)構(gòu)和其所連基團(tuán)之間的鍵，或者例如圍繞磺酰胺和其所連苯環(huán)之間的鍵的旋轉(zhuǎn)受到限制時，本發(fā)明也包括阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體?；衔颕和II可以是鹽形式。此類鹽包括適合藥用的鹽(“藥學(xué)上可接受的鹽”)和適于獸醫(yī)使用的鹽等等。如本領(lǐng)域所熟知，此類鹽可衍生自酸或堿。本文所述的示例性鹽是鈉鹽、鉀鹽、精氨酸鹽、膽堿鹽和鈣鹽，但通常任何藥學(xué)上可接受的鹽均可用于本文所述方法。由于化合物I和化合物II同時具有堿性基團(tuán)，例如嘧啶氮，以及酸性基團(tuán)，例如磺酰胺上的酸性質(zhì)子和/或嘧啶二胺體系的N2和N4的氮，這些化合物可形成藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽。

在一個實(shí)施方式中，所述鹽是藥學(xué)上可接受的鹽。通常，藥學(xué)上可接受的鹽是充分保留母體化合物的一個或多個所需藥理學(xué)活性并且適合給予人體的那些鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括由無機(jī)酸或有機(jī)酸形成的酸加成鹽。適合形成藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的無機(jī)酸包括，例如但不限于：氫鹵酸(例如，鹽酸、氫溴酸、氫碘酸等)、硫酸、硝酸、磷酸等。適合形成藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的有機(jī)酸包括，例如但不限于：乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、羥基乙酸、草酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、棕櫚酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、烷基磺酸(例如，甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙磺酸等)、芳基磺酸(例如，苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸等)、4-甲基二環(huán)[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羥基萘酸、水楊酸、硬脂酸和粘康酸等。

藥學(xué)上可接受的鹽還包括存在于母體化合物中的酸質(zhì)子被金屬離子(如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子)取代、或者與有機(jī)堿(如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺、嗎啉、哌啶、二甲胺、二乙胺、三乙胺、氨水等)配位形成的鹽。

如本領(lǐng)域所熟知的，所述化合物I和II及其鹽還可以是溶劑化物，例如水合物和N-氧化物的形式。

方法

本發(fā)明提供2,4-取代的嘧啶二胺化合物I和II、其前藥、鹽和藥物組合物以便用于治療眼睛的疾病和/或病癥。具體地說，化合物I和II可單用或與其它試劑聯(lián)用。如本文所述，可將化合物I和/或化合物II作為母體和/或其鹽形式和藥物制劑給予。

如本文所用和本領(lǐng)域已知的，“治療”是一種獲得有益或所需結(jié)果，包括臨床結(jié)果的方法。出于本發(fā)明的目的，有益或所需結(jié)果包括但不限于以下一種或多種：緩解或改善一種或多種癥狀、減輕狀況(包括疾病)的程度、穩(wěn)定(即不使其惡化)狀況(包括疾病)的狀態(tài)、防止疾病擴(kuò)散、延遲或減緩狀況(包括疾病、進(jìn)展)、改善或減輕狀況(包括疾病、狀態(tài))、以及緩解(部分或全部)，無論可檢測或不可檢測的?；衔颕和II(至少作為化合物I的來源)是強(qiáng)效性的，從而可以非常低的劑量局部給予，因而最大程度降低全身性不良作用。

化合物I和II是JAK激酶的強(qiáng)效和選擇性抑制劑，尤其對包含JAK3的細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)途徑有選擇性。因?yàn)樵摶钚?，該化合物可用于各種體外、體內(nèi)和離體環(huán)境以調(diào)節(jié)或抑制JAK激酶活性、JAK激酶起作用的信號傳導(dǎo)級聯(lián)以及受這種信號傳導(dǎo)級聯(lián)影響的生物應(yīng)答。例如，在一個實(shí)施方式中，該化合物可用在體外或體內(nèi)，實(shí)際上可在任何表達(dá)JAK激酶的細(xì)胞類型里抑制JAK激酶。例如，在JAK3表達(dá)占優(yōu)勢的造血細(xì)胞中。它們還可用于調(diào)節(jié)JAK激酶，尤其是JAK3起作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。此類JAK-依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)包括但不限于：涉及共有γ鏈的細(xì)胞因子受體如IL-4、IL-7、IL-5、IL-9、IL-15和IL-21的信號傳導(dǎo)級聯(lián)，或者IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受體信號傳導(dǎo)級聯(lián)。該化合物還可用于在體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)，尤其是抑制，受此類JAK-依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)影響的細(xì)胞或生物應(yīng)答。此類細(xì)胞或生物應(yīng)答包括但不限于：IL-4/ramos CD23上調(diào)、IL-2介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖等。重要的是，該化合物可用于體內(nèi)抑制JAK激酶，作為治療或預(yù)防完全或部分由JAK激酶活性介導(dǎo)的疾病的治療方法。此類疾病稱為“JAK激酶介導(dǎo)的疾病”。

雖然不想受理論的束縛，但據(jù)信，本文所述的化合物至少部分因其JAK抑制活性而成為這些眼睛疾病的有效治療方法。至少部分受JAK激酶介導(dǎo)并可按照本發(fā)明方法治療或預(yù)防的疾病的例子包括眼睛的疾病和病癥，包括但不限于：干眼綜合征、葡萄膜炎、過敏性結(jié)膜炎、青光眼、交感神經(jīng)性眼炎和紅斑痤瘡(眼睛的)。然而，雖然本文所述方法用于治療眼科疾病，但由于上述活性，給予所述化合物和/或制劑可具有其它治療益處，即，在身體的其它組織或器官中的益處。一個實(shí)施方式是治療眼科疾病或病癥的方法，其中還認(rèn)識到第二益處。如本文所述，一個實(shí)施方式提供治療眼睛的疾病和/或病癥的方法，包括給予對象治療所述眼睛疾病和/或病癥有效量的化合物，其中所述化合物選自化合物I和化合物II。眼睛的疾病和病癥包括但不限于：干眼綜合征、葡萄膜炎、過敏性結(jié)膜炎、青光眼和紅斑痤瘡(眼睛的)。干眼綜合征(DES)也稱為干燥性角膜結(jié)膜炎(KCS)、干燥性角膜炎、干燥綜合征或干眼病，其是在人和一些動物中常見的淚水產(chǎn)生減少或淚膜蒸發(fā)增加導(dǎo)致的眼睛疾病。葡萄膜炎或虹膜睫狀體炎指眼睛中層(葡萄膜)的炎癥，通常用于指涉及眼睛內(nèi)部的任何炎性過程。過敏性結(jié)膜炎是過敏反應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)膜(覆蓋眼白部分的膜)炎癥。青光眼指影響視神經(jīng)和涉及特征模式的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞喪失的一組疾病，即，一類視神經(jīng)病。眼內(nèi)壓升高是產(chǎn)生青光眼的顯著風(fēng)險因子(高于22mmHg或2.9kPa)，炎性過程，例如葡萄膜炎可導(dǎo)致眼內(nèi)壓的這種升高。

紅斑痤瘡是特征在于面部紅斑的慢性炎性病癥，但其能影響眼睛和鼻子(肥大性酒糟鼻)。本發(fā)明方法包括治療局部面部紅斑、肥大性酒糟鼻和眼睛紅斑痤瘡。在一個實(shí)施方式中，所述眼睛的疾病和/或病癥選自干眼綜合征、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、葡萄膜炎、過敏性結(jié)膜炎、青光眼、紅斑痤瘡和它們的組合。在一個實(shí)施方式中，所述眼睛的疾病和/或病癥是干眼綜合征。在另一實(shí)施方式中，所述眼睛的疾病和/或病癥是葡萄膜炎。在一個實(shí)施方式中，所述眼睛的疾病和/或病癥是過敏性結(jié)膜炎。在一個實(shí)施方式中，所述眼睛的疾病和/或病癥是青光眼。在一個實(shí)施方式中，所述眼睛的疾病和/或病癥是紅斑痤瘡。

在一個實(shí)施方式中，利用化合物I和/或化合物II治療任何上述眼科疾病和/或病癥。在一個實(shí)施方式中，利用鹽形式的化合物I和/或II。在具體的實(shí)施方式中，利用鹽形式的化合物II。在一個實(shí)施方式中，化合物II的鹽選自：鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、精氨酸鹽和膽堿鹽。

