靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及基因超聲靶向轉(zhuǎn)染領(lǐng)域,具體涉及一種用于C-myc肽核酸超聲靶向轉(zhuǎn)染的超聲微泡及其制備方法,所述超聲微泡裝載有肽核酸,所述肽核酸為C-myc原癌基因的反義核酸制備的肽核酸,所述反義核酸的核酸序列如下:5’-AGCGAGGATATCTGG?AAGAAATTCGAG-3’。所述靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法,包括如下步驟:在制備超聲微泡時(shí)加入C-myc原癌基因的反義核酸制備的肽核酸。本發(fā)明在制備超聲微泡時(shí)在白蛋白溶液中加入定量PNA,使其包被于微泡壁白蛋白基質(zhì)中并形成微泡壁結(jié)構(gòu)的一部分,在超聲場(chǎng)作用下靶向轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染效率高,轉(zhuǎn)染率可達(dá)30%以上。
【專(zhuān)利說(shuō)明】靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因超聲靶向轉(zhuǎn)染領(lǐng)域,具體涉及一種靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]C-myc原癌基因是myc基因家族的重要成員之一,是多種生長(zhǎng)因子刺激后誘導(dǎo)的即刻早期基因。它既是一種可易位基因,又是一種多種物質(zhì)調(diào)節(jié)的可調(diào)芐基因。C-Myc在胞漿內(nèi)合成后,與其它蛋白形成寡聚體,再轉(zhuǎn)移到核內(nèi),并結(jié)合到特異性的DNA序列上,從而激活和抑制許多靶基因的轉(zhuǎn)錄,引起細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的改變,發(fā)揮其生理調(diào)節(jié)功能及惡性轉(zhuǎn)化作用。是一種可使細(xì)胞無(wú)限增殖,獲永生化功能,促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因。myc基因參予細(xì)胞凋零、多種腫瘤發(fā)生發(fā)展、血管損傷后內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞早期誘導(dǎo)、分化、增殖和遷移以及內(nèi)膜細(xì)胞間基質(zhì)的合成與堆積調(diào)節(jié)。
[0003]反義寡核苷酸靶 向抑制腫瘤、平滑肌細(xì)胞增生相關(guān)癌基因的體外研究已取得極大的進(jìn)展,作為基因藥物應(yīng)用于體內(nèi)受限主要是它極易被核酸酶降解使其半衰期極短;進(jìn)入特定的靶細(xì)胞較難且較少。因此,許多學(xué)者希望通過(guò)對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾增加其抵抗核酸酶的能力;用病毒攜帶增加其轉(zhuǎn)染特異性等。但丹麥哥本哈根大學(xué)的Nielsen等設(shè)計(jì)合成的肽核酸(PNA)是已知DNA或RNA最成功的類(lèi)似物。
[0004]PNA是一類(lèi)人工合成的DNA或RNA類(lèi)似分子,與核酸分子不同之處是將DNA或RNA分子中的磷酸脫氧核糖核酸或磷酸核糖骨架由重復(fù)排列的有酰胺鍵連接的N-2-乙基甘氨酸單位(肽鏈)取代。PNA可以通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)的形式識(shí)別并結(jié)合DNA或RNA序列,形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負(fù)電荷,與DNA和RNA之間不存在靜電斥力,因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高;不同于DNA或DNA、RNA間的雜交,PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響,與DNA或RNA分子的雜交能力遠(yuǎn)優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA,表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識(shí)別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解,并可以與配基相連共轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞,其細(xì)胞毒性較低。這些都是其他寡核苷酸所不具備的優(yōu)點(diǎn)??勺鳛榛蛱结槪⒛芤苑戳x序列的形式用于基因功能、基因表達(dá)調(diào)控等研究。
