本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及外周血單核細(xì)胞活化抑制劑在制備治療急性肝衰竭的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：急性肝衰竭(acuteliverfailure，alf)發(fā)病急驟，死亡率高，危害極大。在發(fā)達(dá)國家，alf發(fā)病率不到百萬分之十，但在包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家，盡管缺乏準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，但alf發(fā)病率顯然高出許多。2013年bernalw等在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表綜述，沿用了1970年提出的alf定義：無基礎(chǔ)肝臟疾病的嚴(yán)重的、具有潛在可逆性的肝臟損傷，在出現(xiàn)首發(fā)癥狀后8周內(nèi)發(fā)生肝性腦病。根據(jù)首發(fā)癥狀與肝性腦病之間的間隔，又可分為超急性、急性、亞急性，等等。之后世界各大肝病研究機(jī)構(gòu)相繼發(fā)布了多個(gè)alf診療指南，并對alf的定義進(jìn)行相應(yīng)的修訂。我國肝病學(xué)家在2012年《肝衰竭診治指南》中提出將2周內(nèi)出現(xiàn)以ⅱ期以上肝性腦病為特征者定義為alf。我國alf病因與西方國家差異顯著。國外的alf定義強(qiáng)調(diào)本次發(fā)病為“孤立”的，突發(fā)的，此前并沒有肝臟基礎(chǔ)疾病，以藥物性肝損傷為主。而我國alf的常見原因仍然是病毒性肝炎或合并有肝炎。事實(shí)上，隨著人群中hbv攜帶率的下降，我國alf病因也在發(fā)生著深刻變化。解放軍302醫(yī)院肝衰竭診療與研究中心從7家三級醫(yī)院納入177例alf患者進(jìn)行研究，在病因中，藥物毒性占43.5％，僅11.3％的alf由急性病毒性肝炎所致(大部分為hbv感染，其余包括hev、hav、cmv和ebv感染等)。據(jù)該報(bào)告，我國alf的主要原因已不再是急性病毒性肝炎，而是與發(fā)達(dá)國家類似，以藥物性肝損傷為主。急診肝移植是alf有效治療手段，常規(guī)內(nèi)科治療死亡率極高。在上述研究中，所有納入病例均未接受肝移植，死亡率高達(dá)63.82％。受限于供肝的極度短缺，我國每年肝移植適應(yīng)癥患者如愿獲得供肝的比例不到1％。alf治療策略主要包括去除病因、促進(jìn)肝再生、肝功能支持、抗炎癥反應(yīng)以及對癥支持等，但效果均不甚滿意。組織工程肝、生物人工肝和肝細(xì)胞移植可能對alf有效，但技術(shù)尚欠成熟、缺乏足夠臨床病例積累和循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，尤其是缺乏大樣本隨機(jī)臨床對照試驗(yàn)，仍然難以作為常規(guī)治療手段，alf的治療依然是世界性的難題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的治療和/或預(yù)防急性肝衰竭的藥物。外周血單核細(xì)胞活化抑制劑在制備治療和/或預(yù)防急性肝衰竭的藥物中的用途。其中，所述外周血單核細(xì)胞活化抑制劑是抑制外周血單核細(xì)胞的il-6表達(dá)水平和/或ccr2表達(dá)水平的物質(zhì)。外周血單核細(xì)胞：是血液中一群體積最大的白細(xì)胞，來源于骨髓，是脊椎動物先天性免疫系統(tǒng)重要組成部分，也參與適應(yīng)性免疫功能，能分化為成熟的巨噬細(xì)胞或髓系樹突狀細(xì)胞。優(yōu)選地，所述抑制劑是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地，所述抑制劑是il-6基因敲除型單核細(xì)胞。優(yōu)選地，所述抑制劑是il-6基因沉默劑。本發(fā)明還提供了一種治療和/或預(yù)防急性肝衰竭的藥物，它是以外周血單核細(xì)胞活化抑制劑為活性物質(zhì)，加上藥學(xué)上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。其中，所述外周血單核細(xì)胞活化抑制劑是抑制外周血單核細(xì)胞的il-6表達(dá)水平和/或ccr2表達(dá)水平的物質(zhì)。其中，所述抑制劑是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、il-6基因敲除型單核細(xì)胞或者il-6基因沉默劑。其中，所述制劑為注射制劑。本發(fā)明還提供了藥物在制備治療治療和/或預(yù)防急性肝衰竭的藥物中的用途。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)了抑制單核細(xì)胞的活化能夠有效治療和預(yù)防急性肝損傷，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞驗(yàn)證了抑制單核細(xì)胞的活化的確能夠有效治療和預(yù)防急性肝損傷，說明單核細(xì)胞活化抑制劑可以有效治療和預(yù)防急性肝損傷，可以作為治療和預(yù)防急性肝損傷的藥物使用，其中，單核細(xì)胞活化抑制劑可以是il-6基因敲除型單核細(xì)胞，也可以是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，還可以是其他抑制單核細(xì)胞活化的物質(zhì)，如il-6基因沉默劑。本發(fā)明為臨床治療急性肝損傷提供了一種新的選擇，應(yīng)用前景優(yōu)良。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1小鼠尾組織pcr基因型鑒定結(jié)果圖2小鼠骨髓移植實(shí)驗(yàn)流程圖。圖3wt小鼠x射線全身輻照后骨組織清髓he染色(左為正常骨髓，右為清髓后)?！?00圖4股骨組織he染色鑒定骨髓重建。左：wt小鼠來源全骨髓移植重建1月后股骨he染色；右：il-6-/-小鼠來源全骨髓移植重建1月后股骨he染色?！?00圖5apap誘導(dǎo)肝損傷后肝臟he染色，顯示bmt(il-6-/-)組小鼠肝損傷更為輕微，其修復(fù)也更迅速。