相關(guān)申請

本申請要求2014年12月22日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/095,369的優(yōu)先權(quán)，所述申請以引用的方式整體并入。

背景

氧化應(yīng)激反應(yīng)為免疫應(yīng)答的主要部分，它與感染、炎癥、老化等相關(guān)聯(lián)。在臨床上，病狀的環(huán)境與氧化損傷相關(guān)聯(lián)，所述氧化損傷包括慢性炎性疾病和自身免疫疾病、癌癥以及年齡相關(guān)性病癥。氧化應(yīng)激反應(yīng)大部分是通過活性氧(ros)和活性氮(rns)以及其他物質(zhì)介導(dǎo)的。ros是具有高化學(xué)反應(yīng)性的基于氧的分子。這些分子包括生物產(chǎn)生的自由基(超氧化物和羥基、一氧化氮等)和非自由基物質(zhì)諸如過氧化氫和過氧化亞硝酸鹽。

蛋白質(zhì)暴露于ros和rns后改變了其復(fù)合氨基酸和結(jié)構(gòu)，從而生成新抗原(新抗原通常定義為先前未被認(rèn)識的宿主衍生的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在物理/結(jié)構(gòu)或基因修飾之后具有免疫原性)。然而，對于生物分子的氧化損傷很少是特定的，并且這取決于蛋白質(zhì)的濃度、其相對于細(xì)胞氧化劑生成系統(tǒng)的細(xì)胞位置以及修飾的蛋白質(zhì)的清除速率。

雖然自由基在導(dǎo)致分子水平的氧化損傷方面的直接作用已為人所知數(shù)十年，但是氧化損傷改變組織/器官功能的程度在很大程度上仍然是不清楚的。在免疫學(xué)中，氧化損傷已涉及到多種自身免疫疾病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)，其中針對新抗原的異常免疫應(yīng)答表明免疫耐受機制受損害。誘導(dǎo)新抗原形成的因素包括炎癥、感染、藥物、ros以及環(huán)境因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一些方面，本發(fā)明涉及生成抗原的組合物和方法，其中所述抗原是通過活性氧或活性氮修飾的生物分子。在一些方面，本發(fā)明涉及生成抗體的組合物和方法，所述抗體結(jié)合到通過活性氧或活性氮修飾的生物分子。在一些方面，本發(fā)明涉及生成抗體的組合物和方法，所述抗體結(jié)合到未修飾的生物分子上的新型表位。在一些方面，本發(fā)明涉及主動免疫治療性過程的誘導(dǎo)(例如，使用預(yù)防性或治療性疫苗)，所述誘導(dǎo)可包括施用通過本文所述的方法和組合物生成的新抗原。

附圖簡述

圖1.一氧化氮(no)的相關(guān)生物/化學(xué)反應(yīng)性。no可與相關(guān)生物蛋白質(zhì)中易受影響的化學(xué)部分快速反應(yīng)，即：a)例如，酪氨酸殘基：硝化(不可逆)；b)例如，硫醇：s-亞硝基化(可逆)；以及c)例如，過渡金屬離子：亞硝化(可逆)。

圖2.b16作為小鼠黑素瘤腫瘤和免疫療法模型。皮下模型廣泛用于許多腫瘤模型中的療法評價，所述腫瘤模型包括免疫原性差的c57bl/6衍生的b16黑素瘤。在皮下注射之后，b16將在5天至10天內(nèi)形成可觸知的腫瘤，并且在14天至21天內(nèi)生長成最小1×1×1-cm的腫瘤，從而引起通過no和no相關(guān)分子增加的b16衍生的抗原免疫原性：a)重編程：將培養(yǎng)的b16細(xì)胞體外處理到緩慢釋放no的化合物deta-nonoate(250μm-相對低的濃度)18小時，以便促進(jìn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而引起新腫瘤相關(guān)性抗原的出現(xiàn)并且在通過超聲裂解之后將b16細(xì)胞轉(zhuǎn)化成更具有免疫原性的并用作抗原(novax)；b)修飾：在31μm的no衍生的硝化劑過氧化亞硝酸鹽(onoo^-)存在下，在室溫下將通過超聲獲得的未處理的總培養(yǎng)的b16細(xì)胞裂解物孵育3小時，接著在4℃下孵育48小時，并且用作抗原(nivax)。將抗原制劑冷凍并保存在-80℃下，直至將其用于主動治療性免疫中或用于生成用于被動治療性治療攜帶腫瘤的小鼠的抗血清。

圖3.用于被動治療性治療(血清轉(zhuǎn)移)和抗體發(fā)現(xiàn)的抗血清生成。a)在皮下(sc)使用100μl(～100μg的蛋白質(zhì))未處理的b16裂解物(對照vax)、重編程的b16裂解物(novax)或修飾的b16裂解物(nivax)對不攜帶腫瘤的c57bl/6雌性小鼠(6-12周大)進(jìn)行免疫。在第7天和第21天給予使用相同劑量和濃度的抗原進(jìn)行加強免疫。在最后一次加強免疫14天之后，通過心臟刺穿從co2安樂死的動物中采集血液。b)在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，將三個劑量(每個20μl)的來自單個實驗組的合并的血清在腹膜內(nèi)(ip)施用給攜帶腫瘤的小鼠。每周兩次對腫瘤負(fù)荷進(jìn)行監(jiān)測。

圖4.黑素瘤的主動和被動治療性免疫。a)主動：在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，在皮下(sc)使用100μl(～100μg的蛋白質(zhì))未處理的b16裂解物(對照vax或cvax)、重編程的b16裂解物(novax)或修飾的b16裂解物(nivax)對攜帶b16-f0腫瘤的c57bl/6雌性小鼠(6-12周大)進(jìn)行免疫。b)被動：在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，將三個劑量(每個20μl)的來自單個實驗組的合并的血清在腹膜內(nèi)(ip)施用給攜帶b16-f0腫瘤的小鼠。通過腫瘤體積(mm³)±sem來評估腫瘤負(fù)荷。**＝p＜0.01|n＝10。

圖5.修飾的b16裂解物(nivax)生成的抗血清針對未修飾的和修飾的b16蛋白質(zhì)裂解物反應(yīng)。通過sds-page對從未修飾的b16-f0(b16)、過氧化亞硝酸鹽修飾的b16-f0(nb16)以及非黑素瘤小鼠細(xì)胞系el4純化的總蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行解析，并且使用以下各項作為一級抗體對其進(jìn)行免疫印跡：a)對照未免疫的抗血清；b)對照未處理的b16裂解物(對照vax)抗血清；c)修飾的b16裂解物(nivax)抗血清；以及d)不使用抗血清。使用辣根過氧化物酶(hrp)綴合的抗小鼠igg作為二級抗體。

圖6.人類免疫靶標(biāo)識別。使用修飾的b16裂解物(nivax)衍生的抗血清作為一級抗體針對交叉反應(yīng)性篩選綜合人類蛋白質(zhì)表達(dá)微陣列(origene人類蛋白質(zhì)裂解物β陣列)，并且使用hrp綴合的抗小鼠igg作為二級抗體。

圖7.潛在免疫靶標(biāo)的二維電泳分析。通過二維(2-d)電泳對b16-f0總蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行解析。簡言之，使用readystrips/bio-rad(ph3-10，非線性，7cm長)，通過等電聚焦(ief)在第一維度上對天然b16-f0總蛋白質(zhì)裂解物(～20μg)進(jìn)行2-d分析。然后在12％sds-page上分離蛋白質(zhì)，并且使用修飾的b16裂解物(nivax)衍生的抗血清作為一級抗體對其進(jìn)行免疫印跡，并且使用hrp綴合的抗小鼠igg作為二級抗體。

圖8.fen1的二維電泳分析。在2-d電泳中對b16-f0總蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行解析并且使用多克隆抗fen1抗體(細(xì)胞信號傳導(dǎo))對其進(jìn)行免疫印跡。

圖9.使用過氧化亞硝酸鹽硝化的(修飾的)人類fen1針對黑素瘤進(jìn)行的主動治療性免疫。在31μm和62μm的no衍生的硝化劑過氧化亞硝酸鹽(onoo^-)存在下，在室溫下對純化的重組人類fen1蛋白進(jìn)行修飾3小時，接著在4℃下修飾48小時，并且用作用于免疫的抗原。在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，在皮下(sc)使用鹽水溶液(對照)或100μl(～3μg的蛋白質(zhì))未修飾的fen1對照、31μm修飾的fen1或62μm修飾的fen1對攜帶b16-f0腫瘤的小鼠進(jìn)行免疫。通過腫瘤體積(mm³)±sem來評估腫瘤負(fù)荷。**＝p＜0.01|n＝8。

圖10.使用過氧化亞硝酸鹽硝化的(修飾的)人類fen1的主動治療性免疫延長了存活。在31μm和62μm的no衍生的硝化劑過氧化亞硝酸鹽(onoo^-)存在下，對純化的人類fen1蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾。在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，在皮下(sc)使用鹽水溶液(對照)或100μl(～3μg的蛋白質(zhì))未修飾的fen1對照、31μm修飾的fen1或62μm修飾的fen1對攜帶b16-f0腫瘤的小鼠進(jìn)行免疫。

圖11.使用過氧化亞硝酸鹽硝化的(修飾的)人類fen1針對黑素瘤進(jìn)行的被動治療性免疫通過血清抗體進(jìn)行介導(dǎo)。使用蛋白質(zhì)g涂覆的磁珠(蛋白質(zhì)g/生命技術(shù))，使用未修飾的fen1(對照抗體)或使用在31μm過氧化亞硝酸鹽存在下修飾的fen1(31pst抗體)在未攜帶腫瘤的小鼠中生成的抗血清是抗體消耗的(-)或未抗體消耗的(+)。在腫瘤攻擊之后第4天、第7天和第10天，將三個劑量(每個20μl)的來自單個實驗組的合并的血清在腹膜內(nèi)(ip)施用給攜帶b16-f0腫瘤的小鼠。通過腫瘤體積(mm³)±sem來評估腫瘤負(fù)荷。**＝p＜0.01|n＝8。

圖12.使用修飾的人類fen1針對黑素瘤進(jìn)行的被動治療性免疫延長了存活。使用蛋白質(zhì)g涂覆的磁珠(蛋白質(zhì)g/生命技術(shù))，如先前所述地使用未修飾的fen1(對照抗體)或使用在31μm過氧化亞硝酸鹽存在下修飾的fen1(31pst抗體)在未攜帶腫瘤的小鼠中生成的抗血清是抗體消耗的(-)或未抗體消耗的(+)。在腫瘤攻擊之后第4天、第7天和第10天，將三個劑量(每個20μl)的來自單個實驗組的合并的血清在腹膜內(nèi)(ip)施用給攜帶b16-f0腫瘤的小鼠。

