本發(fā)明屬于基因的功能與應用領域，特別涉及一種泛素特異性蛋白酶4(ubiquitin-specific protease 4,USP4)作為靶基因在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中應用。

背景技術：

隨著人們生活方式的改變，尤其是高能量食品的攝入過多及體力活動減少，糖尿病和脂肪肝的發(fā)病率大幅上升，已嚴重危害到人們身體的健康。Ⅱ型糖尿病(Type 2diabetes，T2DM)發(fā)病率的增加導致非酒精性脂肪肝病的患病率及病情嚴重程度也逐步增加。非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)在非肥胖人群【身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)<25kg/m²】中的發(fā)病率約為18.4％，在25kg/m²＜BMI＜30kg/m²的人群中約為63.4％，而在BMI＞30kg/m²人群中約為89.1％，NAFLD在Ⅱ型糖尿病患者中的發(fā)病率約為50％。兒童NAFLD的發(fā)病率也呈上升趨勢，約3％，并可能隨著年齡增加而增加。

非酒精性脂肪肝病是指排除酒精和其他明確因素所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積的疾病，它以病理損傷和肝功能異常為主要特征。包括單純脂肪變性、脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化以及肝硬化。Ⅱ型糖尿病舊稱非胰島素依賴型糖尿病(noninsulin-dependent diabetes mellitus，簡稱NIDDM)或成人發(fā)病型糖尿病(adult-onset diabetes)，是一種代謝性疾病，多在35～40歲之后發(fā)病，占糖尿病患者90％以上。特征為高血糖，主要由胰島素抵抗及胰島素相對缺乏引起，目前被認為是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。環(huán)境因素中營養(yǎng)攝入過多和體育鍛煉減少，都促成了肥胖和胰島素抵抗。

越來越多的證據(jù)顯示非酒精性脂肪肝病與代謝性疾病之間相互作用相互影響，非酒精性脂肪肝病可以預測Ⅱ型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展，而更嚴重的是非酒精性脂肪肝可導致Ⅱ型糖尿病大血管、微血管病并發(fā)癥的發(fā)生。非酒精性脂肪肝病的發(fā)生多與肥胖、血脂異常、糖耐量異常和胰島素抵抗等并存。同樣，糖尿病也可能是發(fā)展為非酒精性脂肪肝的一個獨立的危險因素，Ⅱ型糖尿病繼發(fā)于非酒精性脂肪肝的風險也增加。這啟示醫(yī)生在臨床上不能將這兩個疾病孤立看待，而且為了預防糖尿病的發(fā)生，更應重視對脂肪肝的治療。

目前對于非酒精性脂肪肝和Ⅱ型糖尿病有以下治療方法。首先要對脂肪肝和糖尿病的患者進行教育管理和心理干預，使患者充分認識和了解疾病，為控制疾病的發(fā)展和減少并發(fā)癥等不良事件做好準備。其次要控制體重及肥胖，通過改變生活方式來減肥是預防和治療非酒精性脂肪肝及Ⅱ型糖尿病非常安全和有效的方法。減肥的目標是減輕體重的7％～10％，期間要保證平衡飲食以及體育鍛煉。減肥能改善胰島素抵抗、肝功能，提高生活質(zhì)量。對于那些通過改變生活方式仍不能減輕體重的患者可以考慮通過藥物、減重手術達到減肥目的。目前治療糖尿病的藥物有二甲雙胍(Metformin)，噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones，TZDs)，胰升糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)類似物，二肽基肽酶-4抑制劑等。

泛素特異性蛋白酶4(ubiquitin-specific protease 4,USP4)是一種重要的去泛素化酶，它通過識別特異性靶蛋白，使之去泛素化來阻礙其降解或改變其特性，在腫瘤、病毒感染及多種信號通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。人類USP4基因定位于染色體3p21.3區(qū)帶，哺乳動物細胞的USP4分子由催化區(qū)域和非催化區(qū)域兩部分組成，其催化區(qū)域含有特征性的Cys盒和His盒，二者分別包含一個保守的半胱氨酸殘基或兩個保守的組氨酸殘基，由它們參與構(gòu)成USP4作為巰基蛋白酶的部分活性位點[1]。而泛素樣結(jié)構(gòu)域(UBL)和泛素特異蛋白酶結(jié)構(gòu)域(DUSP)則參與構(gòu)成USP4的大部分非催化區(qū)域，其中N端的UBL與DUSP形成雙結(jié)構(gòu)域單元[2]。

