一種具有nedd8激活酶抑制活性的化合物、其制備方法及醫(yī)藥用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及一種具有式I結(jié)構(gòu)的化合物、其立體異構(gòu)體、或其藥學(xué)上可接受的鹽及其制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該類(lèi)化合物可以抑制NEDD8激活酶的活性，并且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，因此可作為NEDD8激活酶抑制劑用于制備抗腫瘤藥物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種具有NEDD8激活酶抑制活性的化合物、其制備方法及醫(yī)藥 用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及一種具有NEDD8激活酶抑制活性的化合物、其立體 異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽以及其制備方法和醫(yī)藥用途，特別是作為NEDD8激活酶抑制 劑的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者，生命過(guò)程中幾乎所有的環(huán)節(jié)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。 蛋白質(zhì)的合成和降解的平衡對(duì)于維持細(xì)胞正常生理功能起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞內(nèi)蛋白 質(zhì)平衡的破壞將會(huì)阻礙細(xì)胞的正常凋亡，誘導(dǎo)其無(wú)限增殖，從而誘發(fā)癌癥(Natur e，2003， 426:905-909;Science，2008,319:916-919)。在真核細(xì)胞中，泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是調(diào) 控蛋白質(zhì)降解的主要通路，80%的"廢棄"蛋白由其介導(dǎo)降解，從而調(diào)解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)平 衡。UPS調(diào)控的蛋白涉及細(xì)胞周期、基因表達(dá)、抗原提呈以及細(xì)胞信號(hào)通路中的抑制因子與 激活因子，因此，UPS在細(xì)胞分化、細(xì)胞繁殖、細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝調(diào)控、免疫 監(jiān)視等基本細(xì)胞生命過(guò)程中起關(guān)鍵作用，其功能的異常與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，因 此對(duì)UPS的調(diào)控已成為癌癥治療中一種重要的方法。
[0003] 在UPS中，泛素分子在ATP的參與下被泛素激活酶(E1)激活，隨后激活的泛素分子 通過(guò)轉(zhuǎn)硫醇作用轉(zhuǎn)移至泛素結(jié)合酶(E2)，最后在泛素連接酶(E3)的作用下泛素分子被標(biāo)記 到特異性底物蛋白的賴(lài)氨酸殘基上，這一過(guò)程被稱(chēng)為泛素化。泛素化的底物蛋白會(huì)繼續(xù)參 與泛素化過(guò)程，進(jìn)而形成多泛素化的蛋白，最終被蛋白酶體降解。其中，泛素連接酶E3具有 嚴(yán)格的底物特異性，在泛素化過(guò)程中起著重要的作用。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)UPS存在 多條與泛素化過(guò)程類(lèi)似的平行通路，即類(lèi)泛素通路。其中NEDD8通路由于對(duì)部分泛素連接酶 (E3)的活性具有特殊的調(diào)控作用，因此引起了人們廣泛的關(guān)注。與泛素化類(lèi)似，NEDD8首先 被NEDD8激活酶(ΝΑΕ)激活，隨之被轉(zhuǎn)移至NEDD8結(jié)合酶，最終在連接酶的作用下與靶蛋白結(jié) 合。在NEDD8標(biāo)記的眾多底物中，Cul 1 in-RING Ligases(CRLs)最為重要。CRLs是泛素連接酶 (E3)中最大的亞家族，它調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞蛋白在細(xì)胞內(nèi)的活性和含量，進(jìn)而控制細(xì)胞生長(zhǎng)、分 化以及凋亡等生理過(guò)程。而CRLs只有經(jīng)過(guò)Cul 1 in-NEDD化才具有催化活性，從而催化各自底 物進(jìn)行泛素化，進(jìn)而維持底物蛋白的平衡。由此可見(jiàn)，NEDD8通路在CRLs介導(dǎo)的蛋白質(zhì)泛素 化過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用(Annu Rev Biochem，2012,81:323-357;Nat Rev Mol Cell 81〇1，2015，16:30-44)。除〇1111丨118外，一些與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞調(diào)控蛋白也是呢008的底物， 如著名的癌蛋白MDM2和抑癌蛋白p53(Nat Rev Cancer，2011，11:629-643)〇
[0004] 多項(xiàng)研究表明，NEDD8激活酶過(guò)度表達(dá)與人類(lèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后不良密切相 關(guān)（J Natl Cancer Inst，2014，106:dju083;J Clin Invest，2014，124:835-846;J Pathol，2007，213:303-310 ;Mol Cell Biochem，2007,306:163-169)，因此NEDD8激活酶已 成為近年來(lái)抗腫瘤藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。
[0005] MLN4924是由Millennium公司研發(fā)的NEDD8激活酶小分子抑制劑，它可以通過(guò)特殊 的底物協(xié)同機(jī)制抑制NEDD8激活酶的活性，從而達(dá)到調(diào)控整個(gè)NEDD8通路的目的。MLN4924目 前正在開(kāi)展治療急性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓癌、淋巴瘤、黑色素瘤 以及其它實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)研究。然而，目前已報(bào)道的NEDD8激活酶抑制劑種類(lèi)和數(shù)量很少 且結(jié)構(gòu)單一，因此開(kāi)展新型NEDD8激活酶抑制劑研發(fā)具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及一種具有式I所示化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽及其 制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該類(lèi)化合物可以抑制NEDD8激活酶 的活性，并且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。
[0007] 本發(fā)明公開(kāi)通式I所示的化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽：
[0009]其中：
[0010] η代表1~8的整數(shù)；
[0011] Ri代表氨基或乙酰胺基；
[0012] R2 代表：
[0014] 其中：
[0015] X 代表 S、N或 0;
[0016] Y 代表 ΝΗ、0或 S;
[0017] R3代表氫、鹵素、羥基、硝基、三氟甲基、氰基、&-C8烷基、&-C8烷氧基、C3_C 6環(huán)烷基 或 NR4R5;
