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      一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制作方法

      文檔序號:10528681閱讀:733來源:國知局
      一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,成分包括,細(xì)胞因子組合、α?MEM培養(yǎng)液、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、BMP?4、BOP1、FGF?2和AMD3100。所述細(xì)胞因子組合包括IL?3,IL?6,SCF和FL,濃度分別為:IL?3 1?20ng/ml;IL?6 1?100ng/ml;SCF 1?100ng/ml;FL 1?100ng/ml。通過研發(fā)無血清培養(yǎng)基、改變造血因子的加入順序,解決目前臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基現(xiàn)有技術(shù)的弊端。
      【專利說明】
      一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0001 ]本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域,尤其涉及一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB-MSCs)具有較好的分化潛能,可在骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)、 肝臟、心肌等組織工程方面具有廣闊的臨床前景。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞可從人臍帶中分離 出來,具有取材方便,無倫理學(xué)爭議的優(yōu)點(diǎn)。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作 用,能促進(jìn)造血恢復(fù)功能和修復(fù)病變組織器官,在器官移植、自身免疫性疾病、白血病、骨和 肌肉衰退性疾病等方面,有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
      [0003] 而臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)如何實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增又不影響其功能是臍帶血間充質(zhì) 干細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵,然而現(xiàn)有技術(shù)中培養(yǎng)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)不夠成熟,表現(xiàn)在細(xì)胞 的增殖速度慢和傳代次數(shù)較低。
      [0004] 現(xiàn)有的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基需要添加動物血清,在這種環(huán)境生長的干細(xì) 胞,其內(nèi)部結(jié)構(gòu)可能會發(fā)生一些未知的變換,動物血清也可能會引發(fā)免疫排斥反應(yīng),甚至有 被細(xì)菌、病毒等病原微生物污染的風(fēng)險(xiǎn),不利于干細(xì)胞的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究。
      [0005] 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的增值分化、發(fā)育成熟過程相當(dāng)復(fù)雜,依賴于各種造血因子 的調(diào)節(jié),其中細(xì)胞刺激因子發(fā)揮的作用極為關(guān)鍵。m型酪氨酸激酶受體配體(flt3-ligand FL)是最近幾年發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)早期造血的細(xì)胞因子,主要生物活性表現(xiàn)為刺激早期臍帶 血間充質(zhì)干細(xì)胞的增值與分化。白細(xì)胞介素3(Int erleukin3IL-3)有利于臍帶血干細(xì)胞的 生長和活性維持,然而對臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞早期增值分化有抑制效應(yīng)。
      [0006] 通過研發(fā)無血清培養(yǎng)基、改變細(xì)胞因子的加入順序,研究臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞體 外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基,解決目前臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基現(xiàn)有技術(shù)的弊端。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種無血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。
      [0008] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案:
      [0009] -種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,成分包括,細(xì)胞因子組合、α-ΜΕΜ培養(yǎng) 液、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋、BMP-4、BOP 1、FGF-2 和 AMD3100。
      [0010] 所述細(xì)胞因子組合包括IL-3,IL-6,SCF和FL,濃度分別為:IL-3 l-20ng/ml; IL-6 l-100ng/ml;SCF l-100ng/ml;FL l-100ng/ml〇
      [0011] 轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為0.05-0.15μg/ml; BMP-4的濃度為0.05-0.15ng/ml;所述B0P1濃 度為l-10mg/ml;其特征在于所述FGF-2濃度為5-15ng/ml;所述AMD3100濃度為l-15mg/ml。
      [0012] 胰島素濃度為5-15μg/ml。
      [0013] 所述所述α-ΜΕΜ培養(yǎng)液包含0.03-0.04mmol/L脫氧核糖核苷和40-70nmol/L核糖核 苷。
