本發(fā)明涉及醫(yī)用配品，具體涉及穿心蓮內(nèi)酯新的藥物用途。

背景技術(shù)：

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，以下簡(jiǎn)稱andro)，天然植物穿心蓮的主要有效成份，具有祛熱解毒，消炎止痛之功效，對(duì)細(xì)菌性與病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊療效，被譽(yù)為天然抗生素藥物。體外實(shí)驗(yàn)證明：穿心蓮對(duì)培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞dna合成有抑制作用。目前，尚沒有實(shí)驗(yàn)證明穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)用藥對(duì)腫瘤有抑制作用。也尚沒有穿心蓮內(nèi)酯可增強(qiáng)博來(lái)霉素抗腫瘤療效以及降低其毒副作用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

化療是目前最常用的治療腫瘤的方式，博來(lái)霉素(bleomycin，以下簡(jiǎn)稱blm)是一種比較常見的臨床化療藥物。blm，一種來(lái)自于輪枝鏈霉菌的糖肽抗生素，廣譜抗腫瘤藥物，能有效對(duì)抗各種癌癥如淋巴瘤，睪丸腫瘤，食管癌和鱗狀細(xì)胞癌，淋巴瘤，睪丸腫瘤和惡性胸腔積液等。blm作為臨床抗腫瘤藥物最大的優(yōu)勢(shì)是，其在抗腫瘤的同時(shí)沒有明顯的骨髓抑制作用，同時(shí)對(duì)機(jī)體的免疫功能也沒有抑制作用。然而，同大多數(shù)化療藥物一樣，blm也有不容忽視的副作用：長(zhǎng)期使用blm會(huì)導(dǎo)致肺炎樣癥狀及肺纖維化癥狀，因而長(zhǎng)期使用博來(lái)霉素治療腫瘤也是非常危險(xiǎn)的。目前大多數(shù)的化療藥物都有不同程度的骨髓抑制及免疫抑制副作用，所以作為沒有這兩項(xiàng)缺點(diǎn)的化療藥物blm在臨床應(yīng)用上還是很有前景的。但現(xiàn)在還沒有能降低博來(lái)霉素肺纖維化這一毒副作用的技術(shù)手段和有效藥物。因此尋找一種能降低blm肺纖維化副作用的藥物是很急迫的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供穿心蓮內(nèi)酯的新用途，即穿心蓮內(nèi)酯在制藥中的新用途。

具體地說(shuō)，上述穿心蓮內(nèi)酯在制藥中的新用途是，穿心蓮內(nèi)酯在制備提高博來(lái)霉素抗腫瘤效果的藥物中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述藥物中穿心蓮內(nèi)酯的重量百分比含量為76.92％-86.96％。

上述應(yīng)用中，所述的藥物為注射劑或常見的口服劑。

本發(fā)明所述的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備,即將有效成分與醫(yī)學(xué)上可接受的輔料混合制成常規(guī)的藥物制劑，如片劑、膠囊、注射液、粉針劑或滴丸。

本發(fā)明的有益效果是，我們通過(guò)采用h22細(xì)胞(2×10⁶cells/只)對(duì)昆明小鼠造腹水瘤模型，采用灌胃給予不同濃度andro溶液、腹腔注射blm溶液(15mg/kg)以及聯(lián)合給藥來(lái)治療h22腹水瘤小鼠，從而評(píng)價(jià)andro是否能夠提高blm腫瘤效果。實(shí)驗(yàn)一通過(guò)andro、blm以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠腹水體積的影響以及檢測(cè)腹水中腹水瘤細(xì)胞的凋亡率來(lái)證明andro是否能夠增強(qiáng)blm的抗腫瘤作用；實(shí)驗(yàn)二通過(guò)對(duì)andro、blm以及兩者聯(lián)合處理過(guò)的腹水瘤小鼠的肺組織做組織病理學(xué)檢查以檢測(cè)肺纖維化程度，來(lái)證明andro是否具有肺保護(hù)作用，即能夠減輕blm誘導(dǎo)的肺纖維化。通過(guò)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察andro能否增強(qiáng)blm治療腫瘤的作用以及減輕blm引起肺纖維化的副作用。

