本發(fā)明涉及干細(xì)胞提取物制劑，尤其一種含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的外用凝膠制劑及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一組源于基質(zhì)的異質(zhì)細(xì)胞群，可以從人體大多數(shù)組織獲取。它們具有自我更新能力、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)能力，可以向中胚層譜系分化，例如：脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，此外還能夠向及其它胚層譜系細(xì)胞分化，例如向表皮細(xì)胞\血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。

間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系中含有多種大量的活性成分，如：干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、細(xì)胞集落刺激因子、白細(xì)胞介素(IL)、膠原蛋白、透明質(zhì)酸等80余種活性物質(zhì)。目前，也已經(jīng)有將間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于病人的報(bào)道，在深度燒傷的患者的創(chuàng)面涂布自體的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，能夠促進(jìn)皮膚再生和血管的新生。但是由于活性細(xì)胞的存活條件比較苛刻，很容易死亡因此由活細(xì)胞所起的作用也會(huì)大打折扣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種活性穩(wěn)定的含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的外用凝膠制劑及其制備方法和用途，利用干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子為治療皮膚損傷等疾病提供了安全、有效、使用方便的治療藥物。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的外用凝膠制劑，按照體積份數(shù)，包括以下成分：

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物 占總體積的50％

凝膠溶液 占總體積的50％

外用凝膠制劑的pH值為6.0-8.0；

其中，每100ml凝膠溶液中,包括以下成分：

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物是將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按照饑餓培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)得到的，饑餓時(shí)間為12-24小時(shí)。

所述藥用高分子穩(wěn)定劑為海藻酸鈉、透明質(zhì)酸鈉、殼聚糖和羥乙基淀粉中的一種。

所述保濕劑為丙二醇或甘油。

所述復(fù)方電解質(zhì)注射液為中國(guó)大冢制藥有限公司生產(chǎn)的復(fù)方電解質(zhì)葡萄糖MG3注射液。

所述透皮吸收促進(jìn)劑為二甲基亞砜。

上述含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的外用凝膠制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物制備：從細(xì)胞庫中選取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％-95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清3000-4500g條件下離心5-8min，以0.22um濾膜過濾，按照質(zhì)量體積比2％-4％加入人血清白蛋白，混合均勻后待用；

(2)凝膠溶液制備：按配比，將藥用高分子穩(wěn)定劑、保濕劑、透皮吸收促進(jìn)劑,溶于復(fù)方電解質(zhì)溶液中，配制成均一的凝膠溶液待用；

(3)制備外用凝膠制劑：按體積比，凝膠溶液:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物＝1:1的比例進(jìn)行混合，直到混合均勻后，分裝到預(yù)充注射器中，放到-80℃冰箱中凍存待用。

上述含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的外用凝膠制劑在制備治療皮膚潰瘍、燒傷、燙傷、濕疹、外傷藥物中的用途。

本發(fā)明的有益效果是：將凝膠添加到細(xì)胞提取物中，使得細(xì)胞分泌的各種活性成分都得到了保存和利用，而且存活的時(shí)間可以更長(zhǎng)，可達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間促進(jìn)表皮細(xì)胞增長(zhǎng)，可以縮短創(chuàng)口的愈合時(shí)間，并起到消除炎癥，促進(jìn)經(jīng)久不愈的潰瘍愈合的等作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的方法培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞圖；

圖2為不同饑餓時(shí)間提取物中有效因子分泌量比較圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，其具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的外用凝膠制劑，按照體積份數(shù)，包括以下成分：

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物 占總體積的50％

凝膠溶液 占總體積的50％

外用凝膠制劑的pH值為6.0-8.0；

其中，每100ml凝膠溶液中,包括以下成分：

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物是將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按照饑餓培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)得到的，饑餓時(shí)間為12-24小時(shí)。

所述藥用高分子穩(wěn)定劑為海藻酸鈉、透明質(zhì)酸鈉、殼聚糖和羥乙基淀粉中的一種。

所述保濕劑為丙二醇或甘油。

所述復(fù)方電解質(zhì)注射液為中國(guó)大冢制藥有限公司生產(chǎn)的復(fù)方電解質(zhì)葡萄糖MG3注射液。

所述透皮吸收促進(jìn)劑為二甲基亞砜。

上述含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的外用凝膠制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物制備：從細(xì)胞庫中選取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％-95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清3000-4500g條件下離心5-8min，以0.22um濾膜過濾，按照質(zhì)量體積比2％-4％加入人血清白蛋白，混合均勻后待用；

(2)凝膠溶液制備：按配比，將藥用高分子穩(wěn)定劑、保濕劑、透皮吸收促進(jìn)劑,溶于復(fù)方電解質(zhì)溶液中，配制成均一的凝膠溶液待用；

(3)制備外用凝膠制劑：按體積比，凝膠溶液:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物＝1:1的比例進(jìn)行混合，直到混合均勻后，分裝到預(yù)充注射器中，放到-80℃冰箱中凍存待用。

上述含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的外用凝膠制劑在制備治療皮膚潰瘍、燒傷、燙傷、濕疹、外傷藥物中的用途。