圖13.針對未修飾的b16-f0總蛋白質(zhì)裂解物的抗體依賴性抗血清免疫反應(yīng)性。通過sds-page對從未修飾的b16-f0純化的總蛋白裂解物進(jìn)行解析并且在獨立于泳道的多篩選設(shè)備(bio-rad)中使用以下各項對其進(jìn)行免疫印跡：完整的對照未修飾的抗血清(c+)、抗體消耗的對照未修飾的抗血清(c-)、完整的修飾的fen1抗血清(31+)或抗體消耗的修飾的fen1抗血清。使用hrp綴合的抗小鼠igg作為二級抗體。

圖14.新型抗原決定簇的發(fā)現(xiàn)。在31μm過氧化亞硝酸鹽存在下，在室溫下對培養(yǎng)的恰加斯氏利什曼原蟲(leishmaniachagasi)無鞭毛體進(jìn)行裂解和處理3小時，接著在4℃下進(jìn)行48小時并且用作抗原(l-nivax)以對未感染的balb/c小鼠進(jìn)行免疫(100μl-sc|～200μg/劑量)，接著在第7天進(jìn)行加強免疫。在最后一次加強免疫21天之后，通過心臟刺穿采集血液以用于血清分離。將抗血清制劑的相同方案用于含有以下各項的抗原制劑：鹽水溶液(媒介物)、活的恰加斯氏利什曼原蟲無鞭毛體+咪喹莫特(imiquamod)(活的l+imi)以及熱殺死的恰加斯氏利什曼原蟲無鞭毛體(熱殺死的l)。通過sds-page對來自未處理的恰加斯氏利什曼原蟲無鞭毛體的總蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行解析并且使用以下各項對其進(jìn)行免疫印跡：媒介物、活的l+imi、熱殺死的l以及l(fā)-nivax抗血清。使用hrp綴合的抗小鼠igg作為二級抗體。

發(fā)明詳述

在一些方面，本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)：通過特定的一氧化氮(no)相關(guān)性化合物對靶向蛋白進(jìn)行的氧化/亞硝化修飾(例如，硝化)的選擇性誘導(dǎo)通過促進(jìn)對新型抗原決定簇的識別來產(chǎn)生新型改變疾病的免疫原。由ros/rns誘導(dǎo)的氧化/亞硝化損傷還可使得在脂質(zhì)和蛋白質(zhì)中生成不可逆的、非變性的改變，從而產(chǎn)生具有高度免疫原性的新抗原。在自身免疫中觀察到的氧化誘導(dǎo)的免疫原性增強需要對于其他非生物可用的氧化劑/硝化劑的加強免疫性的能力進(jìn)行系統(tǒng)性分析，其目標(biāo)為產(chǎn)生更有效的疫苗、免疫治療性手段以及診斷工具。

定義

除非本文另外定義，否則本申請中所使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語將具有由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。通常，與本文所述的化學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、細(xì)胞和癌癥生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)化學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)及核酸化學(xué)結(jié)合使用的命名以及其技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知和常用的那些命名和技術(shù)。

向受試者“施用(administering/administration)”物質(zhì)、化合物或藥劑可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方法之一來實施。例如，化合物或藥劑可通過以下方式施用：靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、經(jīng)眼、舌下、經(jīng)口(通過攝取)、經(jīng)鼻(通過吸入)、脊柱內(nèi)、腦內(nèi)以及經(jīng)皮(通過吸收，例如通過皮膚管)?；衔锘蛩巹┻€可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^可再充電或可生物降解聚合物裝置或其他裝置例如貼片和泵，或者提供對化合物或藥劑的延長的、緩慢的或受控的釋放的制劑引入。施用還可例如進(jìn)行一次、多次和/或在一個或多個延長時間段內(nèi)進(jìn)行。向受試者施用物質(zhì)、化合物或藥劑的適當(dāng)方法還將取決于例如受試者的年齡和/或身體狀況以及化合物或藥劑的化學(xué)和生物特性(例如，溶解性、可消化性、生物可用性、穩(wěn)定性以及毒性)。在一些實施方案中，化合物或藥劑例如通過攝取向受試者口服施用。在一些實施方案中，口服施用的化合物或藥劑處于延長釋放或緩慢釋放的制劑中，或者使用用于此緩慢或延長釋放的裝置來施用。

“親和力”是指分子(例如，抗體)的單一結(jié)合位點與其結(jié)合配偶體(例如，抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用，“結(jié)合親和力”是指反映結(jié)合對的成員(例如，抗體與抗原)之間的1∶1相互作用的固有結(jié)合親和力。分子x對其配偶體y的親和力可通常由解離常數(shù)(kd)表示。親和力可通過本領(lǐng)域中已知的常用方法來測量。

術(shù)語“抗體”在本文中以最廣泛意義使用并且涵蓋各種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)以及抗體片段，只要它們展現(xiàn)所需的抗原結(jié)合活性即可。

“抗體片段”是指非完整抗體的分子，其包含完整抗體的一部分并且結(jié)合完整抗體所結(jié)合的抗原?？贵w片段的實例包括但不限于fv、fab、fab′、fab′-sh、f(ab′)2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scfv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

術(shù)語“嵌合”抗體是指重鏈和/或輕鏈的一部分來源于特定來源或物質(zhì)，而重鏈和/或輕鏈的其余部分來源于不同來源或物質(zhì)的抗體。

如本文所用的術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。細(xì)胞毒性劑包括但不限于放射性同位素(例如，at²¹¹、1¹³¹、1¹²⁵、y⁹⁰、re¹⁸⁶、re¹⁸⁸、sm¹⁵³、bi²¹²、p³²、pb²¹²以及l(fā)u的放射性同位素)；化學(xué)治療劑或藥物(例如，甲胺蝶呤、阿霉素(adriamicin)、長春花生物堿(長春新堿、長春花堿、依托泊苷)、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素c(mitomycinc)、苯丁酸氮芥、道諾霉素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶以及其片段，諸如核分解酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；以及以下公開的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。

“人類抗體”是具有某一氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列對應(yīng)于由人類或人類細(xì)胞產(chǎn)生的抗體或來源于利用人類抗體譜或其他人類抗體編碼序列的非人類來源的抗體的氨基酸序列。人類抗體的這種定義明確排除包含非人類抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。

“人源化”抗體是指包含來自非人類hvr的氨基酸殘基和來自人類fr的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體將包含至少一個并且通常兩個可變結(jié)構(gòu)域的大致上全部，其中全部或大致上全部hvr(例如，cdr)對應(yīng)于非人類抗體的hvr，并且全部或大致上全部fr對應(yīng)于人類抗體的fr。人源化抗體任選地可包含衍生自人類抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)的“人源化形式”是指已經(jīng)歷人源化的抗體。

“分離的抗體”是已與其天然環(huán)境的組分分離的抗體。在一些實施方案中，將抗體純化至純度大于95％或99％，如通過例如電泳(例如，sds-page、等電聚焦(ief)、毛細(xì)管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相hplc)所測定的。對于用于評估抗體純度的方法的評述，參見，例如flatman等，j.chromatogr.b848：79-87(2007)。

“分離的核酸”是指已經(jīng)與其天然環(huán)境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細(xì)胞中所含有的核酸分子，但核酸分子存在于染色體外或存在于不同于其天然染色體位置的染色體位置處。

如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從大致上均質(zhì)的抗體群體獲得的抗體，即，除可能的變體抗體(例如，含有天然存在的突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制劑的過程中出現(xiàn)的變體，這些變體通常以少量存在)之外，構(gòu)成所述群體的個別抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，單克隆抗體制劑的每個單克隆抗體是針對抗原上的單一決定簇的。因此，修飾語“單克隆”指示如從大致上均質(zhì)的抗體群體獲得的抗體的特征，并且不應(yīng)解釋為需要通過任何具體方法來產(chǎn)生抗體。例如，待根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過各種技術(shù)制備，所述技術(shù)包括但不限于雜交瘤方法、重組dna方法、噬菌體展示方法以及利用含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法，此類方法以及用于制備單克隆抗體的其他示例性方法在本文中進(jìn)行描述。

術(shù)語“一氧化氮供體”或“no供體”是指提供、釋放和/或直接或間接轉(zhuǎn)移一氧化氮物質(zhì)的化合物。

術(shù)語“患者”、“受試者”或“個體”可互換使用并且是指人類或非人類動物。這些術(shù)語包括哺乳動物諸如人類、靈長類動物、家畜動物(包括牛、豬等)、伴侶動物(例如，犬、貓科動物等)以及嚙齒動物(例如，小鼠和大鼠)。

短語“藥學(xué)上可接受的”是本領(lǐng)域認(rèn)可的。在某些實施方案中，所述術(shù)語包括在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適用于與人類和動物的組織相接觸而沒有過量毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥、與合理的利益/風(fēng)險比相稱的組合物、賦形劑、佐劑、聚合物以及其他材料和/或劑型。

“藥學(xué)上可接受的鹽”或“鹽”在本文中用于是指適用于治療患者或與患者的治療相容的酸加成鹽或堿加成鹽。

如本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的酸加成鹽”意指任何無毒的有機或無機鹽。形成合適的鹽的例示性無機酸包括鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸，以及金屬鹽諸如正磷酸一氫鈉和硫酸氫鉀。形成合適的鹽的例示性有機酸包括一元羧酸、二元羧酸和三元羧酸，諸如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水楊酸以及磺酸，諸如對甲苯磺酸和甲磺酸?？尚纬梢辉猁}或二元酸鹽，并且此類鹽可以水合形式、溶劑化形式或大致上無水形式存在。適當(dāng)鹽的選擇將是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的。

如本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的堿加成鹽”意指任何酸化合物的任何無毒的有機或無機堿加成鹽。形成合適的鹽的例示性無機堿包括氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂或氫氧化鋇。形成合適的鹽的例示性有機堿包括脂族、脂環(huán)族或芳香族有機胺，諸如甲胺、三甲胺和甲基吡啶或氨。適當(dāng)鹽的選擇將是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的。

如本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”意指適用于配制用于醫(yī)學(xué)或治療性用途的藥物的藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒介物，諸如液體或固體助濾劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。

術(shù)語“預(yù)防”是本領(lǐng)域認(rèn)可的，并且當(dāng)相對于病狀諸如局部復(fù)發(fā)(例如，疼痛)、疾病諸如癌癥、征候諸如心力衰竭或任何其他醫(yī)學(xué)病狀使用時，是在本領(lǐng)域中所熟知的，并且包括向無癥狀受試者施用組合物，相對于不接受所述組合物的受試者，所述組合物減少所述無癥狀受試者的醫(yī)學(xué)病狀的癥狀的頻率或嚴(yán)重性，或延緩其發(fā)病。因此，癌癥的預(yù)防例如包括例如以統(tǒng)計上和/或臨床上顯著的量，減少接受預(yù)防性治療的患者群體相對于未治療對照群體的可檢測癌性生長的數(shù)量，和/或延緩治療群體相對于未治療對照群體的可檢測癌性生長的出現(xiàn)。感染的預(yù)防包括例如減少治療群體相對于未治療對照群體的感染的診斷的數(shù)量，和/或延緩治療群體相對于未治療對照群體的感染的癥狀的發(fā)病。疼痛的預(yù)防包括例如減小治療群體相對于未治療對照群體中的受試者所經(jīng)歷的疼痛感的強度或可替代地延緩疼痛感。

