本發(fā)明涉及脂質(zhì)體
技術領域：
，具體涉及脂質(zhì)體用于治療慢性乙型病毒性肝炎的用途。
背景技術：
：乙型病毒性肝炎是一種全球性疾病，是由乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹鞑⒖梢鸲嗥鞴贀p害的一種疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告：全球乙型肝炎病毒感染者約占人群的30％，即全球約有18億人曾感染過乙型肝炎病毒，其中約0.35億人為慢性感染者，后者表現(xiàn)為持續(xù)性病毒血癥。在全球范圍內(nèi)，中國屬乙型病毒性肝炎高流行區(qū)，乙型肝炎病毒攜帶者約1.2億，慢性乙型病毒性肝炎患者約0.3億。乙型病毒性肝炎多為圍產(chǎn)期傳播、青春期發(fā)病、青壯年惡化。因此，其危害的人群多為青壯年。大部分患者感染后通過自然病程痊愈，而部分患者則遷延不愈并發(fā)展為肝硬化、肝癌。據(jù)統(tǒng)計，全球每年至少有50萬慢性感染患者死于肝硬化和肝癌。hbv作為一種嗜肝dna病毒，本身并不能直接引起肝細胞損傷，其感染的病理和臨床后果取決于免疫機制。細胞免疫應答中，cd8+細胞毒性t淋巴細胞(cytotoxictlymphocyte，ctl)在控制病毒感染中發(fā)揮了重要的作用。急性hbv感染患者體內(nèi)能檢測到極強的抗原特異性的ctl，因此絕大多數(shù)急性自限性感染患者都可以清除病毒而痊愈。與急性病毒感染患者不同，慢性hbv感染患者體內(nèi)ctl功能低下，并且病毒特異性ctl在持續(xù)性感染病程中逐漸由免疫優(yōu)勢減弱到免疫弱勢，t細胞(抗原)受體(tcellreceptor,tcr)庫多樣性下降，在一些患者中甚至表現(xiàn)為整體tcr庫的多樣性下降。tcr是t細胞表面識別抗原的分子，也是t細胞產(chǎn)生免疫應答最關鍵的分子。t細胞在胸腺發(fā)育過程中，tcr通過v(d)jc基因重排和選擇，組成了外周多樣性的t細胞庫，使其能對外界各種各樣的抗原產(chǎn)生應答。tcr庫是某一特定時間點個體的免疫系統(tǒng)中所有功能多樣性cd8+t細胞抗原受體的總和。其中，hbv特異性ctl的反應決定了hbv感染的最終結果。hbv感染后，ctl活性高的感染者體內(nèi)病毒被清除而痊愈；ctl活性低或測不到的感染者則發(fā)展為慢性持續(xù)感染狀態(tài)，并進一步發(fā)展為肝硬化或/和肝癌。因此，克服hbv持續(xù)感染患者的免疫耐受狀態(tài)，在體增強啟動hbv特異性ctl應答，穩(wěn)定并增加其tcr多樣性反應，可治療hbv慢性感染持續(xù)狀態(tài)，及防止其相關的繼發(fā)性肝硬化、肝癌等疾病。脂質(zhì)體(liposome)于1965年由bangham首次發(fā)現(xiàn)。它是人工制備的類脂質(zhì)小球體，由一個或多個類似于細胞膜的類脂雙分子層包裹著水相介質(zhì)組成。構成雙分子層的類脂及其親水性的首基部分形成膜的內(nèi)外表面，而親脂性的尾端部分處于膜的中間。脂質(zhì)體的這種結構使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩性的物質(zhì)。在醫(yī)藥中，脂質(zhì)體主要作為免疫佐劑及藥物載體被廣泛使用，主要利用脂質(zhì)體可以和細胞膜融合的特點，將藥物送入細胞內(nèi)部。目前尚未有脂質(zhì)體本身作為藥物用于治療慢性乙型病毒性肝炎的報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供脂質(zhì)體用于治療慢性乙型病毒性肝炎的用途。