本發(fā)明屬于磁共振成像(MRI)造影劑的制備領(lǐng)域，特別涉及一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法。

背景技術(shù)：

一直以來，惡性腫瘤都是危害人類生命的頭號殺手，具有死亡率高、難治療以及惡化迅速等特點。因此，腫瘤的早期診斷和特異性治療顯得尤為重要。目前，腫瘤的檢測手段主要有：超聲成像、CT成像、核醫(yī)學(xué)(PET或SPECT)成像以及磁共振成像(MRI)。隨著磁共振技術(shù)的發(fā)展，其掃描時間逐漸縮短，分辨率逐漸提高，對于小病灶的檢測也更加準(zhǔn)確，這也使得磁共振成像技術(shù)成為近年來發(fā)展起來的新型疾病檢測手段。為了提高MRI成像診斷的靈敏度和特異性，有必要選擇合適的MRI造影劑。常規(guī)的MRI造影劑主要分為兩類：一類是T₁加權(quán)的MRI造影劑，一類是T₂加權(quán)的MRI造影劑。至今已有大量文獻報道利用磁性氧化鐵納米顆粒作為MRI陰性造影劑應(yīng)用于癌癥的診斷。然而，在人體血液中、鈣離子富集區(qū)、金屬離子沉積以及人體組織損傷部位在T₂成像過程中也會出現(xiàn)信號減弱現(xiàn)象而得到負造影圖像，這往往會干擾臨床診斷。因此，臨床醫(yī)學(xué)界更期望開發(fā)具有信號增強作用的T₁造影劑。而目前應(yīng)用于臨床MRI的小分子T₁造影劑都存在不可克服的缺陷，如血液循環(huán)時間過短、吸附蛋白質(zhì)而易于聚集等。尤其是釓基造影劑一定濃度下還存在腎毒性。相比之下，金屬或者金屬氧化物納米顆粒更加具有安全性。

作為生物體內(nèi)MRI陽性造影劑，超小Fe₃O₄納米顆粒必須具有良好的水溶性、穩(wěn)定性、生物相容性、和較高的T₁弛豫率。檸檬酸鈉是一種小分子羧酸鹽，擁有三個羧基，被廣泛地應(yīng)用于納米材料合成過程中的晶體生長抑制劑和穩(wěn)定劑，不僅能提供影響納米顆粒膠體穩(wěn)定性的電荷排斥力，還使得納米顆粒表面帶上負電荷的羧基官能團，為納米顆粒的表面多功能修飾提供了可行性。

檢索國內(nèi)外文獻，尚沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于兩性離子L-半胱氨酸修飾的超小氧化鐵MRI陽性造影劑及其體內(nèi)MRI診斷應(yīng)用的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，該方法工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，成本較低；制備的Fe₃O₄納米顆粒能夠長時間穩(wěn)定分散于水溶液中，不會出現(xiàn)團聚現(xiàn)象。

本發(fā)明的一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，包括：

(1)將三價鐵鹽溶于溶劑中，加入檸檬酸鈉Na₃Cit，攪拌溶解，然后加入無水醋酸鈉，攪拌溶解，190～200℃溶劑熱反應(yīng)3～4小時，冷卻至室溫，離心，干燥，得到超小四氧化三鐵納米顆粒；其中，檸檬酸鈉為穩(wěn)定劑，無水醋酸鈉作為反應(yīng)助劑、陰離子表面活性劑；

(2)將步驟(1)中的超小四氧化三鐵納米顆粒分散在超純水中，超聲，經(jīng)過EDC和NHS活化，將活化后的Fe₃O₄溶液逐滴加入到Mal-PEG-NH₂的超純水溶液中，室溫反應(yīng)60～72小時，得到Fe₃O₄-PEG-Mal的水溶液；

(3)將L-半胱氨酸溶解于超純水中，逐滴加入到步驟(2)中的Fe₃O₄-PEG-Mal的水溶液中，室溫下反應(yīng)60～72小時，透析，冷凍干燥，得到兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)。