療法或藥劑(諸如激動劑、拮抗劑或抑制劑)的“治療有效量”(“有效量”)或“治療有效劑量”是藥物或療法當(dāng)向受試者施用時將具有預(yù)期的治療性作用的量。完全的治療性作用并不一定通過施用一次劑量而出現(xiàn)，而可能僅在施用一系列劑量之后才出現(xiàn)。因此，可以一次或多次施用來施用治療有效量。受試者所需的精確有效量將取決于例如受試者的身材、健康和年齡，以及受治療的病狀的性質(zhì)和程度。熟練技術(shù)人員可易于通過常規(guī)實驗確定給定情況的有效量。

“治療”病狀或患者是指采取措施以獲得有益的或所需的結(jié)果，包括臨床結(jié)果。如本文所用以及本領(lǐng)域中所熟知的，“治療”是用于獲得有益的或所需的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方式。有益的或所需的臨床結(jié)果可以包括但不限于一種或多種癥狀或病狀的緩解或改善、疾病程度的減小、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定(即不惡化)、疾病擴(kuò)散的預(yù)防、疾病進(jìn)程的延緩或減慢、疾病狀態(tài)的改善或緩和以及緩解(無論是部分緩解或是全部緩解)，無論是可檢測的或是不可檢測的。“治療”還可意指與未接受治療時期望的存活相比延長存活。

i.生物分子、修飾的生物分子和抗原

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種抗原，其包括通過活性氧(ros)或活性氮(rns)修飾的生物分子。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種抗原，其包括通過活性鹵素物質(zhì)(rhs)修飾的生物分子?？乖梢允切揎椀纳锓肿?。生物分子可以是蛋白質(zhì)，諸如糖蛋白、脂質(zhì)或碳水化合物。生物分子可通過細(xì)胞系(諸如癌細(xì)胞系或病原體)表達(dá)。在一些實施方案中，生物分子是分離的和/或純化的。例如，生物分子可以是重組蛋白或合成肽。修飾的生物分子或抗原可以是重組蛋白或合成肽?？乖梢允请[性抗原。

修飾的生物分子或抗原可以是包含修飾的氨基酸的蛋白質(zhì)或肽，所述氨基酸諸如硝基酪氨酸、二硝基酪氨酸、氯酪氨酸、二氯酪氨酸、二酪氨酸、2-氨基-3-(3，4-二氧代-環(huán)己-1，5-二烯基)-丙酸、間酪氨酸、鄰酪氨酸、l-dopa(3，4-二羥苯丙氨酸)、硝基苯基丙氨酸、氯苯基丙氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、瓜氨酸(例如，其中瓜氨酸替換精氨酸)、n-γ-硝基精氨酸、s-硝基半胱氨酸、半胱次磺酸、半胱亞磺酸、半胱氨酸磺酸、2-氧代組氨酸、天冬酰胺(例如，其中天冬酰胺替換組氨酸)、天冬氨酸(例如，其中天冬氨酸替換組氨酸)、羥脯氨酸、吡咯烷酮、谷氨酸半醛、2-氨基-3-酮丁酸、α-氨基己二酸半醛、羥基色氨酸、2-氧代-色氨酸、犬尿氨酸、n-甲酰犬尿氨酸、羥基賴氨酸、2-氨基己二酰-半醛、mda-賴氨酸、hne-賴氨酸、丙烯醛-賴氨酸、羧甲基賴氨酸或pha-賴氨酸。修飾的氨基酸可以是修飾的半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、組氨酸、賴氨酸或苯丙氨酸。修飾的生物分子或抗原可包括s-硝基谷胱甘肽。修飾的生物分子或抗原可包括4-羥基壬烯醛(“hne”)或丙二醛(“mda”)。修飾的生物分子可包括13-羥基-9z，11e-十八碳二烯酸、13-羥基-9e，11e-十八碳二烯酸、9-羥基-10e，12-e-十八碳二烯酸(9-ee-hode)、11-羥基-9z，12-z-十八碳二烯酸、4-羥基壬烯醛、13-羥基-9z，11e-十八碳二烯酸、9-羥基-10e，12-z-十八碳二烯酸、10-羥基-8e，12z-十八碳二烯酸、12-羥基-9z-13-e-十八碳二烯酸、13-羥基十八碳二烯酸或9-羥基十八碳二烯酸。

生物分子可選自以下各項：皮瓣結(jié)構(gòu)-特異性內(nèi)切核酸酶1(fen1)；高爾基體重組堆疊蛋白1(gorasp1)、具有g(shù)tp酶結(jié)構(gòu)域-錨蛋白重復(fù)序列和ph結(jié)構(gòu)域的arfgap1(agap1)；微管相關(guān)蛋白tau(mapt)；線粒體核糖體蛋白l46(mrpl46)；以及原鈣粘著蛋白β6(pcdhb6)。生物分子可以是包含編碼fen1、gorasp1、agap1、mapt、mrpl46或pcdhb6的氨基酸序列的子序列的肽。生物分子可以是包含與編碼fen1、gorasp1、agap1、mapt、mrpl46或pcdhb6的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽。子序列長度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸。

生物分子可以是tau、α-突觸核蛋白、淀粉樣蛋白β或淀粉樣蛋白β前體蛋白。生物分子可以是包含與編碼tau、α-突觸核蛋白、淀粉樣蛋白β或淀粉樣蛋白β前體蛋白的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽。

生物分子可以是abri蛋白、胰島淀粉樣多肽(胰淀素)、對應(yīng)于亨廷頓蛋白(huntingtin)的外顯子1的肽、孕激素α、雄激素受體蛋白的氨基端結(jié)構(gòu)域、共濟(jì)失調(diào)蛋白(ataxin)-1、drpla蛋白(萎縮蛋白-1)、超氧化物歧化酶i、β-2-微球蛋白或降鈣素。生物分子可以是包含與編碼以下各項的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽：abri蛋白、胰島淀粉樣多肽(胰淀素)、對應(yīng)于亨廷頓蛋白的外顯子1的肽、孕激素α、雄激素受體蛋白的氨基端結(jié)構(gòu)域、共濟(jì)失調(diào)蛋白-1、drpla蛋白(萎縮蛋白-1)、超氧化物歧化酶i、β-2-微球蛋白或降鈣素。

生物分子可以是半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)c、甲狀腺素運載蛋白、β2微球蛋白、血清淀粉樣蛋白a、免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、胰島素、溶菌酶(例如，人類溶菌酶)、α乳清蛋白、應(yīng)樂果甜蛋白(monellin)、雄激素受體蛋白的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域、乳凝集素(例如，medin)、凝溶膠蛋白、載脂蛋白a1、纖維蛋白原或心房利鈉因子。生物分子可以是包含與編碼以下各項的氨基酸的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽：半胱氨酸蛋白酶抑制劑c、甲狀腺素運載蛋白、β2微球蛋白、血清淀粉樣蛋白a蛋白、免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、胰島素、溶菌酶(例如，人類溶菌酶)、α乳清蛋白、應(yīng)樂果甜蛋白、雄激素受體蛋白的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域、乳凝集素(例如，medin)、凝溶膠蛋白、載脂蛋白a1、纖維蛋白原或心房利鈉因子。

生物分子可以是cd52、白細(xì)胞介素2受體、cd30、表皮生長因子受體、cd38、白細(xì)胞介素-1β、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、cd20、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(ctla-4)、cd3、免疫球蛋白e、呼吸道合胞病毒f蛋白、受體酪氨酸蛋白激酶erbb-2(her2/neu)、受體酪氨酸-蛋白激酶erbb-3(her3)、整合蛋白α4β7、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素23、白細(xì)胞介素6受體或整合蛋白α4亞基。

生物分子可以是4-1bb、活化素受體類型-2b、活化素受體樣激酶1、ags-22m6、甲胎蛋白、淀粉樣蛋白α、淀粉樣蛋白β、淀粉樣蛋白前體蛋白、血管生成素-2、炭疽毒素、b細(xì)胞活化因子(baff)、癌癥抗原125(ca-125/粘蛋白16)、碳酸酐酶9(ca-ix)、癌胚抗原(cea)、c-c趨化因子受體類型4(ccr4)、c-c趨化因子受體類型5(ccr5)、c-c基序趨化因子11(ccl11)、cd2、cd3、cd3ε、cd4、cd6、cd11、cd15、cd18、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd28、cd30、cd33、cd37、cd38、cd40、cd40配體(cd40l)、cd44、cd51、cd52、cd56、cd70、cd74、cd79b、cd80、cd125、cd147、cd152、cd154、cd200、cd221、cd274、cea相關(guān)抗原、趨化因子(c-c基序)配體2(ccl2)、密封蛋白-18、集落刺激因子1受體(csf1r)、補體成分5、含銅胺氧化酶3(aoc3)、巨細(xì)胞病毒糖蛋白b、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(ctla-4)、死亡受體-5(dr5/trailr2)、δ樣配體4(dll4)、二肽基肽酶4、大腸桿菌志賀毒素類型-1、大腸桿菌志賀毒素類型-2、含egf樣結(jié)構(gòu)域的蛋白7、唾液酸蛋白、內(nèi)毒素、表皮生長因子受體(her1)、上皮唾蛋白(episialin)、上皮細(xì)胞粘附分子(epcam)、因子d、成纖維細(xì)胞活化蛋白α、葉酸受體1、卷曲受體(frizzledreceptor)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、生長分化因子8、鳥苷酸環(huán)化酶2c、熱休克蛋白90、乙型肝炎表面抗原、肝細(xì)胞生長因子/分散因子(hgf/sf)、人類分散因子受體激酶、亨廷頓蛋白、免疫球蛋白e、免疫球蛋白ε鏈c區(qū)、流感血球凝集素(ha)、胰島素樣生長因子1(igf-1)受體、胰島素樣生長因子2(igf-2)、整合蛋白α4亞基、整合蛋白α4β7、整合蛋白α5β1、整合蛋白α7β7、整合蛋白αiibβ3、整合蛋白αv亞基、整合蛋白αvβ3、整合蛋白β2亞基、細(xì)胞間粘附分子1(icam-1)、干擾素α、干擾素γ、干擾素γ誘導(dǎo)蛋白、干擾素α/β受體、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素2受體、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素5、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素6受體、白細(xì)胞介素9、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素17、白細(xì)胞介素17a、白細(xì)胞介素17f、白細(xì)胞介素22、白細(xì)胞介素23、白細(xì)胞介素31受體a、低密度脂蛋白、l-選擇蛋白、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)性抗原1(cd11a)、淋巴毒素-α、賴氨酰氧化酶同系物2(loxl2)、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(mmif)、間皮素、金屬還原酶steap1、髓磷脂相關(guān)糖蛋白、肌生長抑制素、神經(jīng)生長因子(ngf)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白酶1、神經(jīng)氈蛋白-1、nogo-a、notch受體、pd-1、磷酸鈉共轉(zhuǎn)運蛋白、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、程序性細(xì)胞死亡蛋白1(cd279)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin類型9(pcsk9)、狂犬病病毒糖蛋白、核因子κb配體的受體活化劑(rankl)、受體酪氨酸蛋白激酶erbb-2(her2/neu)、受體酪氨酸蛋白激酶erbb-3(her3)、呼吸道合胞病毒f蛋白、網(wǎng)狀內(nèi)皮素-4、rh血型d抗原、恒河猴因子、硬化蛋白(sost)、選擇蛋白p、slam家族成員7、粘結(jié)蛋白聚糖1、腱生蛋白c、轉(zhuǎn)化生長因子β1(tgf-β1)、轉(zhuǎn)化生長因子β2(tgf-β2)、跨膜糖蛋白nmb、滋養(yǎng)層糖蛋白、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤相關(guān)性鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白2、腫瘤相關(guān)性糖蛋白72(tag-72)、tweak受體、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrp1)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、血管內(nèi)皮生長因子受體1、血管內(nèi)皮生長因子受體2或波形蛋白。