×400圖6apap誘導(dǎo)肝損傷后肝功生化指標(biāo)檢測。*p<0.05圖7luminex液相芯片檢測兩組小鼠肝損傷后血清炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平。*p<0.05圖8fcm檢測兩組小鼠外周血單核細(xì)胞cd11b/ccr2的表達(dá)。***p<0.001圖9外周血細(xì)胞因子的表達(dá)變化。*p<0.05，&p<0.01，$p<0.001圖10毒素給予后一天動物外周血scd163表達(dá)水平。***p<0.001圖11huc-mscs抑制c-mos向肝臟遷移。(a)毒素誘導(dǎo)猴alf后各時(shí)間點(diǎn)肝臟內(nèi)kcs(cd68+)和招募的c-mos(mac387+)。scalebars＝50μm。(b-c)定量統(tǒng)計(jì)肝小葉周圍cd68+和mac387+兩種巨噬細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的陽性數(shù)目，計(jì)數(shù)方法為每10個(gè)不同400倍視野(樣品至少來自3只猴)進(jìn)行計(jì)數(shù)并取其平均值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。圖12免疫熒光雙染檢測肝內(nèi)kcs增殖情況(圖中未見增殖的kcs，而ki67陽性的細(xì)胞為增殖的肝細(xì)胞)圖13fcm檢測動物外周血cd14+cd16+ccr2+單核細(xì)胞。***p<0.001圖14外周血cd14+cd16+ccr2單核細(xì)胞il-6mrna水平。***p<0.001圖15alf猴第3天時(shí)肝臟cd45+炎癥細(xì)胞浸潤情況。圖16預(yù)防性干細(xì)胞輸入組實(shí)驗(yàn)流程圖。圖17預(yù)防性給予huc-mscs顯著抑制肝細(xì)胞損傷及巨噬細(xì)胞活化。***p<0.001圖18健康組與預(yù)防組動物外周血清scd163水平。圖19fcm分析外周血cd14+cd16+ccr2+細(xì)胞和定量pcr檢測il-6的mrna表達(dá)。圖20fcm檢測預(yù)防組白細(xì)胞群和treg細(xì)胞亞群數(shù)量的變化。圖21預(yù)防組第2天和第5天外周循環(huán)中細(xì)胞因子水平。**p<0.01，***p<0.001具體實(shí)施方式主要縮寫詞表：實(shí)施例1抑制外周血單核細(xì)胞活化與急性肝衰竭的關(guān)系一、基因敲除的單核細(xì)胞顯著改善急性肝損傷(一)材料1實(shí)驗(yàn)動物c57bl/6jil-6-/-kopf(il-6-/-)小鼠由四川大學(xué)華西醫(yī)院余希杰教授惠贈。小鼠分籠飼養(yǎng)于spf級動物房，每天12h光照，自由飲水和進(jìn)食。由四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心(持一級動物飼養(yǎng)合格證)按照“四川省醫(yī)學(xué)類實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)和管理?xiàng)l例”及“實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例”進(jìn)行喂養(yǎng)和處理。敲除il-6基因可以抑制單核細(xì)胞的活化，并且骨髓細(xì)胞中，只有單核細(xì)胞會表達(dá)il-6，通過骨髓移植il-6-/-敲除小鼠的骨髓的方式可以有效考察單核細(xì)胞活化與疾病之間的關(guān)系。2主要實(shí)驗(yàn)試劑1)小鼠基因型鑒定相關(guān)試劑：pcr試劑、瓊脂糖、電泳緩沖液、核酸染料等2)全骨髓獲取和移植相關(guān)試劑：75％乙醇，rpmi-1640培養(yǎng)基，紅細(xì)胞裂解液，3％臺盼藍(lán)等3)apap：n-乙酰對氨基酚(sigma,美國)4)組織固定、包埋及病理學(xué)染色相關(guān)試劑：甲醛、乙醇、二甲苯、石蠟、蘇木素染液、伊紅染液、濃鹽酸(科隆試劑，成都)、油紅o染料5)cd11b，ccr2流式抗體(bd，美國)3主要儀器1)x射線輻照儀x-rad320：(pxi，美國)2)骨髓分選相關(guān)手術(shù)器械3)電泳系統(tǒng)：bio-rad4)pcr儀：(ptc-200peltierthermalcycler,mjresearch)5)凝膠成像系統(tǒng)(mqx200,biotek,美國)6)luminex200(millipore,美國)7)流式細(xì)胞儀fc500(二)方法1基因型鑒定il-6基因敲除小鼠由遺傳背景為c57bl/6的野生型小鼠將新霉素抗性基因插入il-6基因的第二外顯子誘導(dǎo)il-6基因突變產(chǎn)生，得到特異性il-6-/-敲除小鼠(詳細(xì)制備方法如lingxiangkong，deletionofinterleukin-6inmonocytes/macrophagessuppressestheinitiationofhepatocellularcarcinomainmice，kongetal.journalofexperimental&clinicalcancerresearch(2016)35:131doi10.1186/s13046-016-0412-1所示)。通過pcr檢測鼠尾樣品，確定小鼠的基因型。il-6小鼠基因型鑒定方法：1)剪取出生2-4周齡小鼠尾巴于ep管中(1-2cm)。2)加入75μlbuffera堿溶液，100℃沸水煮40-45min。3)加入225μlbufferb酸溶液中和buffera，得到小鼠基因組dna模板溶液。4)按照表1配置反應(yīng)體系，總體積20μl。引物序列如表2所示。基因分型buffera(ph≈12.0)：100μl的0.5medta(ph8.0)、625μl的10mol/l雙蒸水定容至250ml?；蚍中蚥ufferb(ph＝3.0)：濃度為40mm的trisbase，濃鹽酸調(diào)ph值至3.0。表1.基因分型pcr反應(yīng)體系(20μl)根據(jù)以下條件進(jìn)行pcr反應(yīng)：表2.