本發(fā)明涉及納米醫(yī)學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體地，涉及納米膠束技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種能進(jìn)行MR-熒光雙模態(tài)成像的可降解納米膠束及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

急性缺血性腦梗塞(Acute Ischemic Stroke,AIS)，是由于腦動(dòng)脈的閉塞導(dǎo)致的腦組織的梗死，不可避免的伴有神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡以及神經(jīng)通路的破壞。目前，臨床治療上主要通過超早期溶栓、腦神經(jīng)保護(hù)及后期康復(fù)鍛煉等措施，雖然部分患者神經(jīng)功能恢復(fù)較好，然而仍有50％～70％的存活者遺留癱瘓、失語(yǔ)等嚴(yán)重殘疾。雖然研究證明腦梗死發(fā)生后，位于室管膜下區(qū)或海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)可激活、增殖、遷移、分化為新生的神經(jīng)元，但是由于內(nèi)源性NSCs數(shù)目、自我更新及轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的速度緩慢，腦梗塞后大腦的自我修復(fù)能力是非常有限的。移植的研究為腦梗死治療開辟了一條新的途徑。多項(xiàng)研究成果已經(jīng)表明移植NSCs通過分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或者直接的腦組織細(xì)胞替代等作用，能有效地促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)作用。干細(xì)胞移植后需要對(duì)體內(nèi)的存活、分布、遷徙、增殖及分化進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，從而評(píng)估其療效和安全性，然而如何監(jiān)測(cè)其在宿主體內(nèi)的情況一直是NSCs移植中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)難題。

傳統(tǒng)的示蹤方法主要有熒光染料標(biāo)記、核酸標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因、染色體等方法，而這些方法均需在體外狀態(tài)下進(jìn)行組織學(xué)分析和鑒定，然而對(duì)于干細(xì)胞移植進(jìn)入臨床應(yīng)用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。干細(xì)胞體內(nèi)示蹤技術(shù)是以非侵入性方式在活體內(nèi)示蹤干細(xì)胞的存活、分布和功能等。目前最為常用的分子影像學(xué)技術(shù)有光學(xué)成像、超聲成像、核醫(yī)學(xué)、磁共振成像(MRI)等，不同的成像技術(shù)敏感性、分辨率、組織特異性不同，各成優(yōu)勢(shì)、互相補(bǔ)充。例如熒光成像信號(hào)強(qiáng)，可直接探測(cè)發(fā)出的信號(hào)，操作簡(jiǎn)單，但其組織分辨率差；MRI因其具有極佳的分辨率(可對(duì)深部組織進(jìn)行精確定位和定量分析)、無創(chuàng)傷、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其對(duì)設(shè)備及成像條件要求較高。多模態(tài)成像綜合2種及以上成像技術(shù)，例如光學(xué)成像和MRI，聯(lián)合各成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，更準(zhǔn)確有效地實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞活體示蹤，推動(dòng)干細(xì)胞研究的臨床轉(zhuǎn)化。

