本發(fā)明屬于生化檢測領(lǐng)域，特別涉及一種新的近紅外熒光分子探針，還涉及該分子探針的制備方法及其在細胞成像中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近紅外(NIR)熒光成像技術(shù)在細胞生物學(xué)、藥理學(xué)、疾病的診斷等方面有廣泛的應(yīng)用。近紅外熒光成像技術(shù)作為一種非侵入性診斷技術(shù)，具有無輻射、無損、實時、在位檢測生物信息等優(yōu)點。許多生物體及其組織在可見光的激發(fā)下自身會發(fā)射熒光，嚴重干擾生物樣品的熒光檢測和造影，近紅外熒光探針的最大吸收波長和發(fā)射波長為600～900nm，可避免背景的干擾。所以，近紅外熒光檢測在生物樣品分析中有明顯的優(yōu)越性。近年來，近紅外熒光成像發(fā)展的主要方向包括制備新的生物相容性好的近紅外熒光染料，合成新的特異性靶向探針。在多項研究中，大量近紅外熒光探針被開發(fā)出來，包括有機熒光染料、無機和生物納米粒子等。在當(dāng)前有機近紅外熒光染料相關(guān)的研究中，含吲哚環(huán)的多甲川菁類化合物是一類重要的且使用廣泛的近紅外熒光染料。其中最具有代表性應(yīng)用的最廣的是吲哚菁綠(IndocyanineGreen，ICG)。自美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)ICG用于臨床后，ICG類有機近紅外熒光染料得到了極大的關(guān)注。ICG是一種全合成的三羧花青系診斷試劑，1955年由美國柯達實驗室研發(fā)，因其毒性低、副作用小，廣泛用于心臟功能、肝功能和視網(wǎng)膜血管造影。最近，ICG也被用來作為一種潛在的光敏劑。然而ICG的應(yīng)用也存在一定的限制如低量子產(chǎn)率，體內(nèi)光不穩(wěn)定性和在血管中的泄露等。因此，許多課題組開始研究ICG衍生物來提高體內(nèi)外成像的亮度、溶解性、耐光性和光穩(wěn)定性等。技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)新穎的七甲川菁類近紅外熒光分子探針，能夠增強熒光強度，提高細胞成像效果。本發(fā)明的另一個目的是提供所述近紅外熒光分子探針的合成方法及應(yīng)用。技術(shù)方案：本發(fā)明所述的七甲川菁類近紅外熒光分子探針，結(jié)構(gòu)如式(Ⅴ)所示：本發(fā)明還提供了所述的七甲川菁類近紅外熒光分子探針的制備方法，包括：(1)有機溶劑中，在惰性氣體保護下，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鹽與對硝基芐溴反應(yīng)，得式(Ⅲ)化合物：(2)有機溶劑中，在惰性氣體保護下，式(Ⅲ)化合物與2-氯-1-甲酰基-2-羥甲基環(huán)己烯反應(yīng)，得所述的式(Ⅴ)化合物。步驟(1)中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鹽具體可以為2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀，結(jié)構(gòu)為：惰性氣體可以為任何不參與反應(yīng)的氣體，如氮氣、氬氣等。步驟(1)中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鹽與對硝基芐溴的摩爾比為1：1-4；所述的有機溶劑為甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、鄰二氯苯和1,4-二氧六環(huán)中的一種或幾種。步驟(1)中，反應(yīng)溫度為85-100℃，優(yōu)選為85-90℃；反應(yīng)時間為15-36h。步驟(2)中，式(Ⅲ)化合物與2-氯-1-甲?；?2-羥甲基環(huán)己烯的摩爾比為2～3:1。2-氯-1-甲酰基-2-羥甲基環(huán)己烯的結(jié)構(gòu)為步驟(2)中，所述的有機溶劑為乙醇、醋酸酐、吡啶、正丁醇和甲苯中的一種或幾種。惰性氣體可以為任何不參與反應(yīng)的氣體，如氮氣、氬氣等。步驟(2)中，還可以添加催化劑無水醋酸鈉，催化劑的物質(zhì)的量與式(Ⅲ)化合物的物質(zhì)的量相同。步驟(2)中，反應(yīng)溫度為70～75℃，反應(yīng)時間為4-8h。步驟(2)反應(yīng)結(jié)束后，需在反應(yīng)體系中純化分離得所述的式(Ⅴ)化合物，所述純化分離的方法包括：將反應(yīng)后的溶液降至室溫，減壓濃縮后加入醚類溶劑，過濾，然后再經(jīng)固體經(jīng)色譜柱進行分離純化，干燥得所述的式(Ⅴ)化合物。其中，所述醚類溶劑為分子量為74-186的醚類化合物，優(yōu)選乙醚、甲基叔丁基醚，醚類溶劑加入量可根據(jù)需要選擇，優(yōu)選地為減壓濃縮后的反應(yīng)液的體積的3-5倍。所述的色譜柱為硅膠柱，硅膠的規(guī)格為200-300目；洗脫液為體積比為8:1-12:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，或為體積比2:1-4:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物。本發(fā)明還提供了所述的七甲川菁類近紅外熒光分子探針在活細胞成像中的應(yīng)用。