本發(fā)明屬于納米材料
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種靶向熒光載藥納米分子探針及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多因素參與的血管壁炎癥過(guò)程。其中平滑肌細(xì)胞的遷移、表型轉(zhuǎn)換、凋亡等行為對(duì)動(dòng)脈硬化的進(jìn)程發(fā)揮了巨大作用。近年來(lái)，對(duì)PPAR(過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體)類激動(dòng)劑的研究對(duì)防治產(chǎn)生動(dòng)脈硬化斑塊發(fā)揮了巨大作用，其中新型的PPAR-δ激動(dòng)劑具有抑制動(dòng)脈硬化斑塊微環(huán)境導(dǎo)致的平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移與凋亡的作用，但其目前仍然存在一些弊端如較強(qiáng)的疏水性、半衰期較短等限制了其應(yīng)用。由于PPAR-δ不具有靶向性，除了對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到治療作用外，還具有降血糖效應(yīng)，因此對(duì)于血糖正常的動(dòng)脈硬化患者是不利的。在現(xiàn)階段的生物醫(yī)學(xué)研究中，人們常常需要把PPAR-δ的激動(dòng)劑溶于DMSO中去治療相應(yīng)的疾病，然而現(xiàn)有的方法沒(méi)有靶向性，常常帶來(lái)對(duì)人體不利的藥物小分子其他效應(yīng)，而且DMSO的毒性也限制了其應(yīng)用，無(wú)法滿足科學(xué)研究的需求。CN105833299A公開了用于動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊診斷的MRI/optical雙模態(tài)納米探針的制備方法，所述納米探針由OPN(骨橋蛋白)抗體和二巰基丁二酸修飾的磁性四氧化三鐵納米顆?？s合而成，OPN抗體的活性氨基與納米顆粒表面DMSA的活性羧基通過(guò)縮合反應(yīng)穩(wěn)定連接。其可以提高診斷的敏感性和特異性。然而該納米探針只是一種診斷探針，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用并不明顯。因此，在本領(lǐng)域中，期望得到一種可以具有診斷和治療雙重作用的納米分子探針。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種靶向熒光載藥納米分子探針及其制備方法和應(yīng)用。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一方面，本發(fā)明提供一種靶向熒光載藥納米分子探針，所述靶向熒光載藥納米分子探針為由連接有靶向分子的載體包裹抗動(dòng)脈粥樣硬化的小分子激動(dòng)劑和熒光染料形成的納米顆粒，所述靶向分子為骨橋蛋白(OPN)單克隆抗體。在本發(fā)明中，所述靶向熒光載藥納米分子探針中骨橋蛋白單克隆抗體可以靶向于動(dòng)脈硬化斑塊中平滑肌細(xì)胞高表達(dá)的骨橋蛋白，被細(xì)胞吞噬后，所述納米分子探針在細(xì)胞內(nèi)具有緩慢降解的作用，是一種能夠用于動(dòng)脈硬化疾病模型以特定細(xì)胞為靶點(diǎn)的載藥納米分子探針。在本發(fā)明中，所述載體為兩親性聚合物，優(yōu)選馬來(lái)酰亞胺修飾的聚己內(nèi)酯-聚乙二醇(PCL-PEG-MAL)。在本發(fā)明中，如果利用馬來(lái)酰亞胺修飾的其他兩親性聚合物例如DSPE-PEG、PLGA-PEG或PDLLA-PEG，雖然能夠與骨橋蛋白單克隆抗體連接，但是用這樣的載體材料會(huì)使得形成的納米膠束不夠穩(wěn)定。優(yōu)選地，所述抗動(dòng)脈粥樣硬化的小分子激動(dòng)劑為PPARδ激動(dòng)劑(例如GW501516)、肝孤核受體激動(dòng)劑(LXR激動(dòng)劑)、SIRT1激動(dòng)劑(Sirtuin1)、IP6K激動(dòng)劑或大麻素受體激動(dòng)劑中的任意一種或至少兩種的組合。