本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以慢性對稱性關(guān)節(jié)炎為特征的自身免疫性疾病,其基本病變?yōu)榛ぱ装Y,可引起軟骨破壞和骨質(zhì)侵蝕,導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)在 2002 年發(fā)布了 RA 治療最新指南,提出 RA 治療策略是阻止病情發(fā)展和達(dá)到緩解,即抑制滑膜炎癥、防止和控制關(guān)節(jié)破壞、阻止功能喪失及減輕疼痛。CIA 模型是目前國際慣用的 RA 動(dòng)物模型,具有與人類 RA 較相似的臨床、組織病理學(xué)和免疫學(xué)變化特點(diǎn)。已知 RA 的關(guān)節(jié)損傷和骨破壞是由慢性滑膜炎癥所介導(dǎo)。感染或創(chuàng)傷等外來刺激,啟動(dòng)了自身免疫反應(yīng),使滑膜細(xì)胞迅速增殖,各種炎癥細(xì)胞對滑膜的浸潤加強(qiáng),同時(shí)分泌產(chǎn)生大量細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和各種抗體等,聯(lián)合介導(dǎo)了 RA 炎癥關(guān)節(jié)損傷和骨破壞。
中醫(yī)在認(rèn)識(shí)與治療本病上有獨(dú)到的優(yōu)勢。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹證”范疇，歷代醫(yī)家根據(jù)其特點(diǎn)又稱之為“歷節(jié)病”、“鶴膝風(fēng)”、“痛痹”、“骨痹”、“旭痹”等。中醫(yī)認(rèn)為本病是由素體虛弱，正氣不足，膝理不密，衛(wèi)外不固，加之外感風(fēng)、寒、濕、熱之邪而形成。即《素問.痹論》所言“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。”氣血運(yùn)行不暢，癖血阻絡(luò)是痹證的中心環(huán)節(jié)。 病多因稟賦素虛,調(diào)攝不慎,病邪復(fù)感,直接感受風(fēng)濕熱之邪,或風(fēng)寒濕三邪,也可由臟腑功能失調(diào),如陽熱體質(zhì),或陰血虧耗所致。何永生等認(rèn)為ＲＡ發(fā)病的病機(jī)關(guān)鍵是邪正交爭中的正傷與邪侵。正傷指人體的正氣虧虛及血瘀、氣滯、痰凝等,是其發(fā)病的內(nèi)在因素；邪侵多責(zé)之于風(fēng)寒濕熱。
蒲桃：本品為桃金娘科植物海南浦桃Syzygium cumini(L.)Skeels的干燥果實(shí)。秋季采集,除去枝葉，晾干?！拘晕丁繚?，溫，辛。【功能與主治】溫腎祛寒。用于“三邪”病，腎寒病，淋濁。【性狀】本品呈圓形、斜矩圓形，長1～2cm，寬0.5～1cm。表面棕褐色至黑色，外果皮皺縮成網(wǎng)狀紋，有時(shí)外果皮脫落，表面較光滑，內(nèi)果皮淡黃棕色,頂端帶有宿萼,似瓶口狀，中心可見一干枯的花柱，種子1枚，黃褐色，堅(jiān)硬。氣清香，味淡。收載于衛(wèi)生部頒藏藥標(biāo)準(zhǔn)（第一冊），標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3-BC-0112-95。
草玉梅：本品為毛莨科植物草玉梅Anemone rivularis Buch.-Ham.ex DC.及同屬多種植物的干燥果實(shí)。秋后采集成熟果實(shí)，揀凈雜質(zhì)，曬干。【性味】辛、苦，溫?！竟δ芘c主治】去腐，提升胃溫，引流黃水。用于胃蟲，刺痛，蛇咬傷，寒性腫瘤，淋病，關(guān)節(jié)積黃水等疾病?！拘誀睢勘酒烦始?xì)長橢圓形,長5～8mm,寬約2mm。表面淺黃綠色或一端顯淺綠色,光滑，基部具短柄，先端宿存細(xì)長花柱，呈鉤狀彎曲。質(zhì)韌，果皮與種皮分離，斷面乳白色，間或呈淺褐色，略顯油性。氣微，味微辣。收載于衛(wèi)生部頒藏藥標(biāo)準(zhǔn)（第一冊），標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3-BC-0066-95。
飄拂草：為莎草科飄拂草屬植物兩岐飄拂草Fimbristylis dichotoma (L) Vahl[Scirpus dichotomus L.;S.annuus All.;Fimbristylis annua(All.)Roem.et Schult]的全草。夏、秋季采收，洗凈，曬干?！拘晕丁课兜?；性寒?！練w經(jīng)】腎；膀胱經(jīng)。【功能主治】清熱利尿；解毒。主小便不利；濕熱浮腫；淋??；小兒胎毒。【化學(xué)成份】 含雙氫莎草醌(dihydrooyperaqnone)、四氫莎草醌。(tetrahydrocyperaquinone)，莎草醌(cyperapuinone)，羥基莎草醌(hydroxycyperapuinone)，去甲莎草醌(demethylcyperapuinone)?！驹参镄螒B(tài)】 兩歧飄拂草，草本。稈叢生，高20-50cm。全株無毛或有疏柔毛。葉線形，短于稈，寬1-2.5mm，先端急尖或鈍；鞘基部革質(zhì)?；ㄐ蛳碌娜~狀苞片3-4，常1-2片，長于花序。聚傘花序復(fù)出或簡單；小穗卵形或長圓狀卵形，長5-12mm，寬2-3mm，有多數(shù)花；鱗片卵形或長圓形，長2-2.5mm，棕褐色，有光澤，有3-5脈，先端有短尖；雄蕊2-3；花柱扁平，上部有緣毛；柱頭2。小堅(jiān)果寬倒卵形，雙凸?fàn)睿L1-1.2mm，白色至至淡褐色，表面有橫長圓形網(wǎng)紋，縱肋7-9條，顯著隆起，有褐色短柄。花、果期7-10月。收載于中藥大辭典。