所述步驟(1)中三價鐵鹽、溶劑、檸檬酸鈉和無水醋酸鈉的比例為1.081～1.09g：38～40mL：0.47～0.50g：1.312～1.33g。

所述三價鐵鹽為六水合氯化鐵，溶劑為一縮二乙二醇DEG。

所述步驟(1)中加入檸檬酸鈉后攪拌的條件為：空氣氣氛下80℃攪拌1～2小時。

所述步驟(1)中溶劑熱反應(yīng)的容器為50ml的高壓反應(yīng)釜。

所述步驟(1)中離心的條件為：8500～9000rpm離心10～15分鐘，棄上清液，用無水乙醇回溶，8500～9000rpm離心10～15分鐘，重復(fù)操作2～3次。

所述步驟(1)中干燥的條件為：60～65℃烘干。

所述步驟(2)中Fe₃O₄、EDC和NHS的質(zhì)量比為160～168：134～144：65～70。

所述步驟(2)中Fe₃O₄和Mal-PEG-NH₂的質(zhì)量比55～60：9～12。

所述步驟(2)中的PEG一端為NH₂(氨基)另一端為Mal(馬來酰亞胺基)；平均分子量為2000。

所述步驟(3)中Fe₃O₄-PEG-Mal和L-半胱氨酸的摩爾比為1.5～2：1～1.5。

所述步驟(3)中透析的條件為：用截留分子量為8000～14000的透析袋透析2～3天(每次透析所用蒸餾水1.5～2L，共換水6～9次)。

所述步驟(3)中兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的粒徑為2～3nm。

本發(fā)明采用兩性離子L-半胱氨酸(L-Cysteine)對超小Fe₃O₄納米顆粒進行修飾，仿生細胞膜結(jié)構(gòu)的兩性離子在納米顆粒表面形成保護性的水化層，能賦予納米粒子良好的分散穩(wěn)定性和生物相容性。L-半胱氨酸作為一種天然的小分子氨基酸，使經(jīng)過兩性離子化的表面改性后的無機納米粒子幾乎不增尺寸，并賦予其優(yōu)異的抗高鹽濃度、抗酸堿性，抗蛋白質(zhì)吸附和抗巨噬細胞內(nèi)吞性。這些特性恰好彌補了磁性Fe₃O₄納米顆粒易于吸附蛋白，聚集和體內(nèi)循環(huán)時間短的缺點，使納米顆?？梢栽谏矬w內(nèi)長效循環(huán)，逐步富集于病灶部位。這種特殊的納米界面對于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的意義。

本發(fā)明采用了類似的方法(一步溶劑熱法)合成出具有良好膠體穩(wěn)定性的超小Fe₃O₄納米顆粒。隨后，在Fe₃O₄納米顆粒的表面通過NH₂-PEG-Mal修飾兩性離子L-半胱氨酸，獲得了具有優(yōu)異抗酸堿性，抗蛋白質(zhì)吸附和抗巨噬細胞吞噬性的納米顆粒，使超小Fe₃O₄納米顆粒的血液循環(huán)時間大為延長，可以應(yīng)用于T₁增強的血池MRI和腫瘤MRI診斷。

本發(fā)明操作簡便易行，原材料成本低；制備的納米顆粒具有良好的水溶性、膠體穩(wěn)定性和生物相容性。以傳統(tǒng)的聚合物(NH₂-mPEG)修飾的Fe₃O₄磁性納米顆粒作為對照，相比之下，兩性離子化修飾后的Fe₃O₄納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)良的抗巨噬細胞吞噬，抗蛋白吸附性能，血液循環(huán)半衰期增長，可以實現(xiàn)磁共振血池成像和腫瘤成像。該方法制備的L-半胱氨酸修飾的超小氧化鐵納米顆粒在MRI分子影像診斷領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。

本發(fā)明使用核磁共振波譜(¹H NMR)、紅外(FTIR)、熱重分析(TGA)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-OES)、Zeta電勢和水合粒徑(DLS)等方法表征制備的磁性納米顆粒的物理及化學(xué)性質(zhì)。隨后通過紫外比色法評價L-半胱氨酸修飾的納米顆粒的阻抗蛋白吸附能力，并使用MRI成像儀測定納米顆粒的T₁成像性能和r₁弛豫率，然后通過溶血實驗、CCK-8法和熒光顯微鏡觀察法評價納米顆粒的血液相容性和細胞毒性，再利用普魯士藍染色法和ICP-OES評價納米顆粒阻抗巨噬細胞(RAW 264.7)內(nèi)吞的能力。最后，采用體內(nèi)MRI實驗檢測L-半胱氨酸修飾的超小氧化鐵納米顆粒的血池造影以及腫瘤診斷效果。