然而，干細(xì)胞本身在常用的分子成像技術(shù)上均不具有特異性信號(hào)，給臨床檢測(cè)帶來了相當(dāng)程度的困難。為了提高干細(xì)胞的分辨和對(duì)比度，臨床上需要對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行特異性的造影劑標(biāo)記，使得干細(xì)胞出現(xiàn)特異性信號(hào)改變而被識(shí)別。高分子聚合物載體因其具有輸送效率高、生物安全性及組織相容性高、細(xì)胞毒副作用低，易進(jìn)行化學(xué)修飾、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好、具有主動(dòng)及被動(dòng)靶向效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在干細(xì)胞示蹤領(lǐng)域顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。盡管已經(jīng)有多篇關(guān)于納米載體用于干細(xì)胞多模態(tài)示蹤的報(bào)道，甚至出現(xiàn)了能對(duì)干細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行MRI、熒光成像和PET三種成像模式的納米載體的報(bào)道。然而這些納米載體多數(shù)基于二氧化硅或釓劑，生物相容性或可降解性差，對(duì)干細(xì)胞及人體存在潛在毒性，難以真正運(yùn)用于臨床；或者僅通過對(duì)磁性納米顆粒(SPIO)進(jìn)行表面修飾后，鏈接熒光分子或放射性核素造影劑，造影劑負(fù)載量低，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞的有效標(biāo)記；或者通過對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾插入報(bào)告基因而到達(dá)干細(xì)胞光學(xué)成像示蹤的目的，而非真正的多模態(tài)納米載體，并且報(bào)告基因操作復(fù)雜。報(bào)告基因會(huì)導(dǎo)致NSCs內(nèi)基因產(chǎn)物的蓄積，可能對(duì)其增殖、分化等能力產(chǎn)生影響。如何實(shí)現(xiàn)安全、有效的干細(xì)胞示蹤，仍然是干細(xì)胞治療向臨床轉(zhuǎn)化的重要難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能自組裝、且能同時(shí)負(fù)載SPIO和尼羅紅的可降解兩親性嵌段聚合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述兩親性嵌段聚合物的制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述兩親性嵌段聚合物在制備能進(jìn)行MR-光學(xué)雙模態(tài)成像的納米膠束中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能進(jìn)行MR-熒光雙模態(tài)成像的可降解納米膠束。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能進(jìn)行MR-熒光雙模態(tài)成像的可降解納米膠束的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述納米膠束在對(duì)神經(jīng)性干細(xì)胞進(jìn)行高效、安全標(biāo)記中的應(yīng)用。所述納米膠束能對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行高效標(biāo)記，且易水解，水解產(chǎn)物可用于臨床使用，安全無毒副作用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述納米膠束在對(duì)神經(jīng)性干細(xì)胞進(jìn)行MR-熒光雙模態(tài)成像中的應(yīng)用。所述納米膠束能負(fù)載高敏磁造影劑及熒光染料，就干細(xì)胞治療中對(duì)其遷移及分布進(jìn)行有效的、實(shí)時(shí)的定位監(jiān)測(cè)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種能共同負(fù)載SPIO和尼羅紅的兩親性嵌段聚合物，所述聚合物由聚天冬酰二甲基乙二胺親水段和膽酸疏水支鏈段兩嵌段共聚物構(gòu)成；所述聚天冬酰二甲基乙二胺親水段分子量為900～3600Da，再引入賴氨酸連接2個(gè)、4個(gè)或8個(gè)膽酸。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)NSCs的高效標(biāo)記，選取帶有正電荷的聚天冬酰二甲基乙二胺為親水段；選取膽酸為疏水段，能夠同時(shí)負(fù)載疏水性SPIO和尼羅紅，同時(shí)使SPIO在細(xì)胞內(nèi)的再聚集，可滿足高靈敏度MR-熒光雙模態(tài)造影劑的要求。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的可控性負(fù)載，可以通過控制聚天冬酰二甲基乙二胺上連接的膽酸數(shù)目，實(shí)現(xiàn)對(duì)有效的提高藥物負(fù)載效率。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)NSCs的安全標(biāo)記，將及易得到且生物安全的改性天冬氨酸聚合物和膽酸通過及易水解的酰胺鍵鏈接，水解產(chǎn)物均對(duì)干細(xì)胞毒性極小，能夠保留干細(xì)胞干性，對(duì)人體安全無毒副作用。

如上所述能同時(shí)負(fù)載SPIO和尼羅紅的兩親性嵌段聚合物的制備方法，由以下方法制備得到：

S1.苯甲醇和L-天冬氨酸合成β-天冬氨酸芐脂；再加入雙(三氯甲基)碳酸酯合成芐氧羰基天冬氨酸酐(BLA-NCA)；

S2.由正丁胺引發(fā)，芐氧羰基天冬氨酸酐(BLA-NCA)開環(huán)聚合成正丁胺-聚芐基天冬氨酸(BA-PBLA)；

S3.將雙(叔丁氧羰基)-L-賴氨酸(Boc-Lys(Boc)-OH)對(duì)接于正丁胺-聚芐基天冬氨酸(BA-PBLA)氨基末端，合成聚芐基天冬氨酸-雙(叔丁氧羰基)L-賴氨酸(PBLA-Lys-BOC₂)；用三氟乙酸除去聚芐基天冬氨酸-雙(叔丁氧羰基)L-賴氨酸(PBLA-Lys-BOC₂)末端的BOC基團(tuán)，得到聚芐基天冬氨酸-賴氨酸(PBLA-Lys)；

S4.將膽酸對(duì)接于聚芐基天冬氨酸-賴氨酸(PBLA-Lys)的氨基端，得到聚芐基天冬氨酸芐脂-賴氨酸-膽酸(PBLA-Lys-CA₂)；

S5.聚芐基天冬氨酸芐脂-賴氨酸-膽酸(PBLA-Lys-CA₂)經(jīng)無水二甲基甲酰胺(DMA)氨解得到聚天冬酰二甲基乙二胺-賴氨酸-膽酸(PAsp(DMA)-Lys-CA2)。

