本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種尿液干細(xì)胞在制備改善小鼠葡萄糖代謝藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是一群具有高度自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，是再生醫(yī)學(xué)和組織功能修復(fù)的理想細(xì)胞來源。干細(xì)胞移植作為新的胰島移植替代物為延緩或逆轉(zhuǎn)糖尿病提供了新的思路。傳統(tǒng)的干細(xì)胞移植如胚胎干細(xì)胞移植或成體干細(xì)胞移植等常常受困于有限的組織來源、有創(chuàng)的取材過程、復(fù)雜的分化過程及高昂的治療費(fèi)用，因而很難大規(guī)模推廣利用。因此，發(fā)展一個(gè)過程簡(jiǎn)便、無創(chuàng)安全，低成本的干細(xì)胞治療途徑具有重要意義。

尿液干細(xì)胞(簡(jiǎn)稱：USCs)具有干細(xì)胞的特點(diǎn)，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將這類細(xì)胞經(jīng)過基因修飾后移植到受損組織處時(shí)，可以參與膀胱、尿道、骨組織、腦損傷的修復(fù)重建，并具有來源不受限、制備過程簡(jiǎn)便、安全無創(chuàng)和成本低等特點(diǎn)，是細(xì)胞替代治療和組織工程研究中更為理想的種子細(xì)胞來源。但上述僅為理論，現(xiàn)有技術(shù)中并沒有相關(guān)的實(shí)際應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種尿液干細(xì)胞在制備改善小鼠葡萄糖代謝藥物中的應(yīng)用，所述尿液干細(xì)胞為人尿液干細(xì)胞。

較佳地，所述的人尿液干細(xì)胞為從150-200ml的人尿液中提取，并采用0.1-1％明膠包被過的培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。

較佳地，所述的人尿液干細(xì)胞制備的改善小鼠葡萄糖代謝藥物，在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病小鼠造模成功后通過胰腺原位移植至小鼠體內(nèi)，監(jiān)測(cè)小鼠生存期。

所述的人尿液干細(xì)胞制備的改善小鼠葡萄糖代謝藥物在STZ誘導(dǎo)糖耐量損傷小鼠造模成功后第10天通過胰腺原位移植至小鼠體內(nèi)，監(jiān)測(cè)小鼠血糖。

較佳地，人尿液干細(xì)胞提取所需要的尿液量為150-200ml。

較佳地，尿液干細(xì)胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)液為含有胎牛血清和多種生長(zhǎng)因子等的Dulbecco’s modified Eagle’s培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱：DMEM)。

較佳地，STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠造模方案為腹腔內(nèi)注射STZ注射液200mg/kg/次，注射2-3次，至空腹12h血糖水平>11.0mmol/L。STZ注射液配置方法為取400mg STZ溶于pH為4.5的100ml檸檬酸緩沖液中配制成4g/L的STZ注射液。小鼠為雄性Balb/c裸鼠。

所述的人尿液干細(xì)胞制備的改善小鼠葡萄糖代謝藥物移植方法為用1％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，打開小鼠腹腔，暴露胰腺，將準(zhǔn)備好的上述尿液干細(xì)胞以1.65×10⁶個(gè)細(xì)胞制成100-200ul的細(xì)胞懸液注射至胰體內(nèi)，縫合腹膜及皮膚，關(guān)閉腹腔。

較佳地，STZ誘導(dǎo)糖耐量受損小鼠造模方案為腹腔內(nèi)連續(xù)4天注射STZ注射液45mg/kg。小鼠血糖監(jiān)測(cè)方法為STZ誘導(dǎo)后第7天，第17天及第31天行葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)。

本發(fā)明采用尿液干細(xì)胞作為制備改善小鼠葡萄糖代謝藥物中原料，尿液干細(xì)胞具有來源不受限，成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。通過直接將尿液干細(xì)胞制備的改善小鼠葡萄糖代謝藥物移植至糖代謝異常小鼠體內(nèi)，顯著改善小鼠糖代謝，延長(zhǎng)小鼠生存期。十分具有實(shí)用價(jià)值。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中未移植及移植后糖尿病小鼠生存期結(jié)果圖；

圖2A-F為本發(fā)明實(shí)施例中移植前與移植后糖耐量損傷小鼠IPGTT結(jié)果圖；

圖3A-F為本發(fā)明實(shí)施例中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)尿液干細(xì)胞表面標(biāo)記物的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，以更好地理解本發(fā)明。

實(shí)施例1：人尿液干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)

