本發(fā)明屬于組織工程與再生醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有促再生功能的豬組織來(lái)源的用于修復(fù)胰腺組織的胰腺基質(zhì)水凝膠的制備方法和用途。

背景技術(shù)：

重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，sap)病情兇險(xiǎn)、進(jìn)展快、并發(fā)癥多，病死率高達(dá)30％。該病是由各種致病因素引起的胰腺腺泡損傷，觸發(fā)活性胰酶釋放入血，激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞而釋放大量炎性因子，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)與代償性抗炎反應(yīng)的失衡，其中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與激活在sap發(fā)生、發(fā)展和演進(jìn)過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。業(yè)已證實(shí)，巨噬細(xì)胞具有高度可塑性，可依賴(lài)局部微環(huán)境刺激產(chǎn)生促炎性巨噬細(xì)胞或抗炎性巨噬細(xì)胞。目前已有研究采用藥物調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能，然而其治療大多是全身給藥，藥物副作用大，臨床可操作性差。因此，尋找一種安全、有效、簡(jiǎn)便的調(diào)控巨噬細(xì)胞功能策略，恢復(fù)受損的胰腺功能，已成為臨床上亟需解決的問(wèn)題。

生物材料可調(diào)控巨噬細(xì)胞的命運(yùn)，研究證實(shí)支架材料的特性如形貌、彈性、孔隙度等均可影響巨噬細(xì)胞的表型。因此，研發(fā)具有促再生功能的材料已成為當(dāng)今生物材料發(fā)展的重要趨勢(shì)。在這方面，來(lái)源于天然組織/器官的胞外基質(zhì)(ecm)生物材料，鑒于其具有最接近天然的組織結(jié)構(gòu)、豐富的生物活性成分、組織特異的微環(huán)境以及低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已成為組織再生領(lǐng)域有應(yīng)用前景的生物材料。特別是其水凝膠形式，可通過(guò)微創(chuàng)注射的方法遞送到組織損傷部位，具有微創(chuàng)、安全、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)大大增強(qiáng)了其在臨床上的應(yīng)用潛力。然而，目前尚無(wú)關(guān)于胰腺基質(zhì)水凝膠制備及其用于胰腺再生的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題的至少一項(xiàng)，本發(fā)明提供一種解決現(xiàn)有胰腺組織工程材料在組分、結(jié)構(gòu)和力學(xué)彈性方面的不足，提供可適宜胰腺細(xì)胞生長(zhǎng)的天然微環(huán)境，以期達(dá)到促進(jìn)重癥胰腺炎胰腺組織的內(nèi)源性修復(fù)的用于修復(fù)胰腺組織的胰腺基質(zhì)水凝膠的制備方法和用途。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

豬胰腺基質(zhì)水凝膠在制備促進(jìn)胰腺修復(fù)的藥物中的用途。

進(jìn)一步地，豬胰腺基質(zhì)水凝膠在制備治療壞死性胰腺炎的藥物中的用途。

進(jìn)一步地，所述藥物為注射劑。

發(fā)明人通過(guò)將豬的胰腺組織制成豬胰腺基質(zhì)水凝膠，并將該物質(zhì)通過(guò)注射的方式注入成功造模的實(shí)驗(yàn)用sd大鼠的胰腺位置，24小時(shí)后，取材觀察其對(duì)胰腺損傷的修復(fù)情況表明，胰腺腺泡細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，組織病理學(xué)評(píng)分也表明，ecm組與sap相比評(píng)分明顯降低。從而，證實(shí)本發(fā)明對(duì)于胰腺損傷和胰腺炎癥等病癥具有較好的改善效果。

進(jìn)一步地，所述注射劑為含有豬脫細(xì)胞胰腺組織的鹽酸-胃蛋白酶溶液。

進(jìn)一步地，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有豬脫細(xì)胞胰腺組織8mg。

進(jìn)一步地，所述含有豬脫細(xì)胞胰腺組織的鹽酸-胃蛋白酶溶液的ph值為7.4。

一種用于修復(fù)胰腺組織的胰腺基質(zhì)水凝膠的制備方法，包括步驟：

b.豬胰腺基質(zhì)水凝膠的制備：

將脫細(xì)胞胰腺組織冷凍干燥后做成粉末，然后按比例與鹽酸-胃蛋白酶溶液混合，調(diào)節(jié)ph值至生理狀態(tài)，即得豬胰腺基質(zhì)水凝膠。