[0018] R4和抱可相同或不相同，任選自：氫Xi-Cs烷基或1?4和他與和它們相連的氮一起形 成5-7元雜環(huán)基，其中所述的雜環(huán)基可任選地包含一個(gè)或多個(gè)選自0、S或N的其它雜原子，并 且該雜環(huán)基可任選地由下述相同或不同的取代基單取代至五取代，所述取代基包括：鹵素、 羥基、硝基、氰基、氨基、&-C8烷基或&-C8烷氧基；
[0019] 其中，下式化合物(LZ3)除外：
[0021] 進(jìn)一步地，具有通式I所述的化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特 征在于：
[0022] η代表1~6的整數(shù)；
[0023]辦代表氨基或乙酰胺基；
[0024] R2 代表：
[0026] X 代表 S、N或 0;
[0027] Y 代表 ΝΗ、0或 S;
[0028] R3代表氫、鹵素、羥基、氰基Xi-Cs烷基、&-C8烷氧基或C3_C 6環(huán)烷基。
[0029] 更進(jìn)一步地，具有通式I所述的化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽，其 特征在于：
[0030] η代表1~6的整數(shù)；
[0031]辦代表氨基或乙酰胺基；
[0032] R2 代表：
[0034] X代表 S或 N;
[0035] Y 代表 ΝΗ、0或 S;
[0036] R3代表氫、鹵素或&_(：8烷氧基。
[0037]具體來(lái)說(shuō)，通式I所述的化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽，其立體異 構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選自下列化合物：
[0038] (Z)-3-[2-亞胺基-5-(2-甲氧基苯乙烯基)-4-羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；?基)丙酰胺(LW-1);
[0039] (Z)-3-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-5-氧代-2-硫代咪唑-1-基]-N-4-(氨磺?；?基)丙酰胺(LW-2);
[0040] (Z)-3-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,5_二氧代咪唑烷-1-基]-N-4-(氨磺酰基苯基） 丙酰胺(LW-3);
[0041 ] (Z)-2-[5-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交┮?酰胺(LW-4);
[0042] (Z)-2-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-5-氧代-2-硫代咪唑-1-基]-N-4-(氨磺?；?基）乙酰胺(LW-5);
[0043] (Z)-4-[5-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺酰基苯基)丁 酰胺(LW-6);
[0044] (Z)-4-[4_(2-甲氧基苯乙烯基)-5_氧代-2-硫代咪唑-1-基]-N-4_(氨磺?；?基)丁酰胺(LW-7);
[0045] (Z)-3-[5-(3-甲氧基苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4_(氨磺酰基苯基)丙 酰胺(LW-8);
[0046] (Z)-3-[5-(4-甲氧基苯乙烯基)-2,4-二羰基噻唑-3-基]-N-4_(氨磺酰基苯基)丙 酰胺(LW-9);
[0047] (Z)-3-[5-(2-氟苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交?丙酰胺 (LW-10)；
[0048] (Z)-3-[5-(2-氯苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交?丙酰胺 (LW-11)；
[0049] (Z)-N-[4-(乙?；酋；?苯基]-3-[5-(2-溴苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]丙 酰胺(LW-12);
[0050] (Z)-3-[5-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-3-(氨磺酰基苯基)丙 酰胺(LW-13);
[0051] (Z)-3-(5-苯乙烯基-2,4-二羰基噻唑-3-基)-N-4-(氨磺?；交┍０?LW-l4);
[0052] 3-(2,3_二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺?；交?丙酰胺(LW-15);
[0053] 3-(5-氟-2,3-二氧吲哚-丨基)-^*-氨磺?；交?丙酰胺(LW-16);
[0054] 3-(5-氯-2,3-二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺?；交?丙酰胺(LW-17);
[0055] 3-(5-溴-2,3-二氧吲哚-1基)-N_(4-氨磺酰基苯基)丙酰胺(LW-18);
[0056] 3-(5-甲氧基-2,3-二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺?；交?丙酰胺(LW-19);
[0057]下面藥理實(shí)驗(yàn)中涉及的化合物代號(hào)等同于此處代號(hào)所對(duì)應(yīng)的化合物。
[0058]本發(fā)明的另一目的在于提供通式I所示化合物的制備方法，其特征在于：
[0059]
，通式I所示化合物的制備方法為:?取代的磺?；桨放c 氯烷基酰氯反應(yīng)生成中間體2，R3取代的苯甲醛與五元雜環(huán)酮反應(yīng)制得中間體3,2與3縮合 反應(yīng)制得通式I所示的化合物，其合成路線如下：
[0061 ]其中，RdPR2的定義如權(quán)利要求1所述。
[0062]
，通式I所示化合物的制備方法為：由中間體2與R3取代的靛 紅反應(yīng)制得通式I所示的化合物，其合成路線如下：
[0064]其中，RjPR2的定義如權(quán)利要求1所述。
[0065] 本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供一種藥物組合物，其由治療上有效量的權(quán)利要求Ια 中任一項(xiàng)所述的化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或 輔料組成。
[0066] 本發(fā)明的再一目的是提供具有通式I和II的化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可 接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中所述的腫瘤為結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤 或多發(fā)性骨髓瘤。
【具體實(shí)施方式】
[0067] 為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例，這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0068] 實(shí)施例1
[0069] 2-亞胺-4-噻唑酮(2a)的制備
[0071] 將硫脲（1 · 52g，0 · 02mo 1)加至10mL95 %乙醇中，攪拌回流lOmin，慢慢滴加氯乙酸 乙酯（2.16mL，0.02mo 1)，滴畢回流3h，冷卻至室溫，抽濾，少量乙醇洗滌，干燥得白色固體 2.518，產(chǎn)率92%，1^ 255-257。(：。1!1-匪1?(3001!^，015〇-(16)3(??111) :11.88(8，1!〇,9.87(8， lH)，3.84(s，2H).
[0072] (Z) -2-亞胺基-5-( 2-甲氧基苯乙烯基)噻唑烷-4-酮(2b)的制備
[0074] 將2a(0· 5g，4· 31mmol)和鄰甲氧基苯甲酸(0 · 586g，4· 31mmol)溶于20mL醋酸中，加 入無(wú)水醋酸鈉(40mg，0.48mmol)，回流6h，冷卻，將反應(yīng)液倒入100mL水中，析出黃色固體，抽 濾，醋酸重結(jié)晶，干燥得黃色固體0.85g，產(chǎn)率84 %，mp 260-262 °C。MMR(300MHz，DMS0-d6)J(ppm):12.58(s，1H)，9.87(s，1H)，7.98(s，1H)，7.53-7.36(m，2H)，7.20-7.04(m，2H)， 3.89(s,3H).