小花鳶尾根：為鳶尾科鳶尾屬植物小花鳶尾Iris speculatrix Hance的根莖及根。9-11月采收，洗凈切段，曬干?！拘晕丁啃?；溫；有小毒?！竟δ苤髦巍炕钛?zhèn)痛；祛風(fēng)除濕。主跌打損傷；風(fēng)寒濕痹；瘋狗咬傷；蛇傷?！驹参镄螒B(tài)】 小花鳶尾 多年生草本，高30-40cm。植株基部圍有棕褐色的老葉鞘纖維及被針形的鞘狀葉。根莖橫生，較粗壯，環(huán)節(jié)顯著。基生葉劍形或條形，長10-40cm，寬3-8mm，先端漸尖，基部鞘狀，全緣；莖生葉3-4片，較基生葉短。花莖扁平，有苞片2，披針形；內(nèi)含l-2花；花梗長3-5.5cm，花謝后彎曲；花藍(lán)紫色或淡藍(lán)色，直徑5-6cm，外輪裂片匙形，有深紫色的環(huán)形斑塊，中脈密具橙黃色須狀附屬物，內(nèi)輪裂片披針形，傾斜；雄蕊3，花藥白色；子房下位，3室，花柱分枝扁平，3分枝，花瓣?duì)?，先?裂，邊緣有齒。蒴果橢圓形，長5-5，5cm，直徑l-1.5cm，先端有細(xì)長而尖的喙，熟時(shí)縱裂為3瓣。種子梨形，棕褐色?；ㄆ?-5月，果期7-8月。收載于中藥大辭典。
飛蛾樹：為槭樹科槭屬植物長裂葛蘿槭Acer grosseri Pax var.hersii（Rehd.）Rehd.［A.hersii Rehd.］的嫩枝和果實(shí)。9-10月采收果實(shí)，曬干；6-7月采收嫩枝，曬干?！拘晕丁?苦；咸；平?！竟δ苤髦巍恐箍?；斂瘡。主新久咳嗽；鵝口瘡?！驹螒B(tài)】 長裂葛蘿槭 落葉喬木，高達(dá)8m。樹皮淡褐色，光滑；當(dāng)年生枝綠色或紫綠色，多年生枝灰黃色或灰褐色，葉對生；葉柄長2-3cm，細(xì)瘦，無毛；葉片紙質(zhì)，卵形，長7-9cm，寬5-6cm，邊緣具密而尖銳的重鋸齒，先端銳尖，基部近于心臟形，常較深的3裂，中央裂片較大，三角狀卵形，上面深綠色，無毛；下面淡綠色，嫩時(shí)在葉脈基部被淡黃色叢毛，老則脫落；基出脈3條，側(cè)脈羽狀?；▎涡?，雌雄異株，常成細(xì)瘦下垂的總狀花序；萼片5；花瓣5；雄蕊8，無毛，在雌花中不發(fā)育；花盤位于雄蕊內(nèi)側(cè)；子房紫色，在雄花中不發(fā)育。花梗長3-4mm。翅果幼時(shí)淡紫色，熟后黃褐色；小堅(jiān)果微扁平，翅連同小堅(jiān)果長2.5-2.9cm，寬約5mm，張開成鈍角或近于水平?；ㄆ?月，果期9月。收載于中藥大辭典。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服背景技術(shù)的不足，提供一種有效防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法。
本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
制成該防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：
草玉梅342-348重量份 蒲桃312-318重量份 小花鳶尾根124-128重量份 飛蛾樹112-116重量份 飄拂草105-109重量份。
優(yōu)選的用于防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，是由如下重量份的原料藥組成：
草玉梅345重量份 蒲桃315重量份 小花鳶尾根126重量份 飛蛾樹114重量份 飄拂草107重量份。
一種防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于藥物組合物可以采用制劑學(xué)的常規(guī)方法制備成片劑或膠囊劑或滴丸。
一種防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于藥物組合物與化學(xué)藥或中藥組成的防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物。
一種防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的制備方法，其特征在于按如下步驟制備：
原料藥的組成和重量份為：草玉梅342-348重量份 蒲桃312-318重量份 小花鳶尾根124-128重量份 飛蛾樹112-116重量份 飄拂草105-109重量份；
制備方法：
（1）按原料藥配比取草玉梅、蒲桃、小花鳶尾根、飛蛾樹、飄拂草，混勻，用重量百分比濃度16%乙醇作為溶劑，在37℃溫浸提取，提取次數(shù)為18次，每次提取時(shí)間為65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的44倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過SP70大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度32%乙醇溶液洗脫SP70大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度32%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；
（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度48%乙醇作為溶劑，加熱回流提取31次，每次提取時(shí)間為0.3小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的78倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.12，濾過，藥液通過SIP1200大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度86%乙醇溶液洗脫SIP1200大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度86%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；