有益效果

(1)本發(fā)明采用簡單的一步溶劑熱法制備水溶性良好的檸檬酸鈉穩(wěn)定的超小Fe₃O₄納米顆粒，然后在納米顆粒表面修飾兩性離子L-半胱氨酸，得到的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒應(yīng)用于MR成像陽性造影劑；此法操作工藝簡單，反應(yīng)條件溫和環(huán)境友好，易于操作分離，具有實施商業(yè)化的前景；

(2)本發(fā)明制備的Fe₃O₄納米顆粒能夠長時間地穩(wěn)定分散于水中不會出現(xiàn)團聚或者沉淀現(xiàn)象；檸檬酸鈉增加了Fe₃O₄納米顆粒的穩(wěn)定性，修飾兩性離子L-半胱氨酸，在Fe₃O₄納米顆粒表面形成保護性的水化層，賦予納米顆?？狗翘禺愋晕剑咕奘杉毎淌傻男阅?，延長了血液循環(huán)半衰期；這些優(yōu)點使本發(fā)明制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒能夠有效地作為MR成像陽性造影劑，增強動物體內(nèi)的血管、腫瘤部位成像的對比度。

附圖說明

圖1是實施例1制備的PEG-(L-Cysteine)的核磁共振氫譜譜圖；

圖2是實施例1中Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄-mPEG(b)、Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(c)的紅外光譜圖；

圖3是實施例2中Fe₃O₄(a)、Fe₃O₄-mPEG(b)、Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(c)的熱重分析圖；

圖4是實施例2中Fe₃O₄-mPEG、Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的紫外比色法分析圖；

圖5是實施例2中Fe₃O₄-mPEG、Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的T₁弛豫時間倒數(shù)與Fe濃度的線性關(guān)系圖；

圖6是實施例2中Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(a)和對照組材料Fe₃O₄-mPEG(b)納米顆粒在鐵濃度為0.05-0.8mM的MR T₁加權(quán)成像；

圖7是實施例3中Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和對照組材料Fe₃O₄-mPEG在鐵濃度為10-200μg/mL下溶血實驗結(jié)果；其中，(a)為溶血率柱狀分析圖，(b)為離心后的溶血圖片；

圖8是實施例4中CCK-8法測得L929細胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照)、Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG在鐵濃度10-100μg/mL條件下處理24小時后的細胞活力；

圖9是實施例4中L929細胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照a)、Fe₃O₄-mPEG(b-e)和Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(f-i)在鐵濃度10(b,f)、25(c,g)、50(d,h)和100(e,i)μg/mL條件下處理24小時后的熒光顯微鏡細胞形貌圖；

圖10是實施例5中RAW264.7細胞經(jīng)過PBS緩沖液(a，e)、Fe₃O₄-mPEG(b-d)和Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(f-h)在鐵濃度25(b,f)、50(c,g)和100(d,h)μg/mL條件下處理4小時后經(jīng)普魯士藍染色后的結(jié)果；圖中的標(biāo)尺為100μm；

圖11是實施例5中RAW264.7細胞經(jīng)過PBS緩沖液、Fe₃O₄-mPEG和Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)在Fe濃度為5-100μg/mL時處理4小時后收集細胞，經(jīng)王水消化后利用ICP-OES測定得到每個細胞內(nèi)的鐵含量結(jié)果；

圖12是實施例6中尾靜脈注射制備得到的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對照材料Fe₃O₄-mPEG(Fe濃度為0.1M，450μL)后不同時間點大鼠血液中Fe濃度擬合的藥物代謝圖；

圖13是實施例7中尾靜脈注射制備得到的(a)Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和(b)對照組材料Fe₃O₄-mPEG(Fe濃度為0.1M，450μL)后不同時間點大鼠主動脈T₁加權(quán)MR成像圖片；