共同給藥

用于治療眼睛疾病時，可單獨(dú)給予化合物I和II，或與用于治療眼睛的疾病和/或病癥的其它藥劑作為混合物和/或組合給予?？蓪⒒衔颕和II與可用于治療其它病癥或疾病的藥劑作為混合物或組合給予，所述藥劑有，例如類固醇、膜穩(wěn)定劑、5-脂肪氧合酶(5LO)抑制劑、白三烯合成和受體抑制劑、IgE同種型轉(zhuǎn)換或IgE合成的抑制劑、IgG同種型轉(zhuǎn)換或IgG合成的抑制劑、β-激動劑、胰蛋白酶抑制劑、阿司匹林、環(huán)加氧酶(COX)抑制劑、氨甲蝶呤、抗-TNF藥物、利妥昔、PD4抑制劑、p38抑制劑、PDE4抑制劑和抗組胺等等?；衔颕和II可以其本身、前藥的形式或作為包含活性化合物和/或前藥的藥物組合物給予。

可與化合物I和II聯(lián)用的具體免疫抑制療劑包括，例如巰基嘌呤，皮質(zhì)類固醇類，如強(qiáng)的松、甲潑尼松龍和潑尼松龍，烷化劑，如環(huán)磷酰胺，神經(jīng)鈣蛋白抑制劑，如環(huán)孢菌素、西羅莫司和他克莫司，肌苷一磷酸脫氫酶(IMPDH)抑制劑，如麥考酚酯、霉酚酸酯和硝基咪唑硫嘌呤，以及設(shè)計用于抑制細(xì)胞免疫而保留完整的受體體液免疫反應(yīng)的藥劑，包括各種抗體(例如，抗淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG)、抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)、單克隆抗-T細(xì)胞抗體(OKT3))和輻射。這些各種藥劑可按照藥物市售形式附帶的處方信息中指明的標(biāo)準(zhǔn)或常規(guī)劑量使用(也可參見《醫(yī)師案頭參考》(The Physician’s Desk Reference)2006年版中的處方信息)，其內(nèi)容通過引用納入本文。硫唑嘌呤目前以商品名AZASAN從賽利克斯制藥有限公司(Salix Pharmaceuticals，Inc.)獲得；巰基嘌呤目前以商品名PURINETHOL從給特制藥有限公司(Gate Pharmaceuticals，Inc.)獲得；強(qiáng)的松和潑尼松龍目前從羅克森實(shí)驗(yàn)室(Roxane Laboratories，Inc.)獲得；甲潑尼松龍目前從輝瑞公司(Pfizer)獲得；西羅莫司(雷帕霉素)目前以商品名RAPAMUNE從惠氏-阿耶斯特公司(Wyeth-Ayerst)獲得；他克莫司目前以商品名PROGRAF從藤澤公司(Fujisawa)獲得；環(huán)孢霉素目前以商品名SANDIMMUNE從諾華公司(Novartis)獲得，并以GENGRAF從雅培公司(Abbott)獲得；IMPDH抑制劑如霉酚酸酯和麥考酚酸目前以商品名CELLCEPT從羅氏(Roche)獲得，并以商品名MYFORTIC從諾華公司獲得；硫唑嘌呤目前以商品名IMURAN從葛蘭素-史克公司(Glaxo Smith Kline)獲得；抗體目前可以商品名ORTHOCLONE從奧多生物技術(shù)公司(Ortho Biotech)獲得，以商品名SIMULECT(巴利昔單抗)從諾華公司獲得，以及以商品名ZENAPAX(達(dá)珠單抗)從羅氏獲得。

在一個實(shí)施方式中，將式I和/或II所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽形式與抗組胺、抗生素、抗炎藥、抗病毒藥和青光眼藥物組合或附加給予。用于眼睛的常規(guī)抗生素的例子是乙?；前?、紅霉素、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星和氧氟沙星。皮質(zhì)類固醇(有時稱為“類固醇”)類似于腎上腺產(chǎn)生的天然物質(zhì)，它們是各種眼睛問題的極有效抗炎藥。皮質(zhì)類固醇可安全地用于眼睛，沒有口服類固醇，例如潑尼松相關(guān)的大多數(shù)風(fēng)險。用于治療眼睛的皮質(zhì)類固醇包括但不限于：潑尼松龍、氟甲龍和地塞米松。用于眼睛的非甾體抗炎藥包括但不限于：布洛芬、雙氯芬酸、酮咯酸和氟比洛芬。常規(guī)抗組胺包括立復(fù)汀(livostin)、帕坦醇(patanol)、色甘酸、阿樂邁(alomide)。有用于眼睛的非處方抗組胺，它們效力不強(qiáng)，在但溫和病例中非常有用，例如非尼拉敏(pheniramine)。常規(guī)抗病毒眼藥包括但不限于：三氟胸苷、腺嘌呤、阿拉伯糖苷和碘苷。青光眼藥物通常試圖降低眼內(nèi)壓，即眼睛內(nèi)部的液體壓力以防止視神經(jīng)破壞，從而導(dǎo)致視覺喪失。這些藥物可通過減少眼睛中液體的產(chǎn)量，增加通過眼睛的天然排流流出的液體，或提供液體離開眼睛的其它途徑來降低壓力。常同時利用多于一種的青光眼藥物，因?yàn)槟芙M合這些作用從而相比于單用一種藥物進(jìn)一步降低壓力。常規(guī)青光眼藥物包括但不限于：β阻斷劑，例如噻嗎洛爾(timolol)、美替洛爾(metipranolol)、卡替洛爾(carteolol)、倍他洛爾(betaxolol)和左布諾洛爾(levobunolol)；前列腺素類似物，例如拉坦前列素(latanoprost)；膽堿能激動劑，例如匹魯卡品和卡巴膽堿；α激動劑，例如溴莫尼定(bromonidine)和愛必定(iopidine)；碳酸酐酶抑制劑，例如多佐胺(dorzolamide)；和腎上腺能激動劑，例如腎上腺素和腎上腺素異戊酯。

藥物組合物

含有本文所述化合物I和II的藥物組合物可以通過常規(guī)的混合、溶解、造粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或凍干等方式進(jìn)行制備。可采用常規(guī)方式，利用一種或多種生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或有助于將活性化合物加工成可藥學(xué)使用的制劑的輔助劑配制這些組合物。

可將化合物I和II配制成藥物組合物本身，或者水合物、溶劑化物或藥學(xué)上可接受的鹽形式，如本文所述。此類鹽通常比相應(yīng)的游離酸和堿更易溶于水溶液，但也可制成溶解度低于相應(yīng)的游離酸和堿的鹽。

在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的藥物制劑包含化合物I和/或化合物II，和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑、防腐劑或穩(wěn)定劑或者它們的混合物。

在一個實(shí)施方式中，所述化合物以藥學(xué)上可接受的無毒鹽提供，如上所述。合適的本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括由鹽酸、延胡索酸、對甲苯磺酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸形成的酸加成鹽。胺基的鹽還包括季銨鹽，其中氨基氮原子攜帶有合適的有機(jī)基團(tuán)，如烷基、烯基、炔基或芳烷基部分。此外，如果本文所述化合物攜帶酸性部分，其合適的藥學(xué)上可接受的鹽可包括金屬鹽，如堿金屬鹽，例如鈉鹽或鉀鹽；以及堿土金屬鹽，例如鈣鹽和鎂鹽。

可由常規(guī)方法形成本文所述藥學(xué)上可接受的鹽，例如在所述鹽不溶的溶劑或介質(zhì)中或在諸如水等溶劑中使產(chǎn)物的游離堿形式與一個或多個當(dāng)量的合適酸反應(yīng)，然后在真空下或通過冷凍干燥或在合適的離子交換樹脂上使現(xiàn)有的鹽的陰離子與另一種陰離子交換以除去溶劑。

化合I和II物可通過口服、胃腸外(例如，肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、ICV、腦池內(nèi)注射或輸注、皮下注射、或移植)、通過吸入噴霧、鼻、陰道、直腸、舌下、尿道(例如尿道栓劑)或局部給藥途徑(例如，凝膠、軟膏、乳膏、氣溶膠等)給予，并可單獨(dú)或一起制成含有適合各給藥途徑的藥學(xué)上可接受的常規(guī)無毒運(yùn)載體、佐劑、賦形劑和載體的合適的劑量單位制劑。除了治療溫血動物，如小鼠、大鼠、馬、牛、綿羊、狗、貓、猴等，本文所述化合物在人中有效。

用于給予化合物I和II的藥物組合物可方便地以劑量單位形式提供，可通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法來制造。例如，可將活性成分與液體載體或細(xì)分的固體載體或這兩者均勻并緊密混合，然后如果需要的話使產(chǎn)品成形成為所需制劑，從而制造藥物組合物。藥物組合物中活性目標(biāo)化合物的含量足以產(chǎn)生所需療效。例如，本文所述藥物組合物可采用實(shí)質(zhì)上適合任何給藥方式的形式，包括，如局部、眼、口服、含服、全身性、鼻、注射、透皮、直腸、陰道給藥方式等等，或者是適合吸入或吹入給藥的形式。