（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。
優(yōu)選的一種防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的制備方法，其特征在于按如下步驟制備：
原料藥的組成和重量份為：草玉梅345重量份 蒲桃315重量份 小花鳶尾根126重量份 飛蛾樹114重量份 飄拂草107重量份；
制備方法：
（1）按原料藥配比取草玉梅、蒲桃、小花鳶尾根、飛蛾樹、飄拂草，混勻，用重量百分比濃度16%乙醇作為溶劑，在37℃溫浸提取，提取次數(shù)為18次，每次提取時(shí)間為65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的44倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過SP70大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度32%乙醇溶液洗脫SP70大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度32%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；
（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度48%乙醇作為溶劑，加熱回流提取31次，每次提取時(shí)間為0.3小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的78倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.12，濾過，藥液通過SIP1200大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度86%乙醇溶液洗脫SIP1200大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度86%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；
（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。
一種防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的制備方法，其特征在于藥物組合物可以采用制劑學(xué)的常規(guī)方法制備成片劑或膠囊劑或滴丸。
一種防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的制備方法，其特征在于藥物組合物與化學(xué)藥或中藥組成防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物。
藥物組合物防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效顯著。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法
防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：草玉梅345g 蒲桃315g 小花鳶尾根126g 飛蛾樹114g 飄拂草107g；
制備方法：
（1）按原料藥配比取草玉梅、蒲桃、小花鳶尾根、飛蛾樹、飄拂草，混勻，用重量百分比濃度16%乙醇作為溶劑，在37℃溫浸提取，提取次數(shù)為18次，每次提取時(shí)間為65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的44倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過SP70大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度32%乙醇溶液洗脫SP70大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度32%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；
（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度48%乙醇作為溶劑，加熱回流提取31次，每次提取時(shí)間為0.3小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的78倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.12，濾過，藥液通過SIP1200大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度86%乙醇溶液洗脫SIP1200大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度86%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；
（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。