這些小分子激動(dòng)劑均具有較強(qiáng)的疏水性，只能溶于DMSO等有機(jī)溶劑中，而不溶于水中，使得其在體內(nèi)循環(huán)時(shí)不穩(wěn)定難以到達(dá)靶標(biāo)部位，而運(yùn)用本發(fā)明的納米分子探針可以成功解決疏水性小分子激動(dòng)劑的溶解問(wèn)題以及在體內(nèi)循環(huán)的穩(wěn)定性問(wèn)題，提高藥物的生物利用度以及治療效果。優(yōu)選地，所述熒光染料為近紅外波段熒光染料，優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺酯(Cy5.5)。包裹在本發(fā)明所述膠束中的熒光染料可以對(duì)該靶向熒光載藥納米分子探針進(jìn)行視蹤，觀察期達(dá)到動(dòng)物模型的部位。本發(fā)明所述靶向熒光載藥納米探針不但具有靶向性，而且有無(wú)毒性，穩(wěn)定性強(qiáng)，較高的載藥量等優(yōu)點(diǎn)，載藥量最高可達(dá)8.2％左右。優(yōu)選地，所述靶向分子與載體的連接使通過(guò)化學(xué)鍵連接，優(yōu)選酰胺鍵、酯鍵或醚鍵，進(jìn)一步優(yōu)選硫醚鍵。當(dāng)然，也包括其他共價(jià)鍵連接類型。優(yōu)選地，本發(fā)明所述靶向熒光載藥納米分子探針中所述靶向分子通過(guò)巰基與載體上的馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)連接來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向分子和載體高效、穩(wěn)定連接，且兩部分功能不會(huì)產(chǎn)生干擾。另一方面，本發(fā)明提供了如上所述靶向熒光載藥納米分子探針的制備方法，所述方法包括以下步驟：(1)利用兩親性聚合物作為載體，包裹治療動(dòng)脈硬化的小分子激動(dòng)劑和熒光染料得到納米膠束；(2)步驟(1)得到的納米膠束與骨橋蛋白單克隆抗體連接得到所述靶向熒光載藥納米分子探針。本發(fā)明采用納米共沉淀法來(lái)制備得到靶向熒光載藥納米分子探針，由于所述靶向熒光載藥納米分子探針的所述特征結(jié)構(gòu)使得其只有通過(guò)納米共沉淀法才能形成高載藥量粒徑均一穩(wěn)定的靶向納米膠束體系，如果像其他聚合物納米膠束一樣，利用乳化法和旋膜超聲法制備，則會(huì)使得體系不夠穩(wěn)定，不能成功包裹藥物和熒光染料得到本發(fā)明所述靶向熒光載藥納米分子探針。作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述靶向熒光載藥納米分子探針的制備方法具體包括以下步驟：I、將馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG、治療動(dòng)脈硬化的小分子激動(dòng)劑以及熒光染料溶于揮發(fā)性有機(jī)溶劑中，將其逐滴滴加至水中，攪拌，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，得到納米膠束；II、步驟(1)得到的納米膠束與二硫鍵被還原成巰基的骨橋蛋白單克隆抗體反應(yīng)，得到所述靶向熒光載藥納米分子探針。優(yōu)選地，相對(duì)于10mg步驟I所述馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG，所述治療動(dòng)脈硬化的小分子激動(dòng)劑的用量為1-3mg，例如1mg、1.3mg、1.5mg、1.8mg、2mg、2.3mg、2.5mg、2.8mg或3mg。優(yōu)選地，相對(duì)于10mg步驟I所述馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG，所述熒光染料的用量為5-30μg，例如5μg、6μg、8μg、10μg、12μg、14μg、16μg、18μg、20μg、22μg、24μg、26μg、28μg或30μg。優(yōu)選地，相對(duì)于10mg步驟I所述馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG，所述揮發(fā)性有機(jī)溶劑的用量為200-500μL，例如200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL或500μL。有機(jī)溶劑或多或少會(huì)具有一定毒性，因此用量不易過(guò)多。優(yōu)選地，步驟I所述揮發(fā)性有機(jī)溶劑為四氫呋喃。