本發(fā)明第一方面涉及脂質(zhì)體用于制備治療慢性乙型病毒性肝炎的藥物的用途，其中所述脂質(zhì)體由包括磷脂和膽固醇的物質(zhì)制備而成。在優(yōu)選的實施方案中，所述脂質(zhì)體由包括磷脂、膽固醇、棕櫚酸和/或維生素e的物質(zhì)制備而成。在優(yōu)選的實施方案中，用于制備所述脂質(zhì)體的各物質(zhì)的摩爾比為磷脂:膽固醇:棕櫚酸:維生素e＝1:(0.1-1):(0-0.15):(0-0.25)。在優(yōu)選的實施方案中，所述磷脂為大豆磷脂。優(yōu)選為大豆卵磷脂。在優(yōu)選的實施方案中，所述脂質(zhì)體的給藥方式為皮下注射。在優(yōu)選的實施方案中，所述脂質(zhì)體的劑型為液體脂質(zhì)體劑型或凍干脂質(zhì)體劑型。優(yōu)選為凍干脂質(zhì)體劑型。所述凍干脂質(zhì)體劑型采用人血白蛋白或聚維酮k30為賦形劑進行凍干，優(yōu)選采用人血白蛋白為賦形劑。本發(fā)明第二方面涉及本發(fā)明第一方面所述的脂質(zhì)體用于制備促進慢性乙型病毒性肝炎患者發(fā)生乙型肝炎e抗體轉(zhuǎn)陽且乙型肝炎e抗原轉(zhuǎn)陰的血清學轉(zhuǎn)換的藥物的用途。本發(fā)明第三方面涉及本發(fā)明第一方面所述的脂質(zhì)體用于制備降低慢性乙型病毒性肝炎患者外周血血清中的乙型肝炎病毒滴度的藥物的用途。本發(fā)明第四方面涉及本發(fā)明第一方面所述的脂質(zhì)體用于制備降低慢性乙型病毒性肝炎患者外周血血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度的藥物的用途。本發(fā)明第五方面涉及本發(fā)明第一方面所述的脂質(zhì)體用于制備保持慢性乙型病毒性肝炎患者的t細胞受體庫穩(wěn)定的藥物的用途。本發(fā)明涉及的脂質(zhì)體選用最常用的磷脂(優(yōu)選大豆磷脂)和膽固醇構成磷脂雙分子層膜。其中，前者是主要的類脂質(zhì)成分，后者兼有穩(wěn)定磷脂雙分子層膜的作用。另外任選添加少量棕櫚酸和/或維生素e，前者能夠增加負電荷數(shù)量，增強脂質(zhì)體的結合能力，后者是為了防止磷脂氧化分解。在凍干過程中，甘露醇和人血白蛋白可作為凍干過程中的保護劑和賦形劑。在制備過程中使用的磷酸緩沖液(優(yōu)選ph6.5)可減緩磷脂的水解，并調(diào)節(jié)滲透壓至等滲。本發(fā)明具有以下有益效果：1.本發(fā)明的制劑脂質(zhì)體能夠大量制備，體外穩(wěn)定性好，能夠滿足慢性疾病患者長期治療、多次給藥的要求，而且制備過程簡便，易于操作。2.在針對慢性乙型病毒性肝炎患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的脂質(zhì)體治療后，可以有效地促使慢性乙型病毒性肝炎患者發(fā)生血清學轉(zhuǎn)換(抗hbe(乙型肝炎e抗體)轉(zhuǎn)陽、hbeag(乙型肝炎e抗原)轉(zhuǎn)陰)、降低患者外周血hbv病毒滴度并降低血清轉(zhuǎn)氨酶濃度，治療效果超過目前大部分用于治療hbv感染的主流藥物；同時，本發(fā)明的脂質(zhì)體作為免疫調(diào)節(jié)劑，能有效地維持ctl的tcr庫的穩(wěn)定性，提示該脂質(zhì)體本身可作為一種治療慢性乙型病毒性肝炎的理想藥物。3.本發(fā)明中脂質(zhì)體本身即可用于治療慢性乙型病毒性肝炎，無需攜帶其他藥物，并且作用效果好。附圖說明圖1中圖1a為通過透射電鏡(tem)觀察的本發(fā)明實施例1中制備的脂質(zhì)體的超微結構；圖1b為通過透射電鏡觀察的本發(fā)明實施例1中制備的每個脂質(zhì)體內(nèi)包含的脂質(zhì)雙層膜個數(shù)所對應的脂質(zhì)體個數(shù)的關系圖。