USP4可與A2A受體的羧基端結(jié)合，使其去泛素化，避免被降解，即USP4可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白折疊的質(zhì)量控制，使A2A受體在細胞膜表達增加，而后者的進一步活化則導致腺苷酸環(huán)化酶cAMP增加，發(fā)揮一系列調(diào)控效應[3]。磷酸肌醇依賴激酶1(PDK1)介導的磷酸化是多種生長因子活化激酶行使效能必不可少的環(huán)節(jié)之一，在細胞增殖和代謝等活動中發(fā)揮重要作用。PDK1在多種人類細胞系中被單泛素化，表明PDK1泛素化是其常見的調(diào)節(jié)形式，而USP4則在體內(nèi)外直接使底物PDK1去泛素化[4]。剪接體的活性和組成也受泛素化調(diào)節(jié)。剪接體由五個核內(nèi)小分子核糖核蛋白(U1、U2、U4、U5、U6snRNP)以及其他非snRNP蛋白質(zhì)所組成。其中Prp19復合物可將U4成員Prp3泛素化，增加其與U5間的親和力以及U4/U6.U5snRNP的穩(wěn)定性。USP4可將Prp3去泛素化，使之易從剪接體釋放，剪接反應得以循環(huán)進行，借此調(diào)節(jié)剪接體的活性，因此認為Prp3也是USP4的作用底物之一，一旦USP4缺失將阻礙mRNA剪接后的細胞內(nèi)分布，干擾細胞周期[5]。USP4是經(jīng)典Wnt信號通路的一種新的負調(diào)節(jié)因子，可阻礙Wnt信號通路活化后的致癌特性，發(fā)揮抑癌作用[6]。選擇閱讀框結(jié)合蛋白1(alternative reading frame-binding protein 1,ARFBP1)具有E3泛素連接酶活性，通常被認為是p53的抑制劑，而USP4直接與ARF-BP1結(jié)合，通過去泛素化作用使之穩(wěn)定，進而促進p53的降解。USP4缺失時p53的表達水平和活性上調(diào)[7]。USP4可直接結(jié)合TβRⅠ，使之去泛素化，從而控制質(zhì)膜TβRⅠ的水平；而蛋白激酶B(AKT)磷酸化USP4，使細胞核中的USP4重新定位于胞質(zhì)和胞膜，與TβRⅠ結(jié)合，發(fā)揮去泛素化作用[8]。USP4最初被認定為癌蛋白，研究報道腎上腺皮質(zhì)癌變時USP4基因表達上調(diào)至少40倍，膀胱癌和前列腺癌組織中USP4的mRNA表達水平較正常組織顯著增高3.3倍和3.9倍[9]，肝細胞癌中miR-148a失調(diào)可引起USP4過表達，進而導致患者預后變差[10]。此外，研究發(fā)現(xiàn)病毒感染后，USP4的表達明顯降低，而USP4的過表達可顯著增強RIG-I的表達和IFN-β的釋放，同時抑制水泡口炎病毒的增殖[11]。

參考文獻

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[4]Uras IZ,List T,Nijman SM.Ubiquitin-specific protease 4 inhibits mono-ubiquitination of the master growth factor signaling kinase PDK1.PLoS One,2012,7:e31003

[5]Song EJ,Werner SL,Neubauer J,et al.The Prp19 complex and the Usp4Sart3 deubiquitinating enzyme control reversible ubiquitination at the spliceosome.Genes Dev,2010,24:1434-1447

[6]Zhao B,Schlesiger C,Masucci MG,et al.The ubiquitin specific protease 4(USP4)is a new player in the Wnt signalling pathway.J Cell Mol Med,2009,13:1886-1895

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[11]Wang L,Zhao W,Zhang M,et al.USP4positively regulates RIG-I-mediated antiviral response through deubiquitination and stabilization of RIG-I.J Virol,2013,87:4507-4515

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種USP4基因的表達與脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之間的相互關系，提供一個用于治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因USP4的新用途，進而把USP4基因應用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治療。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)：

本發(fā)明以野生型C57小鼠與USP4基因敲除小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究USP4基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型WT小鼠對比，USP4基因敲除小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重、空腹血糖水平及血清胰島素水平明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠，。進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗發(fā)現(xiàn)USP4基因敲除小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯減弱。從小鼠肝臟重量及肝臟/體重比以及脂質(zhì)成分結(jié)果等均說明HFD組(High fat diet，高脂飲食)的USP4-KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴重，脂質(zhì)蓄積顯著增加。這表明USP4基因敲除會加劇脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，USP4基因能夠改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。