基因分型pcr引物配置3％瓊脂糖凝膠，配制100mltae：瓊脂糖粉(agrose)2g，加入三角燒瓶的tae溶液混勻，微波爐加熱煮沸至完全溶解；加入8μlgoldviewdna染料輕輕混勻，溶液室溫冷卻后倒入電泳槽中，放入梳子，待膠冷卻凝固；電泳時(shí)，加8μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物樣品，130v電壓下電泳25min；電泳結(jié)束后，取出，凝膠成像系統(tǒng)紫外光下觀察及采集圖像。2骨髓移植(bonemarrowtransplantation，bmt)1)骨髓移植受體為c57bl/6野生型(wt)，小鼠x射線輻照清髓處理：spf級，8-12周成年鼠；致死劑量輻照清髓：小鼠在輻照清除骨髓前一周，即開始飲用添加抗生素(慶大霉素320000u/l和紅霉素250mg/l)的酸化水，全身輻照總劑量為8.0gy，劑量率為0.5gy/min；2)全骨髓細(xì)胞制備：il-6-/-或wt小鼠頸椎脫位處死后，置于75％的乙醇中浸泡10min，超凈臺無菌條件下剝離股骨和脛骨；將所取骨頭轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入rpmi-1640培養(yǎng)基的研缽內(nèi)，冰上輕輕研磨數(shù)分鐘后，200μm濾器過濾，離心1000rpm/10min；去上清，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解10min，離心1500rpm/10min；去上清，加入1mlrpmi-1640重懸細(xì)胞，洗滌，臺盼藍(lán)鑒定活性不小于95％，計(jì)數(shù)，調(diào)整骨髓細(xì)胞濃度2×107/ml(該骨髓細(xì)胞中的單核細(xì)胞為il-6基因敲除型單核細(xì)胞)，備用；3)骨髓移植(bmt)：將分離所得的il-6-/-或wt全骨髓細(xì)胞以2×107/只，經(jīng)尾靜脈移植入受體wt小鼠體內(nèi)。3apap誘導(dǎo)建立小鼠急性肝損傷(ali)模型骨髓移植存活一個(gè)月后的小鼠用來誘導(dǎo)肝損傷模型。小鼠分組情況：野生型骨髓重建組和il-6-/-基因缺陷小鼠骨髓重建組，每組分別6只。所有小鼠均禁食不禁飲水12h后，腹腔注射300mg/kg的apap溶液，注射apap后恢復(fù)自由進(jìn)食和飲水。4he染色預(yù)計(jì)時(shí)間點(diǎn)獲取小鼠肝臟行he常規(guī)染色，染色步驟同前。骨組織he染色中涉及的脫鈣方法和步驟：(1)10％中性福爾馬林固定骨股組織4-5天，流水沖洗標(biāo)本20min；(2)使用10％edta脫鈣液進(jìn)行脫鈣處理后常規(guī)he染色。5小鼠肝功能檢測采用乙醚吸入麻醉小鼠后，眼球取血至ep管中，離心1200rpm/10min，取上清送檢肝功檢測，包括：alt，ast和tbil。6小鼠血清細(xì)胞因子檢測方法簡述如下：提前20min從冰箱中取出試劑盒及凍存的樣本，以平衡室溫。在板上的每個(gè)孔中加入200ul的洗滌液。封板，室溫(20-25℃)，放在振蕩器上10min清洗。倒掉洗滌液，把板反過來在可吸附的紙上輕叩幾次以去掉殘余物質(zhì)。在適當(dāng)?shù)目字屑用糠N標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，用分析緩沖液作為(本底)。在背景孔和所有標(biāo)本孔中加入25ul分析緩沖液。在本底、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品中加入25ul基體溶液。加入25ul標(biāo)本到適當(dāng)孔中。渦旋混合瓶，每個(gè)孔中加入25ul混合的珠子，在加珠子過程中間歇的搖動裝珠子的瓶子，避免沉淀。用封板膜封板，在板的外面上鋁箔，放在振蕩器上室溫(20-25攝氏度)振蕩孵育2h或者4℃孵育過夜。輕輕地去掉板里的內(nèi)容物，洗板兩次。在每個(gè)孔中加入25ul檢測抗體。封板，包上鋁箔，在振蕩器上室溫振蕩孵育1h。在每個(gè)含有25ul檢測抗體的孔中加入25ul鏈霉親和素-藻紅蛋白。封板，包上鋁箔，在振蕩器上室溫振蕩孵育30min。輕輕地去掉板里的內(nèi)容物，洗板兩次。在所有孔中加入150ul鞘液。在振蕩器上重懸珠子15min。將板放在flexmap上用xponent運(yùn)行。保存并使用樣條曲線擬合法分析中間熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)本中細(xì)胞因子的濃度。7小鼠外周血單核細(xì)胞ccr2表達(dá)小鼠眼球取血(體積約為200μl)至肝素鈉洗滌過的ep管，與肝素鈉混勻后，直接加入cd11b，ccr2流式檢測抗體，室溫孵育20min，流式細(xì)胞儀檢測。(三)結(jié)果1小鼠基因型鑒定對特定基因片段擴(kuò)增基因型鑒定結(jié)果(圖1)顯示，il-6基因缺陷(il-6-/-)小鼠pcr產(chǎn)物擴(kuò)增片段為1400bp，野生型(wt)擴(kuò)增片段為900bp。2小鼠骨髓移植實(shí)驗(yàn)流程骨髓移植實(shí)驗(yàn)流程如圖2：wt野生型小鼠輻照清髓6h內(nèi)，使用wt和il-6-/-不同基因型來源小鼠骨髓重建清髓小鼠骨髓系統(tǒng)。骨髓重建成功后，再經(jīng)apap誘導(dǎo)建立急性肝損傷模型。3wt和il-6-/-來源的全骨髓均可重建wt小鼠骨髓造血系統(tǒng)wt野生型小鼠股骨組織清髓he結(jié)果顯示，經(jīng)x射線輻照清髓后，骨髓腔中骨小梁附近的的骨髓細(xì)胞成分幾乎完全被摧毀(圖3)。he染色結(jié)果顯示wt或il-6-/-基因型來源的全骨髓移植1月后，均可重建輻照清髓小鼠的骨髓造血系統(tǒng)(圖4)。4wt和il-6-/-來源骨髓重建后的小鼠apap誘導(dǎo)肝損傷情況apap腹腔注射1天后，he染色結(jié)果顯示兩組動物肝臟中央靜脈區(qū)域出現(xiàn)不同程度的壞死區(qū)域(圖5)。其中，wt小鼠來源骨髓受體小鼠，記做bmt(wt)小鼠，其壞死區(qū)域面積顯著大于il-6-/-小鼠來源骨髓受體小鼠，記做bmt(il-6-/-)小鼠，提示其肝損傷更為嚴(yán)重。第2天時(shí)bmt(wt)小鼠肝臟仍表現(xiàn)為大片狀的壞死區(qū)域，而bmt(il-6-/-)組的壞死區(qū)域逐漸修復(fù)消退，僅表現(xiàn)出嗜酸性和水腫變性。