圖14是實施例7中尾靜脈注射制備得到的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對照組材料Fe₃O₄-mPEG(Fe濃度為0.1M，450μL)后不同時間點大鼠主動脈MRI信噪比值變化柱狀圖；

圖15是實施例8中尾靜脈注射制備得到的(a)Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和(b)對照組材料Fe₃O₄-mPEG(Fe濃度為0.1M，150μL)后不同時間點裸鼠腫瘤的T₁加權(quán)MR成像圖片；

圖16是實施例8中尾靜脈注射制備得到的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對照組材料Fe₃O₄-mPEG(Fe濃度為0.1M，150μL)后不同時間點裸鼠腫瘤的MRI信噪比值變化柱狀圖；

圖17是實施例8中尾靜脈注射制備得到的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒4，8和12小時后，納米顆粒在裸鼠體內(nèi)各臟器中的分布結(jié)果；

圖18是本發(fā)明制備方法示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

將1.09g六水合氯化鐵溶解在40mL一縮二乙二醇(又名二甘醇，DEG)中，然后將0.47g檸檬酸鈉(Na₃Cit)溶解在上述溶液，并于空氣氣氛下80℃攪拌1小時，待檸檬酸鈉完全溶解后再將1.312g的無水醋酸鈉加入到上述溶液中，持續(xù)攪拌至醋酸鈉粉末完全溶解，然后將溶液轉(zhuǎn)移至50mL的高壓反應(yīng)釜中，于200℃反應(yīng)4小時；反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至50mL離心管中8500rpm離心15分鐘，棄上清液，用無水乙醇回溶，8500rpm離心15分鐘，重復(fù)操作3次，然后將沉淀物在60℃烘干得到超小四氧化三鐵納米顆粒，即表面檸檬酸鈉穩(wěn)定的超小氧化鐵納米顆粒。

分別將Mal-PEG-NH₂(10mg)和Fe₃O₄納米顆粒(56mg)分散于超純水(5ml)中并超聲10分鐘，使用EDC(144mg)和NHS(70mg)活化Fe₃O₄溶液3小時，將活化后的Fe₃O₄溶液逐滴加入到Mal-PEG-NH₂(水溶液)中，室溫下反應(yīng)72小時，得到Fe₃O₄-PEG-Mal的水溶液；再將L-半胱氨酸(2mg)溶解于超純水中，然后逐滴加入Fe₃O₄-PEG-Mal的溶液中，室溫下反應(yīng)72小時，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為8000-14000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸餾水2L，共換水9次)，然后真空冷凍干燥，得到產(chǎn)物Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)。為了估算L-半胱氨酸在PEG端基的修飾量，通過¹H NMR檢測NH₂-PEG-(L-Cysteine)在氘代水中的氫譜(如圖1)，可知，NH₂-PEG-(L-Cysteine)在2-4ppm出現(xiàn)的譜峰證明L-半胱氨酸可以通過室溫攪拌的方法連接到PEG上，并通過積分峰面積計算可知，L-Cysteine可以高效的偶聯(lián)在Mal-PEG-NH₂上：每一個PEG上連接了0.9個L-半胱氨酸分子。

制備得到的Fe₃O₄納米顆粒表面有大量的檸檬酸鈉，具有較高的負電荷，這使得納米顆粒之間產(chǎn)生相互的排斥作用而具有很好的膠體穩(wěn)定性。表面電勢和水合粒徑測定結(jié)果如表1所示：用溶劑熱法合成得到的檸檬酸鈉穩(wěn)定的Fe₃O₄表面電勢和水合粒徑分別為-30.2mV和30.9nm。

表1.Fe₃O₄、Fe₃O₄-mPEG和Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)的電勢和水動力直徑