本發(fā)明人的研究證明了：在高脂誘導的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，USP4具有抑制肥胖，降低血糖，減少肝臟脂質(zhì)蓄積，保護肝功能，特別是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。

針對USP4的上述功能，提供USP4作為藥物靶標在篩選保護肝臟及糖代謝的藥物中的應用。

針對USP4的上述功能，提供USP4作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應用。

以上藥物是指能夠促進USP4基因表達的藥物。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)USP4基因的新功能，即USP4基因具有能夠保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。

(2)基于USP4在保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。

附圖說明

圖1是WT和USP4-KO小鼠的體重、空腹血糖、空腹血清胰島素水平結(jié)果圖；

A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計圖，C為空腹胰島素水平統(tǒng)計圖(##：p＜0.01vs WT NC組，**：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖2是WT和USP4-KO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；

A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時間點小鼠血糖水平統(tǒng)計圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積(area under the curve，AUC)比較圖(##：p＜0.01vs WT NC組，**：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖3是USP4-KO和WT小鼠的肝臟重量結(jié)果圖；

A為肝臟重量統(tǒng)計柱狀圖，B為肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計柱狀圖(##：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖4是USP4-KO和WT小鼠的肝臟脂質(zhì)含量分析結(jié)果圖；

A、B、C分別為甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量測定結(jié)果(##：p＜0.01vs WT HFD組)。

具體實施方式

通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實驗用動物及飼養(yǎng)：

實驗動物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6(WT)小鼠和USP4-KO小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司；USP4基因敲除小鼠的構(gòu)建過程如下：

全身性USP4基因敲除小鼠的構(gòu)建：

利用CRISPR-Cas9技術構(gòu)建USP4基因敲除小鼠。首先，通過在線CRISPR設計工具(http://crispr.mit.edu)預測小鼠USP4的引導序列，設計2條單鏈oligo：

oligo1：TAGGGGTATCTTATTGACAGCCGG，

oligo2：AAACCCGGCTGTCAATAAGATACC。

oligo1和oligo2退火形成雙鏈DNA，將雙鏈DNA連入經(jīng)BsaI限制性內(nèi)切酶酶切的pUC57-sgRNA(Addgene 51132)構(gòu)建sgRNA表達載體。

以上述構(gòu)建的sgRNA表達載體為模板，使用如下引物通過PCR擴增含有T7啟動子及引導序列的DNA片段：

Forward primer：GATCCCTAATACGACTCACTATAG，

Reverse primer：AAAAAAAGCACCGACTCGGT。

以所擴增的PCR產(chǎn)物為模板使用MEGAshortscript Kit(Ambion，AM1354)進行體外轉(zhuǎn)錄；Cas9質(zhì)粒(Addgene 44758)通過T7Ultra kit(Ambion，Am1345)進行轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和引導序列RNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiaen，217084)純化后，通過FemtoJet 5247顯微注射系統(tǒng)注射入野生型C57BL/6小鼠的單細胞受精卵內(nèi)。選取經(jīng)顯微注射后存活的受精卵，將其移植到健康雌鼠輸卵管中，經(jīng)過19天妊娠之后得到F0代小鼠。

F1代及F2代小鼠通過PCR鑒定，野生型小鼠包含一段長372bp的DNA序列，而突變小鼠(USP4基因敲除小鼠)含有349bp的DNA序列，最終蛋白產(chǎn)物通過western blot進行檢測鑒定。其中，PCR鑒定引物如下：

USP4-F：5’-CCCCCAAACGTGATTTTGTGA-3’，

USP4-R：5’-GTAGAGATACACGCAGCCCC-3’。

實驗所用小鼠為突變體純合子。

實驗動物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購自美國New Brunswick公司，貨號D12942)：熱量百分比：蛋白質(zhì):18.1％；碳水化合物:20.3％；脂肪:61.6％，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購自美國New Brunswick公司，貨號D12450B)：熱量百分比：蛋白質(zhì):18.3％；碳水化合物:71.5％；脂肪:10.2％，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。

動物飼養(yǎng)及環(huán)境條件：所有的實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學SPF級動物房(許可證號：SYXK(鄂)：2009-0053)。每12小時交替照明，溫度24±2℃，濕度40％-70％，小鼠自由飲水進食。