表明在apap同等劑量誘導(dǎo)的急性肝損傷條件下，bmt(il-6-/-)組小鼠的肝損傷情況顯著輕于bmt(wt)組。肝功能生化指標(biāo)也驗(yàn)證了上述組織病理學(xué)結(jié)果。apap誘導(dǎo)第1天和/或第二天，bmt(wt)組血清中轉(zhuǎn)氨酶alt、ast和tbil水平顯著高于bmt(il-6-/-)組。之后兩組肝功生化指標(biāo)均回落，第3天時(shí)都逐漸恢復(fù)至接近正常水平值(圖6)。以上結(jié)果表明，接受il-6基因剔除的骨髓重建小鼠，apap誘導(dǎo)急性肝損傷條件下表現(xiàn)出較接受wt骨髓組更輕的肝損傷表現(xiàn)。5小鼠血清炎性細(xì)胞因子檢測bmt(wt)和bmt(il-6-/-)兩組小鼠血清中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平結(jié)果如圖7所示。bmt(il-6-/-)組il-6表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于bmt(wt)組。apap誘導(dǎo)肝損傷1天和2天后，bmt(il-6-/-)組炎性細(xì)胞因子tnf-α、ifnγ和趨化因子mcp-1表達(dá)水平顯著低于在bmt(wt)組，兩組有顯著性差異，p<0.05；第3天時(shí)隨著肝損傷的修復(fù)，炎性因子表達(dá)水平回落。6流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血單核細(xì)胞ccr2的表達(dá)接下來我們分析了兩組不同基因型骨髓來源的小鼠在肝損傷時(shí)外周單核細(xì)胞(c-mos)ccr2的表達(dá)水平。如圖8所示，bmt(il-6-/-)組小鼠c-mosccr2的表達(dá)的確被顯著抑制，低于bmt(wt)組2倍多，具有顯著性差異，說明敲除單核細(xì)胞的il-6基因，可以有效抑制單核細(xì)胞的活化。(四)討論我們使用il-6基因缺陷小鼠來源的骨髓重建輻照清髓的野生型小鼠，觀察il-6基因缺陷的單核細(xì)胞在apap誘導(dǎo)肝損傷后，小鼠單核細(xì)胞活化情況。首先，il-6基因缺陷小鼠來源的骨髓和野生型小鼠骨髓均能夠成功重建輻照小鼠的骨髓造血系統(tǒng)；其次，相同肝損傷誘導(dǎo)條件下，il-6基因缺陷骨髓重建的小鼠肝組織病理及肝功生化表現(xiàn)出較野生型更輕微的損傷。同時(shí)，炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平亦顯著低于野生型對照組。最后流式細(xì)胞術(shù)也發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞的ccr2(ccr2為單核細(xì)胞活化的標(biāo)志物)表達(dá)百分比顯著低于對照組。以上結(jié)果表明，正是由于單核細(xì)胞il-6基因的缺失，導(dǎo)致了單核細(xì)胞活化受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致了兩種不同基因型來源骨髓重建小鼠肝損傷后不同的病理損傷表現(xiàn)。(五)結(jié)論il-6基因剔除小鼠來源的骨髓重建的小鼠與wt骨髓來源小鼠相比，由于其可以抑制外周血單核細(xì)胞活化，降低單核細(xì)胞il-6的表達(dá)水平，因而在同等劑量apap肝毒性藥物誘導(dǎo)的急性肝損傷中，表現(xiàn)出較輕的肝組織病理損傷、炎性細(xì)胞因子水平以及更低水平的單核細(xì)胞活化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，通過抑制外周血單核細(xì)胞的活化，可以有效治療和預(yù)防急性肝損傷，具體地，可以使用il-6基因敲除型單核細(xì)胞替代外周血中的正常單核細(xì)胞，從而達(dá)到治療和預(yù)防急性肝損傷的目的。二、間充質(zhì)干細(xì)胞通過抑制單核細(xì)胞活化來改善急性肝損傷(一)材料1恒河猴及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。2恒河猴外周血清、肝穿刺活檢組織及猴外周血單核細(xì)胞。3主要實(shí)驗(yàn)試劑1)免疫組化相關(guān)試劑：甲醛、乙醇、二甲苯、石蠟、蘇木素染液、伊紅染液、濃鹽酸(科隆試劑，成都)等2)抗體：詳見下表抗體及相關(guān)試劑信息3)luminex液相芯片試劑盒：acytokinemonkeymagnetic29-plexpanel(lifetechnologies)4)humancd163quantikineelisakit(r&dsystems，美國)5)ficoll淋巴細(xì)胞分離液(ge，美國)6)trizol(invitrogen，美國)7)pcr相關(guān)試劑：10×taqbuffer，taqdnapolymerase，25mmmgcl2dntp混合物(tiangen，中國)4瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑瓊脂糖，50×tae電泳緩沖液，核酸染料(goldview，賽百勝，北京)5主要儀器設(shè)備1)流式細(xì)胞儀fc500cytomics(beckmancoulter,fullerton,calif.,美國)2)巴德mg15-22全自動活檢槍(bard,美國)3)超純凈水產(chǎn)生系統(tǒng)(milli-q，美國millipore公司)4)各型號移液器(eppedorf公司，德國)5)全自動脫水機(jī)(dako,美國)6)石蠟包埋機(jī)(bm2135,leica,德國)7)石蠟切片機(jī)(eq1150c,leica,德國)8)光學(xué)顯微鏡(020-518.500,olympus,日本)，熒光顯微鏡(leica,德國)9)圖像采集系統(tǒng)(olympusdpcontroller70，日本)10)微型低溫離心機(jī)(thermolfisher,美國)11)pcr儀(ptc-200peltierthermalcycler,mjresearch)12)圖像編輯軟件(photoshopcs2,graphpad5.0,美國)13)統(tǒng)計(jì)分析軟件(spss19.0,美國)14)流式細(xì)胞術(shù)分析軟件(kaluzav1.20software,德國；cxp2.1流式軟件,德國)15)超低溫冰箱(thermoscientific公司，美國)，液氮生物容器(成都液氮容器廠)全自動脫水機(jī)(dako,美國)16)luminex200system(millipore,美國)(二)方法1免疫組織化學(xué)(ihc)染色肝臟穿刺組織石蠟包埋完成后，5μm連續(xù)切片，撈片后將切片置于65℃烤箱中烤片6過夜。