結(jié)果表明andro和blm聯(lián)合用藥有效地改觀了腹水瘤小鼠的精神狀態(tài)，減少了腹水瘤小鼠的腹圍直徑、腹水量，提高了小鼠腹水瘤細(xì)胞的凋亡率，顯著地增強(qiáng)了博來(lái)霉素的抗腫瘤效果。同時(shí)通過(guò)對(duì)組織切片的觀察顯示，andro和blm聯(lián)合用藥能有效改善blm對(duì)肺部組織造成的肺炎樣癥狀及肺纖維化癥狀，對(duì)肺組織有保護(hù)作用。預(yù)示著andro可以提高blm的抗腫瘤效果，顯示了其在制備提高blm抗腫瘤效果藥物中的良好前景。

以下具體實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了andro與blm聯(lián)合應(yīng)用過(guò)程中andro的增強(qiáng)blm的抗腫瘤作用，表明了本發(fā)明的有益效果。其中andro為本實(shí)驗(yàn)教研室自主制成的粉劑。

一.andro增強(qiáng)blm的抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)。

1.1實(shí)驗(yàn)材料

雄性昆明(km)小鼠(18-22g)購(gòu)自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(證書號(hào)scxk2013-0085)98％的穿心蓮內(nèi)酯購(gòu)自于美國(guó)的sigma-aldrich公司，博來(lái)霉素購(gòu)自于日本化藥有限公司，h22細(xì)胞，獲自americantypeculturecollection(rockville，md，usa)，胎牛血清(fbs)和rpmi1640培養(yǎng)基購(gòu)自gibco(grandisland，ny，us)，磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，青霉素和鏈霉素由hyclone(logan，utah，us)提供。

1.2實(shí)驗(yàn)分組

取spf級(jí)18～22g的雄性km小鼠10只做正常組，腹腔注射生理鹽水，剩下的84只雄性km小鼠采用h22細(xì)胞(2×10⁶cells/只)給小鼠腹腔注射法造腹水瘤模型。5天后挑選80只造模成功的腹水瘤小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、blm組、andro低劑量組(andro-l)、andro中劑量組(andro-m)、andro高劑量組(andro-h)、andro-l+blm組、andro-m+blm組、andro-h+blm組。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

分組后開始給藥，blm組腹腔注射blm溶液(15mg/kg，用生理鹽水配制)，andro-l、andro-m、andro-h組分別灌胃andro溶液(用cmc-na配制，濃度依次為25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)，andro-l+blm、andro-m+blm、andro-h+blm組分別腹腔注射blm溶液(15mg/kg)聯(lián)合灌胃andro溶液(濃度依次為25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)，正常組和模型對(duì)照組灌胃給藥cmc-na，每天一次，連續(xù)給藥7天，最后一次給藥24小時(shí)后處死，收集腹水和肺組織。

1.4檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.4.1觀察各組小鼠的一般狀態(tài)

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天觀察各組小鼠飲食、毛發(fā)、精神狀態(tài)和體型的變化等。

1.4.2觀察各組小鼠體質(zhì)量和腹圍變化以及死亡情況。

自接種之日起，每日定時(shí)監(jiān)測(cè)9組小鼠體重、腹圍和死亡狀況并記錄，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，繪制表格。

1.4.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠腹水中的腹水瘤細(xì)胞的凋亡率

處死小鼠，收集好腹水，在4℃，3000rpm的條件下離心3分鐘，然后用pbs洗滌2次，使用0.2％臺(tái)盼藍(lán)分析細(xì)胞活力染色并由countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)，收獲細(xì)胞。所有組的細(xì)胞離心并用冰冷的pbs洗滌兩次，然后重懸于結(jié)合緩沖液中。最后，將細(xì)胞進(jìn)行膜聯(lián)蛋白v-fitc-碘化丙啶(pi)雙染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。測(cè)定數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配置的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的總和代表細(xì)胞調(diào)亡率。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用spss17.0forwindows統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間差異比較用方差分析，以p<0.05為差異有顯著性。