如上所述的可降解兩親性嵌段聚合物在制備能進(jìn)行MR-熒光雙模態(tài)成像的納米膠束中的應(yīng)用。

一種能進(jìn)行MR-熒光雙模態(tài)成像的納米膠束，所述納米膠束由如上所述的可降解的兩親性嵌段聚合物自組裝后，將疏水性的SPIO及尼羅紅負(fù)載于其疏水內(nèi)核，得到能夠進(jìn)行MR-熒光雙模態(tài)成像的納米膠束。

本發(fā)明所述的可降解的兩親性嵌段聚合物自組裝后能形成一種納米尺寸的正電荷納米膠束，將疏水性的SPIO及尼羅紅負(fù)載于其疏水內(nèi)核，得到同時(shí)負(fù)載MRI造影劑及熒光造影劑的納米膠束，將這種納米膠束與神經(jīng)干細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞高效率雙模態(tài)標(biāo)記，同時(shí)，由于該兩親性嵌段聚合物易水解，水解產(chǎn)物可用于臨床使用，納米膠束對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞顯示了極小的細(xì)胞毒性，保留干細(xì)胞干性，對(duì)人體安全無毒副作用。

優(yōu)選地，所述能進(jìn)行MR-熒光雙模態(tài)成像的納米膠束的具體制備方法為：2mg SPIO、0.2mg尼羅紅和20mg PAsp(DMA)-Lys-CA₂同時(shí)溶于2mL的DMSO和氯仿混合溶劑中(v:v＝1:3)。超聲乳化作用下加入溶有20mL的PBS溶液，乳化均勻后旋蒸除去氯仿，經(jīng)針筒濾過器(0.45μm)除去大顆粒，Millipore離心過濾裝置((標(biāo)稱分子量(MW)臨界值：100kDa)超濾除去DMSO和其他親水性雜質(zhì)，得到同時(shí)負(fù)載SPIO和尼羅紅的納米膠束。

如上所述的納米膠束在對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行體外標(biāo)記及體內(nèi)MR-熒光雙模態(tài)示中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種多功能納米膠束的制備及應(yīng)用方法，針對(duì)現(xiàn)有神經(jīng)干細(xì)胞體外標(biāo)記難度大、標(biāo)記后細(xì)胞活力受損嚴(yán)重的問題，得到同時(shí)負(fù)載MRI造影劑及熒光造影劑的納米膠束，將這種納米膠束與神經(jīng)干細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，能夠?qū)Ω杉?xì)胞進(jìn)行高效的SPIO、熒光雙標(biāo)記，在后續(xù)的干細(xì)胞體內(nèi)移植治療中，能實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞的遷移及分布進(jìn)行有效的、實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)MR-熒光雙模態(tài)定位監(jiān)測(cè)。同時(shí)，由于該兩親性嵌段聚合物極易水解，水解產(chǎn)物可用于臨床使用，該納米膠束對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞顯示了極小的細(xì)胞毒性，保留了神經(jīng)細(xì)胞干性，對(duì)人體安全無毒副作用，有望真正實(shí)現(xiàn)納米載體標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

附圖說明

圖1為納米膠束的制備示意圖。

圖2為納米膠束的粒徑、TEM圖。

圖3為納米膠束弛豫率的MRI檢測(cè)。

圖4為納米膠束標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞的熒光標(biāo)記檢測(cè)：流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法。

圖5為納米膠束標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞的鐵標(biāo)記檢測(cè)：(A)MRI T₂值測(cè)量法；(B)普魯士藍(lán)鐵染色法。

圖6為納米膠束對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞的毒性測(cè)試：(A)流失細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)法；(B)CCK8法。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1兩親性嵌段聚合物的合成