取出過夜烤好的切片，按照常規(guī)步驟進(jìn)行脫蠟水化：二甲苯溶液10min×2，無水乙醇3min×2，95％酒精，85％酒精，75％酒精各3min，流水沖洗5min，蒸餾水洗3min×3次。ihc時(shí)，先用3％h2o2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水漂洗兩次后用tris-edta(ph＝9.0)抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)；然后用組化標(biāo)記筆將待切片組織外圍圈好，滴加事先已稀釋好的一抗抗體于組織上，37℃孵育2h。pbs漂洗3次后滴加envision二抗，37℃孵育45min。pbs漂洗3次后使用dab顯色液顯色；蘇木素染色液復(fù)染；脫水透明之后用中性樹膠封片。2免疫熒光(if)染色1)將肝臟石蠟切片脫蠟水化(見上述步驟)；pbs沖洗2次，每次5min；2)抗原修復(fù)：將切片濕盒浸泡在抗原修復(fù)液(檸檬酸鹽緩沖液)中，微波爐30min，冷卻到室溫，pbs沖洗3次，每次5min；3)封閉：5％正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育15min，傾倒封閉液；滴加配制好的抗體工作液(cd68與ki67混合配制)，4℃過夜；4)次日，復(fù)溫后，pbs沖洗三次；滴加適量熒光標(biāo)記二抗工作液(混合配制)，室溫孵育1h；pbs清洗三次，每次5min；5)dapi工作液染核5min后，清洗2次；6)緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察，采集圖像。3elisa檢測血清scd163使用人可溶性cd163試劑盒，此方法檢測靈敏度范圍為1.56-100ng/ml，為確保樣本能夠準(zhǔn)確測出，將血清樣本稀釋100倍，之后按照試劑盒說明書指導(dǎo)下進(jìn)行定量檢測，具體方法：1)包被：每個(gè)聚苯乙烯反應(yīng)孔中加入100μl稀釋成工作液的兔抗cd163，4℃過夜，次日棄去孔內(nèi)溶液，緩沖液洗滌3次，每次3min(簡稱洗滌，下同)；2)加樣：棄去孔內(nèi)液體，洗滌。加入100μl用pbs稀釋100倍的樣品于反應(yīng)孔中，同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔，室溫孵育1h；3)加入酶標(biāo)抗體：洗滌反應(yīng)孔，加入100μl稀釋的cd163單克隆抗體(1:500)，室溫孵育1h，洗滌，加入100μl過氧化酶標(biāo)記的抗體(山羊抗小鼠免疫球蛋白，dakop447，1:4000)，室溫孵育1h，洗滌；4)加底物顯色：先加入100μl過氧化氫/鄰苯二胺鹽酸鹽底物溶液，再加入50μl的硫酸,在elisa酶標(biāo)儀上于492/620nm波長處讀取數(shù)值。批間精密度變異系數(shù)cv分別為6.3和9.6％，對應(yīng)數(shù)值分別為1.84和3.91mg/l(n＝19×2)。4恒河猴外周血單核細(xì)胞(monocyte)分離和純化1)后腿隱靜脈無菌采集約5ml外周血于肝素鋰抗凝管中，室溫2000r/min離心20min，移液槍吸棄上層液體，沉淀層為細(xì)胞。2)細(xì)胞沉淀層中按1:1體積比加入pbs緩沖液，混勻；取一新15ml離心管加入一定體積的ficoll淋巴細(xì)胞分離液；3)使用移液槍吸取混勻的細(xì)胞緩慢小心加入ficoll淋巴細(xì)胞分離液的上層，離心，結(jié)束后，可見離心管中液體分為4層。4)其中第二層云霧狀，即主要為個(gè)單核細(xì)胞。吸棄第一層的血漿，收集血漿和第三層ficoll分離液之間的白膜層于新離心管中。5)加入5倍以上體積pbs吹打混勻，離心洗去所收集的單核細(xì)胞中的ficoll淋巴細(xì)胞分離液，共洗滌2次。6)rpmi-1640培養(yǎng)基以上述同樣的離心條件洗滌1次，離心結(jié)束后，用小量程移液槍盡量吸走全部的上清。再用一定體積添加10％胎牛血清的rpmi1640重懸細(xì)胞。7)吸取50μl細(xì)胞懸液，血小板計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)并調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml；濃度為2％臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞的活力；取一定體積的細(xì)胞懸液，測試單核細(xì)胞表面標(biāo)志物cd14，以確保所得單核細(xì)胞的純度。5流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞活化收集恒河猴外周血2ml于抗凝管中，離心，1500rpm，5min，棄掉上次血清；按照一定比例加入紅細(xì)胞裂解液，8-11min左右；離心棄上清液，清洗下層細(xì)胞團(tuán)。加入用pbs稀釋的熒光素標(biāo)記的anti-cd14、cd16、ccr2抗體200μl，移液槍輕輕吹打混勻，室溫避光孵育15-20min；離心棄上清液，加入pbs繼續(xù)洗滌2次；加入500μl冷pbs，移液槍混勻細(xì)胞，轉(zhuǎn)移置流式管中，4℃冰箱保存，待測。6單核細(xì)胞總rna提取及il-6mrna水平檢測提取mrna使用的移液槍槍頭、ep管等用含0.1％焦炭酸二乙酯(depc)ddh2o浸泡過夜后，高溫高壓滅菌除去depc殘留，100℃烘箱烘干備用。1)trizol裂解得到的單核細(xì)胞，提取rna：在離心管中加入1mltrizol溶液，移液槍吹打離心管底部的細(xì)胞團(tuán)，充分裂解，室溫下靜置10min。