優(yōu)選地，相對(duì)于10mg步驟I所述馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG，所述水的用量為2-5mL，例如2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL或5mL。優(yōu)選地，所述水為超純水。優(yōu)選地，步驟I所述攪拌在避光條件下進(jìn)行。步驟II所述二硫鍵被還原成巰基的骨橋蛋白單克隆抗體與馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG的摩爾數(shù)之比為(50-1000):1，例如50:1、60:1、80:1、100:1、120:1、150:1、200:1、250:1、300:1、500:1、700:1、900:1或1000:1，優(yōu)選(80-300):1。優(yōu)選地，步驟II所述還原時(shí)的還原劑為2-巰基乙胺(2-MEA)。即利用2-巰基乙胺作為還原劑將骨橋蛋白單克隆抗體中的二硫鍵還原成巰基。將骨橋蛋白單克隆抗體中的二硫鍵還原成巰基時(shí)，當(dāng)抗體量少于1ml時(shí)，將6mg的2-MEA溶于100μl反應(yīng)液中，每10μl的抗體量對(duì)應(yīng)1μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)液中且必須含有(1-10)mM(例如1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM)EDTA。優(yōu)選地，步驟II所述反應(yīng)的條件為在pH7.4環(huán)境下常溫?cái)嚢?-12h，例如6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h。在本發(fā)明中，步驟II所述反應(yīng)結(jié)束時(shí)，利用葡萄凝膠柱對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到靶向熒光載藥納米分子探針。另一方面，本發(fā)明提供如上所述靶向熒光載藥納米分子探針在制備治療動(dòng)脈硬化的藥物中的應(yīng)用。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的靶向熒光載藥納米分子探針可以特異性地靶向于動(dòng)脈粥樣硬化中平滑肌細(xì)胞，形成的納米膠束體系穩(wěn)定性好，被細(xì)胞吞噬后，所述納米分子探針在細(xì)胞內(nèi)具有緩慢降解的作用，有望成為一種良好的可用于診斷治療動(dòng)脈粥樣硬化的納米分子探針，可應(yīng)用于生物或醫(yī)學(xué)研究中。并且本發(fā)明所述熒光分子探針的制備方法簡(jiǎn)單易行，不涉及復(fù)雜的操作和苛刻條件，并且成本較低，穩(wěn)定性好。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明的靶向熒光載藥納米探針的納米膠束結(jié)構(gòu)模式圖，其中星形符號(hào)代表近紅外熒光物質(zhì)Cy5.5，圓形代表藥物小分子GW501516即PPARδ的激動(dòng)劑，外周連接的矩形代表OPN抗體。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的靶向熒光載藥納米分子探針形成的納米膠束的透射電鏡圖；圖中標(biāo)尺為100nm。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備的靶向熒光載藥納米分子探針形成的納米體系的水合粒徑分布圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制備的靶向熒光載藥納米分子探針形成的納米體系的Zeta電位圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中PCL-PEG構(gòu)成的納米膠束在連接OPN抗體前后的紫外吸收峰的變化圖。圖6為利用本發(fā)明制備得到的靶向熒光載藥納米分子探針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化體外模型平滑肌細(xì)胞后的單光子激光共聚焦顯微鏡圖。圖7為流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定的本發(fā)明的靶向熒光載藥納米分子探針Anti-OPN-PCL-PEG-GW501516與未連接靶向分子的納米膠束PCL-PEG-GW501516以及空白對(duì)照組(PBS緩沖溶液組)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化體外模型平滑肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度對(duì)比圖。