本發(fā)明涉及一種利用脂質(zhì)體載帶藥物，并利用核酸適體和細(xì)胞穿模肽提高對腫瘤細(xì)胞靶向性及藥物攝取率的方法。本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物體進(jìn)化的細(xì)胞膜可有效阻止外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，保證細(xì)胞內(nèi)各種生物大分子有效行使功能。然而外源藥物很難通過細(xì)胞膜直達(dá)病灶，在一定程度上，細(xì)胞膜成為對腫瘤細(xì)胞治療的一道天然屏障。為了增強(qiáng)藥物的治療效果，一系列方法被用于增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，如細(xì)胞穿模肽、脂肪酸、脂質(zhì)體、聚合物或表面活性劑等。其中細(xì)胞穿模肽能夠載帶小分子藥物、核酸、多肽進(jìn)入細(xì)胞，具有很高的應(yīng)用價值。然而細(xì)胞穿模肽穩(wěn)定性不佳、缺乏細(xì)胞特異性，因而在一定程度上限制了其潛在的應(yīng)用價值。盡管人們通過對細(xì)胞穿模肽進(jìn)行各種修飾增加其對于腫瘤細(xì)胞的靶向性，但進(jìn)一步增強(qiáng)其針對特定腫瘤細(xì)胞的靶向性，降低不良反應(yīng)，可擴(kuò)展其在腫瘤治療的應(yīng)用前景。
核酸適體是一類可折疊成特定三維結(jié)構(gòu)，并且對某些小分子具有很高親和性并可與之結(jié)合的單鏈DNA或RNA短鏈。由于對某些靶標(biāo)的特異性很高，核酸適體常常被用于作為診斷工具，具有廣泛的應(yīng)用價值及很高的應(yīng)用前景。將核酸適體與細(xì)胞穿模肽共同應(yīng)用于載藥可以進(jìn)一步增加藥物作用的靶向性，增加其在臨床應(yīng)用的可能性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有問題的不足，提出一種基于核酸適體和細(xì)胞穿模肽的載帶藥物或納米顆粒進(jìn)入特定靶標(biāo)細(xì)胞的方法，利用脂質(zhì)體載帶藥物或納米顆粒，增強(qiáng)所載帶物的生物相容性，同時利用核酸適體和細(xì)胞穿模肽提高載帶物的靶向遞送及細(xì)胞攝取率，加強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。
在本發(fā)明的技術(shù)方案中，采用脂質(zhì)體包裹藥物小分子阿霉素（doxorubicin，DOX）、紫杉醇（paclitaxel）和金納米棒作為載帶物，在脂質(zhì)體上連接膽固醇修飾的核酸適體和細(xì)胞穿模肽TAT。
本發(fā)明的方法具體為：
一種基于核酸適體和細(xì)胞穿模肽的載帶藥物或納米顆粒進(jìn)入特定靶標(biāo)細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：
（1）制備二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇修飾的細(xì)胞穿膜肽：聚乙二醇修飾的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG 2000-Mal）與半胱氨酸修飾的細(xì)胞穿膜肽以一定比例溶解于含有三乙基胺的氯仿/甲醇溶液中，其v/v=2:1，黑暗條件下于25℃孵育24 hr；隨后真空干燥除去多余的有機(jī)溶劑，沉淀物重新溶于氯仿中；采用孔徑0.02 μm濾膜過濾溶液后，將溶液重新真空干燥除去有機(jī)溶劑，所得沉淀物于-20℃保存待用；
（2）制備包裹藥物或納米顆粒及細(xì)胞穿膜肽TAT的脂質(zhì)體：稱取一定質(zhì)量的磷脂、膽固醇、DSPE-PEG 2000修飾的細(xì)胞穿膜肽，將以上材料溶解于氯仿中，待攪拌均勻后，加入流通的氮氣吹干，并于真空干燥除去殘余的有機(jī)溶劑；待完全干燥后，加入含有藥物等物質(zhì)的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）使單層磷脂水化，磷酸鹽緩沖溶液pH=7.4；采用帶有一定孔徑濾膜的擠壓器擠壓多次，即可得到包裹有待載帶物的脂質(zhì)體；
（3）脂質(zhì)體上連接核酸適體：PBS溶解的核酸適體DNA 在95℃孵育10 min，置于冰盒上孵育 15 min，使核酸適體形成三維結(jié)構(gòu)，將已形成好結(jié)構(gòu)的核酸適體與脂質(zhì)體以一定比例混合，通過某種化學(xué)等作用將核酸適體連接到脂質(zhì)體上，隨后除去多余的核酸適體。