      [0014] 所述的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液包括以下組分:無水氯化鈣、無水硫酸銅、九水硝酸鐵、七水硫 酸亞鐵、氯化鉀、氯化鎂、無水硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、七水硫酸鋅、 L-精氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、次黃嘌呤、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨 酸、L-天門冬酰胺、D-葡萄糖、L-天門冬氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色 氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、亞油酸、硫辛酸、酚紅、維生素 B12、l,4-丁二胺二鹽酸鹽、丙酮酸 鈉、維生素 H、D-泛酸鈣、氯化膽堿、胸苷、葉酸、i-肌醇、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆淳、核 黃素、鹽酸硫胺。
      [0015]所述的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液各組分的濃度為:


      [0019] -種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的使用方法,培養(yǎng)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞 過程如下:a、在制備好α-ΜΕΜ培養(yǎng)液中按濃度加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、BMP-4、BOP 1、FGF-2和 AMD3100制作成培養(yǎng)液;b、在24孔板中進(jìn)行培養(yǎng),每孔lml培養(yǎng)液,接種所需的臍帶血間充質(zhì) 干細(xì)胞,接種密度為1 X l〇5cells/ml,于37°C、5%C02的全飽和濕度下培養(yǎng);c、培養(yǎng)第一周加 入IL-3+IL-6+SCF;第7天同時(shí)加入FL直到第四周結(jié)束;第14d起停用IL-3。
      [0020] 補(bǔ)充說明
      [0021 ] FL是(flt3-ligand)III型酪氨酸激酶受體配體;
      [0022] IL-3 是 Interleukin3 白細(xì)胞介素 3;
      [0023] IL-6 是 Interleukin6 白細(xì)胞介素 6;
      [0024] SCF是stem cell factor干細(xì)胞因子;
      [0025] BMP-4是Bone Morphogenetic Protein骨形態(tài)發(fā)生蛋白4;
      [0026] α-ΜΕΜ是改良型杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基;
      [0027] FGF-2是Fibroblast Growth Factor 2成纖維細(xì)胞生長因子2;
      [0028] FBS是胎牛血清;
      [0029] 凋亡率=凋亡陽性的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)X 100%。
      [0030] 有益效果:本發(fā)明通過研發(fā)無血清培養(yǎng)基,即培養(yǎng)基中不加胎牛血清,從而避免了 臨床應(yīng)用中可能產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng),減少了病原微生物污染的風(fēng)險(xiǎn);通過改變造血因子 的加入順序,可減弱FL對臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞早起增值的抑制作用,提高臍帶血間充質(zhì)干 細(xì)胞在體外增殖分化的活性,降低細(xì)胞凋亡率。
      【具體實(shí)施方式】
      [0031] 按照表格1配制高糖型α-ΜΕΜ培養(yǎng)液 [0032] 表1高糖型α-ΜΕΜ配方表
      [0033]
      [0034]
      [0035] a、配制臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液:在α-ΜΕΜ培養(yǎng)液中按濃度加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋 白、BMP-4、B0P1、FGF-2和AMD3100制作成臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液;
      [0036] b、加入細(xì)胞因子:實(shí)驗(yàn)分成五個(gè)組,第一組為不加 IL-3的對照組,第二組為不加 FL 的對照組,第三組為四種細(xì)胞因子同時(shí)加入,不分先后順序,第四組為本發(fā)明臍帶血間充質(zhì) 干細(xì)胞培養(yǎng)方法,第五組為空白對照實(shí)驗(yàn),四種細(xì)胞因子均不加,具體情況如下:
      [0037] 第一組 IL-6+SCF+FL
      [0038] 第二組 IL-3+IL-6+SCF
      [0039] 第三組 IL-3+IL-6+SCF+FL
      [0040] 第四組培養(yǎng)第一周加入IL-3+IL-6+SCF;第7天同時(shí)加入FL直到第四周結(jié)束;第14d 起停用IL-3;
      [0041 ]其中細(xì)胞因子的濃度為IL-3 5ng/ml,IL-6 50ng/ml,SCF 50ng/ml,F(xiàn)L 50ng/ml; [0042] c、接種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞:培養(yǎng)試驗(yàn)在24孔板中進(jìn)行,每孔lml培養(yǎng)液,接種分 離的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞,接種密度為lX105cell S/ml,于37°C、5%C02的全飽和濕度下培 養(yǎng)。在培養(yǎng)開始及第7天、14天、21天、28天分別計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。
      [0043]結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析:
      [0044] 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在不同細(xì)胞因子組合刺激下擴(kuò)增倍數(shù)
      [0045]
      [0046] 結(jié)果分析:細(xì)胞擴(kuò)增方面,除了第四組外,其他組合都在培養(yǎng)21d時(shí)擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到 最高,隨后出現(xiàn)下降,且在21d時(shí)都小于第四組擴(kuò)增倍數(shù),第四組的最高擴(kuò)增倍數(shù)為培養(yǎng)28d (9847.2倍)時(shí)。說明本發(fā)明組合擴(kuò)增效果最好。
      [0047] 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在不同細(xì)胞因子組合刺激下細(xì)胞凋亡情況比較(% )
      [0048]
      [0049] 結(jié)果分析:結(jié)果二:在細(xì)胞凋亡方面,都在培養(yǎng)至14d達(dá)到最高,以后有所下降。第 四組的最高凋亡率為(?=6. 1) %,低于其他組合,說明本發(fā)明組合凋亡率最低。