所述的細胞具體可以為肺癌細胞如A549細胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的近紅外熒光分子探針，不僅吲哚環(huán)上引入-SO3H這種強吸電子基團，而且在七甲川鏈兩端周圍空間引入了體積較大的芐基和對位的硝基，增大了染料的stock位移，進一步增強其分子熒光強度，改善其在細胞內(nèi)的成像效果。本發(fā)明提供的近紅外熒光分子探針結(jié)構(gòu)新穎，制備工藝簡單，能有效的避開生物自發(fā)熒光和細胞內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，靈敏度高、光學(xué)穩(wěn)定性好、細胞膜滲透性好，能夠作為檢測生物成像的近紅外熒光探針。該熒光分子探針在分析化學(xué)、生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域具有較強的實際應(yīng)用價值。附圖說明圖1是本發(fā)明的近紅外熒光分子探針的1HNMR圖；圖2是本發(fā)明的近紅外熒光分子探針的MS圖；圖3a是本發(fā)明的近紅外熒光分子探針的紫外吸收光譜圖；圖3b是本發(fā)明的近紅外熒光分子探針的熒光發(fā)射光譜圖；圖4是本發(fā)明的近紅外熒光分子探針對A549細胞的細胞毒性圖；圖5為本發(fā)明的近紅外熒光分子探針在活的A549細胞內(nèi)成像圖；a是本發(fā)明的近紅外熒光分子探針在活的A549細胞內(nèi)成像圖，b是與之對應(yīng)的明場細胞成像圖；c是吲哚菁綠在活的A549細胞內(nèi)成像圖，d是與之對應(yīng)的明場細胞成像圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例進一步闡釋本發(fā)明。本發(fā)明具體實施方式中近紅外熒光分子探針的合成反應(yīng)方程式如下：實施例1向50ml單口燒瓶中分批加入3.21mmol化合物1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀)、4.17mmol化合物2(對硝基芐溴)和10ml甲苯，在氬氣的保護下，90℃反應(yīng)16h，降至室溫，過濾，用甲苯洗滌，真空干燥得到0.94g棕紅色固體(化合物3，1-對硝基芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸)，產(chǎn)率78.3％。取1.98mmol化合物3和0.99mmol化合物4(2-氯-1-甲?；?2-羥甲基環(huán)己烯)加入到100ml的反應(yīng)瓶中，加入30ml正丁醇：甲苯＝7:3的混合溶劑中，在氬氣的保護下，75℃下加熱回流反應(yīng)6h，溶液由淺紅色變成深紅色最后有大量綠色組分出現(xiàn)，降至室溫，減壓濃縮后加入濃縮后反應(yīng)液3倍體積的乙醚過濾，濾餅用柱層析(硅膠柱，硅膠的規(guī)格為200-300目)分離提純，洗脫液為體積比為12:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.31g深綠色固體為近紅外熒光分子探針，命名為IR789探針。收率：35.4％。氫譜譜圖見圖1，質(zhì)譜譜圖見圖2。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.75(s,14H),2.53(t,4H),5.71(s,4H),6.34–6.38(d,J＝14.4Hz,2H),7.33–7.35(d,J＝8Hz,2H),7.52–7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.63-7.65(d,J＝8Hz,2H),7.88(s,2H),8.22–8.27(m,6H)。TOF-MSm/z:884.2[M+H]-。其吸收光譜見圖3a，其發(fā)射光譜見圖3b。實施例2向50ml單口燒瓶中分批加入3.21mmol化合物1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀)、8.34mmol化合物2(對硝基芐溴)和10ml甲苯，在氬氣的保護下，90℃反應(yīng)15h，降至室溫，過濾，用甲苯洗滌，真空干燥得到0.92g棕紅色固體(化合物3，1-對硝基芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸)。取1.98mmol化合物3和0.99mmol化合物4(2-氯-1-甲酰基-2-羥甲基環(huán)己烯)加入到100ml的反應(yīng)瓶中，加入30ml無水乙醇溶劑，再加入1.98mmol的無水醋酸鈉作為催化劑，在氬氣的保護下，75℃下回流反應(yīng)4h，反應(yīng)液呈棕色，降至室溫，減壓濃縮后加入濃縮后反應(yīng)液4倍體積的乙醚，過濾，濾餅用柱層析(硅膠柱，硅膠的規(guī)格為200-300目)分離提純，洗脫液為體積比為10:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.21g深綠色固體為近紅外熒光分子探針。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.75(s,14H),2.53(t,4H),5.71(s,4H),6.34–6.38(d,J＝14.4Hz,2H),7.33–7.35(d,J＝8Hz,2H),7.52–7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.63-7.65(d,J＝8Hz,2H),7.88(s,2H),8.22–8.27(m,6H)。TOF-MSm/z:884.2[M+H]-。