實施例2

分別取實施例1制備的Fe₃O₄、Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對比例1制備得到的Fe₃O₄-mPEG納米顆粒2mg溶解在超純水中，得到納米顆粒懸液，超聲均勻，測表面電勢和水合粒徑。實驗結(jié)果表明(表1)，制備得到的Fe₃O₄、Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米顆粒的表面電勢分別為-39.7、-15.7和-16.4mV；水合粒徑分別為30.9、116.2和93.6nm。從實驗結(jié)果得出，超小氧化鐵納米顆粒在修飾NH₂-PEG-(L-Cysteine)和mPEG-NH₂之后表面電勢升高，水動力直徑增大，主要是由PEG或PEG/L-Cysteine的表面修飾引起的。表面電勢和水合粒徑的變化說明mPEG和PEG-(L-Cysteine)已經(jīng)修飾到氧化鐵納米顆粒表面。

分別稱取實施例1制備得到的兩種材料：Fe₃O₄、Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和對比例1得到的對照組材料Fe₃O₄-mPEG 2mg進行紅外光譜測試(如圖2所示)和熱重分析(如圖3所示)。通過解析紅外圖譜(如圖2)，曲線a、b、c中3436cm^-1處的峰為吸附的水分子上OH的伸縮振動峰，2900cm^-1和2850cm^-1附近的特征吸收峰歸屬于檸檬酸鈉上亞甲基的伸縮振動。同時在1396-1642cm^-1(C＝O的伸縮振動)和1064cm^-1(C-O-C的伸縮振動)處的峰，均在Fe₃O₄、Fe₃O₄-mPEG和Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)樣品上得到體現(xiàn)。而圖2c中1433cm^-1附近的強特征峰歸屬于Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)上的S-C鍵；466-601cm^-1上出現(xiàn)的特征吸收峰為Fe₃O₄上Fe-O的伸縮振動(圖2a，b，c)。紅外光譜圖結(jié)果表明超小四氧化三鐵表面有檸檬酸鈉、L-半胱氨酸和PEG的存在。此外，TGA測試結(jié)果表明，F(xiàn)e₃O₄的失重量為60.8％(圖3a)，F(xiàn)e₃O₄-mPEG和Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)的失重分別是52.8％(圖3b)和50.7％(圖3c)，由此定量分析出PEG和L-半胱氨酸連接到Fe₃O₄納米顆粒比例分別為8％和2.1％。

通過比色法分析實施例1制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對比例1制備的Fe₃O₄-mPEG納米顆粒的抗蛋白吸附性能(圖4)，在37℃的條件下，將Fe濃度分別為50、100、500、1000μg/mL的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米顆粒分別與10％的BSA(牛血清蛋白)共孵育2小時，隨后離心(8000rpm，5分鐘)分離。用紫外可見分光光度法測試蛋白質(zhì)原液和離心后上清液蛋白質(zhì)在280nm處的吸光度，吸光度的減少值代表了蛋白質(zhì)的吸附量。從圖中可以看出隨著鐵濃度(50-1000μg/mL)的升高，F(xiàn)e₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米顆粒對蛋白質(zhì)的吸附增加，在相同濃度下，F(xiàn)e₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒吸附的蛋白質(zhì)明顯少于對照組。結(jié)果說明制備得到Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒具有良好的抗蛋白吸附性能。

r₁弛豫率反映Fe₃O₄納米粒子作為MRI造影劑的效率，為單位摩爾濃度鐵的縱向弛豫時間，可通過不同濃度下的T₁弛豫時間的倒數(shù)擬合計算得到。將制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(實施例1)納米顆粒和對照材料Fe₃O₄-mPEG(對比例1)通過ICP-OES測試法測得溶液中Fe元素的濃度，再用超純水配制Fe濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的水溶液2mL，測定不同F(xiàn)e濃度下的T₁弛豫時間(如圖5所示，F(xiàn)e₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對照組材料Fe₃O₄-mPEG的T₁弛豫時間倒數(shù)與Fe濃度的線性擬合圖)和T₁加權(quán)成像(如圖6所示)。弛豫率測試結(jié)果表明Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米顆粒的T₁弛豫時間倒數(shù)在Fe濃度為0.1-1.6mM范圍內(nèi)隨著鐵濃度的增加具有很好的線性關(guān)系。并且通過計算可得Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對照材料Fe₃O₄-mPEG的r₁弛豫率分別為1.2mM^-1s^-1和0.9mM^-1s^-1。因此，制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對照材料Fe₃O₄-mPEG納米顆粒均可作為MRI分子影像學(xué)診斷中的優(yōu)良T₁信號增強造影劑。從圖6中可以看出隨著Fe濃度(0.05-0.8mM)的提高MRI信號逐漸增強，并且呈良好的梯度關(guān)系，測試結(jié)果說明該材料具有良好的MRI成像能力。