對于局部給藥，可將一種或多種JAK-選擇性化合物或前藥配制成本領(lǐng)域熟知的溶液、凝膠、軟膏、乳膏、混懸液等等。具體地說，溶液、凝膠、軟膏、乳膏和混懸液特別適合直接給予眼睛。一個實(shí)施方式是包含化合物I和/或化合物II的藥物制劑，其中所述制劑選自溶液、凝膠、軟膏、乳膏和混懸液。在一個實(shí)施方式中，所述制劑是溶液。在另一實(shí)施方式中，所述制劑是凝膠。在另一實(shí)施方式中，所述制劑是混懸液。在還有另一實(shí)施方式中，所述制劑是乳膏或軟膏。一個實(shí)施方式是用于給予眼睛的試劑盒中的任何上述制劑，可通過局部或經(jīng)注射給予眼內(nèi)。在一個實(shí)施方式中，所述制劑是液體，例如均勻液體或混懸液，成瓶出售，將制劑作為滴眼液分配。在一個實(shí)施方式中，所述制劑是乳膏或軟膏，成管出售，將制劑分配至眼睛，例如在眼瞼下。在另一實(shí)施方式中，所述化合物在粘稠液體(例如，羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙二醇、甘油、聚乙烯醇或含油滴劑)中提供以便滴入眼睛。所述制劑可含防腐劑或不含防腐劑(例如，在一次使用的容器中)。利用不含防腐劑的制品對于治療干眼尤其有益，眼睛常對防腐劑敏感，而在眼中引入防腐劑更使情況惡化。

全身性制劑包括那些為注射給藥(如皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)注射)設(shè)計的制劑，以及那些為透皮、透粘膜口服或肺部給藥設(shè)計的制劑。

有用的可注射制品包括水性或油性載體配制的活性化合物的無菌混懸液、溶液或乳液。所述組合物也可含有配制劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于注射的制劑可以是單位劑型，如安瓿或多劑量容器的形式，并可以包含添加的防腐劑。

或者，可注射制劑可采用粉末形式提供，以便在使用前用適當(dāng)?shù)妮d體重建，所述載體包括但不限于：無菌的無熱原水、緩沖液、葡萄糖溶液等等。為此目的，所述活性化合物可采用任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)(如凍干)干燥，并在使用前重建。

對于透粘膜給藥，在該制劑中使用適合被透過屏障的滲透劑。此類滲透劑是本領(lǐng)域已知的。

對于口服給藥，藥物組合物可采取如錠劑、片劑或膠囊的形式，這些是通過常規(guī)方式，用藥學(xué)上可接受的賦形劑如粘合劑(如預(yù)糊化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或者羥丙基甲基纖維素)；填充劑(如乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅)；崩解劑(如馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)；或潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)制備。所述片劑可以通過本領(lǐng)域熟知的方法，用例如糖、薄膜或腸衣包被。此外，適合口服形式的含2,4-取代的嘧啶二胺作為活性成分或其前藥的藥物組合物還可包括，例如，含片、錠劑、水性或油性混懸液、可分散的粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或者糖漿劑或酏劑?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知的任何制備藥物組合物的方法來制備口服使用的組合物，此類組合物可含有一種或多種選自下組的試劑以提供藥學(xué)上美觀且可口的藥物制品：甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑。片劑中含有活性成分(包括前藥)和適合制備片劑的藥學(xué)上可接受的無毒賦形劑的混合物。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；顆粒劑和分散劑(例如，玉米淀粉或海藻酸)；粘合劑(例如，淀粉、明膠或阿拉伯膠)；以及潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉)。所述片劑可以是未包衣的或者可用已知方法包衣以延遲在胃腸道內(nèi)的崩解和吸收從而在較長時間內(nèi)提供持久作用。例如，可利用延時材料如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。也可采用美國專利號4,256,108；4,166,452；和4,265,874中描述的技術(shù)對它們進(jìn)行包衣以形成控釋滲透治療片劑。本文所述的藥物組合物也可以是水包油乳液的形式。

用于口服給藥的液體制劑可采取如酏劑、溶液、糖漿或混懸液等形式，或者可以以干燥產(chǎn)物的形式提供以便在使用前用水或其他合適的載體重建。此類液體制劑可以通過常規(guī)方法，用藥學(xué)上可接受的添加劑，如懸浮劑(如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水載體(如杏仁油、油脂、普通酒精、cremophore^TM或者分餾的植物油)；防腐劑(如甲基或丙基-對羥基苯甲酸或山梨酸)來制備。該制劑也可按需含有緩沖鹽、防腐劑、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。

眾所周知，可適當(dāng)配制口服給藥的制劑以控釋活性化合物或前藥。

用于含服給藥的組合物可采取常規(guī)方式配置的片劑或錠劑形式。

對于直腸和陰道給藥途徑，可將所述活性化合物配制成含有常規(guī)栓劑基料，如可可脂或其他甘油酯的溶液(用于灌腸劑)、栓劑或軟膏。

對于鼻給藥或通過吸入或吹入給藥，所述活性化合物或前藥可以使用適當(dāng)壓縮氣體(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氟碳化合物、二氧化碳或其他合適氣體)從加壓袋或噴霧器中以氣溶膠噴霧的方式方便遞送。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過提供遞送計量量的閥來確定。可將吸入器或吹藥器中使用的膠囊和藥筒(如由凝膠組成的膠囊和藥筒)配制成含有所述化合物和適當(dāng)?shù)姆刍?如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

所述藥物組合物可以是水性或油性的無菌可注射混懸液形式?？衫蒙鲜瞿切┖线m的分散劑或潤濕劑和懸浮劑，按照已知的方法制備這種混懸液。無菌可注射制品還可以是用胃腸外可接受的無毒稀釋劑或溶劑配制的無菌可注射溶液或混懸液?？衫玫目山邮茌d體和溶劑有水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液?；衔颕和II也可采用栓劑形式給予以便經(jīng)直腸或尿道給予藥物。在具體的實(shí)施方式中，可將所述化合物制成尿道栓劑，例如用于治療尤其是男性的生育疾病，如治療睪丸機(jī)能障礙。

根據(jù)本發(fā)明，2,4-取代嘧啶二胺化合物可用于制備組合物或藥物，包括適合直腸或尿道給藥的藥物。本發(fā)明還涉及制備適合尿道或直腸給藥形式的含2,4-取代嘧啶二胺化合物的組合物，包括栓劑的方法。

對于局部使用，可利用含有化合物I和II的乳膏、軟膏、膠凍劑、凝膠劑、溶液或混懸液等?？衫没衔颕和II制備組合物或藥物，包括適合局部給予的藥物。在某些實(shí)施方式中，可將化合物I和II與聚乙二醇(PEG)一起制成適合局部給藥的形式。這些制劑可任選含有其它藥學(xué)上可接受的成份，如稀釋劑、穩(wěn)定劑和/或佐劑。在具體的實(shí)施方式中，配制局部制劑以便治療眼科疾病和/或病癥。

可用于遞送化合物I和II的特定例子的裝置是本領(lǐng)域熟知的，例如計量吸入器、液體噴霧器、干粉吸入器、噴霧器、熱蒸發(fā)器等。給予特定2,4-取代嘧啶二胺化合物的其它合適技術(shù)包括電動煙霧發(fā)生器?？衫脟婌F和氣溶膠將化合物本身或在制劑中直接給予入眼睛。

本領(lǐng)域已知適合將化合物I和II給予入眼睛的各種載體。具體的非限制性例子描述于美國專利號6,261,547；美國專利號6,197,934；美國專利號6,056,950；美國專利號5,800,807；美國專利號5,776,445；美國專利號5,698,219；美國專利號5,521,222；美國專利號5,403,841；美國專利號5,077,033；美國專利號4,882,150；和美國專利號4,738,851。眼科給藥的制劑通常含有藥學(xué)有效量的本文所述2,4-取代嘧啶二胺化合物，例如約0.0001重量％到約1.0重量％(w/w)。在某些實(shí)施方式中，藥學(xué)有效量的化合物是0.0003％到約0.1％(w/w)，例如約0.003％到約0.5％(w/w)或約0.01％到約0.03％(w/w)。