[0005]在藥用研究方面,目前,它是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上,通過(guò)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)構(gòu)建并最終人工合成的第三代反義試劑。根據(jù)PNA的代謝穩(wěn)定性,主要將其用于抑制基因表達(dá)的反義藥物研究領(lǐng)域,國(guó)外幾家制藥及生物技術(shù)公司,ISIS、PE等公司均投入大量精力從事開(kāi)發(fā)研究;根據(jù)其與DNA優(yōu)良的雜交穩(wěn)定性,PNA又被廣泛用于DNA分子識(shí)別和操縱。
[0006]盡管反義PNA具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn),并可能在基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等環(huán)節(jié)上抑制或下調(diào)靶基因的表達(dá),達(dá)到治療疾病的目的,但目前存在的問(wèn)題是作為藥用PNA不易進(jìn)入細(xì)胞,進(jìn)一步提高組織和細(xì)胞對(duì)反義PNA的攝人量及反義PNA進(jìn)入細(xì)胞核一直是影響其廣泛應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵問(wèn)題。
[0007]超聲造影技術(shù)的不斷發(fā)展和可攜帶基因的微泡聲學(xué)造影劑的研制,使得超聲已經(jīng)從一種臨床診斷工具,進(jìn)入到治療領(lǐng)域。將二者結(jié)合起來(lái)用于腫瘤或心血管疾病等的治療,為這些患者提供一條安全、高效的治療途徑。微泡造影劑聯(lián)合診斷超聲介導(dǎo)基因靶向傳輸,是一種新型、無(wú)創(chuàng)、高效、簡(jiǎn)便易普及的技術(shù)。超聲觸發(fā)破壞微泡方法被認(rèn)為可作為特定器官的靶基因治療手段。其基本原理為:(I)超聲造影劑是基因的良好載體,與病毒載體相t匕,造影劑微泡有更大的容量,可攜帶反義寡核苷酸,任意片斷DNA,乃至整個(gè)染色體。(2)造影劑降低了超聲的空化域值,超聲照射可在特定空間(聚焦區(qū))和特定時(shí)間破壞造影劑微泡,產(chǎn)生空化效應(yīng)和聲化學(xué)效應(yīng),使周?chē)屑?xì)胞(包括血管內(nèi)皮細(xì)胞和組織細(xì)胞)細(xì)胞間隙增寬,膜通透性增大,細(xì)胞表面一過(guò)性小孔形成(聲孔效應(yīng)),同時(shí)微泡破裂時(shí)產(chǎn)生的沖擊波,微聲流作為一種驅(qū)動(dòng)力量,促使從微泡上釋放出來(lái)的基因通過(guò)破裂的微血管和內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入靶細(xì)胞。
[0008]由于PNA是水溶性,進(jìn)入細(xì)胞較難,以往人們采用脂質(zhì)體末段標(biāo)記方法將其帶入細(xì)胞,但細(xì)胞攝入量有限,在體較難發(fā)揮作用;應(yīng)用高效脂質(zhì)體如陽(yáng)離子脂質(zhì)體等可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
[0009]超聲微泡尤其是以白蛋白為原料制備的超聲微泡具低毒性、低免疫原性、低侵襲力、器官特異性、可重復(fù)應(yīng)用以及廣泛的適用性,作為攜帶治療基因的載體,并用超聲觸發(fā)破壞微泡技術(shù)以對(duì)腫瘤、心肌、血管、骨骼肌等靶組織進(jìn)行了一定的研究。這些微泡攜帶DNA的量從IOg到2mg不等;單用超聲照射可使裸DNA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率提高10倍,如聯(lián)合使用微泡造影劑,則可使基因的轉(zhuǎn)染率提高3000倍。以往在制備超聲微泡基因載體時(shí)大多是先制備微泡然后再將其與基因或質(zhì)粒連接,結(jié)合穩(wěn)定性和承載量較難估計(jì),靶向轉(zhuǎn)染基因的量和效果較難控制。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中PNA和超聲微泡存在的缺陷,本發(fā)明的目的是提供一種用于C-myc肽核酸超聲革巴向轉(zhuǎn)染的超聲微泡,即在制備超聲微泡時(shí)在白蛋白溶液中加入定量PNA,使其包被于微泡壁白蛋白基質(zhì)中并形成微泡壁結(jié)構(gòu)的一部分,在超聲場(chǎng)作用下靶向轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞核。