實施例3

由于造影劑的給藥途徑多數(shù)情況下是經(jīng)由靜脈注射方式進入體內(nèi)的。因此，造影劑勢必會與血液直接接觸，而造影劑的介入會不會產(chǎn)生溶血或者其他不良癥狀便成為科研工作者不得不考慮的重要因素之一。為了確保本發(fā)明制備的納米顆粒能安全地用于體內(nèi)生物成像診斷，評價了制備得到的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對照材料Fe₃O₄-mPEG的血液相容性。根據(jù)實施例2中測定的兩種材料的鐵濃度計算稱量出Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒(實施例1)和對照材料Fe₃O₄-mPEG(對比例1)中鐵元素總量各1mg的兩種納米顆粒，分別分散于PBS中配制成1mg/mL的濃度為母液，然后用PBS依次配制濃度為10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的納米顆粒懸浮液。取適量的人新鮮血液，首先離心(2000rpm，5分鐘)去上清液，然后將血紅細胞用PBS洗滌5次，收集健康的紅細胞并用PBS稀釋10倍。再將Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米材料(10-200μg/mL)與紅細胞混合靜置1小時后，10000rpm離心1分鐘，拍照(圖7b)并測上清液的紫外吸收值。該過程以超純水作為陽性對照，PBS作為陰性對照。圖7中顯示了Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG在給定鐵濃度為10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL下的溶血性測試結(jié)果。通過測量上層清液的吸光度值定量評價納米材料的溶血性。如圖7a顯示，在濃度達到200μg/mL時，F(xiàn)e₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG的溶血率都小于5％，說明制備的這些納米材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物體內(nèi)MR成像。

實施例4

以L929細胞為模型細胞評價制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒和對照材料Fe₃O₄-mPEG對細胞存活的影響。稱取相應(yīng)重量的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒(實施例1)和對照材料Fe₃O₄-mPEG(對比例1)干粉(兩種材料鐵元素的含量為1mg)，分散在無菌PBS中配制成1mg/mL的PBS溶液，并用紫外照射過夜殺菌。然后在超凈工作臺中用無菌PBS配制濃度為10、25、50和100μg/mL的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米顆粒懸浮液。L929細胞種植于96孔板后分別與Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米顆粒(濃度為10、25、50和100μg/mL)在37℃下共培養(yǎng)24小時。然后，向培養(yǎng)板孔中加入20μL CCK-8，繼續(xù)在37℃下培養(yǎng)4小時后，棄去培養(yǎng)液，并加入100μL DMSO，振蕩20分鐘后在450nm處測量吸光值，以緩沖液PBS組的吸收值為基準(zhǔn)，不同濃度的材料處理后的吸收值與之相比計算得到L929細胞的存活率(如圖8)。與對照組相比(PBS處理細胞組)，F(xiàn)e₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG在實驗濃度0～100μg/mL范圍內(nèi)對L929細胞的存活率沒有顯著性差異，細胞存活率都在80％以上。這充分說明合成的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG均具有良好的細胞相容性，可以應(yīng)用到生物體內(nèi)MRI成像檢測。同時，使用Calcein-AM熒光試劑染色并通過熒光顯微鏡觀察法進一步驗證材料對細胞的形貌是否有影響。如圖9所示，不同濃度的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米材料(10、25、50和100μg/mL)處理24小時后的細胞形態(tài)和PBS處理后的細胞相比，沒有明顯的變化，進一步說明了合成的材料的良好細胞相容性。