所用的磷脂可為1，2-二油酰基磷脂酰膽堿（DOPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿（DMPC）、二亞油酰磷脂酰膽堿（DLPC）、二花生?；字Ｄ憠A（DAPC）、大豆磷脂（SPC）、氫化大豆磷脂（HSPC）。
所用的脂質(zhì)體與核酸適體的連接方式可為：脂質(zhì)體與膽固醇修飾的核酸適體相連，不同官能團(tuán)功能化的脂質(zhì)體通過縮合、click反應(yīng)化學(xué)方法與相應(yīng)官能團(tuán)修飾的核酸適體相連，脂質(zhì)體通過交聯(lián)劑與官能團(tuán)修飾的核酸適體相連。
所用脂質(zhì)體所攜帶的物質(zhì)為藥物小分子、蛋白、多肽、小干擾RNA、DNA及其衍生結(jié)構(gòu)、無機(jī)納米顆粒、不同納米結(jié)構(gòu)載帶的藥物小分子、不同納米結(jié)構(gòu)載帶的蛋白、不同納米結(jié)構(gòu)載帶的多肽、不同納米結(jié)構(gòu)載帶的小干擾RNA物質(zhì)。
所用的脂質(zhì)體攜帶的核酸適體為以各種不同腫瘤細(xì)胞為靶標(biāo)的單鏈DNA或單鏈RNA。
所用的脂質(zhì)體上連接的細(xì)胞穿膜肽為各種天然細(xì)胞穿膜肽及其衍生物。
該方法通過利用脂質(zhì)體載帶藥物或納米顆粒，并在脂質(zhì)體上修飾適合的核酸適體及細(xì)胞穿模肽，提高藥物的遞送和靶向治療，為疾病診斷治療提供了有效的手段，具有廣闊的應(yīng)用前景
本發(fā)明的優(yōu)點在于：
（1）利用脂質(zhì)體載帶藥物或納米顆粒，增強(qiáng)了藥物或納米顆粒的生物相容性，提高了腫瘤細(xì)胞對藥物或納米顆粒的攝取率。
（2）利用核酸適體和細(xì)胞穿模肽，增強(qiáng)了脂質(zhì)體載帶物對特定腫瘤細(xì)胞的靶向性，可對正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效區(qū)分，減少對正常細(xì)胞的損害，從而有效的殺死腫瘤細(xì)胞。
（3）方法簡單，易于修飾，所用材料天然，易于降解，生物相容性好。
具體實施方式
以下通過具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下的實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
聚乙二醇修飾的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG 2000-Mal）與半胱氨酸修飾的細(xì)胞穿膜肽TAT（Cys-TAT）以1:1.5比例溶解于含有三乙基胺的氯仿/甲醇（v/v=2:1）溶液中，黑暗條件下于25℃孵育24 hr。隨后真空干燥除去多余的有機(jī)溶劑，沉淀物重新溶于氯仿中。采用孔徑0.02 μm濾膜過濾溶液后，將溶液重新真空干燥除去有機(jī)溶劑，所得沉淀物（DSPE-PEG 2000-TAT）于-20℃保存待用。
稱取大豆磷脂（SPC）11.5 mg、膽固醇0.96 mg、DSPE-PEG 2000-TAT 1.15 mg，將以上材料溶解于氯仿中，待攪拌均勻后，加入流通的氮氣吹干，并于真空干燥除去殘余的有機(jī)溶劑。待完全干燥后，加入含有0.1 M DOX的磷酸鹽緩沖溶液（PBS, pH=7.4）使單層磷脂水化。采用帶有100 nm孔徑濾膜的擠壓器擠壓30次，即可得到包裹有DOX的脂質(zhì)體。
將10 μM PBS溶解的核酸適體DNA 在95℃孵育10 min，置于冰盒上孵育 15 min，使核酸適體形成三維結(jié)構(gòu)。將已形成好結(jié)構(gòu)的膽固醇修飾的核酸適體與脂質(zhì)體以100:1比例混合，于37℃孵育30 min，采用HPLC除去多余的核酸適體。
實施例2
聚乙二醇修飾的二硬脂?；字Ｒ掖及罚―SPE-PEG 2000-Mal）與半胱氨酸修飾的細(xì)胞穿膜肽TAT（Cys-TAT）以1:1.5比例溶解于含有三乙基胺的氯仿/甲醇（v/v=2:1）溶液中，黑暗條件下于25℃孵育24 hr。隨后真空干燥除去多余的有機(jī)溶劑，沉淀物重新溶于氯仿中。采用孔徑0.02 μm濾膜過濾溶液后，將溶液重新真空干燥除去有機(jī)溶劑，所得沉淀物于-20℃保存待用。
稱取大豆磷脂（SPC）11.5 mg、膽固醇0.96 mg、DSPE-PEG 2000-TAT 1.15 mg，將以上材料溶解于氯仿中，待攪拌均勻后，加入流通的氮氣吹干，并于真空干燥除去殘余的有機(jī)溶劑。待完全干燥后，加入含有0.1 M紫杉醇的磷酸鹽緩沖溶液（PBS, pH=7.4）使單層磷脂水化。采用帶有100 nm孔徑濾膜的擠壓器擠壓30次，即可得到包裹有paclitaxel的脂質(zhì)體。