2)離心管中加入氯仿：加入1/3trizol體積的氯仿，蓋緊離心管，渦旋儀劇烈振蕩30s，室溫下靜置5-10min，12,000×g，4℃離心15min。3)離心機(jī)中小心取出離心管，緩慢吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管管中，注意不要吸出中間白色蛋白質(zhì)層。4)向上清中加入等體積的異丙醇，輕柔上下?lián)u晃數(shù)次至混勻，在室溫下靜置10-20min。12,000×g，4℃離心10min，離心管底部出現(xiàn)沉淀，即rna。5)輕柔棄去上清液，沿離心管管壁加入1ml75％的乙醇，輕輕上下顛倒離心管，洗滌管壁。12,000×g，4℃離心5min。輕柔傾倒乙醇，輕放室溫干燥2-5min。6)加入適量的rnasefreewater溶解rna樣品，待rna沉淀溶解后，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，剩余樣本分裝并凍存于-80℃冰箱。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)測定總rna的濃度和od260/od280值。按下表所示配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(20μl體系)，反應(yīng)液配制全部在冰上進(jìn)行。(3)根據(jù)以下逆轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行rt-pcr：5minat25℃30minat42℃5minat85℃10minat10℃，反應(yīng)結(jié)束后cdna樣品放入-80℃冰箱長期凍存。逆轉(zhuǎn)錄pcr反應(yīng)體系(20μl)熒光定量pcr按照下表配制qpcr反應(yīng)液(20μl體系)，所有操作反應(yīng)全部在冰上進(jìn)行。熒光定量pcr反應(yīng)體系(20μl)根據(jù)以下條件進(jìn)行qpcr反應(yīng)：qrt-pcr引物購自上海生工生物技術(shù)有限公司，具體信息如下表所示。geneforwarprimersequencereverseprimersequenceil-65'atgaggacacttgcctggtg3'5'gctggcatttgtggttggtt'3'gapdh5'tcgagagtcagccgcattttc3'ggaacttgccatgggtggaa3'7luminex檢測恒河猴血清細(xì)胞因子方法簡述如下：提前20min從冰箱中取出試劑盒及凍存的樣本，以平衡室溫。在板上的每個(gè)孔中加入200ul的洗滌液。封板，室溫(20-25℃)，放在振蕩器上10min清洗。倒掉洗滌液，把板反過來在可吸附的紙上輕叩幾次以去掉殘余物質(zhì)。在適當(dāng)?shù)目字屑用糠N標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，用分析緩沖液作為(本底)。在背景孔和所有標(biāo)本孔中加入25ul分析緩沖液。在本底、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品中加入25ul基體溶液。加入25ul標(biāo)本到適當(dāng)孔中。渦旋混合瓶，每個(gè)孔中加入25ul混合的珠子，在加珠子過程中間歇的搖動裝珠子的瓶子，避免沉淀。用封板膜封板，在板的外面上鋁箔，放在振蕩器上室溫(20-25攝氏度)振蕩孵育2h或者4℃孵育過夜。輕輕地去掉板里的內(nèi)容物，洗板兩次。在每個(gè)孔中加入25ul檢測抗體。封板，包上鋁箔，在振蕩器上室溫振蕩孵育1h。在每個(gè)含有25ul檢測抗體的孔中加入25ul鏈霉親和素-藻紅蛋白。封板，包上鋁箔，在振蕩器上室溫振蕩孵育30min。輕輕地去掉板里的內(nèi)容物，洗板兩次。在所有孔中加入150ul鞘液。在振蕩器上重懸珠子15min。將板放在flexmap上用xponent運(yùn)行。保存并使用樣條曲線擬合法分析中間熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)本中細(xì)胞因子的濃度。8細(xì)胞計(jì)數(shù)使用ipp圖像分析軟件對采集到的免疫組化圖像進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。不同時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本在400x顯微鏡下陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品取5個(gè)視野，然后取其平均值。使用graphpadprism5軟件進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)分析。9數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均代表3次以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)均由專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件spss或graphpadprism5進(jìn)行分析(13.0版)，兩組數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析處理。p值小于0.05表示具有顯著性差異。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。(三)結(jié)果1恒河猴外周血細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子的動態(tài)變化我們利用luminex技術(shù)檢測了恒河猴外周血清中細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子共29個(gè)因子的動態(tài)表達(dá)變化。如圖9所示，兩組動物外周血清炎癥因子tnf-α、il-1β、il-1ra、il-15、ifn-γ，趨化因子mcp-1、mip1α、mip1β和生長因子hgf、vegf、fgf-basic于amanitin毒素注射后3天內(nèi)均略微升高，之后在msc-組隨肝功能惡化而持續(xù)上升，第4-5天時(shí)顯著高于msc+組。