第一個(gè)峰為對(duì)照，第二個(gè)峰為被動(dòng)靶向組(無(wú)連接OPN抗體)，第三個(gè)為主動(dòng)靶向熒光納米膠束組。圖8為流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定的本發(fā)明的靶向熒光載藥納米分子探針Anti-OPN-PCL-PEG-GW501516與未連接靶向分子的納米膠束PCL-PEG-GW501516的平均熒光強(qiáng)度定量結(jié)果圖。圖9為利用ox-LDL、GW501516(PPARδ的激動(dòng)劑)、OPN-NPs-GW501516(即OPN-PCL-PEG-GW501516)以及NPs-GW501516(即PCL-PEG-GW501516)和ox-LDL-NPs(即ox-LDL-PCL-PEG)孵育平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞的MMP2和MMP9以及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)表達(dá)量比較圖。圖10為ox-LDL、GW501516、OPN-NPs-GW501516(即OPN-PCL-PEG-GW501516)以及NPs-GW501516(即PCL-PEG-GW501516)和ox-LDL-NPs(即ox-LDL-PCL-PEG)孵育后的平滑肌細(xì)胞的流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果圖。圖11為本發(fā)明的靶向熒光載藥納米分子探針Anti-OPN-Cy5.5-NPs(Anti-OPN-Cy5.5-PCL-PEG-GW501516)與未連接靶向分子的納米膠束Cy5.5-NPs(Cy5.5-PCL-PEG-GW501516)對(duì)小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化模型在活體內(nèi)的熒光成像圖。圖12為對(duì)比例1-3制備得到的納米體系OPN-DSPE-PEG-PPARδ、OPN-DSPE-PEG-PPARδ和OPN-PLGA-PEG-PPARδ與實(shí)施例1制備得到的納米體系OPN-PCL-PEG-PPARδ的體系穩(wěn)定性對(duì)比圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。以下實(shí)施例中所用材料的來(lái)源：骨橋蛋白(OPN)單克隆抗體購(gòu)自abcam(美國(guó))公司，2-Mercaptoethylamine·HCl(2-MEA)購(gòu)自Thermoscifntific(美國(guó))公司，聚乙二醇(PEG)及聚己內(nèi)酯(PCL)和熒光染料Cy5.5均購(gòu)自西安瑞禧有限公司，四氫呋喃購(gòu)自北京化工有限公司，整個(gè)實(shí)驗(yàn)使用的超純水采用密理博公司的Milli-Q三蒸水(18.2MΩ·cm，MilliporeSystemInc.)。實(shí)施例1在本實(shí)施例中，通過(guò)以下方法制備得到靶向熒光載藥納米分子探針，制備方法具體包括以下步驟：I、將10mg馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG、1mg治療動(dòng)脈硬化的小分子激動(dòng)劑PPARδ(GW501516)以及10μg熒光染料Cy5.5溶于500μL四氫呋喃中，將其逐滴滴加至5mL超純水中，攪拌24h，得到納米膠束；II、利用2-巰基乙胺作為還原劑將20μl骨橋蛋白單克隆抗體(OPN)中的二硫鍵還原成巰基，而后步驟(1)得到的納米膠束與二硫鍵被還原成巰基的骨橋蛋白單克隆抗體在pH7.4環(huán)境下常溫?cái)嚢?2h，其中所用骨橋蛋白單克隆抗體與馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG的摩爾量之比為50:1，得到所述靶向熒光載藥納米分子探針，得到的該靶向熒光載藥納米分子探針的載藥量為7.1％。圖1為制備得到的靶向熒光載藥納米探針的納米膠束結(jié)構(gòu)模式圖。