[0075] 4-N_( 3-氯丙酰基)-苯磺酰胺(3)的制備
[0077] 將對(duì)氨基苯磺酰胺（lg，5.8lmmol)加入20mL無(wú)水THF中，攪拌溶解，加入N-甲基嗎 啉（1.28mL，11.6lmmol)，冰浴下逐滴加入3-氯丙酰氯（1.1 lmL，11.6lmmol)，加畢，室溫反應(yīng) 4h，過(guò)濾，濾液旋干，乙醇重結(jié)晶，干燥得白色固體1.35g，產(chǎn)率88 %，mp 228-230 °C。h-NMR (300MHz，DMS〇-d6)J(ppm): 10.05(s，lH)，7.76(d，J = 2.0Hz，4H)，7.27(s，2H)，3.89(t，J = 6.2Hz，2H)，2.87(t，J = 6.2Hz，2H).
[0078] (Z)-3-[2-亞胺基-5-(2-甲氧基苯乙烯基)-4-羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；?基)丙酰胺(LW-1)的制備
[0080]將3 (0 · 2g，0 · 76mmo 1)和2b (0 · 178g，0 · 76mmo 1)加入20mL DMF中攪拌溶解，加入氫 氧化鈉(0.0618，1.53臟〇1)，加熱至120°(：反應(yīng)1211，將反應(yīng)液倒入1001^水中，稀鹽酸調(diào)節(jié)?!1 至3,乙酸乙酯萃取，無(wú)水MgS〇4干燥，過(guò)濾，旋干，柱層析[E:P = 4:1]得黃色固體0.12g，產(chǎn)率 34.3 % ,mp 274-276 °C 〇ESI-MS :459.1 [M-H]- ； ^-NMRC 300MHz, DMSO-de) ： δ (ppm) ： 10.47 (s, lH)，9.15(s，lH)，7.76(d，J = 2.0Hz，4H)，7.53(d，J = 7.8Hz，lH)，7.36(m，2H)，7.28(s，2H)， 7.20-7.04(m，2H)，6.76(s，lH)，3.83(s，3H)，3.74(t，J = 6.1Hz，2H)，2.55(t，J = 6.1Hz， 2H).
[0081 ] 實(shí)施例2
[0082] 1 -乙酰基硫代乙內(nèi)酰脲(5a)的制備
[0084] 將甘氨酸（1 · 28g，llmmol)和硫氰酸按（0 · 76g，lOmmol)溶于15mL乙酸酐中，加入 lmL冰醋酸，緩慢加熱至100°C，攪拌40min，冷卻，倒入100mL冰水中，析出黃色固體，水洗，乙 醇重結(jié)晶，干燥得淡黃色固體1.2g，產(chǎn)率76%，mp ne-nSOc/H-NMRUOOMHzJMSO-c^J (ppm):12.01(s，lH)，4.1(s，2H)，1.9(s，3H).
[0085]硫代乙內(nèi)酰脲(5b)的制備
[0087] 將5a( lg，6.3mmol)加入20mL濃鹽酸中，回流攪拌lh，濃縮，冷卻，析出固體，抽濾， 水洗，乙醇重結(jié)晶，干燥得淡黃色固體〇.65g，產(chǎn)率88.5%，mp 224-2271:,11-^^(30010^, DMS0-d6)j(ppm):11.66(s，lH)，9.87(s，lH)，4.08(s，lH).
[0088] (Z)-2-亞胺基-5-(2-甲氧基苯乙烯基)-2硫代咪唑烷-4-酮(5c)的制備
[0090] 參照2b的制備方法，由5b和鄰甲氧基苯甲醛反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率81%，111?205- 208°C</H-NMR(300MHz，DMS0-d6) :δ(ρρπι) :12.01 (s，lH)，10.47(s，lH)，8.01(s，1Η)，7·53-7·36(m，2H)，7·20-7·04(m，2H)，3·89(s，3H)·
[0091] (Z)-3-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-5-氧代-2-硫代咪唑-1-基]-N-4-(氨磺?；?基)丙酰胺(LW-2)的制備
[0093] 參照LW-1的制備方法，由5c和3反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率38%，1^ 267-269°(：(^31-MS：459.2[M-H]_；1H-NMR(300MHz,DMS0-d6)：5(ppm)：12.01(saH)a0.47(saH),8.01(s, 1H)，7.76(d，J=2.0Hz，4H)，7.53-7·36(m，2H)，7.28(s，2H)，7·20-7.04(m，2H)，3.83(s， 3H)，3.79(t，J = 6.2Hz，2H)，2.57(t，J = 6.2Hz，2H).
[0094] 實(shí)施例3
[0095] 乙內(nèi)酰脲(6a)的制備
[0097]將氯乙酸（1 · 25g，13 · lmmol)溶于10mL水中，再加入5a( 1.8g，11.4mmol)，回流2h， 濃縮成粘稠狀液體，加入2mL乙醇，析出固體，抽濾，干燥得白色固體0.98g，產(chǎn)率86 %，mp 215-217tC<31H-MMR(300MHz，DMS0-d6) :S(ppm):12.01(s，lH)，10.47(s，lH)，3.87(s，2H)· (Z)-5-(2-甲氧基苯乙烯基)-噻唑烷-2，4-二酮(6b)的制備
[0099] 參照2b的制備方法，由6a和鄰甲氧基苯甲醛反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率79%，111?155-157°C</H-NMR(300MHz，DMS0-d6) :δ(ρρπι) :12.01 (s，lH)，10.47(s，lH)，8.01(s，1Η)，7·53-7·36(m，2H)，7·20-7·04(m，2H)，3·83(s，3H)·
[0100] (Z)-3-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,5-二氧代咪唑烷-1-基]-N-4-(氨磺?；交?丙酰胺(LW-3)的制備
[0102] 參照LW-1的制備方法，由6b和3反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率39%，1^ 258-260°(：(^31-MS：443.2[M-H]_；1H-NMR(300MHz,DMS0-d6)：5(ppm)：11.21(saH)a0.40(saH),7.92(s, lH)，7.75(t，J = 2.1Hz，lH)，7.58(s，lH)，7.51-7.39(m，2H)，7.33(t，J = 7.9Hz，lH)，7.25 (s，1H)，7.10-6.93(m，2H)，6.89(s，2H)，3.84(t，J = 6.1Hz，2H)，2.58(t，J = 6.1Hz，2H).
[0103] 實(shí)施例4
[0104] 4-N-(2-氯丙?；?-苯磺酰胺(4)的制備
[0106] 參照3的制備方法，由對(duì)氨基苯磺酰胺和2-氯乙酰氯反應(yīng)得白色固體，產(chǎn)率80%， Γηρ217-21%~</Η-匪 R(300MHz，DMS0-d6):S(ppm):10.70(s，lH)，7.88-7.63(m，J = 2.8Hz， 4H)，7.37-7.16(m，2H)，4.30(s，2H).