【實施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)獲得

(1)實驗動物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和USP4-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即WT NC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個組別。

(2)模型通過高脂飼料誘導操作流程：

采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，進行表型相關分析，明確USP4基因?qū)χ靖?、Ⅱ型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和USP4-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即WT NC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個組別。每周均詳細記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔2周檢測1次。實驗第10周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對葡萄糖耐受能力，第12周采血，分離血清，于-80℃冰箱中保存，用于測定血清胰島素水平，同時終末取材，稱重，并測定肝臟脂質(zhì)含量。

【實施例2】小鼠體重、血糖水平、血清胰島素水平測定

(1)小鼠空腹體重檢測

1)體重檢測。

①禁食：上午8:00將待實驗小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實驗操作。

②稱重：分別在第0周、2周、4周、8周、10周、12周稱重，將一塑料小桶放在動態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數(shù)據(jù)。飼料量檢測：待稱體重操作完成后，給小鼠加飼料，并在動態(tài)電子天平上記錄小鼠的飼料量。

(2)空腹血糖水平檢測實驗

將所有待實驗的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時后開始實驗操作。

①血糖儀準備：檢查血糖儀(美國強生公司，ONETOUCH)電池，按右側(cè)開關，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進入待測狀態(tài)。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對折，用拇指和食指捏住毛巾對折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計時5秒顯示讀數(shù)。

(3)血清胰島素水平檢測

①試劑及耗材準備：

樣品(冰凍血清)，去離子水一瓶(1000mL)，小鼠胰島素ELISA試劑盒(Millipore，貨號EZRMI-13K)含胰島素ELISA酶標板(1塊，儲存于2-8℃)、酶標板封口膜(1片)、10×HRP洗脫緩沖液(2瓶，每瓶50mL,使用前使用去離子水稀釋10倍)、胰島素標準品(濃度為：0.2，0.5，1，2，5，10ng/mL，每種量為0.25mL)、胰島素質(zhì)量對照buffer(0.25mL)、基質(zhì)溶液(0.5mL)、分析緩沖液(20mL)、胰島素檢測抗體(10mL)、酶溶液(12mL)、底物(12mL)、終止溶液(12mL)。

②實驗步驟：A.確認溫箱開啟，熟悉酶標儀操作，將待檢測的血清標本從-80℃冰箱中找出；

B.將待檢測的血清在室溫下復融至液態(tài)，準備檢測；

C.稀釋10×HRP洗脫緩沖液，每瓶用450mL去離子水稀釋；

D.將取下來的酶標板條安裝到一個空的酶標板架上300μL TBS洗脫緩沖液洗滌3次。洗滌完畢將酶標板倒扣在吸水紙上，輕輕拍幾次，將殘液吸凈(注意：在進行下一步之前避免酶標板干燥，將未使用的酶標板條密封在裝酶標板的袋子里，2-8℃保存)；

E.將10μL分析緩沖液加入非特異性孔(NSB)和所有的樣品孔；

F.在NSB孔，標準孔和對照孔加入10μL基質(zhì)溶液；

G.在預設的標準孔里加入10μL胰島素標準品；

H.在預設的質(zhì)量對照孔里加入胰島素質(zhì)量對照buffer1和2各10μL；

I.在每個樣品孔里加入10μL樣品；

J.每孔中加入80μL胰島素檢測抗體(以上所有加樣步驟在1個小時之內(nèi)完成，室溫孵育2小時，在此期間將酶標板至于酶標板振蕩器上，調(diào)整轉(zhuǎn)速為400-500rpm震蕩)；

K.取下封口膜，棄去液體，在吸水紙上輕輕拍打，吸凈殘液；

L.使用洗脫緩沖液洗板3次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液；

M.每孔加入酶溶液100μL，封口膜封口后，室溫下酶標板振蕩器震蕩30分鐘，取下封口膜，棄去溶液，拍打吸干；

N.使用洗脫緩沖液洗板6次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液加入100μL底物溶液，酶標板震蕩器上震蕩15分鐘左右。此時可以看到標準孔出現(xiàn)深淺漸變的藍色。(注意：在這一步，藍色的出現(xiàn)和進展可能明顯快于15分鐘，也可能明顯慢于15分鐘，取決于室溫溫度。請通過視覺來判斷孵育的時間?；蛘呤褂妹笜藘x370nm波長檢測，讀數(shù)在1.2到1.8之間，則為合適的孵育時間)

