本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及含人干細(xì)胞因子的皮膚修復(fù)液及其制備方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病對(duì)患者最大的威脅來自其慢性并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜病變、糖尿病性腎病、糖尿病神經(jīng)病變和反復(fù)的皮膚感染。其中反復(fù)的皮膚感染體現(xiàn)在經(jīng)久不愈的創(chuàng)面及皮膚自發(fā)潰瘍，這不僅困擾著臨床醫(yī)生，也是醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題。糖尿病慢性并發(fā)癥已成為糖尿病患者致殘和致死的主要原因，也是醫(yī)療費(fèi)用增加的主要因素，帶給患者無可磨滅的痛苦。
目前，傳統(tǒng)的創(chuàng)傷修復(fù)材料對(duì)普通的皮膚創(chuàng)傷具有很好的治療作用，但是對(duì)于糖尿病導(dǎo)致的創(chuàng)面經(jīng)久不愈治療作用不大。一方面是因?yàn)樘悄虿∑つw創(chuàng)傷會(huì)有持續(xù)的炎癥反應(yīng)，普通的創(chuàng)傷修復(fù)材料沒有能夠很好的抑制炎癥反應(yīng)；另一方面是，在選用細(xì)胞因子聯(lián)合生物材料治療重癥皮膚創(chuàng)傷時(shí)，由于細(xì)胞因子在水溶液中的不穩(wěn)定性，易失去活性，導(dǎo)致療效不高。
近年來，隨著組織工程學(xué)研究的不斷深入，干細(xì)胞及其分泌物受到前所未有的重視。它可以透過皮膚表層細(xì)胞阻礙而被深層皮膚細(xì)胞所吸收，有效激活基底層的、不再分化的原始干細(xì)胞，增強(qiáng)皮膚細(xì)胞的分裂增殖能力和新陳代謝功能，所以干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的應(yīng)用為糖尿病引發(fā)的反復(fù)的皮膚感染的愈合提供了可能。
目前還未有將干細(xì)胞生長(zhǎng)因子用于糖尿病皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一種含人干細(xì)胞因子的皮膚修復(fù)液及其制備方法，其對(duì)糖尿病引起的皮膚反復(fù)感染、創(chuàng)面經(jīng)久不愈具有很好的療效。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：含人干細(xì)胞因子的皮膚修復(fù)液，由以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分組成：人干細(xì)胞因子1.0×10-3～0.1％、穩(wěn)定劑1～5％、莎梵婷40～80％、聚乙二醇4005～20％和水余量。
進(jìn)一步地，所述皮膚修復(fù)液由以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分組成：人干細(xì)胞因子3.0×10-3～0.08％、穩(wěn)定劑2～5％、莎梵婷50～80％、聚乙二醇4005～10％和水余量。
進(jìn)一步地，所述穩(wěn)定劑由以下濃度的組分組成：人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞碎片0.5～3mg/ml、牛磺酸2～6mg/ml和α-酮戊二酸1×10-3～5×10-3mol/l。
進(jìn)一步地，所述穩(wěn)定劑由以下濃度的組分組成：人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞碎片1～2mg/ml、?；撬?～4mg/ml和α-酮戊二酸2×10-3～5×10-3mol/l。
進(jìn)一步地，所述穩(wěn)定劑由以下濃度的組分組成：人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞碎片1.5mg/ml、?；撬?.5mg/ml和α-酮戊二酸3.5×10-3mol/l。
進(jìn)一步地，所述人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞碎片由以下步驟制得：
s1、胎盤標(biāo)本處理：取健康母體胎盤，檢驗(yàn)檢疫合格后，將胎盤組織進(jìn)行組織消化，得細(xì)胞懸液；
s2、不連續(xù)percoll梯度密度分離：在50ml離心管中逐層鋪入7個(gè)密度的percoll分離液，每個(gè)密度5ml，再緩緩加入5ml細(xì)胞懸液，使用水平離心機(jī)室溫下1200g離心20min，小心棄除離心管20ml刻度以上的液體，收集12.5～20.0ml刻度的細(xì)胞層和12.5～7.5ml刻度的液體，分別放入不同離心管里，用d-hank’s液稀釋5倍后，室溫下1000g離心15min；