在msc+組，上述因子表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著變化或僅有輕微升高，第5天時(shí)迅速回落，至第7天已恢復(fù)至正常水平。msc-組il-6在第1天時(shí)迅速達(dá)到峰值，較毒素誘導(dǎo)前升高達(dá)100余倍，也高于msc+組34倍。之后il-6水平急轉(zhuǎn)直下，但至第5天時(shí)仍6倍高于msc+組。兩組動物il-2、il-8、il-10、il-12、g-csf、egf、rantes、eotaxin、mif、i-tac、mdc、mig、ip-10等因子在各時(shí)間點(diǎn)兩組的表達(dá)水平無顯著性差異。il-4、il-5、il-17和gm-csf等因子低于檢測閾值，未能測出結(jié)果。2單核細(xì)胞活化檢測外周循環(huán)中炎性細(xì)胞因子檢測結(jié)果提示，毒素輸入引起了恒河猴全身性的炎癥反應(yīng)。外周血il-6在第1天就急劇升高，提示其在alf啟動及進(jìn)展中可能起重要作用。多種細(xì)胞均可分泌il-6，例如活化的t細(xì)胞、單核細(xì)胞甚至成纖維細(xì)胞。然而，急性肝損傷發(fā)生后，首先激活肝內(nèi)巨噬細(xì)胞即庫否細(xì)胞(kcs)，后者成為分泌il-6的主要細(xì)胞群。kcs的活化及分泌il-6是促進(jìn)肝臟修復(fù)的重要保護(hù)性因素。但kcs的過度活化也成為促進(jìn)局部和全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。il-6在alf早期的急劇升高提示kcs的大量動員活化，這可能是毒素導(dǎo)致alf病情進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。cd163是血紅蛋白清道夫受體，特異性表達(dá)于活化的巨噬細(xì)胞膜。血清中的可溶性cd163(solublecd163,scd163)的水平能反映巨噬細(xì)胞活化狀況，也可間接反映肝衰竭病情嚴(yán)重程度[60-62]。我們用elisa分析了兩組動物血清中scd163水平。在第1天時(shí)msc-組scd163就急劇升高，而msc+組僅略微升高，兩組相比具有極顯著性差異(p<0.001)，這也提示了msc-組巨噬細(xì)胞的顯著活化(圖10)。肝臟內(nèi)的kcs是體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群，早期急劇升高的il-6和scd163提示kcs的大量活化。cd68是成熟kcs的特異標(biāo)志物。免疫組化染色結(jié)果顯示在msc-組，直到第3天才見到明顯增多的cd68陽性細(xì)胞，盡管其kcs胞漿豐富，細(xì)胞體積較大，但與msc+組相比，其數(shù)量并無顯著性差異(圖11)。肝臟巨噬細(xì)胞的增多，一部分可能為kcs分裂增殖，另一部分可能來源于循環(huán)中的單核細(xì)胞(circulatingmonocytes,c-mos)，受到ccr2(單核細(xì)胞趨化蛋白mcp-1受體)等信號趨化而遷移到肝損傷局部，分化為kcs。我們檢測了肝臟內(nèi)kcs增殖情況，如圖12所示，肝臟內(nèi)罕見cd68+ki67+細(xì)胞，表明kcs的增殖并不活躍。接下來我們利用免疫組化檢測了由循環(huán)中遷移入肝臟的單核細(xì)胞(c-mos)。mac387是外周血遷移入肝而又尚未分化成熟的單核-巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示早在第2天，msc-組即可觀察到大量mac387+細(xì)胞聚集于肝臟壞死灶周圍，第3天繼續(xù)增多，至第4天時(shí)隨著肝實(shí)質(zhì)的大量丟失其形態(tài)發(fā)生改變(圖11a,b)；而msc+組在各時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)mac387的顯著增多(圖11a,c)。以上結(jié)果提示，肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的大量活化，絕大部分是從c-mos募集而來。單核細(xì)胞趨化蛋白1(mcp-1)與特異性趨化因子受體2(ccr2)結(jié)合后，激活單核-巨噬細(xì)胞，被認(rèn)為具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，高表達(dá)ccr2的單核細(xì)胞被視作活化的單核細(xì)胞。我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了外周血cd14+cd16+ccr2+的單核細(xì)胞。毒素誘導(dǎo)后第1天，盡管我們前面未發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞總數(shù)升高，但msc-組動物外周血cd14+cd16+ccr2+陽性的c-mos比例顯著升高，且遠(yuǎn)高于msc+組(圖13)。為明確活化的c-mos是否是il-6的來源，我們采用rt-pcr檢測了其il-6mrna的水平。結(jié)果顯示，從msc-組分選所得的c-mos其il-6的mrna顯著性升高(圖14)。cd45是炎癥細(xì)胞的共同表面標(biāo)志，我們進(jìn)而通過cd45免疫組化檢測了兩組動物第3天時(shí)肝內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤情況。與msc-組相比，msc+組局部炎性細(xì)胞的浸潤被明顯抑制(圖15)。本部分結(jié)果表明，msc-組肝內(nèi)巨噬細(xì)胞主要是由ccr2趨化的c-mos遷移至肝臟聚集而成，而il-6在第1天時(shí)急劇升高，正是來自于cd14+cd16+ccr2+的c-mos。huc-mscs輸入后，顯著減少了活化的c-mos并抑制其分泌il-6，進(jìn)而有效地阻斷了系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的過度放大，逆轉(zhuǎn)了毒素引起的恒河猴alf的發(fā)生。