1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.6.1各組小鼠生活狀態(tài)

接種5天后空白對(duì)照組和穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)用藥的低中高組小鼠體重均迅速增加，隨后逐漸出現(xiàn)精神萎靡不振、呆滯少動(dòng)、步態(tài)不穩(wěn)，反應(yīng)性差，進(jìn)水進(jìn)食減少，晚期腹部膨隆，呈惡液質(zhì)狀態(tài)。穿心蓮內(nèi)酯與博來(lái)霉素聯(lián)合組除了低劑量組體重增加較快，精神萎靡之外其余兩組體重增加較慢，精神較好。

1.6.2各組小鼠的體重、腹圍和腹水體積情況

與模型組相比，blm組，andro-l+blm組、andro-m+blm組和andro-h+blm組的體重和腹圍均有顯著性差異(p<0.01),andro-l組、andro-m組和andro-h組的體重和腹圍均沒有顯著性差異(p>0.05)。與blm組相比，andro-l+blm組(p<0.05)、andro-m+blm組和andro-h+blm組(p<0.01)的腹圍均有顯著性差異。詳見下表1、表2：

表1：實(shí)驗(yàn)小鼠體重(g)變化表

a：p＜0.05，aa：p＜0.01，與空白組比較；b：p＜0.05，bb：p＜0.01，與模型組比較；c：p＜0.05，與blm組比較

表2：實(shí)驗(yàn)小鼠腹圍直徑(mm)表

a：p＜0.05，aa：p＜0.01，與空白對(duì)照組比較；b：p＜0.05，bb：p＜0.01，與模型組比較；c：p＜0.05，cc：p＜0.01，與blm組比較

與模型組相比，blm組(p＜0.05)，andro-l+blm組、andro-m+blm組和andro-h+blm組(p＜0.01)的腹圍均有顯著性差異。與blm組相比andro-m+blm組和andro-h+blm組的腹圍均有顯著性差異(p＜0.05)。詳見圖1。

結(jié)果表明，blm和andro聯(lián)合用藥能顯著降低腹水瘤小鼠的體重、腹圍和腹水體積。

1.6.3各組小鼠的腹水瘤細(xì)胞的凋亡率

與模型組相比，blm組和blm+andro組腹水瘤細(xì)胞凋亡率明顯上升(p<0.01)并且小鼠腹水瘤細(xì)胞的凋亡率會(huì)隨著andro劑量的增加而提高；與blm組相比，andro-h+blm組的腹水瘤細(xì)胞凋亡率有了明顯的提高(p<0.05)。結(jié)果顯示，blm和andro聯(lián)合用藥能顯著提高小鼠腹水瘤細(xì)胞的凋亡率。詳見圖2。

二.穿心蓮內(nèi)酯減輕blm誘導(dǎo)的肺炎樣癥狀及肺纖維化實(shí)驗(yàn)

2.1實(shí)驗(yàn)分組

同andro增強(qiáng)blm的抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)中的1.2。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

