技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丹皮提取物、提取方法及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，屬于天然藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：丹皮為毛茛科植物牡丹干燥根皮。產(chǎn)于安徽、山東等地。秋季采挖根部，除去細(xì)根，剝?nèi)「?，曬干。生用或炒用。丹皮入心、肝、腎經(jīng)。具有清血，活血散瘀的功能。主治斑疹吐血，血滯經(jīng)閉，經(jīng)前發(fā)勢(shì)，癰腫瘡毒，損傷瘀血，陰虛發(fā)勢(shì)，無汗骨蒸。臨床上主要用于清肝火和涼血散瘀（消炎、降壓），如因肝郁火而致的發(fā)熱、盜汗、自汗、頭痛目澀、月經(jīng)不調(diào)，常配梔子、柴胡等。秀麗隱桿線蟲作為模式生物，通過遺傳分析和顯微觀察，對(duì)線蟲由受精卵分裂、分化發(fā)育為成蟲的過程做了全面的跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)線蟲調(diào)節(jié)器官發(fā)育和程序性細(xì)胞死亡的幾個(gè)關(guān)鍵因素，在高等動(dòng)物和人體中也存在[1]。來自希伯來大學(xué)和約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員研究線蟲細(xì)胞核膜中誘導(dǎo)的突變[2]。加拿大的研究人員利用秀麗隱桿線蟲篩選了14100種小分子化合物找到了一個(gè)叫Nemadipine-A物質(zhì)，它能夠引起線蟲形態(tài)和產(chǎn)卵異常[3]，秀麗隱桿線蟲還可用于對(duì)驅(qū)蟲藥物的篩選[4]。樟腦丸的一種代謝產(chǎn)物1，4萘醌課抑制線蟲的促凋亡蛋白CED-3的活性，從而抑制細(xì)胞的凋亡[5]。生物分析已經(jīng)廣泛用于各種毒理研究，線蟲進(jìn)行藥物毒性的研究最基本方法就是觀察統(tǒng)計(jì)經(jīng)過待測(cè)物質(zhì)處理若干時(shí)間后線蟲的存活率，將線蟲應(yīng)用于化學(xué)試劑毒性檢測(cè)，如對(duì)（甲基硫酸乙酯）進(jìn)行的毒性研究[6]，還有將線蟲用于環(huán)境水質(zhì)的檢測(cè)，通過線蟲的成活率來評(píng)定水的毒性大小。Ras是一種小分子蛋白GTPase，是肉瘤病毒基因的同源物。秀麗隱桿線蟲中的let-60編碼的Ras是調(diào)節(jié)線蟲陰門發(fā)育的一個(gè)因子[7]。隨后，KayneandSternberg等[8]人利用遺傳學(xué)工具闡明了LET-60Ras信號(hào)通路，該通路主要是調(diào)節(jié)線蟲陰門發(fā)育和雄性交合刺的形成。Ras信號(hào)通路是高度保守的，線蟲中的Ras蛋白與人類的K-Ras和N-Ras蛋白在最前面的164個(gè)氨基酸(總共184個(gè)氨基酸)中有83%是完全相同的，且其信號(hào)通路上的大部分因子都能在哺乳動(dòng)物上找到同源物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：近年來，中藥由于其毒副作用小越來越引起更多人的關(guān)注，本發(fā)明利用秀麗隱桿線蟲作為模型生物篩選下調(diào)ras過渡激活的抗腫瘤中藥及藥物急性毒性研究。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)采用秀麗隱桿線蟲突變體篩選具有下調(diào)ras過渡激活的抗腫瘤活性中藥，丹皮的提取物顯示出抗腫瘤活性好且毒性較小的優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)方案是：一種丹皮提取物，它是由丹皮經(jīng)過水提取之后，再經(jīng)過大孔樹脂進(jìn)行吸附、洗脫處理而得到。丹皮提取物的提取方法，包括如下步驟：第1步，取丹皮，加水浸泡，再進(jìn)行煎煮；第2步，將第1步得到的煎液經(jīng)過大孔樹脂進(jìn)行吸附、洗脫處理，洗脫液經(jīng)過減壓濃縮、干燥后，得到提取物。