利用電鏡對(duì)制備得到的納米體系進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示，其體系中粒徑大約為70-100nm，粒徑均一，呈單分散。利用動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)得到的納米體系進(jìn)行表征，其水合粒徑分布圖如圖3所示，其Zeta電位圖如圖4所示，其水合粒徑分布數(shù)據(jù)以及Zeta電位數(shù)據(jù)(ZP)如表1所示。表1粒徑(nm)PDIZP(mV)PCL-PEG-GW501516115.0±2.750.133±0.073.8±0.24OPN-PCL-PEG-GW501516142.5±3.060.159±0.04-18.1±0.46表1中PDI表示多分散指數(shù)。由圖3、圖4以及表1的數(shù)據(jù)可知，水合粒徑在120nm左右，Zeta電位在-18mv,本身PCL-PEG不帶電，膠束連接抗體后，Zeta電位變?yōu)樨?fù)值，間接證明連接抗體成功。由圖5可知，PCL-PEG納米膠束連接OPN抗體后成功后在280nm有吸收峰，同樣證明連接抗體成功。實(shí)施例2在本實(shí)施例中，通過(guò)以下方法制備得到靶向熒光載藥納米分子探針，制備方法具體包括以下步驟：I、將10mg馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG、3mg治療動(dòng)脈硬化的小分子激動(dòng)劑PPARδ以及30μg熒光染料Cy5.5溶于200μL四氫呋喃中，將其逐滴滴加至2mL超純水中，攪拌24h，得到納米膠束；II、利用2-巰基乙胺作為還原劑將20μl骨橋蛋白單克隆抗體中的二硫鍵還原成巰基，而后步驟(1)得到的納米膠束與二硫鍵被還原成巰基的骨橋蛋白單克隆抗體在pH7.4環(huán)境下常溫?cái)嚢?0h，其中所用骨橋蛋白單克隆抗體與馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG的摩爾量之比為80:1，得到所述靶向熒光載藥納米分子探針，得到的該靶向熒光載藥納米分子探針的載藥量為8.2％。實(shí)施例3在本實(shí)施例中，通過(guò)以下方法制備得到靶向熒光載藥納米分子探針，制備方法具體包括以下步驟：I、將10mg馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG、2mg治療動(dòng)脈硬化的小分子激動(dòng)劑PPARδ以及5μg熒光染料Cy5.5溶于200μL四氫呋喃中，將其逐滴滴加至3mL超純水中，攪拌24h，得到納米膠束；II、利用2-巰基乙胺作為還原劑將20μl骨橋蛋白單克隆抗體中的二硫鍵還原成巰基，而后步驟(1)得到的納米膠束與二硫鍵被還原成巰基的骨橋蛋白單克隆抗體在pH7.4環(huán)境下常溫?cái)嚢?h，其中所用骨橋蛋白單克隆抗體與馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG的摩爾量之比為100:1，得到所述靶向熒光載藥納米分子探針，得到的該靶向熒光載藥納米分子探針的載藥量為7.8％。實(shí)施例4在本實(shí)施例中，通過(guò)以下方法制備得到靶向熒光載藥納米分子探針，制備方法具體包括以下步驟：I、將10mg馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG、3mg治療動(dòng)脈硬化的小分子激動(dòng)劑PPARδ以及10μg熒光染料Cy5.5溶于400μL四氫呋喃中，將其逐滴滴加至5mL超純水中，攪拌24h，得到納米膠束；II、利用2-巰基乙胺作為還原劑將20μl骨橋蛋白單克隆抗體中的二硫鍵還原成巰基，而后步驟(1)得到的納米膠束與二硫鍵被還原成巰基的骨橋蛋白單克隆抗體在pH7.4環(huán)境下常溫?cái)嚢?2h，其中所用骨橋蛋白單克隆抗體與馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG的摩爾量之比為200:1，得到所述靶向熒光載藥納米分子探針，得到的該靶向熒光載藥納米分子探針的載藥量為7.6％。