所用的肺組織來(lái)源于andro增強(qiáng)blm的抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)中的1.3收集保存的肺組織。將小鼠的肺組織標(biāo)本快速用生理鹽水洗凈，用10％的福爾馬林固定肺組織，肺組織用常規(guī)組織技術(shù)加工并用石蠟進(jìn)行包埋。將用石蠟包埋的樣品切成5mm厚的切片，放在載玻片上，用蘇木精和伊紅進(jìn)行染色，進(jìn)行病理學(xué)觀察；用masson三色染色法對(duì)膠原沉積進(jìn)行染色，通過(guò)特征藍(lán)色進(jìn)行識(shí)別。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)肺損傷：肺泡充血程度、肺泡壁的厚度以及肺泡的增大程度，實(shí)質(zhì)中結(jié)締組織的增生程度，膠原沉積和炎癥。組織病理學(xué)損傷以0-4的標(biāo)度評(píng)分(0代表正常，沒有損傷，1為25％，輕度損傷，2為25-50％，中度損傷，3為50-75％，重度損傷，4為75-100％，極度損傷)。根據(jù)4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的得分的綜合對(duì)肺損傷進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。根據(jù)肺損傷的程度判斷andro是否能減輕blm誘導(dǎo)的肺炎樣癥狀及肺纖維化。

2.3統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用spss17.0forwindows統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間差異比較用方差分析，以p<0.05為差異有顯著性。

2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示正常組(圖3a1，b1)和模型組(圖3a2，b2)的肺部組織切片無(wú)明顯病理變化，能觀察到正常的支氣管和肺泡以及少量的膠原沉積；blm組(圖3a3，b3)的肺部組織切片病理變化明顯，肺泡壁變厚，肺泡和血管充血，血管外周細(xì)胞和支氣管細(xì)胞出現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)，肺纖維化和膠原沉積，肺損傷嚴(yán)重程度高；andro-l+blm組(圖3a4，b4)、andro-m+blm組(圖3a5，b5)和andro-h+blm組(圖3a6，b6)的病理狀況較blm組逐步減弱，肺損傷嚴(yán)重程度依次下降。圖3的柱狀圖顯示:和正常組相比，blm組的肺損傷嚴(yán)重程度最高(p<0.01)；和blm組相比，andro-l+blm組、andro-m+blm組和andro-h+blm組的肺損傷嚴(yán)重程度均有明顯降低(p<0.01)，并且肺損傷嚴(yán)重程度隨andro的劑量的增加而減弱。證明了andro能減輕blm誘導(dǎo)的肺炎樣癥狀及肺纖維化。

附圖說(shuō)明

圖1為blm以及blm和andro聯(lián)合用藥組的小鼠腹水體積柱狀圖。

圖2為blm以及andro和blm聯(lián)合用藥對(duì)小鼠腹水瘤細(xì)胞凋亡率的影響的效果圖，其中，a圖為流式細(xì)胞儀結(jié)果圖，b圖為腫瘤細(xì)胞凋亡率柱狀圖。

圖3為blm以及andro和blm聯(lián)合用藥對(duì)小鼠肺組織的影響的效果圖，其中，上部為肺組織免疫組化顯微照片，下部為肺損傷等級(jí)柱狀圖。

具體實(shí)施方式

按照醫(yī)藥工業(yè)中已知的方法，將andro作為blm的聯(lián)合增效減毒作用的藥物，與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑相混合，制成不同劑型的藥物組合物。包括口服藥劑或注射藥劑，所述口服藥劑可以為滴丸、軟膠囊等；所述注射藥劑可以為注射用乳劑，注射乳劑可為靜脈注射用乳劑、肌肉注射用乳劑或皮下注射用乳劑。

以下實(shí)施例并不表示本發(fā)明只限于該實(shí)施例。

實(shí)施例1(自乳化軟膠囊)

穿心蓮內(nèi)酯5g,加入500ml的油相(油酸乙酯5ml)、乳化劑(吐溫-8027ml)和助乳化劑(正丁醇18ml),用超聲波使其溶解,所得的溶液與明膠經(jīng)自動(dòng)旋轉(zhuǎn)軋囊機(jī)壓制成軟膠囊,5mg/粒，即可口服與blm聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤治療。

實(shí)施例2(滴丸)

穿心蓮內(nèi)酯150g，取等量的聚乙二酵6000、聚乙二酵4000,混合均勻，加熱熔解，加入穿心蓮內(nèi)酯，混勻，滴制成丸，包薄膜衣，即可口服與blm聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤治療。