[0011 ] 本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種祀向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡,所述超聲微泡裝載有肽核酸,所述肽核酸為C-myc原癌基因的反義核酸制備的肽核酸,所述反義核酸的核酸序列如下:5’ -AGCGAGGATATCTGG AAGAAATTCGAG-3’。
[0012]本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種祀向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法,包括如下步驟:在制備超聲微泡時(shí)在白蛋白溶液中加入權(quán)利要求1所述的C-myc原癌基因的反義核酸制備的肽核酸。
[0013]優(yōu)選的,上述的靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法,具體包括如下步驟:
[0014]a、取包含蔗糖的5%牛血清白蛋白液體10ml,加入2mg合成的如權(quán)利要求1所述的C-myc原癌基因的反義核酸制備的肽核酸,混勻得液體A,所述蔗糖在牛血清白蛋白液體中的質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為10% ;
[0015]b、依次用氧氣和氟碳?xì)怏w飽和液體A,超聲波發(fā)生器處理后即得超聲微泡。 [0016]優(yōu)選的,上述的靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法中,所述超聲微泡的濃度
0.8-1.8X1O9 個(gè)/ml。[0017]優(yōu)選的,上述的靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法中,所述氧氣和氟碳?xì)怏w的流量為6ml.min-1。
[0018]優(yōu)選的,上述的靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法中,所述超聲波發(fā)生器處理具體為:超聲波發(fā)生器輸出功率180W,頻率為20kHz條件下處理lmin。
[0019]本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種上述靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡在制備治療C-myc原癌基因相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明有益效果:本發(fā)明考慮到PNA從結(jié)構(gòu)上屬肽類(lèi),其物理性狀與白蛋白相似且不荷電,與白蛋白間不產(chǎn)生理化作用,同溶于水,因此,在制備超聲微泡時(shí)在白蛋白溶液中加入定量PNA,使其包被于微泡壁白蛋白基質(zhì)中并形成微泡壁結(jié)構(gòu)的一部分,在超聲場(chǎng)作用下靶向轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染效率高。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例里,制備兔髂動(dòng)脈內(nèi)膜增生模型,設(shè)計(jì)合成針對(duì)兔C-myc mRNA原癌基因的肽核酸,用白蛋白作為原料制備超聲微泡,在超聲場(chǎng)作用下靶向轉(zhuǎn)染血管內(nèi)膜,轉(zhuǎn)染效果較高,轉(zhuǎn)染率可達(dá)30%以上。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1:HRP_Streptavindin和trueblueTM染色顯不血管內(nèi)膜反義寡cnyc PNA轉(zhuǎn)染陽(yáng)性SMC,100X ;
[0022]圖2:HRP_Streptavindin和trueblueTM染色顯不血管內(nèi)膜反義寡cnyc PNA轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞,400X ;
[0023]圖3:血管損傷后1周血管壁經(jīng)彈力纖維染色顯示內(nèi)膜明顯增厚,管腔內(nèi)可見(jiàn)血栓形成,200 X ;
[0024]圖4:免疫組化染色顯示增生的血管內(nèi)膜可見(jiàn)較多PCNA反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞,200 X。【具體實(shí)施方式】