實(shí)施例2：防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法
防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：草玉梅342g 蒲桃318g 小花鳶尾根124g 飛蛾樹116g 飄拂草105g；
制備方法：
（1）按原料藥配比取草玉梅、蒲桃、小花鳶尾根、飛蛾樹、飄拂草，混勻，用重量百分比濃度16%乙醇作為溶劑，在37℃溫浸提取，提取次數(shù)為18次，每次提取時(shí)間為65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的44倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過SP70大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度32%乙醇溶液洗脫SP70大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度32%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；
（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度48%乙醇作為溶劑，加熱回流提取31次，每次提取時(shí)間為0.3小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的78倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.12，濾過，藥液通過SIP1200大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度86%乙醇溶液洗脫SIP1200大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度86%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；
（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。
實(shí)施例3：防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法
防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：草玉梅348g 蒲桃312g 小花鳶尾根128g 飛蛾樹112g 飄拂草109g；
制備方法：
（1）按原料藥配比取草玉梅、蒲桃、小花鳶尾根、飛蛾樹、飄拂草，混勻，用重量百分比濃度16%乙醇作為溶劑，在37℃溫浸提取，提取次數(shù)為18次，每次提取時(shí)間為65小時(shí)，每次溶劑用量為原料藥總重量的44倍，濾過，得藥渣A和提取液A，提取液A回收乙醇，濃縮至相對密度1.08，濾過，藥液通過SP70大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度32%乙醇溶液洗脫SP70大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度32%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物A；
（2）取步驟（1）藥渣A，用重量百分比濃度48%乙醇作為溶劑，加熱回流提取31次，每次提取時(shí)間為0.3小時(shí)，每次溶劑用量為藥渣A重量的78倍，濾過，得藥渣B和提取液B，提取液B回收乙醇，濃縮至相對密度1.12，濾過，藥液通過SIP1200大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，再用重量百分比濃度86%乙醇溶液洗脫SIP1200大孔吸附樹脂柱，收集重量百分比濃度86%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮干燥，即得提取物B；
（3）將提取物A和提取物B混勻，即得藥物組合物。
實(shí)施例4：片劑的制備
取實(shí)施例1藥物組合物677g，加入淀粉179g，混勻，制粒，干燥，加微晶纖維素30g，硬脂酸鎂6g，混勻，壓制成3500片， 即得藥物組合物片劑。
實(shí)施例5：膠囊的制備
取實(shí)施例2藥物組合物636g，加入淀粉257g，混勻，制粒，干燥，整粒，加入適量硬脂酸鎂，混勻，裝膠囊2800粒，即得藥物組合物膠囊。
實(shí)施例6：滴丸的制備
稱取聚乙二醇 6000 167g水浴(80℃)加熱煮熔，加入實(shí)施例3藥物組合物11g，充分?jǐn)嚢杈鶆?，以液體石蠟為冷卻劑，置玻璃管（4*80cm）中，冷卻溫度為5℃，滴口內(nèi)外徑為7.0/2.0(mm/mm)，滴口距液面為2.4cm，滴速以每分57滴為最佳條件，用棉布吸干滴丸表面的冷凝劑，即得藥物組合物滴丸。
實(shí)施例7：防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物
防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：
小花鳶尾根110重量份 飛蛾樹180重量份 蒲桃320重量份。
實(shí)施例8：防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物
防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：
小花鳶尾根100重量份 飛蛾樹150重量份 飄拂草110重量份。