在某些實(shí)施例中，含有本文公開的2,4-嘧啶二胺化合物以供眼睛給藥的眼科組合物包含張度劑(tonicity agent)、緩沖液或二者。在眼科組合物的某些實(shí)施例中，張度劑是簡單的碳水化合物或糖醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可在本發(fā)明組合物中利用張度劑以調(diào)節(jié)組合物的張度，優(yōu)選調(diào)節(jié)至普通淚水的張度。合適張度劑的例子包括但不限于：氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、多元醇，如糖醇，包括例如甘露醇、山梨醇、木糖醇、乳糖醇、異麥芽糖(isomalt)、麥芽糖醇和它們的組合。在一些實(shí)施例中，含緩沖液的組合物含有磷酸(鹽)、檸檬酸(鹽)或二者。

在一方面，本發(fā)明的2,4-嘧啶二胺化合物的眼科給藥組合物任選含有表面活性劑、穩(wěn)定聚合物或二者。某些組合物中利用表面活性劑促進(jìn)遞送較高濃度的所給予的2,4-嘧啶二胺化合物。此類表面活性劑能起到溶解化合物的作用。示例性表面活性劑包括聚山梨醇酯、泊洛沙姆、多元醇40硬脂酸酯、聚烴氧基(polyoxyl)蓖麻油、泰洛沙泊、曲通和失水山梨糖醇單月桂酸酯。在某些實(shí)施方式中，表面活性劑選自曲通X114、泰洛沙泊和它們的組合。在眼科給藥組合物的另一實(shí)施方式中，穩(wěn)定聚合物是卡波姆974p。

本文所述的2,4-取代嘧啶二胺化合物或其前藥或組合物通常以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果的有效量使用，例如治療或預(yù)防所治療具體病癥的有效量?？芍委熜越o予所述化合物以實(shí)現(xiàn)治療益處或預(yù)防性給予以實(shí)現(xiàn)預(yù)防益處。治療益處表示根除或緩解所治療的潛在疾病和/或根除或緩解潛在疾病相關(guān)的一種或多種癥狀，從而患者報道感覺或情況有改善，但是患者可能仍受潛在疾病的影響。例如，將化合物給予因過敏性反應(yīng)而罹患眼科疾病的患者不僅提供潛在過敏性應(yīng)答根除或緩解時，還提供患者報道接觸過敏原后過敏反應(yīng)相關(guān)癥狀的嚴(yán)重程度或持續(xù)時間降低時的治療益處。治療益處還包括延遲或減緩疾病進(jìn)展，而無論癥狀是否有改進(jìn)。

對于預(yù)防給藥，可將化合物給予有產(chǎn)生上述病癥之一風(fēng)險的患者。例如，如果不知患者是否會對特定藥物起過敏反應(yīng)，可在給予該藥物之前給予所述化合物以避免或緩解對該藥物的過敏反應(yīng)。或者，可采用預(yù)防給藥以避免癥狀在診斷具有潛在疾病的患者中的發(fā)作。例如，可在過敏反應(yīng)患者預(yù)期接觸過敏原之前先將化合物給予患者。還可將化合物預(yù)防性給予反復(fù)接觸已知是上述疾病之一的致病因子的健康個體以防止疾病發(fā)作。例如，可將化合物給予反復(fù)接觸已知在眼中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的過敏原，例如花粉的健康個體，以圖防止該個體產(chǎn)生過敏反應(yīng)。

化合物的給予量取決于各種因素，包括，例如所治療的具體病癥、給藥模式、所治療病癥的嚴(yán)重程度、患者的年齡和體重、特定活性化合物的生物利用度等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知有效劑量的測定。技術(shù)人員能確定特定個體的最佳劑量。有效劑量最初可從體外試驗(yàn)估算。例如，用于動物的初始劑量可以是使活性化合物的循環(huán)血液或血清濃度達(dá)到或超過體外試驗(yàn)中測得的特定化合物的IC₅₀。計算達(dá)到這種循環(huán)血液或血清濃度的劑量要考慮到特定化合物的生物利用度，這是技術(shù)人員熟知的。讀者可參考Fingl和Woodbury，“總則(General Principles)”，刊于Goodman和Gilman《治療的藥物基礎(chǔ)》(The Pharmaceutical Basis of Therapeutics)，第1章，第1-46頁，最新版本，帕加蒙出版社(Pergamon Press)，及其中引用的參考文獻(xiàn)以供指導(dǎo)。

初始劑量也可從體內(nèi)數(shù)據(jù)如動物模型估算。用于測試化合物治療或預(yù)防上述各種疾病的功效的動物模型是本領(lǐng)域熟知的。劑量范圍通常為約0.0001或0.001或0.01mg/kg/天到約100mg/kg/天，但可以更高或更低，取決于化合物的活性、其生物利用度、給藥模式以及上述各種因素，等等?？筛鶕?jù)個人調(diào)節(jié)劑量和間隔以提供足以維持治療或預(yù)防效果的化合物的血漿水平。例如，化合物可每周給予一次、每周給予若干次(例如每兩天一次)、每天一次或每天多次，取決于給藥模式、所治療的具體適應(yīng)癥和開處方醫(yī)生的判斷，等等。當(dāng)局部給藥或選擇性攝入時，如局部給藥時，活性化合物的有效局部濃度可能與血漿濃度無關(guān)。技術(shù)人員不需要過度實(shí)驗(yàn)就能夠優(yōu)化有效的局部劑量。

上面與2,4-取代的嘧啶二胺化合物劑量需求有關(guān)的描述與前藥的所需劑量有關(guān)，意識到這一點(diǎn)之后，技術(shù)人員不難了解，前藥的給予量還取決于各種因素，包括例如特定前藥的生物利用度、所選給藥途徑下轉(zhuǎn)化成活性藥物化合物的轉(zhuǎn)化率和效率等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知特定應(yīng)用和給藥模式下前藥的有效劑量的確定。

最初可從體外活性和代謝試驗(yàn)估算有效劑量。例如，用于動物的前藥的初始劑量可以是使代謝物活性化合物的循環(huán)血液或血清濃度達(dá)到或超過體外試驗(yàn)中測得的特定化合物的IC₅₀，所述體外試驗(yàn)如體外CHMC或BMMC以及以下文獻(xiàn)中描述的其它體外試驗(yàn)：2003年1月31日提交的美國申請序列號10/355,543(US2004/0029902A1)，2003年1月31日提交的國際申請序列號PCT/US03/03022(WO 03/063794)，2003年7月29日提交的美國申請序列號10/631,029，國際申請序列號PCT/US03/24087(WO2004/014382)，2004年7月30日提交的美國申請序列號10/903,263，和國際申請序列號PCT/US2004/24716(WO005/016893)。計算達(dá)到這種循環(huán)血液或血清濃度的劑量要考慮到特定前藥通過所需給藥途徑的生物利用度，這是技術(shù)人員熟知的。讀者可參考Fingl和Woodbury，“總則”，刊于Goodman和Gilman《治療的藥物基礎(chǔ)》，第1章，第1-46頁，最新版本，帕加蒙出版社及其中引用的參考文獻(xiàn)以供指導(dǎo)。對于眼科給藥，有效劑量可以是向眼睛給藥未導(dǎo)致所述化合物明顯的全身性循環(huán)的劑量，例如在將滴眼劑加入眼睛以治療眼科疾病和在明顯的全身性循環(huán)之前利用非常局部的劑量的情況下。

本文專門考慮了可替代本發(fā)明方法中化合物I和II的其它化合物，它們描述于Argade等.,2009年2月17日授權(quán)的美國專利號7,491,732和2007年8月30日公開的美國專利申請公開號2007/0203161，二者通過引用納入本文。

化合物的合成

如下文所述或通過下述合成的類似方法合成化合物I和II以及鹽III-VII。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉其它合成方法。

實(shí)施例1

I：N2-(3-氨基磺酰基-4-甲基苯基)-5-氟-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺

60℃，將4-硝基苯酚(1.00g,7.19mmol)、炔丙基溴(80重量％，甲苯配制；0.788mL,7.09mmol)和K₂CO₃(1.08g,7.84mmol)在丙酮(16.0mL)中混合并攪拌18小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用水(200mL)稀釋。抽濾分離白色固體狀的4-(丙-2-炔基氧基)硝基苯(1.12g)。¹H NMR(CDCl₃):δ8.22(d,J＝9.0Hz,2H),7.05(d,J＝9.0Hz,2H),4.80(d,J＝2.4Hz,2H),2.59(t,J＝2.4Hz,1H)。