所述的第1步中，加水浸泡步驟中加水重量是丹皮的5倍；煎煮次數(shù)是3次。所述的第1步中，大孔樹脂是HPD400大孔吸附樹脂，洗脫處理采用的是85v/v%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液為提取物溶液。丹皮提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述的抗腫瘤藥物，是指抑制原癌基因ras通路過度激活的抗腫瘤藥物。有益效果本發(fā)明提供了一種丹皮提取物，它對(duì)于Ras基因具有明顯的抑制調(diào)節(jié)作用，采用本發(fā)明提供的提取方法可以獲得效果明確的提取物，經(jīng)過大孔吸附樹脂處理了煎液之后，可以顯著降低提取物的毒性以及提高對(duì)Ras基因的抑制效果，提取過程方法簡(jiǎn)單、收率高、純度高。附圖說明圖1是成蟲野生型在倒置顯微鏡下的形貌圖；圖2是有一個(gè)假陰門的突變體線蟲在倒置顯微鏡下的形貌圖；圖3是有兩個(gè)假陰門的突變體線蟲在倒置顯微鏡下的形貌圖；圖4是有三個(gè)假陰門的突變體線蟲在倒置顯微鏡下的形貌圖；圖5是丹皮提取物對(duì)線蟲突變體MT2124的作用(**p<0.01)；圖6是實(shí)施例1提取物的急性毒性曲線；圖7是對(duì)照例1提取物的急性毒性曲線。具體實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)部分1、儀器、試劑及實(shí)驗(yàn)材料1.1儀器：CJ-26型潔凈工作臺(tái)，DXC型紫外線消毒車，TGL-13型電動(dòng)離心機(jī)，XH-B型旋渦混勻器，HZQ-F160A型恒溫振蕩器，GFL303型氣浴恒溫?fù)u床，海爾BCD20JV型電冰箱，ASV-3023型全自動(dòng)高壓消毒柜，Biofugestratos型高速冷凍離心機(jī)，浮游生物計(jì)數(shù)板，計(jì)時(shí)器，移液槍，槍頭，離心管，微孔濾膜，溫度計(jì)，注射器，燒杯，錐形瓶，槍盒，酒精燈，鑷子，接種環(huán)，涂菌棒，培養(yǎng)皿，96孔板。1.2實(shí)驗(yàn)材料秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）：秀麗隱桿線蟲MT2124，let-60ras(gf)突變體，購于美國(guó)線蟲遺傳中心。大腸桿菌：大腸桿菌OP50，線蟲的食物，購于美國(guó)線蟲遺傳中心。丹皮藥材，購于蘭州惠仁堂藥業(yè)。1.3溶液的配置NGM培養(yǎng)基：100ml純凈水加入0.3031g氯化鈉，1.7033g磷酸二氫鉀，0.2309g磷酸氫二鉀，0.27185g蛋白胨，1.7155g瓊脂，使其全部溶解。（滅菌后加0.2ml氯化鈣，0.2ml硫酸鎂，0.1ml膽固醇。）Sbasal：100ml純凈水加0.585g氯化鈉,0.1g磷酸氫二鉀，0.6g磷酸二氫鉀，混合均勻滅菌。S基礎(chǔ)液：100mlSbasal加入1ml檸檬酸，1mlTrace,100μl膽固醇，300μl硫酸鎂，300μl氯化鈣，混合均勻。（現(xiàn)配現(xiàn)用）LB培養(yǎng)基：100ml純凈水加入1.0g蛋白胨，0.5g酵母粉，1.0g氯化鈉，混合均勻滅菌（再加1.7155g瓊脂，滅菌，得LB固體培養(yǎng)基）。M9緩沖液：100ml純凈水加0.49725g氯化鈉，0.5964g磷酸氫二鈉，0.2992g磷酸二氫鉀，0.012g硫酸鎂，混合均勻，滅菌。裂解液：1M氫氧化鈉：2.4%次氯酸鈉按1：1的比例混合。實(shí)施例1丹皮提取物制備稱取50g丹皮藥材，加十倍量純凈水，浸泡半小時(shí)，煎煮三次，每次1h，合并濾液，濃縮至50ml，制成1g/ml(按生藥材計(jì))的藥液，離心（10000rpm20min），0.22μm微孔濾膜過濾，收集濾液，再將濾液送入填充有HPD400大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，濾液進(jìn)料量是5BV，再采用85v/v%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液用量是3BV，洗脫液經(jīng)過減壓濃縮、干燥后，得到丹皮提取物。