[0107] 2,4_噻唑二酮(4a)的制備
[0109] 將2&(18,8.62臟〇1)加入151^20%的稀鹽酸中，回流1011，濃縮，冷卻，析出白色固 體，抽濾，水洗，70 %的乙醇重結(jié)晶，干燥得白色針狀結(jié)晶0.78g，產(chǎn)率77.2 %，mp 125-128 〇C〇1H-NMR(300MHz,DMS0-d6)：5(ppm)：12.11(saH),4.1(s,2H).
[0110] (Z)-5-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,4_噻唑烷二酮(4b)的制備
[0112] 參照2b的制備方法，由4a和鄰甲氧基苯甲醛反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率81%，mp 235-237Γ ,Η-匪R(300MHz，DMS0-d6):S(ppm) :12.58(s，lH)，7.98(s，1Η)，7 ·53-7·36(ι?，2H)， 7.20-7.04(m，2H)，3.89(s，3H).
[0113] (Z)-2-[5-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,4-二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交┮?酰胺(LW-4)的制備
[0115] 將4b(0.2g，0.76mmol)和3(0.18g，0.76mmol)溶于 10mL THF溶液中，攪拌下加 DIPEA(0.2mL，1.52mmol)，加熱至40°C，反應(yīng)6h，旋干，乙醇重結(jié)晶，干燥得黃色固體0.14g， 產(chǎn)率40 %，mp 268-27(TC iSI-MS: 448 · 1 [M+H] +;咕-匪R( 300MHz，DMS〇-d6): δ (ppm): 10 · 47 (s，1H)，7·98(s，1H)，7.76(d，J=2.0Hz，4H)，7.53-7.36(m，2H)，7.27(s，2H)，7.20-7.04(m， 2H)，3.89(s，3H)，3.76(t，J = 6.2Hz，2H)，2.87(t，J = 6.2Hz，2H).
[0116] 實(shí)施例5
[0117] (Z)-2-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-5-氧代-2-硫代咪唑-1-基]-N-4-(氨磺?；?基)乙酰胺(LW-5)的制備
[0119] 參照LW-1的制備方法，由4和5c反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率39.5%，1^ 254-256°(：(^31-MS：446.1[M-H]_；1H-NMR(300MHz,DMS0-d6)：5(ppm)：12.01(saH)a0.47(saH),8.01(s, 1H)，7 · 76(d，J = 2 · 0Hz，4H)，7 · 53-7 · 36(m，2H)，7.28(s，2H)，7 ·20-7·04(ι?，2H)，4.52(s， 2H)，3.83(s，3H).
[0120] 實(shí)施例6
[0121] 4-N_(4-氯丁?；?_苯磺酰胺(5)的制備
[0123] 參照3的制備方法，由對(duì)氨基苯磺酰胺和4-氯丁酰氯反應(yīng)得白色固體，產(chǎn)率79%， mp245-247 °C。七-匪以300MHz，DMS〇-d6): δ (ppm): 10 · 30(s，1H)，7 · 67-7 · 83 (m，4H)，7 · 2(s， lH)，3.78(t，J = 7.2Hz，2H)，2.45(t，J = 7.2Hz，2H)，2.0(m，2H).
[0124] (Z)-4-[5-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,4-二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交?丁 酰胺(LW-6)的制備
[0126] 參照LW-4的制備方法，由5和4b反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率39.5%，1^ 258-261°(：(^31-MS: 474 · 3 [M-H] -;七-匪以 300MHz，DMS〇-d6): δ (ppm): 10 · 30 (s，1H)，8 · 05 (s，1H)，7 · 67-7 · 83 (m，4H)，7.55(t，J = 8.2Hz，lH)，7.45(d，J = 8.2Hz，lH)，7.(U-7.21(m，2H)，3.92(s，3H)， 3.78(t，J = 7.2Hz，2H)，2.45(t，J = 7.2Hz，2H)，2.0(m，2H).
[0127] 實(shí)施例7
[0128] (Z)-4-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-5-氧代-2-硫代咪唑-1-基]-N-4-(氨磺?；?基)丁酰胺(LW-7)的制備
[0130] 參照LW-1的制備方法，由5和5c反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率42%，mp 274-276°(：<^31-MS:474.2[M-H]-JH-匪 R(300MHz，DMS0-d6):S(ppm):12.01(s，lH)，10.33(s，lH)，7.95(s， 1H)，7.67-7.83(m，4H)，7.55(t，J = 8.2Hz，lH)，7.45(d，J = 8.2Hz，lH)，7.01-7.21(m，2H)， 3.92(s，3H)，3.75(t，J = 7.2Hz，2H)，2.42(t，J = 7.2Hz，2H)，2.0(m，2H).
[0131] 實(shí)施例8
[0132] (Z)-5_(3-甲氧基苯乙烯基)-2,4_噻唑烷二酮(7a)的制備
[0134] 參照2b的制備方法，由3-甲氧基苯甲醛和4a反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率79%，mp 165-167tC<31H-Mffi(300MHz，DMS0-d 6):S(ppm):12.64(s，lH)，7.76(d，J = 2.1Hz，lH)，7.44 (td，J = 8.2,2.1Hz，lH)，7.15(dt，J = 4.2，1.9Hz，2H)，7.09-6.97(m，lH)，3.80(s，3H).
[0135] (Z)-3-[5-(3-甲氧基苯乙烯基)-2,4-二羰基噻唑-3-基]-N-4_(氨磺?；交?丙 酰胺(LW-8)的制備
[0137] 參照LW-4的制備方法，由3和7a反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率45%，1^ 243-245°(：(^31-MS:459.2[M-H] -JH-匪 R(300MHz，DMS0-d6):S(ppm):10.41(s，lH)，7.93(s，lH)，7.70(s， 4H)，7.45(d，J = 8.1Ηz，1Η)，7.27(s，2H)，7.15(d，J=10.3Hz，2H)，7.09(s，lH)，3.98(s， 2H)，3.77(s，3H)，2.76(s，2H).