70℃，將4-(丙-2-炔基氧基)硝基苯(0.910g,5.13mmol)、鐵(1.42g,25.3mmol)和NH₄Cl(0.719g,12.8mmol)在EtOH/水(1:1,55mL)中劇烈攪拌15分鐘。經(jīng)硅藻土趁熱過濾反應(yīng)混合物，真空濃縮。將殘留物懸浮在二氯甲烷配制的10％2N氨性甲醇(ammoniacal methanol)，超聲處理并經(jīng)硅藻土過濾。濃縮得到油狀的4-(丙-2-炔基氧基)苯胺，其不作進(jìn)一步純化即可使用。¹H NMR(CDCl₃):δ6.82(d,J＝8.7Hz,2H),6.64(d,J＝8.7Hz,2H),4.61(d,J＝2.4Hz,2H),2.50(t,J＝2.4Hz,1H)。

室溫下，將4-(丙-2-炔基氧基)苯胺(0.750g,5.10mmol)和2,4-二氯-5-氟嘧啶(1.27g,0.760mmol,可購自美國威斯康星州密爾沃基的西格瑪-阿爾德里奇公司(Sigma-Aldrich))在MeOH/水(4:1,35mL)中攪拌18小時。用EtOAc(200mL)稀釋反應(yīng)混合物，用1N HCl(50mL)和鹽水(50mL)洗滌。干燥有機(jī)層(MgSO₄)，過濾并真空濃縮。柱層析(硅膠,己烷到EtOAc:己烷(1:10))純化殘留物得到淡棕色固體狀的2-氯-5-氟-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-4-嘧啶胺(0.514g)。¹H NMR(CDCl₃):δ8.03(d,J＝2.7Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.02(d,J＝8.7Hz,2H),6.86(s,1H),4.71(d,J＝2.4Hz,2H),2.55(t,J＝2.4Hz,1H)；LCMS:純度:99％；MS(m/e):279(MH⁺)。

將2-氯-5-氟-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-4-嘧啶胺(0.514g,1.85mmol)、3-(氨基磺?；?-4-甲基苯胺(0.689g,3.70mmol,通過還原可商品化購得的2-甲基-5-硝基苯磺酰胺制備或如下所述合成)和三氟乙酸(0.186mL,2.41mmol)與iPrOH(6.0mL)在密封管中混合，在100℃加熱3小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用1N HCl(80mL)稀釋。抽濾分離白色固體狀的N2-(3-氨基磺?；?4-甲基苯基)-5-氟-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺(I)(0.703g)。¹H NMR(DMSO-d₆):δ10.08(bs,2H),8.19(d,J＝4.5Hz,1H),7.89(s,1H),7.74(dd,J＝2.4和8.4Hz,1H),7.58(d,J＝8.7Hz,2H),7.32(bs,2H),7.23(d,J＝8.4Hz,1H),6.97(d,J＝8.4Hz,2H),4.79(d,J＝2.1Hz,2H),3.59-3.55(m,1H),2.53(s,3H)；LCMS:純度:97％；MS(m/e):428(MH⁺)。

II:5-氟-N2-(4-甲基-3-丙?；被酋；交?-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺

在THF(6.0mL)中攪拌N2-(3-氨基磺酰基-4-甲基苯基)-5-氟-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺,I、(0.200g,0.467mmol)、DMAP(40mg,0.33mmol))和三乙胺(0.118mL,0.847mmol)。將丙酸酐(0.180mL,1.40mmol)滴加入溶液。室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。用乙酸乙酯(50mL)稀釋溶液，用水(5x25mL)和鹽水(10mL)洗滌。干燥有機(jī)層(MgSO₄)，過濾并蒸發(fā)。將殘留物懸浮在乙酸乙酯(25mL)中，超聲處理，過濾收集固體得到5-氟-N2-(4-甲基-3-丙酰基氨基磺?；交?-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺,II,(0.20g)。¹H NMR(DMSO-d₆):δ12.01(s,1H),9.44(s,1H),9.26(s,1H),8.16(d,J＝2.4Hz,1H),8.06(dd,J＝0.3和3.3Hz,1H),8.00(dd,J＝2.1和7.8Hz,1H),7.69(d,J＝8.7Hz,2H),7.19(d,J＝8.4Hz,1H),6.95(d,J＝8.7Hz,2H),4.77(d,J＝2.1Hz,2H),3.56(t,J＝2.1Hz,1H),2.49(s,3H),2.24(q,J＝7.2Hz,2H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H)；LCMS:純度:98％；MS(m/e):484(MH⁺)。

III:5-氟-N2-(4-甲基-3-丙?；被酋；交?-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺單鈉鹽

將5-氟-N2-(4-甲基-3-丙?；被酋；交?-N4-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺,II,(0.125g,0.258mmol)懸浮在乙腈(1.5mL)和水(1.5mL)中，冰浴中冷卻。滴加1N NaOH水溶液(0.260mL)。攪拌反應(yīng)混合物直至其變清澈，經(jīng)玻璃棉(glass wool)過濾，凍干得到II的鈉鹽。¹H NMR(DMSO-d₆):δ9.17(bs,2H),8.01(d,J＝3.6Hz,1H),7.89(s,1H),7.78-7.69(m,3H),6.99-6.92(m,3H),4.76(d,J＝2.1Hz,1H),2.43(s,3H),1.95(q,J＝7.2Hz,2H),0.86(t,J＝7.2Hz,3H)；LCMS:純度:98％；MS(m/e):484(MH+)。

采用與上述相似的方式制備以下化合物。

IV:5-氟-N2-[4-甲基-3-(N-丙?；被酋；?苯基]-N4-[4-(2-丙炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺鉀鹽

¹H NMR(DMSO-d₆):δ9.16(s,1H),9.14(s,1H),8.01(d,J＝3.6Hz,1H),7.85(d,J＝2.1Hz,1H),7.75-7.70(m,3H),6.97-6.92(m,3H),4.76(d,J＝1.8Hz,2H),3.55(t,J＝2.4Hz,1H),2.42(s,3H),1.91(q,J＝7.5Hz,2H),0.85(t,J＝7.5Hz,3H)；LCMS:純度:97％；MS(m/z):484(母體,MH⁺)。

V:5-氟-N2-[4-甲基-3-(N-丙酰基氨基磺?；?苯基]-N4-[4-(2-丙炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺鈣鹽

¹H NMR(DMSO-d₆):δ9.16(s,2H),8.00(d,J＝3.6Hz,1H),7.88(d,J＝1.8Hz,1H),7.75-7.69(m,3H),6.97-6.92(m,3H),4.76(d,J＝1.8Hz,2H),3.55(t,J＝2.1Hz,1H),2.43(s,3H),1.94(q,J＝7.5Hz,2H),0.87(t,J＝7.5Hz,3H)；LCMS:純度:98％；MS(m/z):484(母體,MH⁺)。

VI:5-氟-N2-[4-甲基-3-(N-丙酰基氨基磺?；?苯基]-N4-[4-(2-丙炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺精氨酸鹽

¹H NMR(D₂O):δ7.61(d,J＝3.9Hz,1H),7.57-7.55(m,1H),7.36-7.31(m,1H),7.12(d,J＝8.7Hz,2H),6.88(d,J＝8.7Hz,1H),6.72(d,J＝9.0Hz,2H),4.77-4.75(m,2H),3.60(t,J＝6.0Hz,1H),3.09(t,J＝6.9Hz,2H),2.84-2.81(m,1H),2.35(s,3H),2.03(q,J＝5.7Hz,2H),1.80-1.72(m,2H),1.61-1.48(m,2H),0.855(t,J＝7.5Hz,3H)；LCMS:純度:98％；MS(m/z):484(母體,MH⁺)。

VII:5-氟-N2-[4-甲基-3-(N-丙?；被酋；?苯基]-N4-[4-(2-丙炔基氧基)苯基]-2,4-嘧啶二胺膽堿鹽

¹H NMR(DMSO-d₆):δ9.16(s,2H),8.00(d,J＝3.6Hz,1H),7.85(d,J＝1.8Hz,1H),7.75-7.69(m,3H),6.97-6.90(m,3H),5.27(t,J＝4.8Hz,1H),4.76(d,J＝1.8Hz,2H),3.86-3.77(m,2H),3.56-3.54(m,1H),3.40-3.54(m,2H),3.08(s,9H),2.42(s,3H)；LCMS:純度:99％；MS(m/z):484(母體,MH⁺)。