s3、純化：用含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清(fbs)的dmem/f12、丙酮酸鹽、10毫克/升亞硒酸鈉胰島素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/ml的bfgf配制成懸浮液，將密度梯度離心后的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行重懸，用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞后計(jì)數(shù)；
s4、傳代與鑒定：將上述滋養(yǎng)細(xì)胞接種于加入含有體積分?jǐn)?shù)15％fbs的dmem/f12培養(yǎng)液，放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％的co2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3d補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液，按1×104cell/cm2傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液換為體積分?jǐn)?shù)10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基，細(xì)胞代數(shù)記為p1代，待細(xì)胞達(dá)到70～90％融合后，消化，按1×104cell/cm2傳代培養(yǎng)，細(xì)胞代數(shù)記為p2代，收集p2代細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀鑒定，鑒定符合要求后使用d-hank′s平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，離心粉碎，即得。
進(jìn)一步地，所述的皮膚修復(fù)液為液體制劑。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種制備上述的皮膚修復(fù)液的方法，包括以下步驟：
將聚乙二醇400和莎梵婷混合均勻后，加入穩(wěn)定劑，渦旋混勻后，加入人干細(xì)胞因子水溶液，不斷渦旋使其形成均一穩(wěn)定的溶液，即得。
本發(fā)明另一目的在于提供上述的含有干細(xì)胞因子的皮膚修復(fù)液在促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的用途。
人干細(xì)胞因子在水溶液中不穩(wěn)定，易失去活性，影響療效。發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)積累和大量的試驗(yàn)研究，終于得到一種優(yōu)良的穩(wěn)定劑，其由人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞碎片、?；撬岷挺?酮戊二酸組成。試驗(yàn)證明，加入該穩(wěn)定劑后，在4℃保存30天后，本發(fā)明皮膚修復(fù)液中的干細(xì)胞因子仍然可以刺激hdf細(xì)胞(人真皮成纖維細(xì)胞)細(xì)胞增殖，其療效仍然保持良好，而令人意想不到的是，不加入穩(wěn)定劑的修復(fù)液在同樣的環(huán)境下保存后，干細(xì)胞因子的活性有明顯下降。
本發(fā)明的修復(fù)液中通過進(jìn)一步地加入莎梵婷，可以減少聚乙二醇的用量，降低其對(duì)藥物活性的影響，同時(shí)莎梵婷是一種新型的環(huán)脂肽類生物表面活性劑，分子式為c53h93n7o13，其能夠促進(jìn)各有效成分與皮膚的貼合，促進(jìn)皮膚對(duì)活性成分的吸收，從而進(jìn)一步提升療效。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1)本發(fā)明皮膚修復(fù)液主要活性成分為人干細(xì)胞因子，對(duì)糖尿病皮膚創(chuàng)傷修復(fù)就有很好的愈合作用，其體系穩(wěn)定，可持續(xù)長(zhǎng)久地發(fā)揮療效。
2)經(jīng)試驗(yàn)證明，含有穩(wěn)定劑的皮膚修復(fù)液在4℃保存30天后，皮膚修復(fù)液中的干細(xì)胞因子仍然可以刺激hdf細(xì)胞(人真皮成纖維細(xì)胞)細(xì)胞增殖，而不加入穩(wěn)定劑的修復(fù)液在同樣的環(huán)境下保存后，干細(xì)胞因子的活性有明顯下降。