[0138] 實(shí)施例9
[0139] (Z)-5_(4-甲氧基苯乙烯基)-2,4_噻唑烷二酮(7b)的制備
[0141] 參照2b的制備方法，由4-甲氧基苯甲醛和4a反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率82%，mp 240-242tC<31H-Mffi(300MHz，DMS0-d 6):S(ppm):12.53(s，lH)，7.75(d，J = 3.2Hz，lH)，7.56 (dd，J = 9.2,2.9Hz，2H)，7.10(dq，J = 8.5,2.3，1.4Hz，2H)，3.82(d，J = 2.0Hz，3H).
[0142] (Z)-3-[5-(4-甲氧基苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交?丙 酰胺(LW-9)的制備
[0144] 參照LW-4的制備方法，由3和7b反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率43%，1^ 247-249°(：』31- MS:459.2[M-H] -JH-匪 R(300MHz，DMS0-d6):S(ppm):10.41(s，lH)，7.89(s，lH)，7.71(s， 4H)，7.63-7.47(m，2H)，7.25(s，2H)，7.17-7.01(m，2H)，3.95(s，2H)，3.82(s，3H)，2.71(s， 2H).
[0145] 實(shí)施例10
[0146] (Z)-5_(2-氟苯乙烯基)-2,4_噻唑烷二酮(8a)的制備
[0148] 參照2b的制備方法，由2-氟苯甲醛和4a反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率78%，mp210-211 °C</H-NMR(300MHz，DMS0-d6)J(ppn) :12.40(s，lH)，7.98(s，lH)，7.53-7.36(m，2H)，7.20-7.04(m，2H).
[0149] (Z)-3-[5-(2-氟苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺酰基苯基)丙酰胺 (LW-10)的制備
[0151] 參照LW-4的制備方法，由3和8a反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率47%，1^ 263-265°(：(^31-MS:448.2[M-H] -;1H-NMR(300MHz，DMS0-d6)J(ppm) :10.41(s，lH)，7.92(s，lH)，7.72(q，J = 8.9,8.5Hz，4H)，7.59(t，J = 7.4Hz，2H)，7.40(t，J = 8.2Hz，2H)，7.25(s，2H)，3.97(t，J = 7.0Hz，2H)，2.74(t，J = 7.0Hz，2H).
[0152] 實(shí)施例11
[0153] (Z) -5- (2-氯苯乙烯基)-2，4-噻唑烷二酮(9a)的制備
[0155] 參照2b的制備方法，由2-氯苯甲醛和4a反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率78%，mp 220-221 Γ ,Η-匪R(300MHz，DMS0-d6):δ(ρρπ〇 :12.77(s，lH)，7.92(s，lH)，7·68-7·62(ι?，1H)，7.60-7.55(m，lH)，7.51(dt，J = 5.9,2.2Hz，2H).
[0156] (Z)-3-[5-(2-氯苯乙烯基)-2,4-二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交?丙酰胺 (LW-11)的制備
[0158] 參照LW-4的制備方法，由3和9a反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率48%，1^ 268-270°(：(^31- MS:464.1[M-H] -;咕-匪1?(3001抱，015〇-(16):3(??111):1〇.41(8，1!〇,7.98((1，了 = 2.9抱，1!〇， 7.78-7.49(m，8H)，7.24(s，2H)，3.97(t，J = 7.3Hz，2H)，2.74(t，J = 7.3Hz，2H).
[0159] 實(shí)施例12
[0160] N_[ (4-乙酰氨基苯基)磺?；鵠乙酰胺（10a)的制備
[0162] 將磺胺（2.1 g，12.2mmo 1)加入20mL醋酸酐中溶解，回流8h，冷卻，倒入40mL冰水中， 析出大量白色固體，抽濾，水洗，異丙醇重結(jié)晶，干燥得白色固體2.2g，產(chǎn)率70 %，mp253-255 Γ</Η-ΜΚ(300ΜΗζ，0Μ50-(?6):δ(ρρπι):11·99(8，1Η)，10·40(8，1Η)，7·80(α，Ι = 9·0Ηζ，4Η)， 2.09(s，3H)，1.90(s，3H).
[0163] N-(4_乙酰氨基苯基）乙酰胺（10b)的制備
[0165] 將1(^(]^，4.7_31)加入2〇11^1.1251]1〇1/1的氫氧化鈉溶液中，回流反應(yīng)211，冷卻， 用4N鹽酸溶液調(diào)pH至8，抽濾，再繼續(xù)使用4N鹽酸溶液調(diào)pH至4，在冰箱中冷卻24h，析出大量 白色固體，熱水重結(jié)晶，干燥得白色固體0.25g，產(chǎn)率30%，mp 183-184°C。七-匪以300MHz， DMS0-d6)J(ppm):11.99(s，lH)，10.40(s，lH)，7.80(q，J = 9.0Hz，4H)，6.09(s，2H)，1.9(s， 2H).
[0166] N_[ 4-(N_乙酰磺?；?苯基]-3-氯丙酰胺(10c)的制備
[0168] 在20mL水中加入碳酸鉀（2·5g，18mmol)攪拌溶解，加入10b(2·3g，10·74mmol)，攪 拌均勻，冰浴下滴加3-氯丙酰氯（1.23mL，12.89mmol)，加畢室溫反應(yīng)2h，抽濾，干燥得產(chǎn)物 1.8 8，產(chǎn)率92.3%。1^ 234-236。(：。1!1-匪1?(3001抱，0150-(16)3(??11) :10.10(8，1!1)，7.65-7.56(m，2H)，7.34-7.26(m，2H)，7.05(td，J = 7.3，1.3Hz，lH)，3.88(t，J = 6.2Hz，2H)，2.82 (t，J = 6.3Hz，2H).
[0169] (Z)-N-[4-(乙?；酋；?苯基]-3-[5-(2-溴苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]丙 酰胺(LW-12)的制備
[0171] 參照LW-4的制備方法，由10c和4b反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率48 %，mp 289-291°C。 ESI-MS: 502 · 1 [M-H] -;七-匪以 300MHz，DMS〇-d6): δ (ppm): 11 · 47 (s，1H)，7 · 98 (s，1H)，7 · 76 (d，J=2.0Hz，4H)，7.53-7.36(m，2H)，7.27(s，2H)，7.20-7.04(m，2H)，3.89(s，3H)，3.76(t， J = 6.2Hz，2H)，2.87(dd，J = 7.3,5.3Hz，2H)，1.96(s，2H).