實(shí)施例2

5-氨基-2-甲基苯磺酰胺

0℃，用氯磺酸(5.29mL,80mmol)處理4-甲基硝基苯(20mmol)，然后在將均質(zhì)溶液升溫至室溫后，將其在110℃攪拌24小時。然后將得到的漿液倒在冰水(100gm)上，用二乙醚(3x75mL)萃取，用水(75mL)洗滌有機(jī)相，然后用無水硫酸鈉干燥。然后減壓除去溶劑得到粗制的磺酰氯，用乙酸乙酯吸收該磺酰氯，室溫下與氨水?dāng)嚢柽^夜。分離乙酸乙酯層，然后用乙酸乙酯萃取水層。合并有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑。柱層析(硅膠,己烷，然后用10％、20％最高50％的乙酸乙酯-己烷)純化所得油得到3-氨基磺?；?4-甲基硝基苯,LCMS:純度:95％；MS(m/e):217(MH+)。

向3-氨基磺?；?4-甲基硝基苯的二氯甲烷和甲醇溶液中加入10％Pd/C，50psi的氫氣氣氛下振蕩該混合物15分鐘。硅藻土過濾混合物，用甲醇洗滌濾餅。減壓濃縮合并的有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)物，經(jīng)快速柱層析(乙酸乙酯:己烷1:1)進(jìn)一步純化得到3-氨基磺?；?4-甲基苯胺,LCMS:純度:87％；MS(m/e):187(MH+)。

實(shí)施例3

用IL-4刺激Ramos B-細(xì)胞系的試驗(yàn)

檢驗(yàn)JAK抑制的一種方法是檢測化合物I和II對上調(diào)下游基因產(chǎn)物的作用。在Ramos/IL4試驗(yàn)中，用細(xì)胞因子白介素-4(IL-4)刺激B-細(xì)胞，從而通過磷酸化JAK家族激酶JAK1和JAK3，進(jìn)而磷酸化和活化轉(zhuǎn)錄因子Stat-6來活化JAK/Stat途徑?；罨腟tat-6上調(diào)的基因之一是低親和力IgE受體，CD23。為研究抑制劑(例如，本文所述的2,4-取代嘧啶二胺化合物)對JAK1和JAK3激酶的作用，用人IL-4刺激人Ramos B細(xì)胞。刺激后20-24小時，染色細(xì)胞以檢測CD23的上調(diào)，采用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析。與對照條件相比，CD23存在量減少表明測試化合物活躍地抑制JAK激酶途徑。下文詳細(xì)描述了示例性的該類試驗(yàn)。

用細(xì)胞因子白介素-4(IL-4)刺激的B-細(xì)胞通過磷酸化JAK家族激酶JAK-1和JAK-3，進(jìn)而磷酸化和活化轉(zhuǎn)錄因子Stat-6來活化JAK/Stat途徑?；罨腟tat-6上調(diào)的基因之一是低親和力IgE受體，CD23。為研究抑制劑對JAK家族激酶的作用，用人IL-4刺激人Ramos B細(xì)胞。

Ramos B-細(xì)胞系獲自ATCC(ATCC目錄號CRL-1596)。按照ATCC增殖方案，在含熱滅活的10％胎牛血清(FBS)(堪薩斯州列涅薩的JRH生物科學(xué)公司(JRH Biosciences,Inc),目錄號12106-500M)的RPMI 1640(弗吉尼亞州赫恩登CMT公司(Cellgro,MediaTech,Inc.),目錄號10-040-CM)中培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞維持在密度為3.5x10⁵。實(shí)驗(yàn)前一天，將Ramos B-細(xì)胞稀釋至3.5x10⁵個細(xì)胞/mL，以確保它們處于對數(shù)生長期。

離心細(xì)胞，將其懸浮在含5％血清的RPMI中。96-孔組織培養(yǎng)板中，每點(diǎn)使用5x10⁴個細(xì)胞。在37℃孵育箱中，用化合物或DMSO(密蘇里州圣路易斯的西格瑪-阿爾德里奇公司,目錄號D2650)載體對照預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞1小時。然后用終濃度為50單位/毫升的IL-4(新澤西州落基山市的派普羅技術(shù)公司(Peprotech Inc.,Rocky Hill,NJ),目錄號200-04)刺激細(xì)胞20-24小時。然后離心細(xì)胞，用抗-CD23-PE(加利福尼亞州圣迭戈的BDP公司(BD Pharmingen),目錄號555711)染色，通過FACS分析。利用購自加利福尼亞州圣何塞BD生物科學(xué)公司(Becton Dickinson Biosciences)的BD LSR I系統(tǒng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果計算的IC₅₀見表1。

實(shí)施例4

用IL-2刺激的原代人T-細(xì)胞增殖試驗(yàn)

可通過檢驗(yàn)本文所述化合物I和II對原代人T-細(xì)胞增殖反應(yīng)的作用來進(jìn)一步表征本文所述化合物的JAK活性。在該試驗(yàn)中，源自外周血并通過刺激T-細(xì)胞受體和CD28預(yù)活化的原代人T-細(xì)胞對細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)起反應(yīng)而增殖。該增殖反應(yīng)依賴于JAK1和JAK3酪氨酸激酶的活化，所述激酶磷酸化和活化轉(zhuǎn)錄因子Stat-5。在有IL-2存在下，用化合物I和II溫育原代人T-細(xì)胞72小時，在試驗(yàn)終末點(diǎn)檢測胞內(nèi)ATP濃度以評估細(xì)胞活力。與對照條件相比，細(xì)胞增殖降低表明JAK激酶途徑的抑制作用。下文更詳細(xì)描述了該類示例性試驗(yàn)。

源自外周血并通過刺激T-細(xì)胞受體和CD28預(yù)活化的原代人T-細(xì)胞對細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)起反應(yīng)而增殖。該增殖反應(yīng)依賴于JAK1和JAK3酪氨酸激酶的活化，所述激酶磷酸化和活化轉(zhuǎn)錄因子Stat-5。

如下所示制備人原代T細(xì)胞。從健康志愿者獲得全血，與PBS作1:1混合，以2:1血液/PBS:ficoll的比例疊加在Ficoll Hypaque(新澤西州皮斯卡塔韋APB公司(Amersham Pharmacia Biotech),目錄號17-1440-03)上，4℃，以1750rpm離心30分鐘?；厥昭?ficoll界面的淋巴細(xì)胞，用5體積的PBS洗滌兩次。將細(xì)胞重懸在含40U/mL重組IL2(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯的研發(fā)系統(tǒng)公司(R and D Systems),目錄號202-IL(20μg))的Yssel培養(yǎng)基(加利福尼亞州伍德蘭德的雙子生物產(chǎn)品公司(Gemini Bio-products)，目錄號400-103)中，接種入用1μg/mL抗-CD3(加利福尼亞州圣迭戈BDP公司,目錄號555336)和5μg/mL抗-CD28(加利福尼亞州貝瑞阿的貝克曼庫爾特免疫技術(shù)公司(Immunotech,Beckman Coulter),目錄號IM1376)預(yù)涂布的燒瓶。刺激原代T-細(xì)胞3-4天，然后轉(zhuǎn)移入新鮮燒瓶并在含10％FBS和40U/mL IL-2的RPMI中維持。

用PBS洗滌原代T-細(xì)胞兩次以除去IL-2，以2x10⁶個細(xì)胞/毫升重懸在Yssel培養(yǎng)基中。將含有80U/mL IL-2的50μL細(xì)胞懸液加入平底96孔黑色平板的各孔。對于未刺激的對照，從平板上的最后柱中省去IL-2。利用二甲基亞砜(DMSO,99.7％純,測試細(xì)胞培養(yǎng)物,密蘇里州圣路易斯的西格瑪-阿爾德里奇公司,目錄號D2650)，從5mM開始3-倍連續(xù)稀釋化合物，然后用Yssel培養(yǎng)基作1:250稀釋。將50μL 2X化合物一式兩份加入每孔，使細(xì)胞在37℃下增殖72小時。

采用CellTiter-發(fā)光細(xì)胞活力試驗(yàn)(普洛邁格公司(Promega))檢驗(yàn)增殖，該試驗(yàn)根據(jù)ATP的存在量測定培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，作為代謝活性細(xì)胞的指標(biāo)。解凍底物，升溫至室溫。將細(xì)胞滴度-Glo試劑與稀釋劑混合在一起，然后向各孔加入100μL。用軌道搖床混合各板2分鐘以誘導(dǎo)裂解，室溫下再溫育10分鐘以使信號均衡。利用購自康涅狄格州舍爾頓帕金埃爾默公司(Perkin Elmer)的Wallac Victor2 1420多標(biāo)記計數(shù)器進(jìn)行檢測。根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果計算的IC₅₀見表1。