3)本發(fā)明進(jìn)一步地加入莎梵婷，一方面能夠減少聚乙二醇的用量，降低其對(duì)藥物活性的影響，另一方面莎梵婷能夠促進(jìn)各有效成分與皮膚的貼合，促進(jìn)皮膚對(duì)活性成分的吸收，提升療效。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下實(shí)施例。
人干細(xì)胞因子購自于江蘇普羅賽生物技術(shù)有限公司。
實(shí)施例1、人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞碎片的制備
(1)胎盤標(biāo)本處理：從廣東省廣州市三甲醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)臺(tái)獲得足月、剖宮產(chǎn)、健康母體胎盤，經(jīng)檢驗(yàn)檢疫合格后(證實(shí)無hiv、hbv等傳染性疾病)，在無菌條件下剝除母體蛻膜，剪取小塊胚胎蛻膜側(cè)胎盤組織，放入含抗生素的d-hank′s液中，洗盡血液，剔除血管，并剪成1.0～2.0mm3小塊，用含質(zhì)量百分比0.25％的胰蛋白酶和質(zhì)量百分比0.02％edta的消化液消化，得細(xì)胞懸浮液；
(2)不連續(xù)percoll梯度密度分離：在50ml離心管中逐層鋪入7個(gè)密度的percoll分離液，每個(gè)密度5ml，再緩緩加入5ml細(xì)胞懸液，使用水平離心機(jī)室溫下1200g離心20min，小心棄除離心管20ml刻度以上的液體，收集12.5～20.0ml刻度的細(xì)胞層和12.5～7.5ml刻度的液體；在離心管15～20ml刻度處可見明顯的白色云霧狀細(xì)胞層，此處對(duì)應(yīng)的percoll相對(duì)密度為1.046～1.059，是滋養(yǎng)細(xì)胞存在的區(qū)域；離心管10ml刻度附近可見不明顯的細(xì)胞層，此處密度為1.072，是淋巴細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞存在的區(qū)域；分別放入不同離心管里，用d-hank’s液稀釋5倍后，室溫下1000g離心15min，離心管底可見白色細(xì)胞團(tuán)；
(3)純化：用含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清(fbs)的dmem/f12、丙酮酸鹽、10毫克/升亞硒酸鈉胰島素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/ml的bfgf配制成懸浮液，將密度梯度離心后的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行重懸，用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞后計(jì)數(shù)，獲得的滋養(yǎng)細(xì)胞量可達(dá)6.15)×108個(gè)；
(4)傳代與鑒定：將上述滋養(yǎng)細(xì)胞接種于加入含有體積分?jǐn)?shù)15％fbs的dmem/f12培養(yǎng)液放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％的co2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3d補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液，按1×104cell/cm2傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液換為體積分?jǐn)?shù)10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基，細(xì)胞代數(shù)記為p1代；待細(xì)胞達(dá)到70～90％融合后，消化，按1×104cell/cm2傳代培養(yǎng)，細(xì)胞代數(shù)記為p2代，收集p2代細(xì)胞；通過流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原，檢測(cè)結(jié)果顯示得到的細(xì)胞與人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞特征一致，說明分離培養(yǎng)細(xì)胞為人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；使用d-hank′s平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，離心粉碎，即得。
本發(fā)明實(shí)施例2～4修復(fù)液配方及用量
制備方法：