[0172] 實(shí)施例13
[0173] 3-氯-N_(3-氨磺?；交?丙胺(11)的制備
[0175] 參照中間體3的制備方法，由間氨基苯磺酰胺和3-氯丙酰氯反應(yīng)得白色固體，產(chǎn)率 87%,mp 228-230〇C〇1H-NMR(300MHz,DMS0-d6)：5(ppm)：10.39(saH),8.27-8.13(maH), 7.74(tt，J = 6.1，3.1Hz，lH)，7.58-7.47(m，2H)，7.38(s，2H)，3.90(t，J = 6.2Hz，2H)，2.86 (t，J = 6.2Hz，2H). ·
[0176] (Z)-3-[5-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-3_(氨磺?；交?丙 酰胺(LW-13)的制備
[0178] 參照LW-4的合成方法，由11和4b反應(yīng)制得黃色固體，產(chǎn)率53 %，mp 245-247°C。 ESI-MS:459.2[M-H] -jH-NMRUOOMHz，DMS〇-d6):S(ppm) :10.39(s，lH)，8·27-8·13(ι?，1H)， 7.95(s，lH)，7.74(tt，J=6.1，3.1Hz，lH)，7.58-7.47(m，2H)，7.45-7.39(m，2H)，7.38(s， 2H)，7.20-7.04(m，2H)，3.90(t，J = 6.2Hz，2H)，2.86(t，J = 6.2Hz，2H).
[0179] 實(shí)施例14
[0180] (Z)-5-苯乙烯基噻唑2,4-噻唑二酮（12)的制備
[0182] 參照2b的制備方法，由苯甲醛和4a反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率78%，mp248-250°C。 4-匪1?(3001抱，015〇-(16):3(??111):12.62(8,2!〇,7.98(8，1!〇,7.74-7.24(111，5!〇·
[0183] (Z)-3-(5-苯乙烯基-2,4-二羰基噻唑-3-基)-N-4-(氨磺?；交┍０罚↙W-l4)的制備
[0185] 參照LW-4的制備方法，由12和3反應(yīng)得淡黃色固體，產(chǎn)率45%，111? 282-284°(：(^31-MS:430·2[M-H] -;七-匪以300MHz，DMS〇-d6):δ(ppm): 10·42(s，1H)，8·00-7.85(m，lH)，7.73 (qd，J = 7.9,7.2,3.7Hz，4H)，7.63(d，J = 6.1Hz，2H)，7.60-7.46(m，3H)，7.25(s，2H)，3.96 (d，J = 7.5Hz，2H)，2.73(t，J = 7.1Hz，2H).
[0186] 實(shí)施例15
[0187] 3-(2,3-二氧吲哚-1基)-N_(4-氨磺?；交?丙酰胺(LW-15)的制備
[0189] 將3 (0 · 2g，0 · 76mmo 1)和靛紅（0 · 15g，0 · 82mmo 1)加入 15mL DMF溶液中，加入K2⑶3 (0.2g，1.52mmol)，加熱至110°C反應(yīng)8h，加水50mL，旋干溶劑，柱層析純化[Cl2CH 2:Me0H=15 :1 ]得黃色固體0 · 21g，產(chǎn)率73 · 4%，mp 300-304°C iSI-MS: 372 · 2[M-H]-; iH-NMRUOOMHz， DMS〇-d6)J(ppm) :10.58: (s，lH)，7.88-7.68(m，4H)，7.57(d，J = 7.8Hz，lH)，7.38-7.24(m， 2H)，6.79(d，J = 8.4Hz，lH)，6.53(t，J = 7.5Hz，lH)，3.52(t，J = 6.5Hz，2H)，2.89(t，J = 4.1Hz,2H).
[0190] 實(shí)施例16
[0191] 3-(5-氟-2,3-二氧吲哚-氨磺?；交?丙酰胺( LW-16)的制備
[0193] 參照LW-15的制備方法，由5-氟靛紅和3反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率78%，mp 310-313 roESI-MSdgO.UM-HrjH-MffiUOOMHzJMSO-cUhSCppmhIO.SSCsaHhT.TSdJ: 8·2Ηζ，3Η)，7.59(s，2H)，7.43(s，lH)，7.26(s，2H)，6.84(d，J=5.5Hz，lH)，3.52(s，2H)， 2.75(s,2H).
[0194] 實(shí)施例17
[0195] 3-(5-氯-2,3-二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺酰基苯基)丙酰胺(LW-17)的制備
[0197] 參照LW-15的制備方法，由5-氯靛紅和3反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率62%，mp 317-319 CoESI-MSdOe.UM-HrjH-MffiUOOMHzJMSO-c^JbpnOilO.SSCsaHhT.TeCsdH)， 7.54(d，J = 2.6Hz，lH)，7.36(d，J = 9.3Hz，lH)，7.27(s，2H)，6.86(d，J = 9.1Hz，lH)，3.76 (s，2H)，2.70(t，J = 6.5Hz，2H).
[0198] 實(shí)施例18
[0199] 3-(5-溴-2,3-二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺?；交?丙酰胺(LW-18)的制備
[0201] 參照LW-15的制備方法，由5-溴靛紅和3反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率62%，mp 320-323 roESI-MSdSO.UM-HrjH-MffiUOOMHzJMSO-cUhSCppmhIO.SSCsaHhT.TSdJ: 7.7Hz，4H)，7.55-7.41(m，lH)，7.27(s，2H)，6.82(d，J=9.1Hz，lH)，3.65(s，2H)，2.83(m， 2H).
[0202] 實(shí)施例19
[0203] 3-(5-甲氧基-2,3-二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺酰基苯基)丙酰胺(LW-19)的制備
[0205] 參照LW-15的制備方法，由5-甲氧基靛紅和3反應(yīng)得黃色固體，產(chǎn)率68%，111? 308- 310。(：』51-]\^:402.1[]\1-!1]-;咕-匪1?(3001抱，〇15〇-(16) :3(??111):10.55(8，1!〇,7.75((1，了 = 7 ·7Ηζ，4Η)，7· 55-7 ·41(ι?，lH)，7.27(s，2H)，6.82(d，J = 9.1Hz，lH)，3.65(s，3H)，2.68(s， 2H)，2.42(s，2H).