實(shí)施例5

用IFNγ刺激的A549上皮細(xì)胞系

還可通過檢驗(yàn)本文所述化合物I和II對A549肺上皮細(xì)胞和U937細(xì)胞的作用來表征本文所述化合物的JAK活性。A549肺上皮細(xì)胞和U937細(xì)胞對各種不同刺激起反應(yīng)而上調(diào)ICAM-1(CD54)表面表達(dá)。因此，利用ICAM-1表達(dá)作為讀出值，可評估同一細(xì)胞類型中測試化合物對不同信號傳導(dǎo)途徑的作用。通過IL-1β受體用IL-1β刺激活化TRAF6/NFκB途徑，從而導(dǎo)致ICAM-1上調(diào)。IFNγ通過活化JAK1/JAK2途徑誘導(dǎo)ICAM-1上調(diào)。可通過流式細(xì)胞術(shù)，穿過化合物劑量曲線定量測定ICAM-1的上調(diào)并計算EC₅₀值。下文和實(shí)施例6中更詳細(xì)描述了示例性的該類試驗(yàn)。

A549肺上皮細(xì)胞對各種不同刺激起反應(yīng)而上調(diào)ICAM-1(CD54)表面表達(dá)。因此，利用ICAM-1表達(dá)作為讀出值，可評估同一細(xì)胞類型中化合物對不同信號傳導(dǎo)途徑的作用。IFNγ通過活化JAK/Stat途徑上調(diào)ICAM-1。在該實(shí)施例中，評估IFNγ對ICAM-1的上調(diào)作用。

A549肺上皮癌細(xì)胞系源自美國模式培養(yǎng)物保藏所。常規(guī)培養(yǎng)利用含10％胎牛血清、100I.U.青霉素和100ng/mL鏈霉素的F12K培養(yǎng)基(堪薩斯州列涅薩的邁迪技術(shù)公司(Mediatech Inc.),目錄號10-025-CV)(完全F12K培養(yǎng)基)。在37℃，5％CO₂的加濕氣氛下溫育細(xì)胞。用于該試驗(yàn)之前，先用PBS洗滌A549細(xì)胞并作胰蛋白酶處理(邁迪技術(shù)公司,目錄號25-052-CI)以提升細(xì)胞。用完全的F12K培養(yǎng)基中和胰蛋白酶細(xì)胞懸液，離心沉淀細(xì)胞。細(xì)胞沉淀物以2.0x10⁵/mL的濃度重懸在完全的F12K培養(yǎng)基中。將細(xì)胞以每孔20,000個、100μL總體積接種在平底組織培養(yǎng)板中，附著過夜。

在第二天，用2,4-取代的嘧啶二胺測試化合物或DMSO(對照)(密蘇里州圣路易斯的西格瑪-阿爾德里奇公司,目錄號D2650)預(yù)溫育A549細(xì)胞1小時。然后用IFNγ(75ng/mL)(新澤西州落基山市的派普羅技術(shù)公司,目錄號300-02)刺激細(xì)胞并溫育24小時。在200μL含5％FBS,0.3％DMSO的F12K培養(yǎng)基中，最終測試化合物濃度范圍是30μM到14nM。

在第三天，除去細(xì)胞培養(yǎng)基，用200μL PBS(磷酸緩沖鹽水)洗滌細(xì)胞。胰蛋白酶處理各孔以解離細(xì)胞，然后加入200μL完全F12K培養(yǎng)基進(jìn)行中和。離心細(xì)胞，4℃下用APC偶聯(lián)的小鼠抗-人ICAM-1(CD54)(加利福尼亞州圣迭戈的BDP公司,目錄號559771)抗體染色20分鐘。用冰冷的FACS緩沖液(PBS+2％FBS)洗滌細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)分析表面ICAM-1表達(dá)。用購自加利福尼亞州圣何塞BD生物科學(xué)公司的BD LSR I系統(tǒng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。門控事件的有效散射(live scatter)并計算幾何平均值(新澤西州富蘭克林湖Becton-Dickinson細(xì)胞獲取軟件3.3版)。將幾何平均值對化合物濃度作圖，產(chǎn)生劑量應(yīng)答曲線。根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果計算的IC₅₀見表1。

實(shí)施例6

U937 IFNγICAM1 FACS試驗(yàn)

U937人單核細(xì)胞對各種不同刺激起反應(yīng)而上調(diào)ICAM-1(CD54)表面表達(dá)。因此，利用ICAM-1表達(dá)作為讀出值，可評估同一細(xì)胞類型中化合物對不同信號傳導(dǎo)途徑的作用。IFNγ通過活化JAK/Stat途徑上調(diào)ICAM-1。在該實(shí)施例中，評估IFNγ對ICAM-1的上調(diào)作用。

U937人單核細(xì)胞系得自馬里蘭州羅克維爾的ATCC(目錄號CRL-1593.2)，在含有10％(體積/體積(v/v))FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在10％RPMI中培養(yǎng)U937細(xì)胞。然后將細(xì)胞以100,000個細(xì)胞/160μL接種在96孔平底板中。然后如下所示稀釋測試化合物：用DMSO對10mM測試化合物作1:5稀釋(3μL 10mM測試化合物稀釋于12μL DMSO)，再用DMSO對測試化合物作1:3連續(xù)稀釋(用12μL DMSO連續(xù)稀釋6μL測試化合物得到3-倍稀釋液)。然后將4μL測試化合物轉(zhuǎn)移至76μL 10％RPMI得到10X溶液(100μM測試化合物,5％DMSO)。對于對照孔，用76μL 10％RPMI稀釋4μL DMSO。

一式兩份進(jìn)行試驗(yàn)，使用8個數(shù)據(jù)點(diǎn)(8個3-倍稀釋濃度，10μl)，其中4孔僅有刺激條件下的DMSO(對照孔)，4孔僅有未刺激條件下的DMSO。

利用多功能器具(multimek)(加利福尼亞州貝瑞阿BC公司(Beckman Coulter of Brea,California))混合稀釋的化合物平板2次，然后將20μL稀釋化合物轉(zhuǎn)移至含有160μL細(xì)胞的96孔板，然后以低速再混合兩次。然后在37℃、5％CO₂下預(yù)溫育細(xì)胞和化合物30分鐘。

用10％RPMI制備人IFNγ的100ng/mL溶液來制得10X刺激混合物。然后用20μL IFNγ刺激混合物刺激細(xì)胞和化合物得到終濃度為10ng/mL IFNγ、10μM測試化合物和0.5％DMSO。將細(xì)胞維持在37℃、5％CO₂的刺激條件下18-24小時。

將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔圓底平板以便染色，然后在染色期間維持在冰上。4℃，1000rpm離心細(xì)胞5分鐘，然后除去上清液。除去上清液后，每100μL FACS緩沖液加入1μL APC偶聯(lián)的小鼠抗-人ICAM-1抗體。然后在冰上避光溫育細(xì)胞30分鐘。溫育后，加入150μL FACS緩沖液，在4℃以1000rpm離心細(xì)胞5分鐘，然后除去上清液。除去上清液后，加入200μL FACS緩沖液，重懸細(xì)胞。懸浮后，在4℃以1000rpm離心細(xì)胞5分鐘。然后除去上清液，再將細(xì)胞重懸在150μL FACS緩沖液中。

用購自加利福尼亞州圣何塞BD生物科學(xué)公司的BD LSR I系統(tǒng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。門控活細(xì)胞的有效散射并計算ICAM-APC的幾何平均值(新澤西州富蘭克林湖Becton-Dickinson細(xì)胞獲取軟件3.3版)。分析活細(xì)胞％和ICAM-1表達(dá)。測試化合物的試驗(yàn)與已知活性的對照化合物平行進(jìn)行。對照化合物的EC₅₀通常為40-100nM。根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果計算的IC₅₀見表1。

實(shí)施例7

藥物制劑

本實(shí)施例描述了含有化合物I或II(應(yīng)理解為還包含其鹽)的藥物制劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的制備此類制劑，鑒于本實(shí)施例和本文的其它內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難知曉其它制劑。

用化合物I或II制備三種劑量濃度的以上制劑1-7中的每一種：0.001％、0.003％和0.01％(w/w)。將指定量的張度劑(甘露醇)加入燒瓶，在約一半最終體積的指定緩沖液(磷酸或檸檬酸)中加熱至約50℃來制備各制劑。加熱后，將合適量的化合物I或II與所示的其它賦形劑(甘油和/或PEG400)一起加入。加入足夠量的純水。將混合物攪拌均勻(約5分鐘)，然后經(jīng)無菌濾膜過濾入無菌容器中。如果需要，加入1.0N NaOH來調(diào)節(jié)pH。