生物因子可以是與選自以下各項的細(xì)菌傳染病的病變相關(guān)的分子：炭疽病、細(xì)菌性腦膜炎、肉毒中毒、布氏桿菌病(brucellosis)、彎曲桿菌病(campylobacteriosis)、貓抓病、霍亂、白喉、淋病、膿皰病、軍團(tuán)桿菌病(legionellosis)、麻瘋病(漢森氏病(hansen′sdisease))、鉤端螺旋體病(leptospirosis)、李斯特菌病(listeriosis)、萊姆病(lymedisease)、類鼻疽病、mrsa感染、諾卡菌病(nocardiosis)、百日咳(pertussis/whoopingcough)、鼠疫、肺炎球菌肺炎(pneumococcalpneumonia)、鸚鵡病(psittacosis)、q熱病、落基山斑疹熱(rockymountainspottedfever，rmsf)、沙門氏菌病(salmonellosis)、猩紅熱、志賀氏菌病(shigellosis)、梅毒、破傷風(fēng)、沙眼、結(jié)核病、兔熱病(tularemia)、傷寒、斑疹傷寒(包括流行性斑疹傷寒)以及尿道感染。

生物分子可以是與選自以下各項的寄生蟲傳染病的病變相關(guān)的分子：阿米巴病(amoebiasis)、蛔蟲病(ascariasis)、焦蟲病(babesiosis)、恰加斯病(chagasdisease)、華支睪吸蟲病(clonorchiasis)、隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)、豬囊尾蚴病(cysticercosis)、裂頭絳蟲病(diphyllobothriasis)、麥地那龍線蟲病(dracunculiasis)、包蟲病(echinococcosis)、蟯蟲病(enterobiasis)、肝片吸蟲病(fascioliasis)、姜片蟲病(fasciolopsiasis)、絲蟲病(filariasis)、自生阿米巴感染、賈第蟲病(giardiasis)、顎口線蟲病(gnathostomiasis)、膜殼絳蟲病(hymenolepiasis)、孢子球蟲病(isosporiasis)、黑熱病(kaia-azar)、利什曼病(leishmaniasis)、瘧疾、后殖吸蟲病(metagonimiasis)、蠅蛆病、盤尾絲蟲病(onchocerciasis)、虱病(pediculosis)、蟯蟲感染、瘧原蟲、疥瘡、血吸蟲病(schistosomiasis)、絳蟲病(taeniasis)、弓蛔蟲病(toxocariasis)、弓形體病(toxoplasmosis)、橫膈旋毛蟲病(trichinellosis)、旋毛蟲病(trichinosis)、鞭蟲病(trichuriasis)、滴蟲病(trichomoniasis)以及錐蟲病(trypanosomiasis)(包括非洲錐蟲病)。

生物分子可以是與選自由以下組成的組的病毒性傳染病的病變相關(guān)的分子：aids、aids相關(guān)綜合癥、水痘(chickenpox/varicella)、普通感冒、巨細(xì)胞病毒感染(cytomegalovirusinfection)、科羅拉多蜱熱(coloradotickfever)、登革熱(denguefever)、埃博拉出血熱(ebolahaemorrhagicfever)、手足口病、肝炎、單純皰疹(herpessimplex)、帶狀皰疹(herpeszoster)、hpv、流感(influenza/flu)、拉沙熱(lassafever)、麻疹、馬爾堡出血熱(marburghaemorrhagicfever)、傳染性單核細(xì)胞增多癥、腮腺炎、脊髓灰質(zhì)炎、進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病(progressivemultifocalleukencephalopathy)、狂犬病、風(fēng)疹、sars、天花(smallpox/variola)、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅病(westniledisease)以及黃熱病。流感可以是甲型流感、乙型流感或丙型流感，并且甲型流感可以是亞型h3n2、h1n1或h5n1。體液人類免疫系統(tǒng)識別來自病毒的兩種主要免疫原性蛋白，即血凝素(ha)和神經(jīng)氨酸苷酶(na)。ha分子的頭部或頂部已知的表位區(qū)對應(yīng)于高變區(qū)。這些序列是高度可變的并且分離的序列在此區(qū)域內(nèi)具有變型。生物分子可以是流感的血凝素、神經(jīng)氨酸苷酶或m2質(zhì)子通道(例如，m2e肽)。生物分子可以是hiv的分化體bgag、蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、gp120、nef肽、脂肽、gp41或env。生物分子可以是丙型肝炎的包膜糖蛋白(e1/e2)。

生物分子可以是經(jīng)歷原纖維生成的球狀蛋白，并且與一種或多種蛋白構(gòu)象癥狀相關(guān)聯(lián)，所述生物分子包括半胱氨酸蛋白酶抑制劑c、甲狀腺素運載蛋白、β2微球蛋白、血清淀粉樣蛋白a以及其片段、亨廷頓蛋白以及其片段(包括亨廷頓蛋白的外顯子i)、免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、胰島素、溶菌酶(具體地是人類溶菌酶)、α乳清蛋白、應(yīng)樂果甜蛋白、雄激素受體蛋白的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域、乳凝集素以及更具體地其片段(例如，氨基酸殘基245-294；medin)、凝溶膠蛋白、載脂蛋白a1、纖維蛋白原以及其片段以及心房利鈉因子。

作為具體實例，在阿爾茨海默氏病中，病變與4kda淀粉樣蛋白β(aβ)肽的存在強烈相關(guān)，所述4kda淀粉樣蛋白β(aβ)肽是aβ肽前體(app)通過酶早老素1(ps1)裂解的部分。研究指示，aβ1-40的纖維狀形式刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，并且當(dāng)前被認(rèn)為在阿爾茨海默氏病的發(fā)病中起到重要作用(jekabsone，a.等，j.neuroinflammation3：24(2006))。aβ1-40的肽序列在表2中示出。在另一方面，aβ1-42被認(rèn)為有助于引發(fā)纖維狀aβ的形成，所述aβ1-42是斑塊形成aβ的微小部分。這種肽的“長形式”在表2中進(jìn)行描述。生物分子可以是例如aβ1-40、aβ1-42或前述任一者的子序列。

另一個具體實例是帕金森氏病(pd)。pd是影響1％-2％年齡超過50歲的個體的退行性神經(jīng)病癥。神經(jīng)病理學(xué)標(biāo)志的特征在于在稱為路易體(lb)的嗜酸性內(nèi)含物、細(xì)胞漿內(nèi)含物、蛋白質(zhì)內(nèi)含物存在下黑質(zhì)密部中的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性喪失。α-突觸核蛋白是路易體中最豐富的蛋白質(zhì)，并且它看起來在pd中是毒性的重要介體，甚至可能是病因因素。因此，減少毒性α-突觸核蛋白被認(rèn)為對于pd患者是有益的。衍生自全長蛋白質(zhì)的c端區(qū)的一種此類小鼠α-突觸核蛋白肽的序列在表2中示出。此外，消除或隔離硝化的α-突觸核蛋白以及其片段看起來對于患有pd的患者具有有利的作用。在本發(fā)明的一些實施方案中，生物分子是包含人類α-突觸核蛋白的氨基酸121-137(dneayempseegyqdye)的片段。在一些實施方案中，α-突觸核蛋白片段(121-137)序列在不同物質(zhì)中在位置121和位置122處被取代，在每個y(酪氨酸)位置處被三硝化，和/或在s129處被磷酸化。

在一些實施方案中，生物分子是基于與朊病毒疾病相關(guān)的肽序列。各種物質(zhì)的朊病毒序列通過harmeyer，s.等，jgenvirol.79(pt4)：937-45(1998)進(jìn)行公開，所述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。

在一些實施方案中，生物分子是基于衍生自超氧化物歧化酶i(sod1)的肽序列。已知sod1突變與一些形式的家族性als的病變具有因果關(guān)系。據(jù)報道，針對sod1的突變體形式(人類g93asod1重組蛋白)產(chǎn)生的抗血清對于攜帶g37r突變體sod1的als小鼠模型具有保護(hù)性作用，所述小鼠模型過度表達(dá)的sod1蛋白比內(nèi)源性小鼠sod1高4倍。

錯折疊蛋白在亨廷頓氏病(huntington′sdisease)中也起作用，所述亨廷頓氏病是由亨廷頓蛋白(htt)中的聚谷氨酰胺(polyq)通道的病理擴(kuò)張而導(dǎo)致的遺傳癥狀，引起神經(jīng)變性和過早死亡。結(jié)合到由亨廷頓蛋白的n-端17個氨基酸形成的表位的單鏈抗體(lecerf，j-m等，procnat’lacadsciusa98(8)：4764-4769(2001))已顯示減少亨廷頓氏病的果蠅模型(drosophilamodel)中的病狀。(wolfgang，wj等，procnat’lacadsciusa.102(32)：11563-11568(2005))。

另一個具體實例是透析相關(guān)性淀粉樣變性(dra)。dra可能是由不同形式的血液過濾導(dǎo)致的，所述血液過濾諸如血液透析、血液過濾或連續(xù)不臥床腹膜透析(capd)。dra在透析超過15年的患者中具有大于95％的發(fā)病率，其中β-2-微球蛋白(b2m)淀粉樣變性是普遍的并且隨時間可預(yù)測地增加。已在臨床環(huán)境下觀察到b2m的構(gòu)象異構(gòu)體。b2m是人類白細(xì)胞抗原(hla)i類分子的部分，并且它具有淀粉樣蛋白原纖維的突出的β折疊結(jié)構(gòu)特征。已知b2m作為分布在細(xì)胞外空間的未結(jié)合單體進(jìn)行循環(huán)。b2m經(jīng)歷原纖維生成而在各種組織中形成淀粉樣沉積物。此沉積造成腎衰竭，所述腎衰竭造成b2m的合成和釋放增加，從而使病狀惡化。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，生物分子可以是β2微球蛋白或其片段。b2m的示例性片段是表2中跨氨基酸殘基21-40的片段，其適用作本發(fā)明的生物分子。