[0025]為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果,以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說(shuō)明。
[0026]實(shí)施例
[0027]1.本發(fā)明用于C-myc肽核酸超聲祀向轉(zhuǎn)染的超聲微泡的制備及其轉(zhuǎn)染
[0028]1.1 C-myc mRNA原癌基因的肽核酸設(shè)計(jì):
[0029]對(duì)比分析原核及真核動(dòng)物包括病毒(v-myc )、小鼠、大鼠、兔、羊、貓、狗、豬和人c-myc原癌基因的cDNA序列,發(fā)現(xiàn)其自轉(zhuǎn)錄起始密碼開(kāi)始下游133位至177位共45個(gè)堿基序列完全相同。根據(jù)核酸探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)針對(duì)c-mycmRNA的肽核酸(PNA)序列如下(共27 個(gè)堿基):136 位至Ij 162 位,5,-AGC GAGGAT ATC TGG AAG AAA TTC GAG-3,由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成,其5’氨基端以生物素分子標(biāo)記。
[0030]1.2載上述PNA的超聲微泡的制備
[0031]無(wú)菌制備含10%(g.ml-1)鹿糖的5%(g.mi-1)牛血清白蛋白液體10ml,置于有蓋50ml塑料離心管中;加入2mg上述步驟合成的PNA并充分混勻;依次用氧氣和氟碳?xì)怏w飽和上述混勻的液體(流量:6ml.mirT1),約10min,超聲波發(fā)生器處理1min (條件:180W,固定頻率20kHz);調(diào)整微泡濃度0.8-1.8X 109個(gè)/ml,PNA含量為0.2mg/ml,將制備的微泡4°C下密閉保存?zhèn)溆谩H〔糠诛@微鏡觀察微泡形態(tài)并計(jì)數(shù);ZetaSiZer3000儀測(cè)定粒徑大小和表面Zeta電位。
[0032]1.3血管造模和超聲靶向轉(zhuǎn)染
[0033]純種新西蘭兔22只(雄性,2.3-2.5kg),隨機(jī)分為分組:
[0034](1)實(shí)驗(yàn)組(n=12):經(jīng)股動(dòng)脈插管,球囊剝脫一側(cè)髂動(dòng)脈內(nèi)膜造成內(nèi)膜損傷和增生模型。選擇肝臟為超聲顯影對(duì)照器官。
[0035]術(shù)后二維超聲經(jīng)腹壁觀察肝臟顯影后經(jīng)耳緣靜脈注入載PNA白蛋白微泡劑5ml (含PNAlmg)并觀察到肝臟顯影明顯增強(qiáng),立即經(jīng)皮行局部受損血管治療性超聲照射(超聲頻率1MHz,強(qiáng)度1.5ff/cm2,6min)并觀察到肝臟顯影逐步恢復(fù)至正常。
[0036](2)對(duì)照組(n=10):球囊剝脫內(nèi)膜后經(jīng)靜脈輸入等量生理鹽水及同等條件超聲的治療。
[0037]1.4取材和病理檢查
[0038]術(shù)后I周氣體栓塞處死動(dòng)物,取實(shí)驗(yàn)髂動(dòng)脈血管大體觀察后石蠟包埋,常規(guī)病理活檢,石蠟包埋切片做HE、馬氏三色、彈力纖維染色;真彩色病理圖像分析儀(Leica)直接進(jìn)行血管內(nèi)膜形態(tài)測(cè)量;免疫組織化學(xué)染色。
[0039]1.5原位轉(zhuǎn)基因效果檢測(cè)
[0040]石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,PBS及SSC洗并加入稀釋的HRP-Streptavindin (晶美生物工程公司)37°C孵育,I Xbiotin wash solusion 洗后加入truebIueTM染色和Orcein對(duì)比染色,二甲苯透明并封片。陽(yáng)性產(chǎn)物為在胞衆(zhòng)或細(xì)胞核內(nèi)藍(lán)綠色顆粒狀沉淀物。計(jì)數(shù)各段動(dòng)脈橫切面血管壁200個(gè)細(xì)胞所占的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率作為轉(zhuǎn)染率。
[0041]1.6免疫組化染色
[0042]采用標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素生物素法(LSAB法)并按試劑盒說(shuō)明操作。I抗體為小鼠抗SMC°-actin單克隆抗體(DAC0,1:200稀釋)和小鼠抗PCNA單克隆抗體(DAC0,1:100稀釋)由福建邁新公司提供。計(jì)數(shù)各段動(dòng)脈橫切面內(nèi)膜中200個(gè)細(xì)胞所占的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),求其平均值作為實(shí)際計(jì)數(shù)。