實(shí)施例9：防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物
防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的原料藥的組成和重量份為：
小花鳶尾根140重量份 飛蛾樹100重量份 飄拂草100重量份。
實(shí)驗(yàn)例1：防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的試驗(yàn)研究
1實(shí)驗(yàn)材料
1.1動(dòng)物
健康雄性Wistar大鼠,清潔級(jí),體質(zhì)量(162±10)g,中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK-(軍)2002-001)。
1.2藥物及試劑
藥物組合物（實(shí)施例1藥物組合物）用前制成含0.1g藥材 /mL的水煎液。牛Ⅱ型膠原(CⅡ),chondrex公司產(chǎn)品；完全弗氏佐劑(CFA),Difco公司產(chǎn)品；白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-6放射免疫分析法(RIA)測定試劑盒,中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所產(chǎn)品；前列腺素(PG)E2酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒,美國R&D進(jìn)口分裝產(chǎn)品；Rabbit Anti-Rat IgM (bsb-0346R)、Rabbit Anti-Rat IgG (bsb-0293R)、streptavidin/HRP(bsb-0437R),北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
1.3儀器
BMJ-1生物組織包埋機(jī)、QPJ-1C石蠟切片機(jī)(天津航空機(jī)電公司)；111N-101-20g數(shù)顯游標(biāo)卡尺(廣陸數(shù)字測控股份有限公司)；LANMED SOPHIE 乳腺鉬靶機(jī)(芬蘭 Planmed Oy 公司)；GC911放射免疫γ計(jì)數(shù)器(中國科技大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司)；Multiskan Ascent酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司)。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1造模及給藥
將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及藥物組合物組,每組10只。除正常組外,其余2組制備CIA模型：取適量牛CⅡ乳化劑,溶于0.1mol/L醋酸(4℃過夜),加入 CFA,混懸乳劑充分乳化,以滴入水中呈珠狀為度,取適量配好的乳劑,每只大鼠以0.1mL(含100μgCⅡ)于尾根部皮下散點(diǎn)注射。第7日等量乳化劑激發(fā)免疫。造模后第7日開始灌胃給藥,藥物組合物給藥劑量分別為0.2g藥材/kg,按1mL/100g體質(zhì)量給藥,每日1次,連續(xù)4周。同時(shí),正常組和模型組灌服等容積蒸餾水。
2.2取材及組織處理
免疫后第35日大鼠眼球后靜脈叢取血,4℃離心,取血清-20℃保存待用；取雙后肢膝關(guān)節(jié)和右后踝關(guān)節(jié)4%多聚甲醛溶液4℃固定,X線拍片(側(cè)位)后,10%乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液脫鈣,石蠟包埋,常規(guī)切片5μm,蘇木素-伊紅(HE)染色；取左后踝關(guān)節(jié)去皮、液氮冷凍后進(jìn)行組織勻漿,取上清-20℃保存待用。
2.3檢測指標(biāo)
2.3.1發(fā)病率及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分
自免疫8d開始,每3d進(jìn)行一次臨床積分,每足4分制,共16分。采用0～4級(jí)關(guān)節(jié)評(píng)分法。0分,無關(guān)節(jié)炎：1分,小趾關(guān)節(jié)輕度腫脹；2分,小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分,踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分,包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部關(guān)節(jié)腫脹。關(guān)節(jié)炎發(fā)生率：以至少有1只爪臨床積分≥2分判斷為關(guān)節(jié)炎發(fā)生。
2.3.2關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)觀察和評(píng)分
光鏡下觀察踝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨、骨的病理改變,并從炎性細(xì)胞浸潤、血管翳形成、軟骨破壞和骨侵蝕等方面進(jìn)行半定量分析。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)。炎性細(xì)胞浸潤：0分,無炎性細(xì)胞；1分,稀疏散在；2分,較密集；3分,大量。血管翳形成：0 ,無形成；1分,少量存在＜50%；2分,血管翳面積＞50%；3分,大量存在。關(guān)節(jié)軟骨破壞：0分,無破壞；1分,小灶狀破壞＜1/3；2分,1/2破壞；3分,2/3 破壞；4分,全部破壞。骨侵蝕程度：0分,無侵蝕；1分,少量侵蝕＜50%；2分,侵蝕面積＞50%；3分,大量侵蝕。