生物分子可以是包含與編碼任一種前述生物分子的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的肽。子序列長度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400或500個氨基酸。對疾病狀態(tài)或不良反應(yīng)具有一些重要性的肽序列可通過對相關(guān)表位的實驗研究來識別。這些序列可包括非天然存在的肽序列，例如適用于治療疾病或病狀的序列(參見，例如wo2006/031727和us6,930,168，其各自以引用的方式整體并入本文)。

此外，表位可通過以下方式憑經(jīng)驗確定：通過對合成組合肽文庫進(jìn)行位置掃描來識別候選序列，或通過制備感興趣的整個蛋白質(zhì)的重疊肽序列，并且使用例如適用于此類目的的任何讀出測定來測試那些肽的免疫反應(yīng)性，所述讀出測定諸如hi測定、病毒攻擊模型或?qū)τ诩膊』蛭镔|(zhì)(針對其尋找新型抗原或抗體)適當(dāng)?shù)捏w外或體內(nèi)測定系統(tǒng)。候選分子可包括在合成過程中或在合成之后通過例如糖添加和/或修飾糖添加(諸如糖基化和糖合成，n-連接的或s-連接的)、脂肪酸修飾(諸如十四烷基化)或二硫鍵形成來修飾的肽。在識別候選表位之后，一組另外的相關(guān)表位可使用亞株變體、集群變體、滑移變體、位移變體或者通過在可易于獲得的參考文獻(xiàn)(例如，wo2000/042559，它以引用的方式并入本文)中描述的建模和預(yù)測算法來生成?？捎米鞅景l(fā)明的生物分子的各種子序列在表1和表2中呈現(xiàn)。

表1.可用作本發(fā)明的生物分子的病毒蛋白的子序列

表2.可用作本發(fā)明的生物分子的人類蛋白質(zhì)的子序列

修飾的生物分子可包含的表位相對于未修飾的生物分子上的相同表位具有增加的免疫原性。

在一些實施方案中，生物分子通過rns進(jìn)行修飾，所述rns是一氧化氮或過氧化亞硝酸鹽。生物分子可以是通過酪氨酸的硝化、硫醇的s-亞硝基化或金屬離子的亞硝化進(jìn)行修飾的蛋白質(zhì)。生物分子可通過金屬離子的亞硝化進(jìn)行修飾，其中所述金屬離子是鐵。金屬離子可以是銅、鉻、錳或鈷。在一些實施方案中，生物分子包括卟啉(諸如血紅素，例如血紅素a、血紅素b、血紅素c或血紅素o)，并且生物分子通過對結(jié)合到卟啉的金屬離子進(jìn)行亞硝化來修飾。生物分子可包括鈷胺素，諸如甲基鈷胺素或腺苷鈷胺。

生物分子可使用以下各項修飾：過氧化亞硝酸、過氧化亞硝酸鹽、一氧化氮、二氧化氮、二氧化氮基、三氧化二氮、亞硝鎓陽離子、亞硝基硫酸鹽、亞硝基高氯酸鹽、四氟硼酸亞硝鎓、亞硝基過氧碳酸鹽、硝鎓陽離子、碳酸根、過氧化一碳酸根、羧基、過氧化物、過氧化氫、有機過氧化氫、過氧基、烷氧基、超氧化物、單線態(tài)氧、羥基、臭氧、氧硫基、次鹵酸鹽、次氯酸鹽、次溴酸鹽、次硫氰酸鹽、硝酰氯、鹵胺、單氯胺、溴胺、二氧化氯或磷酸根。

ii.抗體、抗體片段以及嵌合抗原受體

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種選擇性地結(jié)合到修飾的生物分子的抗體，其中抗體對于修飾的生物分子的親和力大于抗體對于未修飾的生物分子的親和力。例如，抗體對于修飾的生物分子的親和力可比抗體對于未修飾的生物分子的親和力高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、10,000％或100,000％。

在某些實施方案中，抗體對于修飾的生物分子的親和力與抗體對于未修飾的生物分子的親和力大約相同。例如，抗體對于修飾的生物分子的親和力可以是抗體對于未修飾的生物分子的親和力的0.1倍與10倍之間。

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種選擇性地結(jié)合到未修飾的生物分子的抗體，其中抗體對于未修飾的生物分子的親和力大于抗體對于修飾的生物分子的親和力。例如，抗體對于未修飾的生物分子的親和力可比抗體對于修飾的生物分子的親和力高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、10,000％或100,000％。

抗體可以是分離的抗體。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體?？贵w可以是人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在一些實施方案中，抗體是igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg3或igg4抗體。

在某些方面，本發(fā)明涉及一種編碼抗體的分離的核酸。在某些方面，本發(fā)明涉及一種包含編碼抗體的外源核酸的細(xì)胞。在某些方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)表達(dá)編碼所述抗體的核酸的細(xì)胞。

在某些方面，本發(fā)明涉及一種包含抗體的組合物，其中所述抗體綴合到細(xì)胞毒性劑。

在某些方面，本發(fā)明涉及一種抗體片段，所述抗體片段包含抗體的抗原結(jié)合區(qū)。抗體片段可以是單鏈可變片段(scfv)?？贵w片段可以是抗原結(jié)合片段(fab)、化學(xué)地連接的fab片段或fab片段，其包括鉸鏈區(qū)f(ab’)2、二聚體scfv(雙scfv)、單結(jié)構(gòu)域抗體(sdab)、三官能抗體(3funct)或雙特異性t細(xì)胞接合器(bite)。

在某些方面，本發(fā)明涉及一種編碼所述抗體片段的核酸。在某些方面，本發(fā)明涉及一種包含編碼所述抗體片段的外源核酸的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在某些方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗體片段的方法，所述方法包括培養(yǎng)表達(dá)編碼所述抗體片段的核酸的細(xì)胞。在某些方面，本發(fā)明涉及一種包含抗體片段的組合物，其中所述抗體片段綴合到細(xì)胞毒性劑。

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含如本文所述的抗體或抗體片段諸如scfv的嵌合抗原受體。在某些方面，本發(fā)明涉及一種編碼所述嵌合抗原受體的核酸。在某些方面，本發(fā)明涉及一種包含編碼所述嵌合抗原受體的外源核酸的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在某些方面，本發(fā)明涉及一種包含所述嵌合抗原受體的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。包含所述嵌合抗原受體的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞，諸如t細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是外周血單核細(xì)胞。包含所述嵌合抗原受體的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是人類淋巴細(xì)胞，諸如人類t細(xì)胞。

iii.克隆細(xì)胞、表達(dá)細(xì)胞以及治療性細(xì)胞

在一些方面，本發(fā)明涉及一種包含如本文所述的抗體、抗體片段或嵌合抗原受體的細(xì)胞。在一些實施方案中，細(xì)胞包含編碼如本文所述的抗體、抗體片段或嵌合抗原受體的核酸。在一些實施方案中，細(xì)胞表達(dá)如本文所述的抗體、抗體片段或嵌合抗原受體。

細(xì)胞可選自以下各項：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞桿菌、蜥蜴利什曼原蟲(leishmaniatarentolae)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)、煙草(nicotiana)、黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)、草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)、粉紋夜蛾(trichoplusiani)、原雞(gallusgallus)、小家鼠(musmusculus)、野豬(susscrofa)、綿羊(ovisaries)、野山羊(capraaegagrus)、奶牛(bostaurus)、sf9細(xì)胞、sf21細(xì)胞、schneider2細(xì)胞、schneider3細(xì)胞、highfive細(xì)胞、ns0細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(“cho”)細(xì)胞、幼倉鼠腎臟細(xì)胞、cos細(xì)胞、vero細(xì)胞、hela細(xì)胞以及hek293細(xì)胞。例如，細(xì)胞可包含編碼抗體、抗體片段或嵌合抗原受體的核酸，并且所述細(xì)胞可以是大腸桿菌，例如以用于克隆所述核酸。細(xì)胞可包含編碼抗體或抗體片段的核酸，并且所述細(xì)胞可以是cho細(xì)胞，例如以用于表達(dá)所述抗體或抗體片段。

細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞，諸如t細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞。細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞并且包含編碼嵌合抗原受體的核酸。細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞并且包含嵌合抗原受體。細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞并且所述淋巴細(xì)胞可表達(dá)嵌合抗原受體。細(xì)胞可以是t細(xì)胞并且所述t細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體，例如，其中所述嵌合抗原受體選擇性地結(jié)合到修飾的生物分子。細(xì)胞可例如通過缺失一個或多個hla蛋白來進(jìn)行修飾以用于同種異體移植。

iv.疫苗

在某些方面，本發(fā)明涉及一種包含抗原的疫苗?？乖梢允侨绫疚乃龅男揎椀纳锓肿印Ｒ呙邕€可包含藥學(xué)上可接受的載體。

包含修飾的生物分子的疫苗可促進(jìn)針對靶標(biāo)生物分子的主動免疫，所述靶標(biāo)生物分子包含或不包含存在于疫苗中的修飾。例如，包含修飾的生物分子的疫苗可誘導(dǎo)受試者生成針對自身抗原的自身免疫應(yīng)答，所述自身抗原諸如與癌癥、炎性疾病或神經(jīng)變性疾病相關(guān)聯(lián)的自身抗原。類似地，包含修飾的生物分子的疫苗可誘導(dǎo)受試者生成針對存在于病原體或毒素上的抗原的免疫應(yīng)答，所述抗原通常不會激發(fā)免疫應(yīng)答，諸如所述病原體的隱性表位。另外，包含修飾的生物分子的疫苗可誘導(dǎo)受試者生成針對生物分子的特異性表位的免疫應(yīng)答，所述生物分子可引起的免疫應(yīng)答比針對未修飾的生物分子引起的免疫應(yīng)答更有利(例如，更耐久、更強烈或兩者)。例如，修飾的生物分子可包含的表位相對于未修飾的生物分子上的相同表位具有增加的免疫原性，從而增加針對所述表位的免疫應(yīng)答。

v.用于產(chǎn)生抗原的方法

在某些方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗原的方法，所述方法包括將細(xì)胞與活性氧(ros)或活性氮(rns)接觸，其中ros或rns對由細(xì)胞產(chǎn)生的生物分子進(jìn)行修飾，并且抗原是修飾的生物分子或修飾的生物分子上的表位。在某些方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗原的方法，所述方法包括將細(xì)胞與活性鹵素物質(zhì)(rhs)接觸，其中rhs對由細(xì)胞產(chǎn)生的生物分子進(jìn)行修飾，并且抗原是修飾的生物分子或修飾的生物分子上的表位。

在某些方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗原的方法，所述方法包括將生物分子與活性氧(ros)或活性氮(rns)接觸，其中ros或rns對生物分子進(jìn)行修飾，并且抗原是修飾的生物分子或修飾的生物分子上的表位。在某些方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗原的方法，所述方法包括將細(xì)胞與活性鹵素物質(zhì)(rhs)接觸，其中rhs對生物分子進(jìn)行修飾，并且抗原是修飾的生物分子或修飾的生物分子上的表位。