對(duì)照例1丹皮提取物制備與實(shí)施例1的區(qū)別在于：未采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附和洗脫處理。稱取50g丹皮藥材，加五倍量純凈水，浸泡半小時(shí)，煎煮三次，每次1h，合并濾液，濃縮至50ml，制成1g/ml(按生藥材計(jì))的藥液，離心（10000rpm,20min），微孔濾膜過濾，收集濾液，再將濾液經(jīng)過減壓濃縮、干燥后，得到丹皮提取物。實(shí)施例2藥效試驗(yàn)大腸桿菌OP50培養(yǎng)將從線蟲遺傳中心購置的在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的OP50，用接種環(huán)接種到LB液體培養(yǎng)基中，放在搖床上,培養(yǎng)條件200rpm，20℃，培養(yǎng)24h，一部分用于涂菌，每板加400μl菌液，用涂菌棒涂布均勻，放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用于線蟲轉(zhuǎn)板；另一部分離心（10000rp10min）得到固體菌，將其稱重，然后稀釋成110mg/ml的菌液，置于4℃冰箱保存。線蟲培養(yǎng)將凍存于-80℃冰箱中的秀麗隱桿線蟲MT2124轉(zhuǎn)接到涂有OP50的固體NGM培養(yǎng)基上，在20℃下培養(yǎng)成蟲進(jìn)行同步化。將同步化線蟲孵化成L1期小線蟲用于藥物活性實(shí)驗(yàn)的生物模型和急性毒性實(shí)驗(yàn)。線蟲同步化將培養(yǎng)了2-3d的固體板線蟲用M9液沖洗至10ml離心管中，使線蟲沉降，吸出上清液，先后加入3ml1M氫氧化鈉和3ml2.4%次氯酸，在渦旋器上渦旋6min，快速吸入1.5ml的離心管中，離心（4min3000rp），快速吸出裂解液，再用M9液沖洗兩次，最后加約1mlM9液，放置恒溫箱中培養(yǎng)24h后。同步化液體線蟲時(shí)，吸出S液時(shí)用M9液清洗一次，再加裂解液，后面步驟跟固體板線蟲相同。對(duì)線蟲突變體的抑制效果將實(shí)施例1和對(duì)照例1中的丹皮提取物用S基礎(chǔ)液按照表1稀釋成不同濃度梯度的藥液，配制成均勻藥液；再用S基礎(chǔ)液將110mg/ml的OP50稀釋成11mg/ml的菌液；同時(shí)把培養(yǎng)2d的同步化線蟲用S基礎(chǔ)液稀釋成60-80條每20μl的線蟲液。在96孔板的藥物組的每一藥孔中加160μl均勻藥液，20μlOP50，20μl線蟲，在空白組的每孔中加160μlS基礎(chǔ)液，20μlOP50，20μl線蟲，然后將其混合均勻，放置恒溫振蕩器中培養(yǎng)，不斷觀察，待線蟲培養(yǎng)成成蟲后，觀察統(tǒng)計(jì)藥物組與空白組中野生型的比例（野生型比例=野生型/線蟲總數(shù)）[10]，然后將藥物組與空白組進(jìn)行比較，判斷藥物對(duì)線蟲突變體是否有抑制作用。表1稀釋后的丹皮水提液的濃度線蟲中的野生型和突變體的判定由于成蟲野生型和突變體線蟲真假陰門表型很容易在倒置顯微鏡下觀察和區(qū)別，陰門發(fā)育從L1期開始，成蟲期時(shí)發(fā)育完全，且便于觀察?？梢钥闯鰣D1所表示野生型線蟲，只有一個(gè)真陰門，圖2-4表示的是突變體，圖2中只有一個(gè)假陰門，圖3中有兩個(gè)假陰門，圖4中有三個(gè)假陰門。不同中藥對(duì)秀麗隱桿線蟲ras過度激活突變體MT2124多陰門表型的影響將丹皮提取物按照表1進(jìn)行稀釋成不同濃度的藥液，然后作用于L1期線蟲，將所有組線蟲培養(yǎng)至成蟲后，在倒置顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)其野生型比例。實(shí)施例1中的提取物作用效果如圖5顯示，與空白組比較丹皮提取物有顯著的抑制線蟲突變體的作用，并呈劑量依賴關(guān)系，與空白組比較，藥物組在各濃度下對(duì)突變體線蟲均有顯著抑制作用，且這種效果與藥液濃度呈正比關(guān)系。