具有較高濃度化合物I或II(例如，0.03％w/w)的制劑可任選包含表面活性劑和任選的穩(wěn)定聚合物。對于制劑6和7，優(yōu)選的表面活性劑包括曲通X114和泰洛沙泊，二者可分別購自西格瑪-阿爾德里奇公司(密蘇里州圣路易斯)和壓力化學(xué)品公司(Pressure Chemical Company)(賓夕法尼亞州匹茲堡)。優(yōu)選的穩(wěn)定聚合物包括卡波姆Carbopol 974p(可購自俄亥俄州威克利夫市的留勃里佐爾公司(Lubrizol))。

首先將卡波姆以終濃度的10X分散在含表面活性劑的緩沖液中來制備制劑6和7，(例如，50mM pH 6.5的磷酸緩沖液配制的3％泰洛沙泊，含2.5％甘露醇和5％卡波姆974p)。然后化合物I或化合物II也以其終濃度的10X分散在該預(yù)濃縮液中。均勻化該混合物，用匹配的緩沖液10X稀釋過濾的預(yù)濃縮液獲得最終制劑。

實(shí)施例8

誘導(dǎo)型干眼小鼠模型

本實(shí)施例描述了在干眼的小鼠模型中治療癥狀。用可注射鹽水制備包含2.5mg/mL東莨菪堿(西格瑪-阿爾德里奇公司)的注射劑(每只動物1-1.5毫升)。交替在普通C57小鼠的臀及后腿中注射200-250μL東莨菪堿溶液，每2.5小時4次。將小鼠置于特定的籠中(前后有孔)，并置于罩中。在各籠前安置風(fēng)扇，運(yùn)行16小時過夜，連續(xù)5天。每日檢測淚水產(chǎn)生，5天結(jié)束時，所有小鼠視作干燥誘導(dǎo)的。用1μL藥物或載體(上述制劑1-7中的一種)處理小鼠，每日1次，進(jìn)行2周。檢測淚水產(chǎn)生，通過正常淚水產(chǎn)生值的部分或全部恢復(fù)來檢測處理結(jié)果。

可通過定量方式檢測淚水產(chǎn)生，或可定性評估動物的角膜，例如通過生物顯微鏡檢測所處理眼睛的熒光素或孟加拉玫瑰紅染色模式。此類染色降低表明成功治療了干眼病癥。

實(shí)施例9

其它動物模型

可利用干眼的其它動物模型證明所公開試劑在治療該病癥中的活性。例如，現(xiàn)已開發(fā)了幾種舍格倫綜合征模型，該模型模擬該病癥中所見的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的早期活化和浸潤。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型顯示在淚腺以及其它器官中主要是CD4⁺Th1細(xì)胞的淋巴細(xì)胞浸潤，所述其它器官包括胰腺、下頜下腺和甲狀腺。雄性NOD小鼠從8周齡開始顯示淚腺的明顯炎性病損，而雌性NOD小鼠直至30周齡才顯示出變化。Takahashi等.,雄性非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中自身免疫淚腺炎的高發(fā)病率依賴于性類固醇(High incidence of autoimmune dacryoadenitis in male non-obese diabetic(NOD)mice depending on sex steroid).Clin Exp Immunol.1997；109:555–561。舍格倫綜合征的MRL/MpJ-fas⁺/fas⁺(MRL/+)和MRL/MpJ-fas^lpr/fas^lpr(MRL/lpr)小鼠模型顯示特征在于CD4⁺T細(xì)胞占優(yōu)勢的淚腺浸潤。Van Blokland和Versnel,舍格倫綜合征的發(fā)病機(jī)制：自身免疫外分泌腺病的不同小鼠模型的特征(Pathogenesis of syndrome:characteristics of different mouse models for autoimmune exocrinopathy).Clin Immunol.2002；103:111–124。

由于相比于小鼠，家兔暴露的眼睛面積更大，用家兔進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)干眼臨床檢驗(yàn)，例如淚水崩解時間和眼睛表面的熒光素或孟加拉玫瑰紅染色更加容易。可將培養(yǎng)增殖的自體外周血淋巴細(xì)胞與從對側(cè)切除的腺體中獲得的上皮細(xì)胞注射入淚腺來激發(fā)家兔中類似于舍格倫綜合征的自身免疫疾病。

利用這些和其它動物模型檢驗(yàn)要求保護(hù)的化合物以及組合制劑，例如本文所述那些。將所述制劑給予動物，檢查眼睛中淚水產(chǎn)生增加或干眼減輕的證據(jù)。

實(shí)施例10

治療方法和組合制劑

根據(jù)提示干眼是否存在的臨床表現(xiàn)或眼科檢查選擇要用本發(fā)明制劑治療的對象。例如，對象可抱怨眼睛有不適或燒灼感。嚴(yán)重病例中甚至可存在畏光或視力模糊。患者的醫(yī)療史也可能提示干眼，例如預(yù)先診斷到紅斑痤瘡、經(jīng)歷放療、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡或硬皮病或其它自身免疫疾病的患者。通常用狹縫燈進(jìn)行生物顯微鏡檢查以檢測與干燥性角膜結(jié)膜炎一致的瞼板腺炎、結(jié)膜擴(kuò)張、淚半月板減少、淚碎片增加、粘液鏈或染色模式。還可評估低于10秒的淚水崩解時間，常進(jìn)行席氏檢驗(yàn)來更客觀地鑒定會從本發(fā)明試劑治療中獲益的對象。

可選擇特定患者組進(jìn)行治療，例如淚腺產(chǎn)生淚水減少的那些患者(例如，席氏檢驗(yàn)提示因免疫介導(dǎo)的或其它疾病導(dǎo)致淚腺機(jī)能減退的那些患者)。采用滴眼劑或軟膏將本發(fā)明組合物滴入眼睛，一天2-4次。治療可持續(xù)至少一周、一月或一年，在一些對象中，治療可延續(xù)多年。

在特定病例中，選擇對象作其它藥物或非藥物干預(yù)的相伴治療。例如，進(jìn)行淚小點(diǎn)阻塞以減少淚水自眼睛流出，同時本發(fā)明組合物增加淚腺的淚水產(chǎn)生。

還提供組合療法，該療法聯(lián)用式I和/或II所示化合物(包括其鹽)與治療另一病癥，例如干眼相關(guān)病癥的另一試劑。在一些實(shí)施例中，對象診斷有干眼相關(guān)的潛在疾病，則給予該對象組合療法。在一個實(shí)施例中，發(fā)現(xiàn)對象具有對局部應(yīng)用皮質(zhì)類固醇，例如醋酸潑尼松龍眼科混懸液1％有反應(yīng)的瞼板腺炎。將式I和/或式II所示化合物(包括其鹽)懸浮在潑尼松龍制劑中，滴入眼中，每天2-4次。在其它實(shí)施例中，干眼與季節(jié)性過敏反應(yīng)或其它炎性病癥有關(guān)，將滴眼液與包含以下藥物的制劑一起給予或在該制劑中給予：抗組胺(例如非尼拉敏、依美斯汀(emedastine)、或氮卓斯汀(azelastine))、解充血劑(例如鹽酸四氫唑啉或萘甲唑啉)或非甾體抗炎劑(例如奈帕芬胺(nepafenac)或酮咯酸)、皮質(zhì)類固醇(例如，氟米龍(fluorometholone)或氯替潑諾(loteprednol))、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑(例如氮卓斯汀(azelastie)、克羅莫(cromal)、依美斯汀(emedastine)、酮替芬、洛度沙胺(lodoxamine)、奈多羅米、奧洛他定(olopatadine)或吡嘧司特(pemirolast))。如果干眼與感染性細(xì)菌病癥(例如，淚腺感染或角膜感染)相關(guān)，將滴眼液與含合適抗生素(例如，環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、氧氟沙星、乙?；前?、妥布霉素或單氧氟沙星(monofloxacin))的組合制劑一起給予或在該組合制劑中給予。如果干眼與病毒感染相關(guān)，將滴眼液與含抗病毒藥物，例如三氟尿苷或碘苷的組合制劑一起給予或在該組合制劑中給予。

組合治療的另一例子是表現(xiàn)出不適的眼睛和面部紅斑以及毛細(xì)管擴(kuò)張后，診斷患有眼睛紅斑痤瘡的對象。用含有式I和/或II所示化合物的滴眼液治療該對象，還用口服抗生素，例如四環(huán)素類抗生素，如米諾環(huán)素治療該對象。

在另一實(shí)施例中，對象表現(xiàn)出干眼和另一已有的自身免疫疾病，用含有式I和/或II所示化合物的滴眼液治療該對象。還用全身性(例如)口服皮質(zhì)類固醇療劑，例如劑量逐漸降低的潑尼松龍治療該對象。