將10 μM PBS溶解的核酸適體DNA 在95℃孵育10 min，置于冰盒上孵育 15 min，使核酸適體形成三維結(jié)構(gòu)。將已形成好結(jié)構(gòu)的膽固醇修飾的核酸適體與脂質(zhì)體以100:1比例混合，于37℃孵育30 min，采用HPLC除去多余的核酸適體。
實施例3
首先合成金種，在750 μL十六烷基三甲基溴化銨（0.1 M，CTAB）水溶液中加入25 μL 氯金酸（H AuCl4，12 mM），60 μL 冰浴的硼氫化鈉（Na BH4，10 mM）后，快速震蕩，25℃孵育2 hr。金納米棒生長，將950 μL CTAB（0.1 M），40 μL H AuCl4（12 mM），6 μL 硝酸銀（Ag NO3，0.01 M），6.4 μL 抗壞血酸（AA，0.1 M）的生長液快速震蕩混勻，使溶液顏色變?yōu)闊o色。之后在生長液中加入2 μL金種，快速震蕩10 s后，25℃孵育至少2 hr，所得棒型金納米顆粒（Au NRs）尺寸大約在60 nm×25 nm左右。
所得金納米棒離心三次洗去表面多余的CTAB，沉淀重懸后，將Au NRs與巰基修飾的DNA 以1:3000比例混勻，緩慢加入氯化鈉（Na Cl）及磷酸緩沖液（PB）使其終濃度分別達(dá)到0.1 M和 10 mM。隨后，離心三次洗去游離的巰基DNA。
聚乙二醇修飾的二硬脂?；字Ｒ掖及罚―SPE-PEG 2000-Mal）與半胱氨酸修飾的細(xì)胞穿膜肽TAT（Cys-TAT）以1:1.5比例溶解于含有三乙基胺的氯仿/甲醇（v/v=2:1）溶液中，黑暗條件下于25℃孵育24 hr。隨后真空干燥除去多余的有機(jī)溶劑，沉淀物重新溶于氯仿中。采用孔徑0.02 μm濾膜過濾溶液后，將溶液重新真空干燥除去有機(jī)溶劑，所得沉淀物于-20℃保存待用。
稱取大豆磷脂（SPC）11.5 mg、膽固醇0.96 mg、DSPE-PEG 2000-TAT 1.15 mg，將以上材料溶解于氯仿中，待攪拌均勻后，加入流通的氮氣吹干，并于真空干燥除去殘余的有機(jī)溶劑。待完全干燥后，加入含有濃縮10倍的Au NRs的磷酸鹽緩沖溶液（PBS, pH=7.4）使單層磷脂水化。采用帶有200 nm孔徑濾膜的擠壓器擠壓30次，即可得到包裹有Au NRs的脂質(zhì)體。
將10 μM PBS溶解的核酸適體DNA 在95℃孵育10 min，置于冰盒上孵育 15 min，使核酸適體形成三維結(jié)構(gòu)。將已形成好結(jié)構(gòu)的膽固醇修飾的核酸適體與脂質(zhì)體以1:100比例混合，于37℃孵育30 min，采用HPLC除去多余的核酸適體。
<110> 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司
<120> 基于核酸適體和細(xì)胞穿模肽的載帶藥物或納米顆粒進(jìn)入特定靶標(biāo)細(xì)胞的方法
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<212>DNA
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gggagacaag aataaacgct caagcagttg atcctttgga taccctggtt cgacaggagg ctcacaacag gc
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>
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<212>DNA
<213>人工序列
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ataccagctt attcaattcg ttgcatttag gtgcattacg ggggttatcc gctctctcag atagtatgtg caatca
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<212>DNA
<213>人工序列
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<221>misc feature
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<223>n =a或g或c或t
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<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<222>(23)…(62)
<223>n =a或g或c或u
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