[0043]2結(jié)果分析:
[0044]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS for Windowl1.0處理,數(shù)據(jù)采用x ± s表示,組間差異采用方差分析。P <0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性。
[0045]2.1超聲微泡的物理表征
[0046]制備的超聲微泡園球形囊泡狀,大小較一致,分散良好,直徑2-5 μ m。經(jīng)4°C保存2周后未發(fā)生微泡融合、破裂,形態(tài)學(xué)上未發(fā)生改變,計(jì)數(shù)與新制備的微泡溶液差別不顯著,對(duì)熱穩(wěn)定性良好(40 °C, 30min )。
[0047]2.2靶向轉(zhuǎn)PNA效果
[0048]對(duì)照組血管壁未見(jiàn)PNA轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組在血管中層可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在增生的內(nèi)膜(請(qǐng)參閱圖1和圖2),計(jì)數(shù)平均為(67.25±25.10個(gè)),轉(zhuǎn)染率為 33.63%。
[0049]2.3血管壁病理及免疫組化改變
[0050]球囊損傷兔髂動(dòng)脈后I周見(jiàn)內(nèi)皮缺失,內(nèi)膜增厚,內(nèi)膜細(xì)胞明顯增多,管腔變窄,可見(jiàn)血栓形成(請(qǐng)參閱圖3)。免疫組化顯示大多數(shù)細(xì)胞抗a-actin抗體反應(yīng)陽(yáng)性,反映這些增生細(xì)胞是SMC ;部分細(xì)胞顯示PCNA陽(yáng)性,表明這些細(xì)胞增生較為活躍(請(qǐng)參閱圖4)。病理形態(tài)測(cè)量及免疫組化陽(yáng)性計(jì)數(shù)以及反義PNA對(duì)這些指標(biāo)影響見(jiàn)下表1??梢?jiàn)反義PNA明顯抑制內(nèi)膜增厚和內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)PCNA。表1為反義PNA對(duì)血管損傷后I周內(nèi)膜厚度、面積和 PCNA 表達(dá)的影響(X 土 S),其中 *P < 0.05 ;#P <0.01。
[0051]表1
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡,其特征在于,所述超聲微泡裝載有肽核酸,所述肽核酸為C-myc原癌基因的反義核酸制備的肽核酸,所述反義核酸的核酸序列如下:5’ -AGCGAGGATATCTGG AAGAAATTCGAG-3’。
2.一種靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:在制備超聲微泡時(shí)在白蛋白溶液中加入權(quán)利要求1所述的C-myc原癌基因的反義核酸制備的肽核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法,其特征在于,包括如下步驟: a、取包含蔗糖的5%牛血清白蛋白液體10ml,加入2mg合成的如權(quán)利要求1所述的C-myc原癌基因的反義核酸制備的肽核酸,混勻得液體A,所述蔗糖在牛血清白蛋白液體中的質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為10% ; b、依次用氧氣和氟碳?xì)怏w飽和液體A,超聲波發(fā)生器處理后即得所述超聲微泡。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法,其特征在于,所述超聲微泡的濃度0.8-1.8X IO9個(gè)/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法,其特征在于,所述氧氣和氟碳?xì)怏w的流量為6ml.mirT1。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡的制備方法,其特征在于,所述超聲波發(fā)生器處理具體為:超聲波發(fā)生器輸出功率180W,頻率為20kHz條件下處理lmin。
7.如權(quán)利要求1所述靶向轉(zhuǎn)染肽核酸的超聲微泡在制備治療C-myc原癌基因相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K49/22GK103784977SQ201410081629
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】楊建安, 季軍, 何霞, 陳小玲, 令小萍 申請(qǐng)人:楊建安, 季軍