[0206] 實(shí)施例20
[0207] 細(xì)胞內(nèi)ΝΑΕ活性評(píng)價(jià)
[0208] 1)試驗(yàn)方法
[0209] 采用Western Blot進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ΝΑΕ活性測(cè)試，陽(yáng)性對(duì)照為L(zhǎng)Z3(J Chem Inf Model， 2014,54(6):1785-1797.)〇 [0210] 2)實(shí)驗(yàn)材料
[0211] BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、配膠試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研 究所）；一抗Ubcl2(BostonBiochem公司）；二抗Anti-rabbit IgG、蛋白預(yù)染Marker (Bioworld公司）；0-catenin(南京金斯瑞生物科技有限公司）。
[0212] 3)實(shí)驗(yàn)步驟
[0213] (1)提蛋白（冰上操作）
[0214]①將6孔板中的培養(yǎng)基吸出（每?jī)蓚€(gè)一組），加 lmL7令的PBS洗，將PBS吸盡。
[0215] ②用刮刀將細(xì)胞刮至一側(cè)，加100_150yL裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞 充分接觸。
[0216] ③然后將裂解液吸至EP管，冰上裂解30min。
[0217] ④各孔重復(fù)此過(guò)程，4°C，12000rpm，15min，然后小心的吸取上清。
[0218] ⑵蛋白含量的測(cè)定
[0219] ①取0.8mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到-管蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20mg BSA)中，充分溶解后配制成 25mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后可立即使用，也可以-20°C長(zhǎng)期保存。
[0220] ②取20yL 25mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入980yL PBS稀釋至終濃度為0.5mg/mL的蛋白標(biāo) 準(zhǔn)液，-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0221] ③根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作 液，充分混勻。例如5mL BCA試劑A加100yL BCA試劑B，混勻，配制成5.1mL BCA工作液。BCA工 作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。
[0222] ④將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12，16，20yL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 補(bǔ)足到20yL。
[0223] ⑤加2yL樣品到96孔板的樣品孔中，加18yL PBS到20yL。
[0224] ⑥各孔加入200yL BCA工作液，37°C放置20-30min。
[0225] ⑦測(cè)定A570的波長(zhǎng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。
[0226] (3)樣品制備
[0227] ①根據(jù)所測(cè)蛋白濃度，用PBS將蛋白稀釋至所測(cè)的最低濃度
[0228] ②向蛋白樣品中分別加入5XSDS凝膠上樣緩沖液，沸水煮lOmin，同樣準(zhǔn)備蛋白質(zhì) 分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
[0229] (4)SDS_PAGE 電泳
[0230]按相同體積加入各蛋白樣品及預(yù)染蛋白marker，使蛋白含量不低于20yg/孔。將電 泳裝置與電源接通，樣品在濃縮膠中泳動(dòng)時(shí)電壓為80V，30-40min后當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠 后，將電壓增至120V，繼續(xù)電泳直到溴酚藍(lán)接近分離膠底部，關(guān)閉電源。
[0231] (5)轉(zhuǎn)膜
[0232] 從電泳裝置上取下玻璃板，小心撓開(kāi)玻璃板。參照預(yù)染蛋白maker，確定目的蛋白 所在的位置，剪切大小適合的PVDF膜及濾紙。PVDF膜以甲醇活化10s，然后與濾紙一起浸入 轉(zhuǎn)移緩沖液中。用轉(zhuǎn)移緩沖液潤(rùn)濕海綿，按海綿-雙層濾紙-膠-PVDF膜-雙層濾紙-海綿的順 序組裝凝膠轉(zhuǎn)移夾層，用玻璃棒趕走氣泡，合上夾板，放入轉(zhuǎn)移槽中。加入轉(zhuǎn)移緩沖液，接通 電源，300mA恒流電轉(zhuǎn)移45min-3h(根據(jù)轉(zhuǎn)移蛋白分子量的大小來(lái)確定具體的轉(zhuǎn)移）。
[0233] (6)免疫印跡雜交
[0234] 轉(zhuǎn)移完畢，取出PVDF膜，在TBST溶液中洗滌3次，每次5min，然后放入5 %脫脂奶粉 封閉液中，置搖床上室溫封閉2h。封閉過(guò)的膜用TBST洗滌3次，每次5min。將膜放入雜交袋 中，加入一抗(anti-Ubcl2 1:500稀釋)4°C孵育過(guò)夜，使抗原抗體充分結(jié)合。隔天，將膜從雜 交袋中取出，用TBST洗滌3次，每次5min;再放入新雜交袋中，加入HRP標(biāo)記的二抗以結(jié)合一 抗，置搖床上室溫孵育2h。
[0235] (7)Western blot結(jié)果檢測(cè)
[0236] 取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次SmiruECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，將混合好的發(fā)光液 滴加到膜上，用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。利用凝膠成像系統(tǒng)軟件，分析蛋白條帶密度。
[0237] (8)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
[0238]所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SEM)表示，統(tǒng)計(jì)分析采用兩樣本均數(shù)比較 的組間t檢驗(yàn)，用SPSS軟件進(jìn)行結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0239] (9)數(shù)據(jù)處理
[0240] ΝΑΕ活性抑制率（％ ) = (1-A鵬/A?) X 100 %
[0241] 其中：A加藥代表給藥組混合體系中Ubcl2-NEDD8蛋白的灰度值;A空白代表空白對(duì) 照。根據(jù)此公式計(jì)算化合物對(duì)ΝΑΕ的抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0242] (10)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0243]表1本發(fā)明的化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)ΝΑΕ的抑制活性
[0245] 注:Α:表示IC5Q值在0.1~10μΜ;Β:表示IC5Q值在10~30yM;C:表示
[0246] IC5〇>30yM。
[0247] 實(shí)施例21
[0248] 本發(fā)明化合物細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試
[0249 ]采用四甲基氮唑藍(lán)比色法(MTT)評(píng)價(jià)本發(fā)明部分化合物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制活性。 MTT法已廣泛用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感測(cè)定等。 [0250] 人源性細(xì)胞株:乳腺癌細(xì)胞MCF-7,結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，白血病細(xì)胞KG-1，淋巴癌細(xì) 胞0CI-LY99，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U-266。
[0251] 陽(yáng)性對(duì)照藥為L(zhǎng)Z3。