O.加入100μL終止溶液，震蕩酶標板確保充分的混勻，此時藍色變?yōu)辄S色。5分鐘內(nèi)在450nm和590nm處分別讀取吸光值。根據(jù)測定的標準曲線，通過吸光值換算出濃度。

Ⅱ型糖尿病損傷嚴重程度的評估指標主要包括體重、血糖及血清胰島素水平等，變化結(jié)果如圖1所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第2周開始體重明顯高于其NC飼料組，給與USP4-KO小鼠12周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第2周開始HFD組的USP4-KO小鼠體重明顯高于HFD組的WT小鼠體重，一直持續(xù)到第12周(見圖1A)；經(jīng)空腹血糖檢測發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第2周、4周、6周、8周、10周、12周的空腹血糖水平明顯較相應NC對照組升高，HFD組的USP4-KO小鼠空腹血糖水平也明顯高于WT組小鼠空腹血糖水平(見圖1B)，血清胰島素水平檢測結(jié)果表明，HFD組小鼠在第12周，血清胰島素水平顯著高于相應NC組，且HFD組的KO小鼠血清胰島素水平也顯著高于WT組小鼠(圖1C)。表明USP4基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，USP4基因能顯著提高小鼠的糖代謝能力，USP4基因可顯著抑制高脂誘導的Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。

【實施例3】葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

實驗第10周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對糖耐受能力。

(1)在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計算葡萄糖的注射體積。

(2)先檢測葡糖糖注射前即0分鐘時空腹血糖，在檢測完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進針定位及注射：從腹部一側(cè)進針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進針，回抽，注射時針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側(cè)進入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。

(4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時間點剪尾測小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測時間。

進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)來評估各組小鼠對葡萄糖的處理能力，在實驗第10周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和USP4-KO小鼠血糖水平在15分鐘時間點劇增達到峰值，隨著時間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平(0分鐘時血糖)，在2小時時恢復至空腹血糖水平，且USP4-KO小鼠血糖水平從0分鐘至2小時一直處于高于WT小鼠的血糖水平(圖2A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，發(fā)現(xiàn)WT小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，USP4-KO HFD組的AUC顯著大于WT HFD組的AUC(圖2B)，表明USP4可維持糖代謝的穩(wěn)態(tài)。

【實施例4】肝臟大體外觀及肝臟組織脂質(zhì)成分測定

(1)終末肝臟組織取材

①小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。

②用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。

③迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速稱重。

(2)小鼠肝組織脂質(zhì)檢測

①從-80℃冰箱取出肝臟組織樣品，稱量50mg組織，使用研磨器將肝臟組織研磨成粉末狀，溶于1mLPBS中，混勻后再與1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育過夜。

②以12000g高速離心15min后，收集管底脂質(zhì)層物質(zhì)，風干，以去除水分。

③將分離出的脂質(zhì)層物質(zhì)溶于200μL含1％Triton X-100的PBS溶液中，仔細吹吸混勻。

④開啟電腦labman軟件，打印機，再開啟生化分析儀；

⑤選擇并清洗檢測探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無雜質(zhì)附著，吸光值在設定的參考范圍；

⑥在labman軟件上檢查所需檢測指標試劑是否足夠，設定檢測指標和檢測順序等。

⑦將制得的混勻液上機檢測，分析。

HFD組的USP4-KO小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的WT小鼠高(如圖3A、B)。而如圖4A-C所示，從肝臟脂質(zhì)成分的結(jié)果所示，HFD組的USP4-KO小鼠均較HFD組的WT小鼠高，這些結(jié)果說明USP4基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。

上述結(jié)果顯示USP4-KO小鼠在HFD的誘導下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著加重。這些結(jié)果表明USP4基因?qū)Ω纳脾蛐吞悄虿『椭靖尉哂酗@著的作用。本發(fā)明結(jié)果說明USP4基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的保護作用。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學

<120> 泛素特異性蛋白酶4在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> oligo1

<400> 1

taggggtatc ttattgacag ccgg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> oligo2

<400> 2

aaacccggct gtcaataaga tacc 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 擴增含有T7啟動子及引導序列的DNA片段的上游引物

<400> 3

gatccctaat acgactcact atag 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴增含有T7啟動子及引導序列的DNA片段的下游引物

<400> 4

aaaaaaagca ccgactcggt 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> USP4-F

<400> 5

cccccaaacg tgattttgtg a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> USP4-R

<400> 6

gtagagatac acgcagcccc 20