(1)芐氧羰基天冬氨酸酐(BLA-NCA)的合成，反應(yīng)機(jī)理及過程如下：

苯甲醇和L-天冬氨酸合成β-天冬氨酸芐脂；再加入雙(三氯甲基)碳酸酯合成芐氧羰基天冬氨酸酐(BLA-NCA)。具體步驟參照文獻(xiàn)¹。

(2)正丁胺-聚芐基天冬氨酸(BA-PBLA)的合成，反應(yīng)機(jī)理及過程如下：

由十二醇引發(fā)，BLA-NCA開環(huán)聚合成正丁胺-聚芐基天冬氨酸(BA-PBLA)。稱取73.14mg的正丁胺(1.0nmol，0.74g/mL)至50mL的反應(yīng)瓶中，加入30mL的無水CH₂Cl₂充分溶解。稱取2.49g BLA-NCA(10mmol)溶于20mL無水二甲基甲酰胺后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入到正丁胺溶液中，在35℃下攪拌反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液沉淀在大量無水乙醚中。分離沉淀并用無水乙醇洗滌，真空干燥后得到最終產(chǎn)物BA-PBLA。

(3)聚芐基天冬氨酸-賴氨酸(PBLA-Lys)的合成，反應(yīng)機(jī)理及過程如下：

使用O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)及1-羥基苯并三唑(HOBT)作為偶聯(lián)試劑，將雙(叔丁氧羰基)-L-賴氨酸(Boc-Lys(Boc)-OH)耦合至正丁胺-聚芐基天冬氨酸(BA-PBLA)的氨基末端，合成聚芐基天冬氨酸-雙(叔丁氧羰基)L-賴氨酸(PBLA-Lys-BOC₂)。稱取雙(叔丁氧羰基)-L-賴氨酸(Boc-Lys(Boc)-OH)(1.5mmol)于干燥的50mL反應(yīng)瓶中，加入二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再加入O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)(1.5mmol)、1-羥基苯并三唑(HOBT)(1.5mmol)及正丁胺-聚芐基天冬氨酸(0.75mmol)，很快有白色沉淀產(chǎn)生，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入過量無水乙醚中沉淀。分離沉淀并用無水乙醇洗滌，真空干燥后得到產(chǎn)物PBLA-Lys-BOC₂。

用三氟乙酸除去PBLA-Lys-BOC₂末端的BOC基團(tuán)，得到PBLA-Lys。稱取PBLA-Lys-BOC₂至25mL反應(yīng)瓶中，加入三氟乙酸(TFA)10mL攪拌溶解，成淡黃色溶液。反應(yīng)1h后，將反應(yīng)液倒入過量無水乙醚中沉淀。分離沉淀并用無水乙醇洗滌，真空干燥后得到產(chǎn)物PBLA-Lys。

(4)聚芐基天冬氨酸芐-賴氨酸-膽酸(PBLA-Lys-CA₂)合成，反應(yīng)機(jī)理及過程如下：

稱取膽酸(CA)(3mmol)于干燥的50mL反應(yīng)瓶中，加入N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)溶解，再加HBTU(3mmol)、HOBT(3mmol)及PBLA-Lys(1.5mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入過量無水乙醚中沉淀。分離沉淀并用無水乙醇洗滌，真空干燥后得到產(chǎn)物PBLA-Lys-CA₂。

(5)聚天冬酰二甲基乙二胺-賴氨酸-膽酸(PAsp(DMA)-Lys-CA₂)合成，反應(yīng)機(jī)理及過程如下：

PBLA-Lys-CA₂經(jīng)無水二甲基甲酰胺(DMA)氨解得到聚天冬酰二甲基乙二胺-賴氨酸-膽酸(PAsp(DMA)-Lys-CA₂)。于50mL反應(yīng)瓶中用20mL無水二甲基亞砜(DMSO)溶解0.90g PBLA-Lys-CA₂(0.3mmol)和2.6g DMA(30mmol，相當(dāng)于芐基10eq.)，在35℃下攪拌反應(yīng)24h。將反應(yīng)液逐滴加入100mL并用超聲波分散，用透析袋(14kDa)在無氧水中透析3d，冷凍干燥得到終產(chǎn)物PAsp(DMA)-Lys-CA₂。

實(shí)施例2兩親性嵌段聚合物的合成

參照實(shí)施例1合成兩親性嵌段聚合物，改變正丁胺-聚芐基天冬氨酸(BA-PBLA)的分子量，設(shè)計(jì)聚合度分別為5和20(實(shí)施例1為10)，其余反應(yīng)步驟均與實(shí)施例1一致，得到正電嵌段長(zhǎng)度不同的嵌段聚合物PAsp(DMA)-Lys-CA₂，聚天冬酰二甲基乙二胺(PAsp(DMA))的分子量分別為900Da和3600Da。