實施例3向50ml單口燒瓶中分批加入3.21mmol化合物1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀)、12.51mmol化合物2(對硝基芐溴)和15ml甲苯，在氬氣的保護下，85℃反應(yīng)36h，降至室溫，過濾，用甲苯洗滌，真空干燥得到0.88g棕紅色固體(化合物3，1-對硝基芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸)。取1.98mmol化合物3和0.99mmol化合物4(2-氯-1-甲?；?2-羥甲基環(huán)己烯)加入到100ml的反應(yīng)瓶中，加入30ml吡啶做反應(yīng)溶劑，在氬氣的保護下，75℃下回流反應(yīng)8h，降至室溫，減壓濃縮后加入濃縮后反應(yīng)液5倍體積的乙醚，過濾，濾餅用柱層析(硅膠柱，硅膠的規(guī)格為200-300目)分離提純，洗脫液為體積比為8:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.23g深綠色固體為近紅外熒光分子探針。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.75(s,14H),2.53(t,4H),5.71(s,4H),6.34–6.38(d,J＝14.4Hz,2H),7.33–7.35(d,J＝8Hz,2H),7.52–7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.63-7.65(d,J＝8Hz,2H),7.88(s,2H),8.22–8.27(m,6H)。TOF-MSm/z:884.2[M+H]-。實施例4本發(fā)明還合成了化合物1a，結(jié)構(gòu)為：除原料外合成方法參照實施例1，具體合成路線如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.58(m,2H),1.72(s,12H),2.09(t,4H),5.52(s,4H),6.36-6.40(d,J＝13.6Hz,2H),7.26-7.40(m,12H),7.62-7.64(d,2H),7.85(s,2H),8.22-8.25(d,J＝13.6Hz,2H)。TOF-MSm/z:794.2[M+H]-。表1染料吸收波長(nm)發(fā)射波長(nm)斯托克斯(stokes)位移(nm)IR789789824351a78380320由表1的結(jié)果可知，化合物1a因其斯托克斯(stokes)位移非常小，在20nm左右，造成熒光自淬滅，IR789的斯托克斯(stokes)位移更大，不容易發(fā)生熒光自淬滅，IR787與其相比具有更好的效果。實施例5體外細胞毒性實驗檢測近紅外熒光分子探針I(yè)R789對人肺癌上皮細胞系A(chǔ)549細胞活性的影響。在100mlPBS的培養(yǎng)基中，加入0.5gMTT溶解，用濾膜過濾以除去溶液里的細菌，4℃避光保存。用含10％PBS的培養(yǎng)液將細胞株配成單細胞懸液，以每孔體積100ul，約1×104個細胞，接種到96孔板，在37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察1d。觀察細胞，待細胞貼壁后，開始實驗處理。實驗設(shè)置空白對照組、陽性對照組(吲哚菁綠ICG)和IR789實驗組，并加入相應(yīng)受試物，處理培養(yǎng)24h后，每孔加15ul預(yù)先配置好的MTT溶液(5mg/m1)。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，用吸管小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)的上清液。然后每孔加150ul的DMSO，在7℃培養(yǎng)箱孵育30min，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。在酶標(biāo)儀上檢測490nm波長下吸光度值(D)，每組重復(fù)5次取平均值。實驗結(jié)果見圖4，結(jié)果表明，與ICG相比，IR789對A549細胞的毒性沒有顯著性差異。IR789濃度為10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、120nM處理24h后的細胞存活率分別為95.64％，94.75％，96.35％，101.29％，95.54％，75.06％。細胞毒性實驗表明IR789有很好的生物相容性，是安全低毒的。實施例6應(yīng)用本發(fā)明近紅外熒光分子探針在活的A549細胞內(nèi)成像，檢測該探針是否能在生物體中成像。將A549置于玻璃基底的培養(yǎng)液中，37℃在A549細胞中加入本發(fā)明近紅外熒光分子探針(10μM)和ICG(10μM)孵育30min，然后用PBS緩沖溶液(pH7.4)沖洗3遍。在激發(fā)波長為789nm下觀察探針在A549細胞中的熒光分布情況，在激發(fā)波長為805nm下觀察ICG在A549細胞中的熒光分布情況。從圖(5a，5c)中我們可以看到本發(fā)明近紅外熒光分子探針和ICG可以透過細胞膜，都呈現(xiàn)出較強的熒光信號，但本發(fā)明近紅外熒光分子探針的熒光強度相比于ICG提高了25.78％。而在明場圖片中(圖5b，5d)A549細胞狀態(tài)與圖(5a，5c)是一致的。實驗結(jié)果證實，本發(fā)明近紅外熒光分子探針有很好的細胞膜滲透性，在細胞內(nèi)呈現(xiàn)較強的熒光，能夠用于活細胞的近紅外熒光成像。當(dāng)前第1頁1 2 3