實施例5

通過兩性離子L-半胱氨酸修飾的氧化鐵納米顆粒用于生物體內(nèi)時，應(yīng)該能夠逃脫巨噬細胞的吞噬，從而延長體內(nèi)循環(huán)時間，逐步富集于病灶，提高血池成像和腫瘤成像效果。通過普魯士藍染色法檢測不同濃度的納米顆粒與RAW 264.7細胞共培養(yǎng)4小時后細胞的普魯士藍染色(如圖10)來評價Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的巨噬細胞內(nèi)吞效果。RAW 264.7細胞以2×10⁵個/孔種植于12孔板，過夜培養(yǎng)后再分別與實施例1中Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和對比例1中的Fe₃O₄-mPEG納米顆粒(Fe濃度為25，50和100μg/mL)在37℃下共培養(yǎng)4小時，并且以PBS處理的細胞作為對照組。共培養(yǎng)后細胞用PBS洗三次，再用胰酶消化并離心，棄上清液，將細胞懸浮于1mL PBS中。普魯士藍染色后用相差顯微鏡拍照記錄，根據(jù)細胞染成藍色的深淺來定性分析細胞吞噬納米顆粒的多少。在圖10中隨著Fe濃度的提高，與納米顆粒共培養(yǎng)的細胞經(jīng)染色后藍色逐漸加深，說明巨噬細胞對兩種納米顆粒的吞噬均呈濃度依賴性，并且在相同F(xiàn)e濃度下，與對照組相比，F(xiàn)e₃O₄-PEG-(L-Cysteine)組的細胞藍色明顯更淺。這說明L-半胱氨酸修飾后賦予了納米顆粒較高的抗巨噬細胞吞噬的性能。此外，還采用ICP-OES技術(shù)定量分析了平均每個細胞吞噬Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米顆粒的質(zhì)量，細胞的處理方式與普魯士藍染色一致。當(dāng)不同濃度的納米顆粒與細胞共培養(yǎng)24小時后，用PBS洗滌細胞3次，然后胰酶消化、計數(shù)，最后用王水消化細胞，用ICP-OES測試每孔吞噬鐵元素的總量，再除以細胞數(shù)目，得出每個細胞吞噬鐵含量。如圖11所示，在相同F(xiàn)e濃度下，細胞對Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的內(nèi)吞量明顯少于對Fe₃O₄-mPEG納米顆粒的內(nèi)吞量，進一步證明了Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)具有一定的生物抗污性。這些結(jié)果說明磁性Fe₃O₄納米顆?？梢酝ㄟ^L-半胱氨酸進行兩性離子化修飾，從而大大減少巨噬細胞對納米顆粒的非特異性內(nèi)吞。

實施例6

將制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(實施例1)和對照材料Fe₃O₄-mPEG(對比例1)按配置成Fe濃度為0.1M的450μL PBS分散液，通過大鼠尾靜脈注射來評價血液中代謝半衰期(如圖12)。在注射后的不同時間點(0、0.5、1、2、4、8、12、24、48和72小時)，通過大鼠眼眶靜脈竇采血并通過ICP-OES檢測血液中Fe元素含量來擬合藥物代謝半衰期。如圖12顯示，在不同時間點，注射Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的大鼠血液中Fe的含量均大于對照組。經(jīng)過擬合得到，F(xiàn)e₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒在大鼠體內(nèi)的半衰期(6.2小時)遠大于Fe₃O₄-mPEG在大鼠體內(nèi)的半衰期(2.3小時)，并且遠大于檸檬酸穩(wěn)定的磁性氧化鐵納米顆粒的血液循環(huán)半衰期(0.6-1.3小時)(C.Corot et al./Advanced Drug Delivery Reviews 58(2006)1471–1504)。與傳統(tǒng)的聚合物修飾相比，兩性離子L-半胱氨酸可以大大延長磁性納米顆粒在體內(nèi)的循環(huán)時間。這些結(jié)果說明，本發(fā)明制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的血液循環(huán)半衰期較長，具有潛在應(yīng)用價值，可應(yīng)用于體內(nèi)血池造影和腫瘤成像。