圖2為通過激光粒度分析儀檢測的本發(fā)明實施例1中制備的脂質(zhì)體的粒徑分布。圖3中圖3a-3c分別為本發(fā)明實施例3中采用高通量測序定量分析慢性乙型病毒性肝炎患者接受本發(fā)明實施例1中制備的脂質(zhì)體治療(以下簡稱脂質(zhì)體治療組)前(第0周)后(第76周)、未經(jīng)治療的慢性乙型病毒性肝炎患者(以下簡稱未治療組)在第0周和第76周以及健康人在第0周和第76周的tcr庫的變化。各組分別選取一個代表性病例進行兩個時間點的tcr庫相關性比較，一個點代表一個t細胞克隆。通過比較發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體治療組患者在接受本發(fā)明的脂質(zhì)體治療之后，tcr庫譜發(fā)生變化(參見圖3a)。與未治療組患者的tcr庫多樣性持續(xù)下降(參見圖3b)相反,脂質(zhì)體治療組維持甚至擴展了個體整體的tcr庫多樣性；與未治療的健康人相比(參見圖3c)，脂質(zhì)體治療組有新的高豐度t細胞克隆出現(xiàn)，可能反映了脂質(zhì)體在患者體內(nèi)誘導了hbv特異性的cd8+ctl。圖3d為上述三個組前后兩個時間點的tcr庫克隆豐度相關性比較。以各t細胞克隆前后時間點的豐度(abundance)做相關性分析，得到相關系數(shù)。相關系數(shù)是用以反映變量之間相關程度的統(tǒng)計指標。在比較兩個時間點tcr庫的相關系數(shù)時，此變量就是各單個t細胞克隆在兩個tcr庫的表達量。兩個樣本間的tcr庫相關系數(shù)，即表示各t細胞克隆在兩個樣本間表達量的相似程度。值從-1到1，越接近于1，表示各t細胞克隆在兩個樣本間的表達量越接近；越接近于-1，表示t細胞克隆在兩個樣本間的表達量變化越大。圖3d更進一步證明脂質(zhì)體本身可以穩(wěn)定tcr庫，并可以長期維持針對hbv的優(yōu)勢t細胞免疫應答。具體實施方式為更好地理解本發(fā)明，下文將結合實施例對本發(fā)明進行詳細描述，但應理解的是，這些實施例僅為對本發(fā)明進行示例說明，而非意在限制本發(fā)明，在本發(fā)明的構思前提下對本發(fā)明的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。在本發(fā)明中，如無其他說明，則所有操作均在室溫、常壓實施。實施例1：脂質(zhì)體制備及性質(zhì)分析(1)脂質(zhì)體制備、濃縮及凍干：采用以下原料制備本實施例的脂質(zhì)體：大豆卵磷脂、膽固醇、棕櫚酸、維生素e、甘露醇(20％無菌水溶液)、人血白蛋白(濃度為20％的溶液)、乙醚、乙醇和磷酸鹽緩沖液(ph6.5，0.1mm)。采用高壓注射和二次乳化的方法制備脂質(zhì)體。將大豆卵磷脂14.1166g、膽固醇2.3202g、棕櫚酸0.4630g、維生素e0.8514g加入300ml乙醚中溶解；將上述溶液經(jīng)0.2μm微孔膜過濾至乳化瓶中，再加入300ml乙醇，形成乳化液(w/o)；將得到的上述乳化液注入14.4l水中，同時控制反應溫度為40℃并進行攪拌，二次形成乳化液(w/o/w)，隨著乙醚的揮發(fā)逐步形成脂質(zhì)體。通過超濾裝置濃縮和透析(透析倍數(shù)須達到200倍以上)，去除液體中可能游離的有機溶劑，獲得高濃度的脂質(zhì)體0.5l，即脂質(zhì)體濃縮液。然后將0.5l脂質(zhì)體濃縮液中加入20％甘露醇水溶液140ml，20％人血白蛋白30ml，30ml磷酸鹽緩沖液，充分混勻后，按1ml/瓶的規(guī)格進行分裝。