將150-200ml尿液收集到若干個(gè)50ml的無菌試管中，以400×g速度室溫離心10min，小心吸出上清液，留1ml尿液柔和地重懸沉淀，然后將之轉(zhuǎn)至50ml試管中，試管加入10ml的洗滌液，以200×g速度室溫離心10min，小心棄去上清液，留0.2ml上清，加入1ml DMEM培養(yǎng)液，然后轉(zhuǎn)至0.1％的明膠包被的六孔板中，每孔加入2ml的DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，每3天換液一次去除未貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為尿液干細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到80％左右的融合度后進(jìn)行傳代。

使用上述人尿液干細(xì)胞制備的改善小鼠葡萄糖代謝藥物在STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠造模成功后通過胰腺原位移植至小鼠體內(nèi)，監(jiān)測(cè)小鼠生存期。

步驟如下：

(1)取400mg STZ溶于pH為4.5的100ml檸檬酸緩沖液中配制成4g/L的STZ注射液。

(2)6-8周Balb/c裸鼠腹腔內(nèi)注射STZ注射液200mg/kg/次，注射2-3次，至空腹12小時(shí)血糖水平>11.0mmol/L。

(3)用1％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，打開小鼠腹腔，暴露胰腺，將準(zhǔn)備好的上述尿液干細(xì)胞制備的改善小鼠葡萄糖代謝藥物以1.65×10⁶個(gè)細(xì)胞制成100-200ul的細(xì)胞懸液注射至胰體內(nèi)，縫合腹膜及皮膚，關(guān)閉腹腔。

圖1為移植后糖尿病小鼠生存期結(jié)果。結(jié)果顯示尿液干細(xì)胞移植對(duì)糖尿病小鼠的生存期具有明顯改善作用。

人尿液干細(xì)胞制備的改善小鼠葡萄糖代謝藥物在STZ誘導(dǎo)糖耐量損傷小鼠造模成功后第10天通過胰腺原位移植至小鼠體內(nèi)，監(jiān)測(cè)小鼠血糖。

步驟如下：

(1)6-8周Balb/c裸鼠腹腔內(nèi)注射步驟二中STZ注射液連續(xù)4天(45mg/kg)；

(2)在STZ誘導(dǎo)后第7天，第17天及第31天行IPGTT試驗(yàn)，STZ誘導(dǎo)后第10天行尿液干細(xì)胞胰島原位移植術(shù)。

(3)尿液干細(xì)胞制備的改善小鼠葡萄糖代謝藥物移植方法同糖尿病小鼠。

圖2A-F為移植前與移植后糖耐量損傷小鼠IPGTT結(jié)果。結(jié)果顯示STZ處理第7天，STZ誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)明顯葡萄糖耐量損傷(圖2A、D)，尿液干細(xì)胞移植后，STZ處理第17天(圖2B、E)和第31天(圖2C、F)尿液干細(xì)胞移植小鼠葡萄糖耐量明顯改善。

實(shí)施例2：尿液干細(xì)胞表面標(biāo)志物及多能干性鑒定

1.流式細(xì)胞儀鑒定

步驟如下：

(1)將分離培養(yǎng)的第3代尿液干細(xì)胞消化后用DMEM培養(yǎng)基重懸；

(2)1000rpm離心5分鐘，棄上清后用PBS緩沖液重懸洗滌；

(3)再次1000rpm離心5分鐘，棄上清后用PBS重懸細(xì)胞，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×10⁶個(gè)/mL；

(4)取細(xì)胞懸液各200ul分裝至樣品管中；

(5)再分別加入5ul不同熒光標(biāo)記的單抗(CD29-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD73-PE、CD146-PE和HLA-DR-PE)混勻，避光條件下室溫孵育30分鐘；

(6)每管分別加入2ml PBS緩沖液，吹打混勻；

然后1000rpm離心5分鐘，棄上清后重懸細(xì)胞；

(7)加入200ul的0.01M PBS(含0.5％多聚甲醛)充分混勻后4℃避光放置，然后設(shè)置參數(shù)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)；

(8)相同顏色熒光標(biāo)記的IgG抗體為同型對(duì)照。

圖3A-F為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第三代尿液干細(xì)胞表面標(biāo)記物，結(jié)果顯示尿液干細(xì)胞表達(dá)CD29(圖3A)，CD73(圖3B)，和CD90(圖3C)等間充質(zhì)干細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物及周細(xì)胞表面分子CD146(圖3D)，而不表達(dá)CD45(圖3F)和HLA-DR(圖3E)表面分子，表明尿液干細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。

本發(fā)明采用尿液干細(xì)胞作為制備改善小鼠葡萄糖代謝藥物中原料，尿液干細(xì)胞具有來源不受限，成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。通過直接將尿液干細(xì)胞制備的改善小鼠葡萄糖代謝藥物移植至糖代謝異常小鼠體內(nèi)，顯著改善小鼠糖代謝，延長(zhǎng)小鼠生存期。十分具有實(shí)用價(jià)值。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。