生物分子可以是蛋白質(zhì)或脂質(zhì)。例如，生物分子可選自以下各項：皮瓣結(jié)構(gòu)-特異性內(nèi)切核酸酶1(fen1)；高爾基體重組堆疊蛋白1(gorasp1)、具有g(shù)tp酶結(jié)構(gòu)域-錨蛋白重復(fù)序列和ph結(jié)構(gòu)域的arfgap1(agap1)；微管相關(guān)蛋白tau(mapt)；線粒體核糖體蛋白l46(mrpl46)；以及原鈣粘著蛋白β6(pcdhb6)。生物分子可以是以上部分i中所描述的任一種生物分子。

所述方法可包括將生物分子與一氧化氮、一氧化氮供體(例如，nonoate)或亞硝化劑(例如，過氧化亞硝酸鹽)接觸。例如，所述方法可包括將生物分子與nonoate化合物一起孵育，其中所述方法包括將生物分子與一氧化氮接觸，并且nonoate化合物產(chǎn)生一氧化氮。所述方法可包括將生物分子與nonoate化合物一起孵育，其中所述方法包括將生物分子與一氧化氮供體接觸，并且nonoate化合物是一氧化氮供體。nonoate化合物可以是二亞乙基三胺nonoate。所述方法可包括將生物分子與過氧化亞硝酸鹽或任何其他亞硝化化合物接觸。

在一些實施方案中，組合物包含生物分子，所述組合物諸如包含細(xì)胞的組合物(即，其中所述細(xì)胞包含所述生物分子)、包含細(xì)胞裂解物的組合物、包含病毒的組合物(即，其中所述病毒包含所述生物分子)或包含生物分子和溶劑(例如，水)的組合物。所述方法可包括將組合物與一氧化氮、一氧化氮供體(例如，nonoate)或亞硝化劑(例如，過氧化亞硝酸鹽)接觸。例如，所述方法可包括將組合物與nonoate化合物一起孵育，其中所述方法包括將組合物與一氧化氮接觸，并且nonoate化合物產(chǎn)生一氧化氮。所述方法可包括將組合物與nonoate化合物一起孵育，其中所述方法包括將組合物與一氧化氮供體接觸，并且nonoate化合物是一氧化氮供體。nonoate化合物可以是二亞乙基三胺nonoate。所述方法可包括將組合物與過氧化亞硝酸鹽或任何其他亞硝化化合物接觸。

方法可包括將生物分子與以下各項接觸：過氧化亞硝酸、過氧化亞硝酸鹽、一氧化氮、二氧化氮、二氧化氮基、三氧化二氮、亞硝鎓陽離子、亞硝基硫酸鹽、亞硝基高氯酸鹽、四氟硼酸亞硝鎓、亞硝基過氧碳酸鹽、硝鎓陽離子、碳酸根、過氧化一碳酸根、羧基、過氧化物、過氧化氫、有機過氧化氫、過氧基、烷氧基、超氧化物、單線態(tài)氧、羥基、臭氧、氧硫基、次鹵酸鹽、次氯酸鹽、次溴酸鹽、次硫氰酸鹽、硝酰氯、鹵胺、單氯胺、溴胺、二氧化氯或磷酸根。

組合物可與ros或rns一起孵育至少5分鐘，諸如至少10分鐘、至少20分鐘、至少30分鐘、至少45分鐘、至少1小時、至少2小時、至少4小時、至少8小時、至少12小時、至少16小時或至少18小時。

在一些實施方案中，接觸包括與活性氧、活性氮或活性鹵素物質(zhì)一起孵育至少5分鐘，諸如至少10分鐘、至少20分鐘、至少30分鐘、至少45分鐘、至少1小時、至少2小時、至少4小時、至少8小時、至少12小時、至少16小時或至少18小時。

在一些實施方案中，抗原可通過合成生物分子(例如，通過合成“修飾的生物分子”)產(chǎn)生。例如，抗原可以是肽，并且產(chǎn)生抗原可包括例如使用復(fù)制氧化損傷的特征的一種或多種氨基酸(或氨基酸混合物)來合成肽。例如，肽可在肽的氨基酸序列中的一個或多個位置處使用硝基酪氨酸(即，包含合適的保護(hù)基團(tuán)，例如用于fmoc或tboc化學(xué))代替酪氨酸來合成。類似地，肽可在肽的氨基酸序列中的一個或多個位置處使用硝基酪氨酸和酪氨酸的混合(例如，以1∶10、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1的比率)來合成。

vi.用于識別抗體的方法

在一些方面，本發(fā)明涉及一種識別抗體的方法，所述方法包括將細(xì)胞與活性氧(ros)或活性氮(rns)接觸，其中ros或rns對生物分子進(jìn)行修飾；以及選擇結(jié)合到修飾的生物分子的抗體。

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及識別抗體的方法，所述方法包括：將生物分子與活性氧(ros)或活性氮(rns)接觸以便對生物分子進(jìn)行修飾；以及選擇結(jié)合到修飾的生物分子的抗體。生物分子可以是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或碳水化合物。生物分子可以是本文所述的任一種生物分子。例如，生物分子可以是皮瓣結(jié)構(gòu)-特異性內(nèi)切核酸酶1(fen1)；高爾基體重組堆疊蛋白1(gorasp1)、具有g(shù)tp酶結(jié)構(gòu)域-錨蛋白重復(fù)序列和ph結(jié)構(gòu)域的arfgap1(agap1)；微管相關(guān)蛋白tau(mapt)；線粒體核糖體蛋白l46(mrpl46)；或原鈣粘著蛋白β6(pcdhb6)。生物分子可以是包含與編碼fen1、gorasp1、agap1、mapt、mrpl46或pcdhb6的氨基酸序列的子序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列的肽或多肽。生物分子可以是包含氨基酸序列的肽或多肽，所述氨基酸序列是編碼fen1、gorasp1、agap1、mapt、mrpl46或pcdhb6的氨基酸序列的子序列。

所述方法可包括將生物分子與一氧化氮、一氧化氮供體或亞硝化劑接觸。例如，所述方法可包括在nonoate化合物產(chǎn)生一氧化氮的條件下與nonoate化合物一起孵育。nonoate化合物可以是二亞乙基三胺nonoate(deta-nonoate)或二乙基胺nonoate(dea-nonoate)。所述方法可包括將生物分子與過氧化亞硝酸鹽接觸。方法可包括將生物分子與以下各項接觸：過氧化亞硝酸、過氧化亞硝酸鹽、一氧化氮、二氧化氮、二氧化氮基、三氧化二氮、亞硝鎓陽離子、亞硝基硫酸、亞硝基高氯酸鹽、四氟硼酸亞硝鎓、亞硝基過氧碳酸鹽、硝鎓陽離子、碳酸根、過氧化一碳酸根、羧基、過氧化物、過氧化氫、有機過氧化氫、過氧基、烷氧基、超氧化物、單線態(tài)氧、羥基、臭氧、氧硫基、次鹵酸鹽、次氯酸鹽、次溴酸鹽、次硫氰酸鹽、硝酰氯、鹵胺、單氯胺、溴胺、二氧化氯或磷酸根。

在一些實施方案中，接觸包括與活性氧、活性氮或活性鹵素物質(zhì)一起孵育至少5分鐘，諸如至少10分鐘、至少20分鐘、至少30分鐘、至少45分鐘、至少1小時、至少2小時、至少4小時、至少8小時、至少12小時、至少16小時或至少18小時。

在一些實施方案中，接觸包括與過氧化亞硝酸鹽一起孵育至少5分鐘，諸如至少10分鐘、至少20分鐘、至少30分鐘、至少45分鐘、至少1小時、至少2小時、至少4小時、至少8小時、至少12小時、至少16小時或至少18小時。

選擇抗體可包括將動物暴露于修飾的生物分子，以及分離動物所產(chǎn)生的抗體。

選擇抗體可包括將動物暴露于修飾的生物分子；將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞從動物分離；分離由所述細(xì)胞產(chǎn)生的抗體；以及確認(rèn)抗體結(jié)合到修飾的生物分子。

動物可以是小鼠、大鼠、兔、豬、馬或羊。

在一些實施方案中，選擇抗體包括通過噬菌體展示選擇抗體。

vii.用于治療受試者的方法

在一些方面，本發(fā)明涉及一種用于治療受試者的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的修飾的生物分子的組合物(主動免疫)。在其他方面，本發(fā)明涉及一種用于治療受試者的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的抗體或抗體片段的組合物(被動免疫)。在一些方面，本發(fā)明涉及一種用于治療受試者的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的細(xì)胞的組合物，例如，其中細(xì)胞包含嵌合抗原受體和/或編碼嵌合抗原受體的核酸。在一些方面，本發(fā)明涉及一種用于治療受試者的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的核酸的組合物，例如，其中核酸編碼如本文所述的抗體、抗體片段或嵌合抗原受體。

在一些方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療受試者中的疾病或病狀的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的修飾的生物分子的組合物(主動免疫)。在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療受試者中的疾病或病狀的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的抗體或抗體片段的組合物(被動免疫)。在一些方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療受試者中的疾病或病狀的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的細(xì)胞的組合物，例如，其中細(xì)胞包含嵌合抗原受體和/或編碼嵌合抗原受體的核酸。在一些方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療受試者中的疾病或病狀的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的核酸的組合物，例如，其中核酸編碼如本文所述的抗體、抗體片段或嵌合抗原受體。

受試者可選自嚙齒類動物、兔類動物、貓科動物、犬科動物、豬科動物、羊科動物、牛科動物、馬科動物以及靈長類動物。受試者可以是人類受試者。

受試者可患有瘤，并且所述方法可以是一種用于治療所述瘤的方法。受試者可患有癌癥，諸如結(jié)腸癌、黑素瘤、卵巢癌或乳腺癌。受試者可患有前列腺癌、胃癌(stomachcancer)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺癌或肺癌。

例如，受試者可患有病毒感染，并且所述方法可以是用于治療所述病毒感染的方法。例如，受試者可患有細(xì)菌感染，并且所述方法可以是用于治療所述細(xì)菌感染的方法。例如，受試者可患有寄生蟲感染(諸如利什曼病)，并且所述方法可以是用于治療所述寄生蟲感染的方法。

所述疾病或病狀可以是瘤。所述瘤可以是癌癥。所述瘤可以是成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腺癌、轉(zhuǎn)移性腦癌、腎上腺皮質(zhì)癌、肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin′slymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌(gastriccancer)、胃腸癌、結(jié)腸直腸癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑素瘤、頭頸癌、鼻咽癌、胰腺癌或腎細(xì)胞癌。