實(shí)施例5在本實(shí)施例中，通過(guò)以下方法制備得到靶向熒光載藥納米分子探針，制備方法具體包括以下步驟：I、將10mg馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG、2mg治療動(dòng)脈硬化的小分子激動(dòng)劑PPARδ以及20μg熒光染料Cy5.5溶于400μL四氫呋喃中，將其逐滴滴加至5mL超純水中，攪拌24h，得到納米膠束；II、利用2-巰基乙胺作為還原劑將20μl骨橋蛋白單克隆抗體中的二硫鍵還原成巰基，而后步驟(1)得到的納米膠束與二硫鍵被還原成巰基的骨橋蛋白單克隆抗體在pH7.4環(huán)境下常溫?cái)嚢?2h，其中所用骨橋蛋白單克隆抗體與馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG的摩爾量之比為500:1，得到所述靶向熒光載藥納米分子探針，得到的該靶向熒光載藥納米分子探針的載藥量為6.8％。實(shí)施例6以本實(shí)施例1制備得到的靶向熒光載藥納米分子探針在5μM濃度下孵育經(jīng)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激24h后的兔血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)24h，在單光子激光共聚焦顯微鏡下成像，通過(guò)觀察靶向熒光載藥納米分子探針的熒光信號(hào)確定該探針在細(xì)胞中的位置和形態(tài)，結(jié)果如圖6所示，圖6顯示細(xì)胞內(nèi)部的熒光信號(hào)，證明連接有OPN抗體的包載Cy5.5的納米膠束更容易被細(xì)胞吞噬。圖7為流式細(xì)胞測(cè)熒光強(qiáng)度圖，證明細(xì)胞對(duì)本發(fā)明的靶向熒光載藥納米分子探針Anti-OPN-PCL-PEG-GW501516與未連接靶向分子的納米膠束PCL-PEG-GW501516的吞噬能力不同，Anti-OPN-PCL-PEG-GW501516組細(xì)胞熒光強(qiáng)度高說(shuō)明細(xì)胞更容易吞噬該靶向熒光探針。圖8為圖7的平均熒光強(qiáng)度定量圖，證明相同條件下，細(xì)胞更容易吞噬連接有骨橋蛋白單克隆抗體的主動(dòng)靶向納米探針(Anti-OPN-GW501516-NPs)，測(cè)得的熒光強(qiáng)度更高。結(jié)果表明：靶向熒光載藥納米分子探針標(biāo)記的細(xì)胞胞漿中有出現(xiàn)Cy5.5熒光，說(shuō)明靶向熒光載藥納米分子探針出現(xiàn)的位置與骨橋蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的位置具有一致性，具有良好的標(biāo)記特異性。細(xì)胞形態(tài)良好，靶向熒光載藥納米分子探針本身和標(biāo)記過(guò)程不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，適用于活細(xì)胞標(biāo)記。平滑肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)氧化低密度脂蛋白遷移能力受到抑制。對(duì)利用ox-LDL、GW501516(PPARδ的激動(dòng)劑)、OPN-NPs-GW501516(即OPN-PCL-PEG-GW501516)以及NPs-GW501516(即PCL-PEG-GW501516)和ox-LDL-NPs(即ox-LDL-PCL-PEG)孵育平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞的MMP2和MMP9表達(dá)量如圖9所示，結(jié)果表明，各種干預(yù)對(duì)ox-LDL孵育平滑肌細(xì)胞后MMP2和MMP9表達(dá)量的不同，MMP2和MMP9在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊里對(duì)平滑肌細(xì)胞(VSMC)遷移起到促進(jìn)作用，促進(jìn)斑塊發(fā)展，且具有增加斑塊的不穩(wěn)定性。在主動(dòng)靶向載藥納米膠束組OPN-NPs-PPARδ抑制MMP2，MMP9作用最強(qiáng)，優(yōu)于被動(dòng)靶向組及單純給藥組。圖10為利用流失細(xì)胞儀對(duì)ox-LDL、GW501516、OPN-NPs-GW501516(即OPN-PCL-PEG-GW501516)以及NPs-GW501516(即PCL-PEG-GW501516)和ox-LDL-NPs(即ox-LDL-PCL-PEG)孵育后的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行的測(cè)定，證明本發(fā)明的納米材料抑制此環(huán)境中平滑肌細(xì)胞凋亡的作用優(yōu)于被動(dòng)靶向組及單純給藥組。