進(jìn)一步地，所述的用于修復(fù)胰腺組織的胰腺基質(zhì)水凝膠的制備方法，還包括步驟：

a.胰腺的脫細(xì)胞化：

(1)將胰腺組織切成薄片，并用生理鹽水漂洗，得到胰腺組織薄片；

(2)將所述胰腺組織薄片浸于含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液中攪拌，得到胰腺組織；

(3)將所述胰腺組織浸于tritonx-100溶液中攪拌至所述胰腺組織透明后，用生理鹽水漂洗后得到脫細(xì)胞胰腺組織。

進(jìn)一步地，所述步驟b中采用濃度為0.1mol/l氫氧化鈉溶液和10xpbs調(diào)節(jié)ph值至7.4；所述脫細(xì)胞胰腺組織與鹽酸-胃蛋白酶溶液的比例關(guān)系為：在調(diào)節(jié)ph值之前，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細(xì)胞胰腺組織的量為10mg；在調(diào)節(jié)ph值之后，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細(xì)胞胰腺組織的量為8mg。

進(jìn)一步地，所述鹽酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的質(zhì)量占所述鹽酸-胃蛋白酶溶液總重的1％，所述鹽酸-胃蛋白酶溶液中鹽酸的濃度為0.1mol/l；所述含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液中十二烷基硫酸鈉的重量占含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液總重的0.5％；所述tritonx-100溶液中tritonx-100的重量百分?jǐn)?shù)為1％。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是：本發(fā)明的胰腺基質(zhì)水凝膠不但具有溫敏性、低免疫原性及能提供最天然的細(xì)胞外微環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，而且操作工藝簡(jiǎn)單、實(shí)施條件溫和，為胰腺組織工程提供了一種新型水凝膠材料。該材料適宜于胰腺細(xì)胞的生長(zhǎng)，可調(diào)控巨噬細(xì)胞向抗炎性m2型極化，進(jìn)而促進(jìn)重癥胰腺炎胰腺組織的內(nèi)源性修復(fù)，因此有望發(fā)展為一種用于治療重癥急性胰腺炎藥物用途的產(chǎn)品，這對(duì)改進(jìn)重癥急性胰腺炎的臨床治療具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1he染色觀察脫細(xì)胞化的胰腺組織切片的脫細(xì)胞胰腺基質(zhì)圖像。

圖2免疫熒光染色觀察細(xì)胞外i型膠原保留情況圖像。

圖3免疫熒光染色觀察細(xì)胞外iv型膠原保留情況圖像。

圖4免疫熒光染色觀察細(xì)胞外層粘連蛋白保留情況圖像。

圖5免疫熒光染色觀察細(xì)胞外纖連蛋白保留情況圖像。

圖6本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠在常溫下的狀態(tài)示意圖。

圖7本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠在37℃下的狀態(tài)示意圖。

圖8he染色觀察本發(fā)明的豬胰腺胞外基質(zhì)(ecm)水凝膠與皮下組織的生物相容性圖像。

圖9用sd大鼠建立sap模型后其胰腺圖像。

圖10掃描電鏡下觀察本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠圖像。

圖11sap組胰腺組織he染色圖像。

圖12豬胰腺基質(zhì)水凝膠注射組胰腺組織he染色圖像。

圖13sap組免疫熒光染色觀察胰腺巨噬細(xì)胞m2型(cd68+/cd206+)極化情況圖。

圖14ecm組免疫熒光染色觀察胰腺巨噬細(xì)胞m2型(cd68+/cd206+)極化情況圖。

圖15sham組、sap組和ecm組的大鼠胰腺體重比(pancreas/bodyweight)對(duì)比示意圖。

圖16sham組、sap組和ecm組的淀粉酶(amylase)對(duì)比示意圖。

圖17sham組、sap組和ecm組的脂肪酶(lipase)對(duì)比示意圖。

圖18sham組、sap組和ecm組的髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)對(duì)比示意圖。