實施例7

將制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(實施例1)和對照材料Fe₃O₄-mPEG(對比例1)按配置成Fe濃度為0.1M的450μL PBS分散液。通過大鼠尾靜脈注射納米顆粒的分散液評價MR血池造影效果(如圖13)，與注射前相比較，尾靜脈注射Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的大鼠主動脈明顯變亮，MR成像的對比度持續(xù)增強4.5小時。并且在相同的時間點，與注射Fe₃O₄-mPEG的大鼠相比，注射Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的大鼠主動脈明顯更亮。說明Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆?？梢栽谘苤芯S持較長的循環(huán)時間。圖14是相應(yīng)注射時間點的大鼠主動脈部位MRI信噪比，在相同的時間點，注射實施例1中制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的大鼠血管部位的信噪比明顯高于對照組，再次驗證了上述結(jié)論。這些結(jié)果表明，出L-半胱氨酸修飾的納米顆粒具有良好的血池造影效果，而MR血池成像是檢測動脈粥樣硬化，腎衰竭以及心肌梗塞等疾病的主要方式，因此，制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒作為MR造影劑具有潛在應(yīng)用價值。

實施例8

將制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(實施例1)和對照材料Fe₃O₄-mPEG(對比例1)配置Fe濃度為0.1M的150μL PBS分散液。2×10⁶個HeLa細胞接種到裸鼠體內(nèi)，三周后待腫瘤直徑達到0.6-1cm時，通過尾靜脈注射Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)和Fe₃O₄-mPEG納米顆粒PBS溶液來評價腫瘤部位的MR成像效果(如圖15)。與注射前的裸鼠相比較，在注射后30分鐘到3小時內(nèi)，注射Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的裸鼠腫瘤部位，逐步變亮并在注射后1.5小時達到最亮，而注射Fe₃O₄-mPEG的在注射后45分鐘達到最亮。圖16是相應(yīng)的注射時間點的腫瘤部位MRI信噪比，注射Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒的裸鼠腫瘤部位信號逐步增強，在注射1.5小時后信噪比達到最高值，而后緩慢下降，而注射Fe₃O₄-mPEG納米顆粒的裸鼠腫瘤部位信噪比在達到峰值以后迅速下降，這些結(jié)果展示出L-半胱氨酸修飾的納米顆粒具有增強的MRI腫瘤診斷效果，能成功應(yīng)用于體內(nèi)MRI腫瘤診斷。

為了研究納米顆粒的生物組織分布情況，將經(jīng)尾靜脈注射Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)的裸鼠處死并解剖，取出心、肝、脾、肺、腎、腫瘤稱重，剪成2×2mm的碎塊，然后用王水消化24小時，再用ICP-OES來測量各個樣品的鐵元素含量，最后計算出各個重要器官中鐵的含量(圖17)。從圖中可看出在注射本發(fā)明制備的Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)(Fe濃度為0.1M，150μL)納米顆粒后，肝、脾和血液中鐵的含量較注射前均明顯增加，而在其他的器官，比如：心、肺、腎和腫瘤，鐵的含量較少。同時需要指出的是，隨著時間的增長，F(xiàn)e元素先在血液中含量較高，而后在腎臟和脾臟中聚集，最后在各器官中均逐漸下降。這些結(jié)果不僅證明了Fe₃O₄-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒具有較長的血液循環(huán)時間，而且說明本發(fā)明制備的納米顆粒能在小鼠體內(nèi)正常的代謝清除。

對比例1

表面修飾聚合物是常用的磁性納米顆粒改性方法，修飾后的納米顆粒穩(wěn)定性增加。為了比較兩性離子L-半胱氨酸與傳統(tǒng)聚合物修飾的納米顆粒的性能，按照實施例1中的方法和步驟合成得到Fe₃O₄納米顆粒。然后將制備得到的Fe₃O₄納米顆粒分散在DMSO溶劑中并超聲10分鐘使其完全分散，分別將EDC和NHS的DMSO溶液加入到上述Fe₃O₄(DMSO溶液)中，攪拌反應(yīng)3小時，將活化后的Fe₃O₄溶液逐滴加入到得到mPEG-NH₂(DMSO溶液)中反應(yīng)72小時，得到產(chǎn)物Fe₃O₄-mPEG，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為8000～14000的透析袋透析3天(前三次用PBS緩沖液透析，每次透析所用PBS緩沖液或者蒸餾水2L，共換PBS緩沖液或者水9次)，然后真空冷凍干燥，即得Fe₃O₄-PEG。產(chǎn)物Fe₃O₄-mPEG的表征詳見實施例2。