利用實(shí)施例2-5制備的靶向熒光載藥納米分子探針進(jìn)行如上相同的試驗(yàn)，得到了與實(shí)施例1的靶向熒光載藥納米分子探針相同的結(jié)果。實(shí)施例7在本實(shí)施例中，考察本發(fā)明的靶向熒光載藥納米分子探針在活體小鼠體內(nèi)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響，考察方法為：利用活體成像儀，在動(dòng)脈粥樣硬化模型的小鼠尾靜脈注射本發(fā)明的靶向熒光載藥納米分子探針Anti-OPN-Cy5.5-NPs(Anti-OPN-Cy5.5-PCL-PEG-GW501516)與未連接靶向分子的納米膠束Cy5.5-NPs(Cy5.5-PCL-PEG-GW501516)后，不同的時(shí)間點(diǎn)觀察是否有特異性光學(xué)信號(hào)變化。如圖11所示，說(shuō)明動(dòng)脈粥樣硬化模型的小鼠尾靜脈注射本發(fā)明的靶向熒光載藥納米分子探針Anti-OPN-Cy5.5-NPs后利用小動(dòng)物活體成像儀，不同的時(shí)間點(diǎn)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的信號(hào)顯現(xiàn)，可以看出箭頭處信號(hào)是先增強(qiáng)后減弱，符合納米膠束在體內(nèi)的代謝時(shí)間規(guī)律。動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠尾靜脈注射未連接靶向分子的納米膠束Cy5.5-NPs后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得小動(dòng)物活體成像，都為非特異聚集，沒(méi)有箭頭處所標(biāo)的特異斑塊的信號(hào)。后續(xù)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠分為6組，分別為持續(xù)給PBS組，單純給GW501516藥物小分子組，主動(dòng)靶向納米藥物組(OPN-NPs-GW501516)，被動(dòng)靶向納米藥物組(NPs-GW501516)，不包裹藥物小分子的空殼納米膠束組(NPs)每天給藥后，持續(xù)兩周后處死免疫組化觀察斑塊的治療效果。預(yù)期主動(dòng)靶向納米藥物治療效果最佳，被動(dòng)靶向組次之，單純給藥組治療效果不如前兩者。給PBS和空殼納米膠束組一樣基本上沒(méi)有治療效果。對(duì)比例1與實(shí)施例1不同之處在于，將實(shí)施例1中使用的馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG替換為馬來(lái)酰亞胺修飾的脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-MAL)。對(duì)比例2與實(shí)施例1不同之處在于，將實(shí)施例1中使用的馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG替換為馬來(lái)酰亞胺修飾的聚乳酸-羥基乙酸-聚乙二醇(PLGA-PEG-MAL)。對(duì)比例3與實(shí)施例1不同之處在于，將實(shí)施例1中使用的馬來(lái)酰亞胺修飾的PCL-PEG替換為馬來(lái)酰亞胺修飾的D,L-聚乳酸-聚乙二醇(PDLLA-PEG-MAL)。對(duì)比例1-3制備的納米體系OPN-DSPE-PEG-PPARδ、OPN-DSPE-PEG-PPARδ和OPN-PLGA-PEG-PPARδ與實(shí)施例1制備得到的納米體系OPN-PCL-PEG-PPARδ的體系穩(wěn)定性對(duì)比圖如圖12所示，利用納米沉淀法能成功包載PPARδ并連接OPN抗體形成的納米膠束的常規(guī)高分子材料的選擇上只有PCL-PEG比較成功適合，且OPN-PCL-PEG-PPARδ納米膠束穩(wěn)定且丁達(dá)爾現(xiàn)象明顯，而其余常高分子如(DSPE-PEG，PLGA-PEG，PDLLA-PEG)形成的納米膠束過(guò)夜后均不穩(wěn)定，出現(xiàn)沉淀。申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的靶向熒光載藥納米分子探針及其制備方法和應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3