[0252] 實(shí)驗(yàn)方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞配成4.5 X105/mL細(xì)胞懸液，接種至96孔培養(yǎng)板 中，每孔180yL，每組設(shè)5個(gè)平行孔，分別加入不同濃度受試物各20yL。置于恒溫⑶ 2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)72h，將四甲基氮唑藍(lán)加入96孔板中，每孔20yL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸去上清液，加入DMS0，每 孔150yL，平板搖床上振搖5min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為490nm處測(cè)定每孔的吸收度，以 上實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次。由下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，根據(jù)抑制率建立直線回歸方程求得半數(shù)抑 制濃度IC 5Q值。結(jié)果見(jiàn)表2。
[0254]表2本發(fā)明部分化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性Κ：5〇(μΜ)
[0256] 注:A:表示 IC5Q 值在 0.1 ~10μΜ;Β:表示 IC5Q 值在 10 ~30yM;C:表示 IC5〇>30yM。
[0257] 細(xì)胞內(nèi)ΝΑΕ抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的化合物具有明顯的ΝΑΕ抑制活 性，其中化合物L(fēng)W-6和LW-7的活性優(yōu)于化合物L(fēng)Z3。體外抗增殖實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明的化合物 對(duì)人源腫瘤細(xì)胞有不同程度的抑制活性，其中化合物L(fēng)W-6和LW-7對(duì)MCF-7的抑制活性優(yōu)于 LZ3，化合物L(fēng)W-7和LW-8對(duì)0CI-LY99的抑制活性優(yōu)于LZ3，和化合物8對(duì)0CI-LY99的抑制活性 優(yōu)于LZ3化合物L(fēng)W-5和LW-6對(duì)U-266的抑制活性優(yōu)于化合物L(fēng)Z3。由于ΝΑΕ在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng) 和凋亡中具有重要作用，因此本發(fā)明所提供化合物可以用于預(yù)防和治療與ΝΑΕ異常相關(guān)的 疾病，尤其是腫瘤的治療。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 通式I所示的化合物、其立優(yōu)忌抝優(yōu)成I葯堂H可培凈的鹽. 其中：η代表1~8的整數(shù)； Ri代表氨基或乙酰胺基；R2代表： 其中： X 代表 S、NSO; Y代表ΝΗ、0或S; R3代表氫、鹵素、羥基、硝基、三氟甲基、氰基、C1-C8烷基、C1-C 8烷氧基、C3-C6環(huán)烷基或 NR4R5； R4和抱可相同或不相同，任選自：氫X1-C8烷基或RjPR5與和它們相連的氮一起形成5-7 元雜環(huán)基，其中所述的雜環(huán)基可任選地包含一個(gè)或多個(gè)選自0、S或N的其它雜原子，并且該 雜環(huán)基可任選地由下述相同或不同的取代基單取代至五取代，所述取代基包括：鹵素、羥 基、硝基、氰基、氨基、C 1-C8烷基或C1-C8烷氧基； 其中，下式化合物除外：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于： η代表1~6的整數(shù)； Ri代表氨基或乙酰胺基；R2代表： X 代表 S、NSO; Y代表ΝΗ、0或S; R3代表氫、鹵素、羥基、氰基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基或C 3-C6環(huán)烷基。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于： η代表1~6的整數(shù)； Ri代表氨基或乙酰胺基； R2代表：X代表S或N; Y代表NH、O或S; R3代表氫、鹵素或Cl_C8烷氧基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于所 述化合物優(yōu)先選自： (Z)-3-[2-亞胺基-5-(2-甲氧基苯乙烯基)-4-羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交?丙酰胺； (Z)-3-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-5-氧代-2-硫代咪唑-1-基]-N-4-(氨磺酰基苯基)丙 酰胺； (Z)-3-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,5_二氧代咪唑烷-1-基]-N-4-(氨磺?；交?丙酰 胺； (Z)-2-[5-(2-甲氧基苯乙烯基）-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交┮阴?胺； (Z)-2-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-5-氧代-2-硫代咪唑-1-基]-N-4-(氨磺?；交┮?酰胺； (Z)-4-[5-(2-甲氧基苯乙烯基）-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交┒□?胺； (Z)-4-[4-(2-甲氧基苯乙烯基)-5-氧代-2-硫代咪唑-1-基]-N-4-(氨磺?；交?丁 酰胺； (Z)-3-[5-(3-甲氧基苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺酰基苯基）丙酰 胺； (Z)-3-[5-(4-甲氧基苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交┍?胺； (Z) -3- [ 5- (2-氟苯乙烯基)-2，4-二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺?；交?丙酰胺； (Z) -3- [ 5- (2-氯苯乙烯基)-2，4-二羰基噻唑-3-基]-N-4-(氨磺酰基苯基)丙酰胺； (Z)-N-[4-(乙酰磺?；┍交鵠-3-[5-(2-溴苯乙烯基）-2,4_二羰基噻唑-3-基]丙酰 胺； (Z)-3-[5-(2-甲氧基苯乙烯基)-2,4_二羰基噻唑-3-基]-N-3-(氨磺?；交┍?胺； (Z) -3- (5-苯乙烯基-2，4-二羰基噻唑-3-基)-N-4-(氨磺?；交?丙酰胺； 3-(2,3_二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺酰基苯基)丙酰胺； 3-(5-氟_2,3_二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺?；交?丙酰胺； 3-(5-氯_2,3_二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺?；交?丙酰胺； 3-(5-溴_2,3_二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺酰基苯基)丙酰胺； 3-(5-甲氧基_2,3_二氧吲哚-1基)-N-(4-氨磺酰基苯基)丙酰胺。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，其特征在于： a) 當(dāng)Rf，通式I所示化合物的制備方法為:1^取代的磺?；桨放c氯 烷基酰氯反應(yīng)生成中間體2，R3取代的苯甲醛與五元雜環(huán)酮反應(yīng)制得中間體3,2與3縮合反 應(yīng)制得通式I所示的化合物，其合成路線如下：其中，RjPR2的定義如權(quán)利要求1所述。 b) 當(dāng)R2)時(shí)，通式I所示化合物的制備方法為：由中間體2與R3取代的靛紅反 應(yīng)制得通式I所示的化合物，其合成路線如下：其中，RjPR2的定義如權(quán)利要求1所述。6. -種治療腫瘤的藥物組合物，其由治療上有效量的權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的化 合物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成。7. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的化合物、其立體異構(gòu)體、其藥學(xué)上可接受的鹽或權(quán)利要 求6所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述的腫瘤為結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤或多 發(fā)性骨髓瘤。
【文檔編號(hào)】C07D277/54GK105884712SQ201610300373
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年5月9日
【發(fā)明人】賴(lài)宜生, 王輝, 孫其銳, 章穎溢, 李月珍, 張奕華
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)