      [0050] 以上所述,僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此, 任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi),可輕易想到的變化或替換,都應(yīng) 涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此,本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1. 一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,其特征在于:成分包括,細(xì)胞因子組合、 α-ΜΕΜ培養(yǎng)液、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、BMP-4、BOPI、FGF-2和AMD31OO。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,其特征在于:所述 細(xì)胞因子組合包括IL-3,IL-6,SCF和FL,濃度分別為:IL-3 l-20ng/ml; IL-6 l-100ng/ml; SCF l-100ng/ml;FL l-100ng/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,其特征在:轉(zhuǎn)鐵蛋 白的濃度為〇 · 05-0 · 15μg/ml ;BMP-4的濃度為0 · 05-0 · 15ng/ml;所述BOPl濃度為l-10mg/ml; 其特征在于所述FGF-2濃度為5-15ng/ml;所述AMD3100濃度為l-15mg/kg。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,其特征在于:胰島 素濃度為5-15μg/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,其特征在于:所述 α-ΜΕΜ培養(yǎng)液包含0.03-0.04mmol/L脫氧核糖核苷和40-70nmol/L核糖核苷。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,其特征在于:所述 的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液包括以下組分:無水氯化鈣、無水硫酸銅、九水硝酸鐵、七水硫酸亞鐵、氯化 鉀、氯化鎂、無水硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、七水硫酸鋅、L-精氨酸鹽酸 鹽、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨 酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、次黃嘌呤、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-天門冬酰 胺、D-葡萄糖、L-天門冬氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨 酸、L-纈氨酸、亞油酸、硫辛酸、酚紅、維生素 B12、l,4-丁二胺二鹽酸鹽、丙酮酸鈉、維生素 Η、 D-泛酸鈣、氯化膽堿、胸苷、葉酸、i-肌醇、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆淳、核黃素、鹽酸硫 胺。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基,其特征在于:所述 的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液各組分的濃度為: 無水氯化鈣 90- 1如mg/1 無水硫酸銅 0· 001-0. Q02 mg/:L 九水硝酸鐵 0. 07 mg/L 七水硫酸亞鐵 0. 3-5: mg/L 氯化鉀 3()0-40:0 mg/L 氯化鎂 20-35 mg/L 無水硫酸鎂 40-60 mg/L 氯化鈉 6000-8000 mg/L 無水磷酸二氧鈉 45-ffi mg/L. 磷酸氫二鈉 6:5-8Θ mg/L 七水硫酸鋅 0.4-0. 5: mg/L L-精氨酸鹽酸鹽 100-200 mg/L L-胱氨酸鹽酸鹽 20-4Θ mg/L L-谷氨酰胺 3〇0-4卯 mg/L 甘氯酸 IQ-30 mg/L .L·:-亮氨酸 40-(50 ing/L L-賴氨酸鹽酸鹽 80-100 mg/L L-蛋氨酸 15-22mg/l 次黃嘌呤 1-3 mg/L L-苯丙氨酸 30-4(3 mg/1 L-絲氨酸 20-30 mg/L L-蘇氨酸 4?-60 mg/L L_ 丙氨酸 B'-5 mg/L L-天門冬酰胺 .5-1.0 mg/L D-葡萄糖 500-1500 mg/L L-天門冬氨酸 5-7 mg/L L-半胱氨酸鹽酸鹽 IQ-20 mg/L· L-谷氨酸 5-9 mg/L L-脯氨酸 15-20 mgA L-色氨酸 .8-10 mg/L L-酪氨酸 30-45 mg/L L-纈氨酸 45-55 mg/L 收:油酸 0· 03-0. 05 mg/L 硫辛酸 0· 1-:0., 15 mg./L 酚紅 7-10 mg/L 維生素 B12 0. 5-lmg/L 1,4-丁二胺二鹽酸鹽 0.05-0.1 rag/L 丙酮酸鈉 4G-6:0 mg/L 維生素 H 0. :003-0. 04 mg/L D-泛酸鈣 2-3 nig/L 氯化膽堿 7-9 mg/L 胸苷 0. _3-0.,_4 m.g/L 葉酸 4 mg/L i-肌醇 .10-20 mg/L 煙酰胺 L 5-2. i liig/L 鹽酸吡P多醛 1-3 mg/'L 鹽酸吡哆淳 G. 0:2-0. 04 mg/L 核黃素 0. 1-0. 3 mg/L 盈酸硫胺 S_2_. _5. mg/L。8.-種權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的使用方法, 其特征在于:培養(yǎng)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞過程如下:a、在制備好α-ΜΕΜ培養(yǎng)液中按濃度加入胰 島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、BMP-4、B0P1、FGF-2和AMD3100制作成培養(yǎng)液;b、在24孔板中進(jìn)行培養(yǎng),每孔 Iml培養(yǎng)液,接種接種所需的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞,接種密度為I X 105cel ls/ml,于37°C、 5%C02的全飽和濕度下培養(yǎng);c、培養(yǎng)第一周加入IL-3+IL-6+SCF;第7天同時(shí)加入FL直到第 四周結(jié)束;第Hd起停用IL-3。
      【文檔編號】C12N5/0775GK105886464SQ201610398496
      【公開日】2016年8月24日
      【申請日】2016年6月7日
      【發(fā)明人】謝海濤, 李相魯, 張嚴(yán)冬
      【申請人】廣東萬海細(xì)胞生物科技有限公司
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