一種肽核酸化合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于肽核酸領(lǐng)域，公開了一種肽核酸化合物，所述的肽核酸化合物的堿基序列為5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’。所述的一種肽核酸化合物的制備方法，包括下述步驟：（1）將氨基保護的肽核酸單體接到固相載體上；（2）脫除保護基使氨基游離出來；（3）下一個氨基保護的肽核酸單體與載體上的肽核酸的氨基偶合反應生成肽鍵；（4）重復上述步驟至肽核酸序列合成完成，序列為5’-CACTTACTGGGATAGCGG-3’；（5）將肽核酸序列從固相載體上列接下來，并脫除所有側(cè)鏈保護基；（6）將上述產(chǎn)物經(jīng)過凝膠柱分離和反向HPLC純化，得到最終產(chǎn)物。
【專利說明】一種肽核酸化合物及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學合成領(lǐng)域，涉及一種肽核酸化合物及其制備方法，具體是涉及一 種具有抑制黑色素生成效果的肽核酸化合物及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 酪氨酸酶在人體黑色素形成過程中起著關(guān)鍵作用，黑色素細胞內(nèi)的酪氨酸在酪氨 酸酶的作用下轉(zhuǎn)換為多巴，并進一步氧化為多巴醌，多巴醌經(jīng)過一系列中間產(chǎn)物最終形成 真黑色素。通過減少酪氨酸酶的生成或抑制酪氨酸酶的活性實現(xiàn)抑制黑色素生成的效果在 皮膚病防治、腫瘤治療以及美容領(lǐng)域都有著重要的意義。近年來隨著分子生物學的發(fā)展基 因干擾技術(shù)為減少酪氨酸酶生成提供了一條可行的途徑，其原理是根據(jù)堿基互補配對特性 將與酪氨酸酶基因片段互補的RNA或肽核酸（PNA)序列引入黑色素細胞，通過引入序列與 目標基因片段的特異性結(jié)合阻礙酪氨酸酶基因的表達，從而實現(xiàn)減少酪氨酸酶生成進而減 少黑色素生成的效果。 目前所用的干擾序列有RNA和PNA，其中PNA以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵 取代了 DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，不僅可以通過Watson-Crick堿基配對的形式識別并 結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，又由于其不帶負電荷，與DNA和RNA之間不 存在靜電斥力，結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高，成為基因干擾治療中更加安全高效的 手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 要解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提出了一種肽核酸化合物TDS的制備方法及應用，它 與黑色素細胞序列中酪氨酸酶的基因序列片段互補，并且與酪氨酸酶基因以外的任何人類 已知基因序列無同源性，TDS通過與酪氨酸酶的特異結(jié)合達到抑制酪氨酸酶和黑色素生成 的效果。
[0004] 技術(shù)方案：本發(fā)明公開了 一種肽核酸化合物，其堿基序列為 5' -CACTTACTGGGATAGCGG-3'，記為 TDS。 該肽核酸化合物通過以下四種肽核酸單體合成：

【權(quán)利要求】
1. 一種肽核酸化合物，其特征在于，所述的肽核酸化合物的堿基序列為 5, -CACTTACTGGGATAGCGG-3，。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肽核酸化合物，其特征在于所述的肽核酸化合物由單 體構(gòu)成，所述的單體用下列通式表示：