所述疾病或病狀可以是病毒感染、細(xì)菌感染或寄生蟲感染。所述疾病或病狀可以是艱難梭菌(clostridiumdifficile)、hiv、膿毒癥、埃博拉、利什曼病、流感、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、假絲酵母(candida)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒或狂犬病。受試者可處于發(fā)展以下疾病的風(fēng)險下：艱難梭菌、hiv、膿毒癥、埃博拉、利什曼病、流感、金黃色葡萄球菌、假絲酵母、銅綠假單胞菌、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒或狂犬病。所述疾病或病狀可以是aids、aids相關(guān)綜合癥、水痘、普通感冒、巨細(xì)胞病毒感染、科羅拉多蜱熱、登革熱、埃博拉出血熱、手足口病、肝炎、單純皰疹、帶狀皰疹、人乳頭瘤病毒(hpv)、流感、拉沙熱、麻疹、馬爾堡出血熱、傳染性單核細(xì)胞增多癥、腮腺炎、脊髓灰質(zhì)炎、進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病、風(fēng)疹、sars、天花、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅病或黃熱病。受試者可處于發(fā)展以下疾病的風(fēng)險下：aids、aids相關(guān)綜合癥、水痘、普通感冒、巨細(xì)胞病毒感染、科羅拉多蜱熱、登革熱、埃博拉出血熱、手足口病、肝炎、單純皰疹、帶狀皰疹、hpv、流感、拉沙熱、麻疹、馬爾堡出血熱、傳染性單核細(xì)胞增多癥、腮腺炎、脊髓灰質(zhì)炎、進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病、狂犬病、風(fēng)疹、sars、天花、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅病或黃熱病。所述疾病或病狀可以是阿米巴病、蛔蟲病、焦蟲病、恰加斯病、華支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、豬囊尾蚴病、裂頭絳蟲病、麥地那龍線蟲病、包蟲病、蟯蟲病、肝片吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、自生阿米巴感染、賈第蟲病、顎口線蟲病、膜殼絳蟲病、孢子球蟲病、黑熱病、瘧疾、后殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、蟯蟲感染、瘧原蟲、疥瘡、血吸蟲病、絳蟲病、弓蛔蟲病、弓形體病、橫膈旋毛蟲病、旋毛蟲病、鞭蟲病、滴蟲病或錐蟲病(包括非洲錐蟲病)。受試者可處于發(fā)展以下疾病的風(fēng)險下：阿米巴病、蛔蟲病、焦蟲病、恰加斯病、華支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、豬囊尾蚴病、裂頭絳蟲病、麥地那龍線蟲病、包蟲病、蟯蟲病、肝片吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、自生阿米巴感染、賈第蟲病、顎口線蟲病、膜殼絳蟲病、孢子球蟲病、黑熱病、瘧疾、后殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、蟯蟲感染、瘧原蟲、疥瘡、血吸蟲病、絳蟲病、弓蛔蟲病、弓形體病、橫膈旋毛蟲病、旋毛蟲病、鞭蟲病、滴蟲病或錐蟲病。受試者可暴露于毒素，諸如炭疽。

所述疾病或病狀可以是炎性疾病。所述疾病或病狀可以是炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病(crohn’sdisease)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斑塊型銀屑病、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、狼瘡、哮喘、系統(tǒng)性硬皮病、皮肌炎或多發(fā)性肌炎。

所述疾病或病狀可以是神經(jīng)變性疾病。所述疾病或病狀可以是阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、散發(fā)性肌萎縮性側(cè)索硬化、拉福拉病(laforadisease)或亨廷頓氏病。所述疾病或病狀可以是荷蘭遺傳性腦出血伴隨淀粉樣變性(腦血管淀粉樣變性)、嗜剛果紅血管病(congophilicangiopathy)、皮克氏病(pick′sdisease)、進(jìn)行性核上性麻痹、家族性英國型癡呆癥、路易體相關(guān)性疾病、多系統(tǒng)萎縮癥、哈勒沃登-施帕茨病(hallervorden-spatzdisease)、脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)元核內(nèi)包涵體疾病、遺傳性齒狀核紅核-蒼白球底丘腦核萎縮(hereditarydentatorubral-pallidoluysianatrophy)、朊病毒相關(guān)性疾病、綿羊瘋癢病、牛海綿狀腦病、克羅伊茨費爾特-雅各布病(creutzfeldt-jakobdisease)、格-施-沙綜合征(gerstmann-straussler-scheinkersyndrome)、庫魯病(kuru)、致命性家族性失眠癥(fatalfamilialinsomnia)、遺傳性半胱氨酸蛋白酶抑制劑c淀粉樣血管病或拳擊員癡呆癥。

所述疾病或病狀可以是阿斯佩各綜合征(aspergersyndrome)、孤獨癥、adhd、高膽固醇血癥、血脂異常、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、心力衰竭、缺血性再灌注損傷、缺血性中風(fēng)、血栓栓塞、肌營養(yǎng)不良、脆性x綜合征(fragilexsyndrome)、鐮狀紅細(xì)胞病、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、早老癥、扁平苔蘚、白癜風(fēng)、支氣管肺發(fā)育不良、成人呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、闌尾炎、胰腺炎、急性胰腺炎、酒精中毒、糖尿病、黃斑變性、葡萄膜炎、白內(nèi)障生成、骨質(zhì)疏松、少肌癥、慢性疲勞綜合征或坐骨神經(jīng)痛。

受試者可經(jīng)歷過移植，諸如同種異體移植或異種移植。受試者可處于器官移植排斥的風(fēng)險下。受試者可患有移植物抗宿主疾病。

受試者可患有缺血或血栓栓塞，或者患者可處于缺血或發(fā)展栓塞的風(fēng)險。受試者可患有心臟病或缺血性中風(fēng)，或者受試者可處于患心臟病或缺血性中風(fēng)的風(fēng)險下。

所述疾病或病狀可以是癌癥，并且修飾的生物分子可以是修飾的fen1蛋白或其一部分。所述方法可包括例如在向受試者施用包含修飾的生物分子、抗體、細(xì)胞或核酸的組合物之前，鑒定患有過度表達(dá)fen1的癌癥的受試者。過度表達(dá)fen1的癌癥包括結(jié)腸癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺癌以及肺癌。

所述疾病或病狀可以是神經(jīng)變性疾病，諸如阿爾茨海默氏病或帕金森氏病，并且修飾的生物分子可以是修飾的tau蛋白或其一部分。所述方法可包括鑒定患有與tau相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)變性疾病的受試者。與tau相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)變性疾病包括阿爾茨海默氏病和帕金森氏病。

所述疾病或病狀可以是利什曼病，并且修飾的生物分子可以是修飾的利什曼原蟲蛋白。所述方法可包括鑒定患有利什曼病的受試者。所述方法可包括例如通過在向受試者預(yù)防性地施用如本文所述的修飾的生物分子、抗體或抗體片段預(yù)防受試者中的利什曼病。

施用可包括注射組合物。注射組合物可包括靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射或瘤內(nèi)注射。

此公開將根據(jù)以下實驗細(xì)節(jié)得到更好的理解。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將易于理解，所討論的具體方法和結(jié)果僅僅是說明性的，在隨后的實施方案中將對本公開進(jìn)行更充分的描述。

例證

實施例1-使用b16細(xì)胞和細(xì)胞裂解物生成抗原和抗體的方法

b16作為小鼠黑素瘤腫瘤和免疫療法模型。皮下模型廣泛用于評價在許多腫瘤模型中的療法，所述腫瘤模型包括免疫原性差的c57bl/6衍生的b16黑素瘤(圖2)。在皮下注射之后，b16將在5天至10天內(nèi)形成可觸知的腫瘤，并且在14天至21天內(nèi)生長為最小1×1×1-cm的腫瘤，從而產(chǎn)生通過no和no相關(guān)分子增加的b16衍生的抗原免疫原性。將培養(yǎng)的b16細(xì)胞體外處理到緩慢釋放no的化合物二亞乙基三胺nonoate(deta-nonoate)(250μm-相對低的濃度)18小時，以便促進(jìn)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，從而引起新腫瘤相關(guān)性抗原的出現(xiàn)并且在通過超聲裂解之后將b16細(xì)胞轉(zhuǎn)化成更具有免疫原性的并用作抗原(novax)。

修飾。在31μm的no衍生的硝化劑過氧化亞硝酸鹽(onoo^-)存在下在室溫下將通過超聲獲得的未處理的總培養(yǎng)的b16細(xì)胞裂解物孵育3小時，接著在4℃下孵育48小時，并且用作抗原(nivax)。將抗原制劑冷凍并保存在-80℃下，直至將其用于主動治療性免疫中或用于生成用于被動治療性治療攜帶腫瘤的小鼠的抗血清。

用于被動治療性治療(血清轉(zhuǎn)移)和抗體發(fā)現(xiàn)的抗血清生成。在皮下(sc)使用100μl(～100μg的蛋白質(zhì))未處理的b16裂解物(對照vax)、重編程的b16裂解物(novax)或修飾的b16裂解物(nivax)對未攜帶腫瘤的c57bl/6雌性小鼠(6-12周大)進(jìn)行免疫。在第7天和第21天給予使用相同劑量和濃度的抗原進(jìn)行加強免疫。在最后一次加強免疫14天之后，通過心臟刺穿從co2安樂死的動物中采集血液。在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，將三個劑量(每個20μl)的來自單個實驗組的合并的血清在腹膜內(nèi)(ip)施用給攜帶腫瘤的小鼠。每周兩次對腫瘤負(fù)荷進(jìn)行監(jiān)測。給藥方法在圖3中進(jìn)行描繪。

黑素瘤的主動治療性免疫。在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，在皮下(sc)使用100μl(～100μg的蛋白質(zhì))未處理的b16裂解物(對照vax或cvax)、重編程的b16裂解物(novax)或修飾的b16裂解物(nivax)對攜帶b16-f0腫瘤的c57bl/6雌性小鼠(6-12周大)進(jìn)行免疫。

黑素瘤的被動治療性免疫。在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，將三個劑量(每個20μl)的來自單個實驗組的合并的血清在腹膜內(nèi)(ip)施用給攜帶b16-f0腫瘤的小鼠。通過腫瘤體積(mm³)±sem來評估腫瘤負(fù)荷。**＝p＜0.01|n＝10。

結(jié)果。與使用未處理的b16裂解物(對照vax或cvax)相比，使用重編程的b16裂解物(novax)或修飾的b16裂解物(nivax)的主動免疫以治療性方式使用，顯著減少了腫瘤生長。然而，僅修飾的b16裂解物(nivax)在被動血清轉(zhuǎn)移治療性方式中顯示出顯著的腫瘤生長延遲，這表明在重編程的b16裂解物(novax)處理的小鼠中不存在的腫瘤抑制性因子存在于修飾的b16裂解物(nivax)免疫的小鼠的血清中(圖4)。

實施例2-使用b16細(xì)胞和細(xì)胞裂解物生成抗原和抗體的方法

修飾的b16裂解物(nivax)生成的抗血清針對未修飾的和修飾的b16蛋白質(zhì)裂解物反應(yīng)。通過sds-page對從未修飾的b16-f0(b16)、過氧化亞硝酸鹽修飾的b16-f0(nb16)以及非黑素瘤小鼠細(xì)胞系el4純化的總蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行解析，并且使用以下各項作為一級抗體對其進(jìn)行免疫印跡：a)對照未免疫的抗血清；b)對照未處理的b16裂解物(對照vax)抗血清；c)修飾的b16裂解物(nivax)抗血清；以及d)不使用抗血清。使用辣根過氧化物酶(hrp)綴合的抗小鼠igg作為二級抗體。