凍干機預冷至8℃后，將上述樣品放入凍干機，降溫至-39℃過夜；依次開啟冷凝器、真空泵及加熱器，升華樣品中的有機溶劑和水分，最終得到白色疏松塊狀物；滅菌并包裝得到成品。(2)透射電鏡形態(tài)學觀察:將步驟(1)制備的脂質(zhì)體凍干成品用1ml無菌注射水重懸后，用0.22μm的聚碳酸酯膜濾器過濾除去雜質(zhì)，取100μl的脂質(zhì)體溶液，用pbs(ph6.5，0.1mm)稀釋到2ml，重懸脂質(zhì)體溶液，充分攪拌；用移液槍將制備的上述樣品滴于支持膜銅網(wǎng)上，晾干；打開透射電鏡，將載有樣品的銅網(wǎng)放入透射電鏡中進行觀察，放大倍數(shù)為×160000。結果如圖1所示，由圖1a可見，脂質(zhì)體成囊泡存在，大小相對均一，大部分小于100nm；由圖1b可見，大部分脂質(zhì)體含有2個雙層膜，少數(shù)含有4個或6個雙層膜。(3)激光粒度分析儀檢測脂質(zhì)體粒徑分布：運用馬爾文zen1690型激光粒度分析儀檢測制備的脂質(zhì)體粒徑分布。將步驟(1)制備的脂質(zhì)體凍干成品用1ml無菌注射水重懸后，用0.22μm的聚碳酸酯膜濾器過濾除去雜質(zhì)，取100μl的脂質(zhì)體溶液，用pbs(ph6.5，0.1mm)稀釋到2ml，充分攪拌；取1.2ml上述樣品加入樣品容器中進行檢測。如圖2所示，激光粒度分析儀的分析結果與透射電鏡結果類似，可見制備的脂質(zhì)體粒徑分布范圍為30-250nm，大部分處于50-100nm范圍內(nèi)，說明該脂質(zhì)體為納米級別。實施例2：脂質(zhì)體凍干賦形劑的選擇脂質(zhì)體的凍干與賦形：比較脂質(zhì)體濃縮液體積占比、不同的賦形劑(人血白蛋白、聚維酮k30)及其濃度對脂質(zhì)體凍干后外形收縮程度的影響，結果如表1所示。表1：脂質(zhì)體濃縮液體積占比和賦形劑及其濃度對凍干的影響注：*脂質(zhì)體濃縮液的體積占乳化液的體積百分比。由表1可以看出，在對脂質(zhì)體進行凍干時，當脂質(zhì)體濃縮體積是最終乳化液體積的25-50％，加入1％的人血白蛋白作為賦形劑可以保證脂質(zhì)體凍干后外形不發(fā)生收縮。實施例3：脂質(zhì)體在慢性乙型病毒性肝炎患者中的治療作用本實施例利用實施例1中制備的脂質(zhì)體成品，對篩選的慢性乙型病毒性肝炎患者進行治療，探索其在慢性乙型病毒性肝炎中的治療作用及效果。(1)受試對象的選擇：選擇慢性乙型病毒性肝炎患者119名作為受試對象。受試對象具體資料如下：(2)給藥方式：用上臂皮下注射方式給藥，每次給予900μg脂質(zhì)體成品；將脂質(zhì)體成品溶解在3ml無菌水中分別在治療的第0、4、8、12、20、28周皮下注射給藥6次。(3)療效評價：慢性乙型病毒性肝炎患者經(jīng)過本發(fā)明實施例1的脂質(zhì)體治療后，分別在第12、28、32、40、52、64、76周采集受試患者的外周血，分別檢測hbeag/抗hbe轉(zhuǎn)換率、血清hbv病毒滴度及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)濃度，評價脂質(zhì)體治療效果。①脂質(zhì)體治療后患者發(fā)生較高血清學轉(zhuǎn)換率：研究結束時，脂質(zhì)體治療組119例受試者中，有24例受試者發(fā)生hbeag/抗hbe血清學轉(zhuǎn)換(hbeag轉(zhuǎn)陰、抗hbe轉(zhuǎn)陽)，轉(zhuǎn)換率為20.2％(表2)。根據(jù)2016年美國肝病學會慢性乙型肝炎實踐指南中的數(shù)據(jù)(表3)，接受本發(fā)明的脂質(zhì)體治療后hbeag/抗hbe血清學轉(zhuǎn)換率僅次于長效干擾素，與恩替卡韋療效相當，優(yōu)于阿德福韋和拉米夫定，遠高于安慰劑。