野生型比例試驗(yàn)結(jié)果如下：濃度mg/ml051020實(shí)施例1提取物12.5±4.231.1±3.8**▲44.2±5.6**▲60.4±4.3**▲對(duì)照例1提取物11.8±3.820.2±3.428.6±4.5**36.7±5.1****與空白組相比p<0.05，▲與對(duì)照例1相同濃度組相比p<0.05通過實(shí)施例1和對(duì)照例1組相比，在相同濃度下，實(shí)施例1中的提取物具有更高的線蟲野生型比例，說明通過大孔吸附樹脂可以富集了有效成分，經(jīng)過該改進(jìn)提取方法之后，提高了抑制藥效。實(shí)施例3對(duì)線蟲MT2124的急性毒性將丹皮提取液配制為溶液作用于L1期線蟲，并將線蟲培養(yǎng)24h，統(tǒng)計(jì)中藥不同濃度時(shí)，線蟲死亡比例，分別與其空白組對(duì)照，實(shí)施例1和對(duì)照例1的結(jié)果如圖6和圖7所示?？梢钥闯觯?dāng)實(shí)施例1和對(duì)照例1提取物濃度均為62.5mg/ml時(shí)，其所對(duì)應(yīng)的線蟲致死率分別是53.7%、83.1%，經(jīng)過大孔吸附樹脂處理后，可以有效地降低提取物的毒性。參考文獻(xiàn)[1]Artal-SanzM.,deJongL.,TavernarakisN.,Caenorhabditiselegans:Aversatileplatformfordrugdiscovery[J].Biotechnol,2006,1(8):1405-1418.[2]Ben-HarushK.,WieselN.,KrispinF.,MoellerD.,SorepE.,AebisU.,HerrmannH.,GruenbaumY.,MedaliaO.,TheSupramolecularOrigazinationoftheC.elegansNuclearLaminFilament[J].Mol.Biol.2009,386(5):1392-1402.[3]KwokT.C.,RichenN.,FraserR.,ChanA.W.,BurnsA.,StanleyE.F.,MccourtP.,CutlerS.R.,RoyP.J.,Asmall-moleculescreeninC.elegansyieldsanewcalciumchannelantagomist[J].Nature,2006,441(7089):91-95.[4]GnoulaC.,GuissouI.,DuboisJ.,Duez-TalantaP.,5(6)-carboxyfluoresceindiacetateasanindicatorofCaenorhabditiselegansviabilityfortheDevelopmentofinvitroanthelminticdrugassay[J].Talanta,2007,71(5):1886-1892.[5]Tomokok.,MoriH.,MizushinaYoshiyuki.,MatsubaraK.,1,4-Naphthoquinoneisapotentinhibitorofhumancancercellgrowthandangiogenesis[J].CancerLetter,2009,278(1):34-40.[6]王渤.線蟲Caenorhabditiselegans在甲基硫酸乙酯(EMS)中的毒性實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2004,21(12):24-26.[7]HanM.,SternbergP.W.,let-60agenethatspecifiescellfatesduringC.elegansvulvalinduction,encodesarasprotein[J].Cell,1990,63(5):921-931.[8]KayneP.S.,SternbergP.W.,RaspathwaysinCaenorhabditiselegans[J].CurrentOpinioninGenetics.,Development,1995,5(1):38-43.[9]丁曉霞.以秀麗隱桿線蟲作為模式生物對(duì)雄黃微生物浸出液活性和毒性的研究[D].2009。當(dāng)前第1頁1 2 3