3預(yù)防性輸入huc-mscs有效抑制毒素誘導(dǎo)的肝損傷huc-mscs的輸入強(qiáng)有力地抑制了c-mos活化進(jìn)而改善了毒素引起的alf。我們進(jìn)而探討了預(yù)防性給與huc-mscs是否同樣能保護(hù)肝細(xì)胞免于毒素?fù)p傷。我們在毒素誘導(dǎo)建模前的-9，-8和-7天分別通過外周靜脈給予1×107個(gè)huc-mscs，共計(jì)3×107huc-mscs，作為預(yù)防組(pre-msc+)。實(shí)驗(yàn)流程如圖16所示。結(jié)果顯示，預(yù)防組動物除了在毒素給予后的前兩天食欲有所減退，之后始終保持良好的生理和精神狀態(tài)，動物無一死亡。肝功生化指標(biāo)顯示，與毒素誘導(dǎo)前相比，pre-msc+組第2天時(shí)酶學(xué)指標(biāo)、膽紅素和血氨水平幾乎沒有發(fā)生改變，第5天時(shí)alt僅為501u/l，膽紅素和血氨水平與正常水平相當(dāng)(圖17a)。其肝功能指數(shù)明顯好于msc-組，甚至好于msc+組。第3天時(shí)肝活檢組織的he染色結(jié)果顯示為正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，cd68和mac387陽性細(xì)胞極少(圖17b)。外周血清scd163水平檢測也顯示第1天時(shí)pre-msc+組僅較注射毒素前略有上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明scd163也被顯著抑制(圖18)。同樣，流式細(xì)胞術(shù)檢測pre-msc+組cd14+cd16+ccr2+單核細(xì)胞比例，也顯示其外周血活化的c-mos接近于正常健康動物，并且這群單核細(xì)胞的il-6mrna表達(dá)水平也不升高(圖19)。同樣，提前輸入huc-mscs并未引起外周血白細(xì)胞數(shù)目和treg等淋巴細(xì)胞亞群比例發(fā)生變化(圖20)。我們又采用luminex液相芯片檢測了細(xì)胞因子水平。與健康對照比較，從第2天到第5天，pre-msc+組動物外周血清中炎癥介質(zhì)，如il-1α、tnf-α、il-1β、ifn-γ，趨化因子，如mcp-1、mip1α、mip1β等幾乎無顯著改變或僅有輕微升高，外周血il-6亦被顯著抑制。某些炎性因子如il-1α等較huc-msc+組更低(圖21)。該結(jié)果提示預(yù)防性給予huc-mscs似乎能更顯著地抑制局部及后續(xù)的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。(四)討論通過流式我們分析了外周血cd14+cd16+ccr2+單核細(xì)胞亞群，結(jié)果證實(shí)alf猴c-mos被顯著活化，高表達(dá)il-6mrna，成為血清中il-6的主要來源。huc-mscs能明顯抑制c-mos的活化和遷移過程，并抑制其產(chǎn)生il-6。同時(shí)，我們的研究也證實(shí)huc-mscs治療和預(yù)防alf的的靶細(xì)胞正是c-mos。(五)結(jié)論外周血輸入的huc-mscs通過抑制c-mos的過度活化及產(chǎn)生il-6，從而顯著抑制繼發(fā)性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，使恒河猴免于致死性alf。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，通過抑制外周血單核細(xì)胞的活化，可以有效治療和預(yù)防急性肝損傷，其中，huc-mscs即可以有效抑制單核細(xì)胞的活化，具體地，可以抑制活化標(biāo)志物ccr2的表達(dá)，同時(shí)抑制il-6的分泌，說明huc-mscs是一種外周血單核細(xì)胞的活化抑制劑，可以通過抑制外周血單核細(xì)胞的活化，進(jìn)而治療和預(yù)防急性肝損傷。綜上，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)從基因水平證實(shí)了抑制單核細(xì)胞的活化能夠有效治療和預(yù)防急性肝損傷，再以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞驗(yàn)證了抑制單核細(xì)胞的活化的確能夠有效治療和預(yù)防急性肝損傷，說明單核細(xì)胞活化抑制劑可以有效治療和預(yù)防急性肝損傷，可以作為治療和預(yù)防急性肝損傷的藥物使用，其中，單核細(xì)胞活化抑制劑可以是il-6基因敲除型單核細(xì)胞，也可以是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，還可以是其他抑制單核細(xì)胞活化的物質(zhì)，如il-6基因沉默劑。本發(fā)明為臨床治療急性肝損傷提供了一種新的選擇，應(yīng)用前景優(yōu)良。sequencelisting<110>四川大學(xué)華西醫(yī)院<120>外周血單核細(xì)胞活化抑制劑在制備治療急性肝衰竭的藥物中的用途<130>gy026-17p1109<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>il-6pcr引物f<400>1tcgagtatctgacaatgtgg20<210>2<211>21<212>dna<213>il-6pcr引物r1<400>2tagccagaagttccaaattgg21<210>3<211>22<212>dna<213>il-6pcr引物r2<400>3atagcctgaaaccaactgtgcc22<210>4<211>20<212>dna<213>il-6qrt-pcr引物f<400>4atgaggacacttgcctggtg20<210>5<211>20<212>dna<213>il-6qrt-pcr引物r<400>5gctggcatttgtggttggtt20<210>6<211>21<212>dna<213>gapdhqrt-pcr引物f<400>6tcgagagtcagccgcattttc21<210>7<211>20<212>dna<213>gapdhqrt-pcr引物r<400>7ggaacttgccatgggtggaa20當(dāng)前第1頁12