其中，上述圖中的sham組，sap組，ecm組分別表示：假手術(shù)組、重癥急性胰腺炎組、ecm水凝膠注射組；

其中，圖15-圖18中的*表示p<0.05，#表示p<0.01，p為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性指標(biāo)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)附圖結(jié)合實(shí)施例來(lái)描述說(shuō)明但不限制本發(fā)明。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以下僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些應(yīng)當(dāng)都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

0.5％十二烷基硫酸鈉/生理鹽水指的是十二烷基硫酸鈉的重量占含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液總重的0.5％。

豬胰腺基質(zhì)水凝膠在制備促進(jìn)胰腺內(nèi)源性修復(fù)的藥物中的用途。

進(jìn)一步地，豬胰腺基質(zhì)水凝膠在制備治療壞死性胰腺炎的藥物中的用途。

進(jìn)一步地，所述藥物為注射劑。

發(fā)明人通過(guò)將豬的胰腺組織制成豬胰腺基質(zhì)水凝膠，并將該物質(zhì)通過(guò)注射的方式注入成功造模的實(shí)驗(yàn)用sd大鼠的胰腺位置，24小時(shí)后，取材觀察其對(duì)胰腺損傷的修復(fù)情況表明，胰腺腺泡細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，組織病理學(xué)評(píng)分也表明，ecm組與sap相比評(píng)分明顯降低。從而，證實(shí)本發(fā)明對(duì)于胰腺損傷和胰腺炎癥等病癥具有較好的改善效果。

進(jìn)一步地，所述注射劑為含有豬脫細(xì)胞胰腺組織的鹽酸-胃蛋白酶溶液。

進(jìn)一步地，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有豬脫細(xì)胞胰腺組織8mg。

進(jìn)一步地，所述含有豬脫細(xì)胞胰腺組織的鹽酸-胃蛋白酶溶液的ph值為7.4。

一種用于修復(fù)胰腺組織的胰腺基質(zhì)水凝膠的制備方法，包括步驟：

b.豬胰腺基質(zhì)水凝膠的制備：

將脫細(xì)胞胰腺組織冷凍干燥后做成粉末，然后按比例與鹽酸-胃蛋白酶溶液混合，調(diào)節(jié)ph值至生理狀態(tài)，即得豬胰腺基質(zhì)水凝膠。

進(jìn)一步地，所述的用于修復(fù)胰腺組織的胰腺基質(zhì)水凝膠的制備方法，還包括步驟：

a.胰腺的脫細(xì)胞化：

(1)將胰腺組織切成薄片，并用生理鹽水漂洗，得到胰腺組織薄片；

(2)將所述胰腺組織薄片浸于含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液中攪拌，得到胰腺組織；

(3)將所述胰腺組織浸于tritonx-100溶液中攪拌至所述胰腺組織透明后，用生理鹽水漂洗后得到脫細(xì)胞胰腺組織。

進(jìn)一步地，所述步驟b中采用濃度為0.1mol/l氫氧化鈉溶液和10xpbs調(diào)節(jié)ph值至7.4；所述脫細(xì)胞胰腺組織與鹽酸-胃蛋白酶溶液的比例關(guān)系為：在調(diào)節(jié)ph值之前，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細(xì)胞胰腺組織的量為10mg；在調(diào)節(jié)ph值之后，每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細(xì)胞胰腺組織的量為8mg。

進(jìn)一步地，所述鹽酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的質(zhì)量占所述鹽酸-胃蛋白酶溶液總重的1％，所述鹽酸-胃蛋白酶溶液中鹽酸的濃度為0.1mol/l；所述含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液中十二烷基硫酸鈉的重量占含有十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液總重的0.5％；所述tritonx-100溶液中tritonx-100的重量百分?jǐn)?shù)為1％。

實(shí)施例1豬胰腺基質(zhì)水凝膠的制備

具體步驟如下:

(1)豬胰腺的脫細(xì)胞化:首先將豬胰腺組織切為約2毫米厚的薄片并用生理鹽水漂洗，然后將其浸沒(méi)于0.5％十二烷基硫酸鈉/生理鹽水中，室溫?cái)嚢?4小時(shí)；最后將其轉(zhuǎn)移于1％tritonx-100溶液，室溫?cái)嚢柚敝两M織透明，約需1小時(shí)，并用生理鹽水漂洗3-5次，每次15分鐘，去除殘余的洗滌劑。

(2)豬胰腺基質(zhì)水凝膠的制備:將低溫凍干的脫細(xì)胞胰腺組織，用粉碎機(jī)磨成粉末，然后按照10mg/ml比例加入鹽酸-胃蛋白酶溶液中，室溫緩慢攪拌至溶解狀態(tài)，通過(guò)加入0.1m氫氧化鈉和10xpbs調(diào)至生理狀態(tài)(ph＝7.4)，使水凝膠終濃度為8mg/ml，置于37℃下數(shù)分鐘即可成膠。

豬胰腺基質(zhì)水凝膠體內(nèi)移植治療：使用時(shí)，將上述制備的8mg/ml水凝膠懸液注射到sap大鼠胰腺組織內(nèi)，觀察其對(duì)胰腺損傷的修復(fù)情況。

實(shí)施例2豬胰腺基質(zhì)水凝膠在制備促進(jìn)胰腺內(nèi)源性修復(fù)的藥物中的用途

a、豬胰腺基質(zhì)水凝膠的制備和鑒定

(1)豬胰腺基質(zhì)水凝膠制備：取豬新鮮胰腺，剪去表面的脂肪組織和外膜，將豬胰腺組織切為約2毫米厚的薄片并用生理鹽水漂洗數(shù)次除去血細(xì)胞，然后將其浸沒(méi)于0.5％十二烷基硫酸鈉/生理鹽水中，室溫?cái)嚢?4小時(shí)；最后將其轉(zhuǎn)移于1％tritonx-100溶液，室溫?cái)嚢柚敝两M織透明，約需1小時(shí)，并用生理鹽水漂洗3-5次，每次15分鐘，去除殘余的洗滌劑。脫細(xì)胞化的胰腺儲(chǔ)存于-80℃。

(2)豬胰腺脫細(xì)胞鑒定：將脫細(xì)胞化的豬胰腺組織直接用組織包埋劑oct(tissueoct-freezemedium)包埋，做冰凍切片后，一方面用蘇木素和伊紅染色觀察細(xì)胞殘留情況，可見(jiàn)沒(méi)有細(xì)胞核殘留(圖1)；另一方面用免疫熒光染色觀察胞外基質(zhì)成分保留情況。根據(jù)圖2-圖5所示，所制備的豬胰腺脫細(xì)胞基質(zhì)保留了i型膠原、iv型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等主要細(xì)胞外基質(zhì)成分。

(3)將脫細(xì)胞的豬胰腺組織置于低溫凍干機(jī)上進(jìn)行干燥，用粉碎機(jī)將其磨成粉末，并在使用前通過(guò)暴露于環(huán)氧乙烷中16小時(shí)進(jìn)行滅菌。

(4)按照10mg/ml濃度(每毫升鹽酸-胃蛋白酶溶液中含有脫細(xì)胞胰腺組織的量為10mg)將上述胰腺脫細(xì)胞粉末溶解于鹽酸-胃蛋白酶溶液中，室溫緩慢攪拌至溶解狀態(tài)，超速離心除去未消化的大顆粒物，取上清液低溫儲(chǔ)存待用。

(5)通過(guò)加入0.1m氫氧化鈉和10xpbs調(diào)至生理狀態(tài)(ph＝7.4)，使水凝膠終濃度為8mg/ml，置于37℃數(shù)分鐘即可成膠，常溫下表現(xiàn)為液態(tài)(圖6)，當(dāng)置于37℃數(shù)分鐘即可成膠，如圖7所示，即為所制備的豬胰腺基質(zhì)水凝膠。如圖10所示，掃描電鏡檢測(cè)顯示豬胰腺基質(zhì)水凝膠呈現(xiàn)為多孔狀結(jié)構(gòu)，不同粗細(xì)豬胰腺基質(zhì)水凝膠纖維呈網(wǎng)狀分布。

b、豬胰腺基質(zhì)水凝膠生物相容性檢測(cè)