G為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶四種堿基中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肽核酸化合物的制備方法，其特征在于制備方法包括 下述步驟：（1)將氨基保護的肽核酸單體接到固相載體上； (2) 脫除保護基使氨基游離出來； (3) 下一個氨基保護的肽核酸單體與載體上的肽核酸的氨基偶合反應生成肽鍵； (4) 重復上述步驟至肽核酸序列合成完成，序列為5' -CACTTACTGGGATAGCGG-3' ； (5) 將肽核酸序列從固相載體上列接下來，并脫除所有側(cè)鏈保護基； (6) 將上述產(chǎn)物經(jīng)過凝膠柱分離和反向HPLC純化，得到最終產(chǎn)物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種肽核酸化合物的制備方法，其特征在于制備方法包括 下述步驟： (1) 稱取固相多肽合成樹脂于反應器中，充分洗滌后加入PNA-C，HOBt，DCC，DCM，DMF， 室溫下攪拌，以DCM和NMP交替洗滌后以TFA/DCM溶液脫保護后用DCM和NMP交替洗滌樹 脂； (2) 重復上述操作，將目標PNA序列中的單體按從5'到3'的順序依次接入，序列為 5, -CACTTACTGGGATAGCGG-3,； (3) 在反應器中緩慢加入TFA/TIS/H20=95/2. 5/2. 5 (重量比）的溶液，反應后過濾并用 氮氣吹去大部分的溶劑，先后用無水乙醚和30%乙酸水溶液洗滌，再用1. 5:1的乙腈/水和 30%乙酸水溶液交替洗滌，合并洗液，減壓蒸餾后冷凍干燥得到粗產(chǎn)物； (4) 將粗產(chǎn)物溶于0. 5mol/L的乙酸溶液，濾除不溶物，使用凝膠柱純化，，收集淋洗曲 線第一個主峰處的產(chǎn)物，冷凍干燥； (5) 粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化，經(jīng)過HPLC純化后得到最終產(chǎn)品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種肽核酸化合物的制備方法，其特征在于制備方法包括 下述步驟： (1) 稱取IOOmg固相多肽合成樹脂于反應器中，充分洗滌后加入PNA-C50mg，HOBt 34mg，DCC51mg，DCM3mL，DMF0. 5mL，室溫下攪拌3h，以DCM和NMP交替洗滌后以25%的 TFA/DCM溶液脫保護30分鐘后用DCM和NMP交替洗滌樹脂； (2) 重復上述操作，將目標PNA序列中的單體按從5'到3'的順序依次接入，序列為 5, -CACTTACTGGGATAGCGG-3,； (3) 在反應器中緩慢加入TFA/TIS/H20=95/2. 5/2. 5的溶液，反應3小時后過濾并用氮 氣吹去大部分的溶劑，先后用無水乙醚和30%乙酸水溶液和洗滌，再用1. 5:1的乙腈/水和 30%乙酸水溶液交替洗滌，合并洗液，減壓蒸餾后冷凍干燥得到粗產(chǎn)物； (4) 將粗產(chǎn)物溶于2-3毫升0. 5mol/L的乙酸溶液，濾除不溶物，使用凝膠柱純化，淋洗 液為0. 5mol/L乙酸溶液，流速為lml/min，收集淋洗曲線第一個主峰處的產(chǎn)物，冷凍干燥； (5) 粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化，色譜柱為C18柱，流動相為：A:0. 1%TFA/H20,B: 70%CH3CN/0. 1%TFA/H20，流速為lmL/min，經(jīng)過HPLC純化后得到最終產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種肽核酸化合物的制備方法，其特征在于制備方法包括 下述步驟：（1)稱取150mg固相多肽合成樹脂于反應器中，充分洗滌后加入PNA-C 50mg， HOBt34mg，DCC 51mg，DCM 3mL，DMF 0. 5mL，40攝氏度下攪拌lh，以DCM和NMP交替洗滌后 以25%的TFA/DCM溶液脫保護30分鐘后用DCM和NMP交替洗滌樹脂； (2) 重復上述操作，將目標PNA序列中的單體按從5'到3'的順序依次接入，序列為 5, -CACTTACTGGGATAGCGG-3,； (3) 將反應后的樹脂放入氟化氫裂解儀中，加入1滴苯甲醚，將裂解儀抽真空并冷卻， 加入2mL液態(tài)氟化氫，-5°C反應2小時，使用油泵抽除未反應的氟化氫；先后用無水乙醚和 30%乙酸水溶液和洗滌，再用1. 5:1的乙腈/水和30%乙酸水溶液交替洗滌，合并洗液，減壓 蒸餾后冷凍干燥得到粗產(chǎn)物； (4) 將粗產(chǎn)物溶于2毫升0. 5mol/L的乙酸溶液，濾除不溶物，使用凝膠柱純化，淋洗液 為0. 5mol/L乙酸溶液，流速為lmL/min，收集淋洗曲線第一個主峰處的產(chǎn)物，冷凍干燥； (5 )粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化得到最終產(chǎn)品。
【文檔編號】C07K14/00GK104311642SQ201410506226
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】李子寅, 凌靜, 凌天陽 申請人:蘇州維泰生物技術(shù)有限公司