2.3.3關(guān)節(jié)X光片分析
計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)。骨侵蝕：0分,正常；1分,可疑或有1個(gè)微小局部病灶；2分,2個(gè)局部病灶或病灶總表面積≤50%；3分,3個(gè)以上的病灶或病灶總表面積＞50%；4分,關(guān)節(jié)面完全破壞,或出現(xiàn)骨縮小。關(guān)節(jié)間隙：0分,正常；1分,可疑或有1個(gè)微小局部病灶；2分,關(guān)節(jié)出現(xiàn)狹窄；3分,關(guān)節(jié)強(qiáng)直或關(guān)節(jié)間隙增寬。骨破壞：0分,正常；1分,骨質(zhì)疏松期；2分,骨質(zhì)破壞期；3分,骨質(zhì)嚴(yán)重破壞期；4分,強(qiáng)直。
2.3.4促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)含量
RIA檢測血清和關(guān)節(jié)組織勻漿上清中促炎細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測血清 PGE2的含量,具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。
3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS15.0 軟件,組織病理和影像學(xué)計(jì)分的評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)方法采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test),發(fā)病率統(tǒng)計(jì)采用卡方檢驗(yàn),其余用多因素方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s 表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
4 結(jié)果
4.1 藥物組合物對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎臨床積分及發(fā)病率的影響
正常組大鼠關(guān)節(jié)無紅腫變形；模型組大鼠關(guān)節(jié)炎臨床癥狀在免疫后第 10 日開始出現(xiàn),17 d 紅腫明顯加重,最高臨床積分8.2 分,28 d 部分可見關(guān)節(jié)變形。發(fā)病率自免疫后 23 d 起一直維持在 90%的高水平,32 d 達(dá)到 100%。藥物組合物組能明顯降低臨床積分（3.0分）和發(fā)病率（35%）。
4.2 藥物組合物對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠病理改變的影響
正常組關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常,滑膜組織無充血水腫,滑膜細(xì)胞無增生,無血管翳形成,關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、無剝脫,關(guān)節(jié)軟骨下骨小梁大小、排列正常；模型組可見明顯的滑膜細(xì)胞增生,排列紊亂,滑膜組織充血水腫,并可見炎性細(xì)胞浸潤,血管翳形成,軟骨表層細(xì)胞變性、壞死,關(guān)節(jié)軟骨面剝脫,關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量的剝脫壞死組織,軟骨下骨小梁排列紊亂；藥物組合物組滑膜組織充血水腫明顯減輕,滑膜細(xì)胞增生明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤顯著減少,血管增生和血管翳形成受到抑制。
4.3 藥物組合物對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠影像學(xué)改變的影響
正常組踝關(guān)節(jié)面光滑,關(guān)節(jié)間隙清晰；模型組關(guān)節(jié)面呈蟲蝕樣破壞,邊緣性骨質(zhì)侵蝕,伴骨質(zhì)增生反應(yīng),骨端增生、粗大,關(guān)節(jié)間隙狹窄或增寬,關(guān)節(jié)相互融合甚至骨性強(qiáng)直；與模型組相比,藥物組合物組關(guān)節(jié)面較光滑,關(guān)節(jié)間隙較清晰。
4.4 藥物組合物對膠原誘導(dǎo)型大鼠血清和關(guān)節(jié)組織促炎細(xì)胞因子和血清炎癥介質(zhì)的影響
模型組血清和炎癥關(guān)節(jié)組織中促炎細(xì)胞因子 IL-1β、TNF-α和 IL-6 含量以及血清中炎癥介質(zhì) PGE2的含量均較正常組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。除關(guān)節(jié)組織中 TNF-α外,藥物組合物組可顯著降低 CIA 大鼠血清和炎癥關(guān)節(jié)中升高了的促炎細(xì)胞因子 IL-1β、TNF-α和IL-6 和炎癥介質(zhì) PGE2的含量(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001)。