表2：脂質(zhì)體治療后患者hbeag/抗hbe血清轉(zhuǎn)換率表3:其他藥物治療后的hbeag/抗hbe血清學轉(zhuǎn)換率*拉米夫定安慰劑阿德福韋恩替卡韋長效干擾素轉(zhuǎn)換率16～21％4～6％12％21％27～32％*數(shù)據(jù)源于aasldguidelinesfortreatmentofchronichepatitisb,hepatology.2016；63(1):261-83。②脂質(zhì)體治療后患者血清hbv病毒滴度降低：受試患者接受本發(fā)明實施例1的脂質(zhì)體治療后，隨著時間的延長，外周血hbvdna載量呈逐漸下降趨勢(表4)。至研究開始后76周(治療結束第48周)，發(fā)生hbvdna載量下降大于等于2個對數(shù)級的受試者比例達到40.3％(48/119)，證明本發(fā)明的脂質(zhì)體有利于降低患者血清hbv病毒滴度。表4：脂質(zhì)體治療后血清hbvdna載量下降大于等于2個對數(shù)級的患者百分比③脂質(zhì)體治療后患者血清alt水平有較高的復常率：血清中的alt由肝臟細胞釋放，當肝臟細胞受損時，其釋放的alt增加，則外周血中的alt水平升高。受試患者接受本發(fā)明實施例1的脂質(zhì)體治療后，alt水平恢復正常范圍的比率(復常率)逐步升高(表5)，第4周為6.7％，第76周上升至34.5％(41/119)。因此表明接受本發(fā)明的脂質(zhì)體治療后，可以有效降低患者的血清alt水平，證明本發(fā)明的脂質(zhì)體可以減輕hbv感染所造成的肝臟損傷。表5：脂質(zhì)體治療后血清alt水平復常率(3)療效對比實驗：在對比實驗中，分別以未治療組和健康人組為對照組。在脂質(zhì)體治療組給予本發(fā)明實施例1的脂質(zhì)體前后，以及在兩個對照組與脂質(zhì)體治療組治療前后相對應的兩個時間點，分別采集、分離脂質(zhì)體治療組和兩個對照組人員的外周血單個核細胞，進行深度測序，進行tcr庫分析。圖3a-3c分別為脂質(zhì)體治療組、未治療組以及健康人組前后兩個時間點的tcr庫的變化。在脂質(zhì)體治療組中，通過監(jiān)測脂質(zhì)體治療前和脂質(zhì)體治療后76周的tcr庫來觀察脂質(zhì)體是否可以使t細胞長期存活。以各t細胞克隆前后時間點的豐度(abundance)做相關性分析，得到相關系數(shù)。由圖3d可以看出，脂質(zhì)體本身可以穩(wěn)定tcr庫，并可以長期維持針對hbv的優(yōu)勢t細胞免疫應答，在慢性乙型病毒性肝炎感染的治療中發(fā)揮重要作用。綜上，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)體自身在治療慢性乙型病毒性肝炎中具有良好的效果，該效果是出乎本領域技術人員所預料的。發(fā)明人推測本發(fā)明的脂質(zhì)體具有治療慢性乙型病毒性肝炎的用途原因可能有以下幾個方面：首先，脂質(zhì)體中的脂質(zhì)成分，如卵磷脂、腦磷脂、磷脂酰肌醇和溶血卵磷脂等，具有免疫調(diào)節(jié)作用，有益于慢性乙型病毒性肝炎的治療；其次，乙型肝炎病毒的抗原，如表面抗原本身含有大量脂質(zhì)成分，可與脂質(zhì)體發(fā)生膜融合，從而被包裹于脂質(zhì)體內(nèi)部；而脂質(zhì)體同樣可以與抗原呈遞細胞的細胞膜融合，從而將其攜帶的抗原釋放到細胞內(nèi)部，從而使該抗原通過mhci類分子途徑進行呈遞，有利于誘導ctl應答。雖然已參照特定實施方案對本發(fā)明進行了說明，但本領域技術人員應認識到的是，在不偏離本發(fā)明主旨和范圍的情況下，可對所述實施方案進行改變或改進，本發(fā)明范圍通過所附權利要求書限定。當前第1頁12