將聚乙二醇400和莎梵婷混合均勻后，加入穩(wěn)定劑，渦旋混勻后，加入人干細(xì)胞因子水溶液，不斷渦旋使其形成均一穩(wěn)定的溶液，即得。
對(duì)比例1、含人干細(xì)胞因子的皮膚修復(fù)液
對(duì)比例1與實(shí)施例2的區(qū)別在于：用十二烷基硫酸鈉替換莎梵婷，其余參數(shù)及操作如實(shí)施例2。
對(duì)比例2、含人干細(xì)胞因子的皮膚修復(fù)液
對(duì)比例2與實(shí)施例2的區(qū)別在于：莎梵婷的用量為82％，其余參數(shù)及操作如實(shí)施例2。
試驗(yàn)一、本發(fā)明修復(fù)液促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)傷修復(fù)試驗(yàn)
1.1試驗(yàn)材料：南京大學(xué)模式動(dòng)物中心提供的c57bks.cg-m+/+leprdb基因型ⅱ型糖尿病小鼠60只。
1.2皮膚損傷模型的建立：先用脫毛膏將小鼠背部雙側(cè)毛發(fā)脫除，再用皮膚打孔器在雙側(cè)做8mm的圓形全層皮膚切除傷口。
1.3試驗(yàn)分組和給藥方法：取上述皮膚損傷模型的小鼠60只，隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組(10只，不加任何處理)、陽性對(duì)照組(10只，涂抹中國(guó)專利申請(qǐng)cn106492269a所述溫敏水凝膠)、實(shí)施例2組(10只，傷口處涂抹實(shí)施例2皮膚修復(fù)液)、實(shí)施例3組(10只，傷口處涂抹實(shí)施例3皮膚修復(fù)液)、對(duì)比例1組(10只，傷口處涂抹對(duì)比例1皮膚修復(fù)液)和對(duì)比例2組(10只，傷口處涂抹對(duì)比例2皮膚修復(fù)液)。
1.4統(tǒng)計(jì)結(jié)果：給藥后每天觀察創(chuàng)口愈合情況，并統(tǒng)計(jì)愈合率，結(jié)果如表1所示。
表1試驗(yàn)結(jié)果
注：與對(duì)照組相比，**p＜0.01，*p＜0.05。
從表1可以明顯看出，涂抹本發(fā)明實(shí)施例2～4皮膚修復(fù)液后第7天愈合率較對(duì)照組明顯顯著(**p＜0.01)，尤其是涂抹后第14天，愈合率達(dá)到了90％以上，而對(duì)照組僅僅為50％左右，并且所有試驗(yàn)小鼠均存活至試驗(yàn)完成。
對(duì)比例1組為各組愈合率最差，這說明，與常規(guī)的表面活性劑十二烷基硫酸鈉相比，莎梵婷更適于應(yīng)用于本發(fā)明修復(fù)液體系。
對(duì)比例2組愈合率較實(shí)施例2組有所下降，這說明，莎梵婷的用量對(duì)本發(fā)明修復(fù)液的療效也有一定的影響。
從陽性對(duì)照組試驗(yàn)結(jié)果可以看出，現(xiàn)有的創(chuàng)傷修復(fù)產(chǎn)品對(duì)糖尿病皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的治療作用不大。
試驗(yàn)二、不同穩(wěn)定劑組成對(duì)皮膚修復(fù)液穩(wěn)定性的影響
按下表2設(shè)置不同穩(wěn)定劑組成制備得到各皮膚修復(fù)液，將各皮膚修復(fù)液置于4℃的條件下儲(chǔ)藏5d、15d、30d后收集各組細(xì)胞因子，洗凈，備用；檢測(cè)各皮膚修復(fù)液中干細(xì)胞因子的生物活性。
試驗(yàn)方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)hdf細(xì)胞(人真皮成纖維細(xì)胞)1×106細(xì)胞/ml，以每孔1×105細(xì)胞/孔加入96孔培養(yǎng)板中，12h加入上述收集得到的各組細(xì)胞因子，繼續(xù)培養(yǎng)6h后加入細(xì)胞裂解液再培養(yǎng)4h，od570nm比色，試驗(yàn)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。
表2不同穩(wěn)定劑組成
表3試驗(yàn)結(jié)果
由表3可知，與不含有穩(wěn)定劑的對(duì)照組相比，a～d組的od570nm值明顯增加，特別值得說明的是，a組在4℃保存30天后od570nm值仍保持在較高水平，這說明，在4℃保存30天后，本發(fā)明皮膚修復(fù)液中的干細(xì)胞因子仍然可以刺激hdf細(xì)胞(人真皮成纖維細(xì)胞)細(xì)胞增殖。
b～d組od570nm值與a組相比均有所下降，尤其是b組下降幅度最大，這表明，穩(wěn)定劑組成的改變均會(huì)對(duì)干細(xì)胞因子的活性有明顯影響。
上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。