本發(fā)明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中會(huì)分泌多種大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠深入皮膚基底層，促進(jìn)皮膚組織分化、血管新生以及肉芽組織的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)損傷皮膚組織的結(jié)構(gòu)重建與再生修復(fù)，減少疤痕組織的產(chǎn)生；可調(diào)節(jié)局部組織微環(huán)境，促進(jìn)血管新生，改善局部供血，從而達(dá)到緩解缺血癥狀、促進(jìn)組織新生的效果；還可調(diào)節(jié)局部組織的免疫功能，減少創(chuàng)面組織的細(xì)菌感染及炎癥反應(yīng)。

實(shí)施例1

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物：從細(xì)胞庫中選取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％(見圖1)，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)12小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％--95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清3000g條件下離心8min，以0.22um濾膜過濾，按照質(zhì)量體積比2％加入人血清白蛋白，混合均勻后待用；

(2)凝膠溶液制備：按配比，將藥用高分子穩(wěn)定劑海藻酸鈉2.5g，無菌的保濕劑丙二醇5ml,透皮吸收促進(jìn)劑二甲基亞砜5ml,溶于90ml復(fù)方電解質(zhì)溶液中，配制成均一的凝膠溶液待用；

(3)制備外用凝膠制劑：按體積比凝膠溶液：人來源活間充質(zhì)干細(xì)胞提取物＝1:1的比例進(jìn)行混合，直到混合均勻后，分裝到預(yù)充注射器中，放到-80℃冰箱中凍存待用。

實(shí)施例2

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物：從細(xì)胞庫中選取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)12小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％--95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清4000g條件下離心6min，以0.22um濾膜過濾，按照質(zhì)量體積比3％加入人血清白蛋白，混合均勻后待用；

(2)凝膠溶液制備：按配比，將藥用高分子穩(wěn)定劑透明質(zhì)酸鈉5g，無菌的保濕劑丙二醇7.5ml,透皮吸收促進(jìn)劑二甲基亞砜7.5ml,溶于85ml復(fù)方電解質(zhì)溶液中，配制成均一的凝膠溶液待用；

(3)制備外用凝膠制劑：按體積比凝膠溶液：人來源活間充質(zhì)干細(xì)胞提取物＝1:1的比例進(jìn)行混合，直到混合均勻后，分裝到預(yù)充注射器中，放到-80℃冰箱中凍存待用。

實(shí)施例3

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物：從細(xì)胞庫中選取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24小時(shí)(見圖2)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％--95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清4500g條件下離心5min，以0.22um濾膜過濾，按照質(zhì)量體積比4％加入人血清白蛋白，混合均勻后待用；

(2)凝膠溶液制備：按配比，將藥用高分子穩(wěn)定劑殼聚糖10g，無菌的保濕劑甘油10ml,透皮吸收促進(jìn)劑二甲基亞砜10ml,溶于80ml復(fù)方電解質(zhì)溶液中，配制成均一的凝膠溶液待用；

(3)制備外用凝膠制劑：按體積比凝膠溶液：人來源活間充質(zhì)干細(xì)胞提取物＝1:1的比例進(jìn)行混合，直到混合均勻后，分裝到預(yù)充注射器中，放到-80℃冰箱中凍存待用。

實(shí)施例4

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物：從細(xì)胞庫中選取細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用無酚紅DMEM/DF12和體積比濃度為10％胎牛血清做完全培養(yǎng)基，T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶在37℃，5％CO₂進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)程度達(dá)到90％--95％后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清4500g條件下離心5min，以0.22um濾膜過濾，按照質(zhì)量體積比4％加入人血清白蛋白，混合均勻后待用；

(2)凝膠溶液制備：按配比，將藥用高分子穩(wěn)定劑羥乙基淀粉10g，無菌的保濕劑甘油10ml,透皮吸收促進(jìn)劑二甲基亞砜10ml,溶于80ml復(fù)方電解質(zhì)溶液中，配制成均一的凝膠溶液待用；

(3)制備外用凝膠制劑：按體積比凝膠溶液：人來源活間充質(zhì)干細(xì)胞提取物＝1:1的比例進(jìn)行混合，直到混合均勻后，分裝到預(yù)充注射器中，放到-80℃冰箱中凍存待用。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)

(1)選取7周齡的SD大鼠12只，平均分為3組，①空白組；②陰性對(duì)照組；③實(shí)驗(yàn)組制備大鼠皮損模型，皮損面積為直徑2厘米的傷口。

(2)造模成功后，按照①空白組在皮損部位涂抹生理鹽水；②陰性對(duì)照組涂抹未添加細(xì)胞提取物的海藻酸鈉凝膠；③實(shí)驗(yàn)組涂抹實(shí)施例1制得的細(xì)胞提取物凝膠，進(jìn)行治療，分別在給藥后的第1、3、5、7、9、11、13天對(duì)傷口的直徑進(jìn)行測(cè)量，并統(tǒng)計(jì)。

(3)數(shù)據(jù)分析，分析各實(shí)驗(yàn)組傷口愈合的時(shí)間差異。

表1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)傷口愈合統(tǒng)計(jì)表

綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。