通過(guò)皮下注射本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠(采用現(xiàn)有的商業(yè)化的膠原水凝膠作對(duì)照)于大鼠腹股溝處，觀察其生物相容性，如圖8所示，he染色結(jié)果顯示膠原水凝膠組可見(jiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠材料可均勻分布于皮膚組織，沒(méi)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這表明本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠具有良好的組織相容性。

c、動(dòng)物的選擇和sap模型制備

本發(fā)明選擇sd大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)用sd大鼠(250-300g左右)，用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉后，行開(kāi)腹術(shù)，充分暴露胰腺，使用微量輸液泵以12ml/h速度逆行向胰膽管注入5％牛磺膽酸鈉溶液(0.1ml/100g大鼠體重)，維持10min后關(guān)腹。3小時(shí)后可以看到腹腔內(nèi)腹水形成和臟器造化斑形成，sap模型建立前后的sd大鼠胰腺對(duì)比圖如圖11和圖12所示，用sd大鼠建立sap模型后其胰腺圖像如圖9所示。

本發(fā)明中將sd大鼠分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將sd大鼠分成sham組，sap組和ecm組即假手術(shù)組、重癥急性胰腺炎組和ecm水凝膠注射組，分別觀察各個(gè)組內(nèi)sd大鼠的胰腺修復(fù)情況。

d、豬胰腺基質(zhì)水凝膠修復(fù)胰腺功能

(1)豬胰腺基質(zhì)水凝膠移植sap大鼠胰腺:通過(guò)胰腺內(nèi)多點(diǎn)注射于成功造模的sap大鼠，24后取材觀察其對(duì)胰腺損傷的修復(fù)情況，如圖14-16所示，ecm組與sap組相比，胰腺腺泡細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，組織病理學(xué)評(píng)分也表明，ecm組與sap相比評(píng)分明顯降低。這表面本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠對(duì)胰腺損傷具有較好的修復(fù)能力。

(2)豬胰腺基質(zhì)水凝膠可調(diào)控巨噬細(xì)胞m2型極化:通過(guò)對(duì)比圖13和圖14，通過(guò)免疫染色檢測(cè)胰腺組織內(nèi)巨噬細(xì)胞表型，結(jié)果顯示該水凝膠移植sap模型后，如圖14所示，損傷部位可見(jiàn)大量的m2巨噬細(xì)胞(cd68/cd206)出現(xiàn)，這表明本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠可通過(guò)提供天然胰腺組織微環(huán)境進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞m2型極化。

(3)豬胰腺基質(zhì)水凝膠可改善胰腺功能：如圖15-18所示，胰腺基質(zhì)水凝膠移植后，可見(jiàn)大鼠胰腺體重比降低(圖15)，elisa檢測(cè)血清胰酶、脂肪酶和mpo的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與sap組比較，ecm組血清胰酶、脂肪酶和mpo水平顯著降低(圖16-18)，這表明本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠降低了胰腺的損傷程度，改善了胰腺功能。從而，本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠能夠促進(jìn)胰腺的修復(fù)。

綜上，本發(fā)明的豬胰腺基質(zhì)水凝膠能夠應(yīng)用在制備促進(jìn)胰腺內(nèi)源性修復(fù)的藥物中。具體地，本發(fā)明的胰腺基質(zhì)水凝膠能夠應(yīng)用于治療重癥急性胰腺炎的藥物中。較佳地，所述重癥急性胰腺炎為急性壞死性胰腺炎。所述液態(tài)水凝膠為豬胰腺來(lái)源的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述水凝膠具有溫敏性，可通過(guò)注射的方式輸送到胰腺受損部位，在體溫即可轉(zhuǎn)變?yōu)樗z形式，其不但可為受損的胰腺細(xì)胞提供接近天然的胰腺組織微環(huán)境，而且巨噬細(xì)胞也可響應(yīng)微環(huán)境的改變而向抗炎性巨噬細(xì)胞極化，因此該水凝膠降低了炎性介質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而改進(jìn)了胰腺功能。

根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的記載即可較好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案。