結(jié)果。修飾的b16裂解物(nivax)抗血清證實了針對修飾的和未修飾的黑素瘤b16-f0純化的蛋白質(zhì)，而不是針對非黑素瘤el4(c57bl/6衍生的鼠胸腺瘤細(xì)胞系)純化的蛋白質(zhì)的選擇性免疫反應(yīng)性活性，這表明選擇性免疫反應(yīng)性抗體的生成不限于特定的蛋白質(zhì)修飾(硝化)(圖5)。

實施例3-抗原的識別

人類免疫靶標(biāo)識別。使用修飾的b16裂解物(nivax)衍生的抗血清作為一級抗體針對交叉反應(yīng)性篩選綜合人類蛋白質(zhì)微陣列(origene人類蛋白質(zhì)裂解物β陣列)，并且使用hrp綴合的抗小鼠igg作為二級抗體(圖6)。

結(jié)果。使用修飾的b16裂解物(nivax)衍生的抗血清作為免疫篩選工具來識別六種新型交叉反應(yīng)性人類免疫靶標(biāo)：1)皮瓣結(jié)構(gòu)-特異性內(nèi)切核酸酶1(fen1)；2)高爾基體重組堆疊蛋白1(gorasp1)；3)具有g(shù)tp酶結(jié)構(gòu)域-錨蛋白重復(fù)序列和ph結(jié)構(gòu)域的arfgap1(agap1)；4)微管相關(guān)蛋白tau(mapt)；5)線粒體核糖體蛋白l46(mrpl46)；以及6)原鈣粘著蛋白β6(pcdhb6)。這些結(jié)果表明這些免疫靶標(biāo)單獨或組合地作為用于診斷的新型黑素瘤相關(guān)性抗原或作為免疫治療性工具的潛在用途。

實施例4-抗原的識別

潛在免疫靶標(biāo)的二維電泳分析。通過二維(2-d)電泳對b16-f0總蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行解析。簡言之，使用readystrips/bio-rad(ph3-10，非線性，7cm長)，通過等電聚焦(ief)在第一維度上對天然b16-f0總蛋白質(zhì)裂解物(～20μg)進(jìn)行2-d分析。在12％sds-page上分離蛋白質(zhì)，并且使用修飾的b16裂解物(nivax)衍生的抗血清作為一級抗體并使用hrp綴合的抗小鼠igg作為二級抗體對其進(jìn)行免疫印跡(圖7)。檢測到一個顯著的免疫反應(yīng)性信號，所述信號與先前使用人類蛋白質(zhì)微陣列免疫篩選進(jìn)行識別的交叉反應(yīng)性人類免疫靶標(biāo)中的一個相符，所述人類免疫靶標(biāo)即具有大約8的ief和大約42kda的分子量的fen1。

fen1的二維電泳分析。在如上所述的2-d電泳中對b16-f0總蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行解析并且使用多克隆抗fen1抗體(細(xì)胞信號傳導(dǎo))對其進(jìn)行免疫印跡。特定信號揭示具有大約8的ief和大約42kda的分子量的免疫反應(yīng)性蛋白，所述蛋白質(zhì)與由修飾的b16裂解物(nivax)衍生的抗血清生成的顯著信號中的一個相符(圖8)。此數(shù)據(jù)表明fen1可用于免疫療法或用作診斷工具。

實施例5-使用修飾的fen1進(jìn)行的免疫

使用過氧化亞硝酸鹽硝化的(修飾的)人類fen1針對黑素瘤進(jìn)行的主動治療性免疫。在31μm和62μm的no衍生的硝化劑過氧化亞硝酸鹽(onoo^-)存在下，在室溫下對純化的重組人類fen1蛋白進(jìn)行修飾3小時，接著在4℃下修飾48小時，并且用作用于免疫的抗原。在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，在皮下(sc)使用鹽水溶液(對照)或100μl(～3μg的蛋白質(zhì))未修飾的fen1對照、31μm修飾的fen1或62μm修飾的fen1對攜帶b16-f0腫瘤的小鼠進(jìn)行免疫。通過腫瘤體積(mm³)±sem來評估腫瘤負(fù)荷。**＝p＜0.01|n＝8。與使用未修飾的fen1對照或62μm修飾的fen1相比，使用31μm修飾的fen1的主動免疫以治療性方式使用，顯著減少了腫瘤生長，這表明為了激發(fā)有效的抗腫瘤應(yīng)答，用于純化的人類fen1硝化的過氧化亞硝酸鹽的最佳濃度為31μm(圖9)。

使用過氧化亞硝酸鹽硝化的(修飾的)人類fen1的主動治療性免疫延長了存活。如上所述，在31μm和62μm的no衍生的硝化劑過氧化亞硝酸鹽(onoo^-)存在下，對純化的人類fen1蛋白進(jìn)行修飾。在腫瘤攻擊之后第4天、第11天和第18天，在皮下(sc)使用鹽水溶液(對照)或100μl(～3μg的蛋白質(zhì))未修飾的fen1對照、31μm修飾的fen1或62μm修飾的fen1對攜帶b16-f0腫瘤的小鼠進(jìn)行免疫。與未處理和未修飾的對照相比，使用31μm或62μm修飾的fen1的主動免疫顯著增加攜帶腫瘤的小鼠的存活率(圖10)。

實施例6-從接種fen1的小鼠獲得的抗體的使用。

使用過氧化亞硝酸鹽硝化的(修飾的)人類fen1針對黑素瘤進(jìn)行的被動治療性免疫通過血清抗體進(jìn)行介導(dǎo)。使用蛋白質(zhì)g涂覆的磁珠(蛋白質(zhì)g/生命技術(shù))，如先前所述地使用未修飾的fen1(對照抗體)或使用在31μm過氧化亞硝酸鹽存在下修飾的fen1(31pst抗體)在未攜帶腫瘤的小鼠中生成的抗血清是抗體消耗的(-)或未抗體消耗的(+)。在腫瘤攻擊之后第4天、第7天和第10天，將三個劑量(每個20μl)的來自單個實驗組的合并的血清在腹膜內(nèi)(ip)施用給攜帶b16-f0腫瘤的小鼠。通過腫瘤體積(mm³)±sem來評估腫瘤負(fù)荷。**＝p＜0.01|n＝8(圖11)。血清轉(zhuǎn)移顯著減小腫瘤體積。然而，與來自31μm修飾的fen1免疫的小鼠的全血清相比，來自31μm修飾的fen1免疫的小鼠的抗體消耗型抗血清的被動血清轉(zhuǎn)移以治療性方式使用，不能控制腫瘤生長，這表明含有抗體的血清在來自31μm修飾的fen1免疫的小鼠的被動轉(zhuǎn)移血清的治療效用中的特定作用。

使用修飾的人類fen1針對黑素瘤進(jìn)行的被動治療性免疫延長了存活。使用蛋白質(zhì)g涂覆的磁珠(蛋白質(zhì)g/生命技術(shù))，如先前所述地使用未修飾的fen1(對照抗體)或使用在31μm過氧化亞硝酸鹽存在下修飾的fen1(31pst抗體)在未攜帶腫瘤的小鼠中生成的抗血清是抗體消耗的(-)或未抗體消耗的(+)。在腫瘤攻擊之后第4天、第7天和第10天，將三個劑量(每個20μl)的來自單個實驗組的合并的血清在腹膜內(nèi)(ip)施用給攜帶b16-f0腫瘤的小鼠(圖12)。血清轉(zhuǎn)移延長了存活。然而，與來自31μm修飾的fen1免疫的小鼠的全血清相比，來自31μm修飾的fen1免疫的小鼠的抗體消耗型抗血清的被動血清轉(zhuǎn)移當(dāng)以治療性方式使用時在腫瘤攻擊20天之后不能維持存活，這表明含有抗體的血清在來自31μm修飾的fen1免疫的小鼠的被動轉(zhuǎn)移血清的治療效用中的特定作用。

實施例7-從b16黑素瘤細(xì)胞系的fen1接種的小鼠靶標(biāo)裂解物獲得的抗體

針對未修飾的b16-f0總蛋白質(zhì)裂解物的抗體依賴性抗血清免疫反應(yīng)性。通過sds-page對從未修飾的b16-f0純化的總蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行解析并且在獨立于泳道的多篩選設(shè)備(bio-rad)中使用以下各項對其進(jìn)行免疫印跡：完整的對照未修飾的抗血清(c+)、抗體消耗的對照未修飾的抗血清(c-)、完整的修飾的fen1抗血清(31+)或抗體消耗的修飾的fen1抗血清。使用hrp綴合的抗小鼠igg作為二級抗體。從fen1接種的小鼠獲得的血清特異性地針對b16-f0總蛋白質(zhì)裂解物反應(yīng)，如在圖13中的相對光密度分析上所反映的。

實施例8-使用硝化劑生成結(jié)合到未修飾的生物分子上的新型表位的抗體。

在31μm過氧化亞硝酸鹽存在下，在室溫下對培養(yǎng)的恰加斯氏利什曼原蟲無鞭毛體進(jìn)行裂解和處理3小時，接著在4℃下進(jìn)行48小時并且用作抗原(l-nivax)以對未感染的balb/c小鼠進(jìn)行免疫(100μl-sc|～200μg/劑量)，接著在第7天進(jìn)行加強免疫。在最后一次加強免疫21天之后，通過心臟刺穿采集血液以用于血清分離。將抗血清制劑的相同方案用于含有以下各項的抗原制劑：鹽水溶液(媒介物)、活的恰加斯氏利什曼原蟲無鞭毛體+咪喹莫特(imiquamod)(活的l+imi)以及熱殺死的恰加斯氏利什曼原蟲無鞭毛體(熱殺死的l)。通過sds-page對來自未處理的恰加斯氏利什曼原蟲無鞭毛體的總蛋白質(zhì)裂解物進(jìn)行解析并且使用媒介物、活的l+imi、熱殺死的l以及l(fā)-nivax抗血清對其進(jìn)行免疫印跡。使用hrp綴合的抗小鼠igg作為二級抗體。與其他免疫標(biāo)準(zhǔn)模式相比，當(dāng)使用l-nivax時，蛋白質(zhì)印記顯示針對裂解的、未處理的恰加斯氏利什曼原蟲無鞭毛體的顯著強烈的免疫反應(yīng)性帶(圖14)。這些結(jié)果證實硝化的抗原可揭開新型的、非硝化的抗原決定簇。

以引用的方式并入

本文所引用的所有專利、公開專利申請以及非專利文獻(xiàn)均以引用的方式并入本文。

等效物

本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅使用常規(guī)實驗將認(rèn)識到或者能夠確定本文所述的發(fā)明的具體實施方案的許多等效方案。此類等效方案意圖通過以下權(quán)利要求書涵蓋。