實(shí)施例3兩親性嵌段聚合物的合成

參照實(shí)施例1合成兩親性嵌段聚合物，得到聚芐基天冬氨酸-賴氨酸后(PBLA-Lys)，其末端兩個(gè)氨基經(jīng)與雙(叔丁氧羰基)-L-賴氨酸(Boc-Lys(Boc)-OH)耦合、脫保護(hù)后，可得到末端帶四個(gè)氨基的PBLA-Lys₃，PBLA-Lys₃再接一次Boc-Lys(Boc)-OH并脫保護(hù)可得到末端帶8個(gè)氨基的PBLA-Lys₇。PBLA-Lys₃和PBLA-Lys₇按實(shí)施例1的方法接度膽酸并氨解，可得到末端接不同數(shù)目膽酸的兩親性聚合物，膽酸接枝數(shù)目分別是4個(gè)和8個(gè)。

實(shí)施例4納米膠束的制備及表征

取實(shí)施例1制備得到的兩親性嵌段聚合物按納米復(fù)合物制備方法準(zhǔn)備同時(shí)負(fù)載SPIO和尼羅紅的納米膠束，制備思路如圖1所示。

得到的納米粒子溶液，用測(cè)定其水力學(xué)直徑及形貌結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2所示。(A)納米膠束粒徑為64.1±1.7nm。(B)電鏡結(jié)果表明，納米粒子呈均勻的球形結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例5納米膠束弛豫率的MRI檢測(cè)

將實(shí)施例4制備的PAsp(DMA)-CA₂納米膠束于96孔板內(nèi)按濃度梯度逐級(jí)稀釋，進(jìn)行MRI(Philips Inter，3.0T)體外測(cè)試。MRI掃描參數(shù)如下：?jiǎn)未渭ぐl(fā)多次采集的自旋回波序列：重復(fù)時(shí)間(TR)/回波時(shí)間(TE)＝2000/20-80ms，4次梯度回波采集，采集次數(shù)(NSA)＝1，采集矩陣＝160×266,視野(FOV)＝80×80mm²,層厚＝2mm。獲取T2的弛豫時(shí)間。以鐵濃度(mM)為橫坐標(biāo)，T的倒數(shù)(r2)為縱坐標(biāo)，采用線性最小二乘回歸分析，直線斜率即為T2的弛豫度。圖3結(jié)果顯示，負(fù)載于納米膠束內(nèi)的SPIO由于團(tuán)簇效應(yīng)，具有很高的T2弛豫率，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)干細(xì)胞的有效標(biāo)記。

實(shí)施例6納米膠束標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞的熒光標(biāo)記檢測(cè)

將實(shí)施例4制備的納米膠束在鐵濃度為10μg/mL的情況下標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞4小時(shí)后，流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡納米膠束對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的熒光標(biāo)記情況。圖4結(jié)果顯示：流式細(xì)胞儀示神經(jīng)干細(xì)胞被載有熒光染料尼羅紅的納米膠束高效標(biāo)記，標(biāo)記高達(dá)97.55％。

實(shí)施例7納米膠束對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的鐵標(biāo)記檢測(cè)

將實(shí)施例4制備的納米膠束在鐵濃度為10μg/mL的情況下標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞4小時(shí)后，收集細(xì)胞PBS洗滌三次后重懸細(xì)胞于200μL 1％瓊脂糖凝膠中(細(xì)胞密度為2.5×10⁶/mL)，MRI、普魯士藍(lán)檢測(cè)納米膠束對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的SPIO標(biāo)記情況，MRI參數(shù)同實(shí)施例5。圖5結(jié)果顯示：(A)MR示標(biāo)記后細(xì)胞的T2值為35.70±8.95，明顯低于對(duì)照組；(B)普魯士藍(lán)染色示標(biāo)記后神經(jīng)干細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有較多藍(lán)染鐵顆粒。滿足后續(xù)活體MR示蹤的條件。

實(shí)施例8納米膠束的細(xì)胞毒性檢測(cè)

采用CCK8法檢測(cè)實(shí)施例4制備的納米膠束與NSCs孵育后細(xì)胞的存活率，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀定量檢測(cè)了孵育后NSCs的凋亡情況，綜合評(píng)價(jià)納米膠束對(duì)細(xì)胞的毒性，結(jié)果如圖6所示，納米膠束顯示了極小的細(xì)胞毒性，對(duì)人體安全無毒副作用，有望真正實(shí)現(xiàn)囊米載體標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。