本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，但其治療效果差、轉(zhuǎn)移率高，治療困難較大。目前治療惡性腫瘤的手段主要有外科手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、免疫療法和基因治療等手段。常用的化學(xué)藥物治療雖然能夠快速殺死腫瘤細(xì)胞，但藥物缺乏選擇性，會對正常的細(xì)胞或組織產(chǎn)生高毒副作用?；蛑委熤惺褂玫膕irna生物穩(wěn)定性差，易被血清中的核酸酶降解，體內(nèi)干擾持續(xù)時間短，這些缺點(diǎn)限制了其廣泛應(yīng)用。近年來，組合治療在醫(yī)藥領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。大量研究證實，化藥和基因共給藥具有增加藥物抗腫瘤療效和提高基因轉(zhuǎn)染效率的協(xié)同作用，但是實現(xiàn)化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)的挑戰(zhàn)之一是共轉(zhuǎn)運(yùn)載體的構(gòu)建。有效的共轉(zhuǎn)運(yùn)載體能良好地負(fù)載化藥與基因，克服體內(nèi)、胞內(nèi)的各種屏障，特異性識別靶向部位，并將藥物及基因遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，構(gòu)建一種新型化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)納米載體，改善化藥和sirna在治療中的缺陷，并發(fā)揮藥物與基因的協(xié)同作用具有重要的科學(xué)意義。

碳納米管(carbonnanotubes,cnts)是單層或多層的石墨卷曲形成的圓柱狀結(jié)構(gòu)材料，作為一種新型的納米載體，因其獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)性能，引起了人們廣泛的關(guān)注。單壁碳納米管(single-walledcarbonnanotubes，swcnts)是一種特殊的cnts，它具有比表面積大、非特異性吸附、高細(xì)胞穿透能力等特點(diǎn)，在載體研究中占據(jù)了很大的空間。原始的cnts由于其自身所具有的疏水結(jié)構(gòu)，使其難以均勻分散于體液中，容易在生物組織和細(xì)胞中聚集，故需采用化學(xué)的方法對原始cnts進(jìn)行共價或非共價修飾，不僅能夠有效地提高cnts在溶劑中的分散性和生物相容性，而且進(jìn)入生物體內(nèi)的cnts還可以通過腎臟代謝等途徑，通過尿液將其排出體外。cnts具有類似石墨表面的π-π共軛結(jié)構(gòu)，使得其表面具有很強(qiáng)的吸附藥物分子的能力?；蚧蚝怂帷⒌鞍踪|(zhì)以及其他難溶性的含芳環(huán)藥物等可以通過物理包覆和π-π吸附等方式加載到cnts表面。因此，cnts作為一種新穎的藥物和基因載體，可以實現(xiàn)藥物和基因在生物體內(nèi)的高效轉(zhuǎn)運(yùn)和利用。

聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，pei)作為一種非病毒商業(yè)化基因載體而被廣泛地應(yīng)用。pei具有較強(qiáng)的核酸結(jié)合能力、細(xì)胞黏合能力和緩沖能力，因其“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，pei與基因復(fù)合物被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后，能在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中吸收h⁺，使其滲透壓增高，導(dǎo)致膜不穩(wěn)定甚至破裂，從而使被吞噬的復(fù)合物逃逸出來，避免了dna被溶酶體內(nèi)酶的降解。大分子量的pei具有高效的基因轉(zhuǎn)染效率，但因其大量正電荷的存在以及非生物降解性，顯示出較大的細(xì)胞毒性；低分子量的pei毒性低，但基因轉(zhuǎn)染效率也隨之降低，這樣就嚴(yán)重限制了它在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

靶向穿透肽br2是一種含有17個氨基酸的多肽，該靶向穿透肽能特異性地識別腫瘤細(xì)胞，通過與癌細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂的相互作用，從而進(jìn)入細(xì)胞；同時，br2可使納米粒靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，提高sirna的轉(zhuǎn)染效率。

至今未出現(xiàn)以新型功能化swcnts為載體，同時負(fù)載抗腫瘤藥和sirna，構(gòu)建腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性化藥與基因共轉(zhuǎn)運(yùn)的靶向納米載體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管的制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明的制備方法操作簡單、易得、可靠，所制備的功能化碳納米管在水中分散性和生物相容性較好，藥物及基因負(fù)載能力高，具有明顯的腫瘤細(xì)胞靶向能力和控制藥物、基因釋放的能力。

本發(fā)明的提供了一種化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管的制備方法，包括以下步驟：

(1)將甜菜堿與聚乙烯亞胺在有機(jī)溶劑中于20-40℃下攪拌反應(yīng)，透析后得到聚合物單體；

(2)將表面酰氯化的碳納米管在保護(hù)氣氛下，在有機(jī)溶劑中與步驟(1)得到的聚合物單體于60-85℃下反應(yīng)，離心、洗滌沉淀后得到聚合物修飾的碳納米管；

(3)將抗癌藥物與步驟(2)得到的聚合物修飾的碳納米管在ph為6.0-8.0的緩沖溶液中混勻，攪拌12-24h，離心后在上清液中加入步驟(2)得到的聚合物修飾的碳納米管，重復(fù)多次直至上清液無色，得到載藥功能化碳納米管；

(4)將步驟(3)得到的載藥功能化碳納米管、磷脂-聚乙二醇-馬來酰亞胺、靶向穿透肽br2-sh以及sirna在葡萄糖水溶液中混勻，在30-40℃下進(jìn)行孵育，得到化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，表面酰氯化的碳納米管的制備方法包括以下步驟：

(s1)將單壁碳納米管在濃硫酸和濃硝酸混勻后，在60-80℃下攪拌4-8h，過濾、干燥后得到氧化碳納米管；

(s2)將氧化碳納米管、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)和氯化亞砜(socl2)混合均勻，在50-70℃下攪拌反應(yīng)16-32h，洗滌、離心、干燥，得到表面酰氯化的碳納米管。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，聚乙烯亞胺的分子量為10-30kda。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，聚乙烯亞胺與甜菜堿的摩爾比為1:80-120。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇和乙腈中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，有機(jī)溶劑為n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙酸異丙酯和四氫呋喃中一種。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，保護(hù)氣氛為氮?dú)?、氦氣、氖氣、氬氣、氙氣或氡氣氣氛?/p>

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，表面酰氯化的碳納米管與聚合物單體的質(zhì)量比為1:10-30。

進(jìn)一步地，在步驟(3)中，抗癌藥物為多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(taxol)、阿霉素(dox)和柔紅霉素中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，在步驟(3)中，聚合物修飾的碳納米管與抗癌藥物的質(zhì)量比為1:1-5。

進(jìn)一步地，在步驟(4)中，首先將載藥功能化碳納米管與磷脂-聚乙二醇-馬來酰亞胺(dspe-peg-mal)在葡萄糖水溶液中渦旋10-20min，然后加入靶向穿透肽br2-sh震蕩12-24h，最后加入sirna進(jìn)行孵育。磷脂-聚乙二醇-馬來酰亞胺中，聚乙二醇分子量為1500-5000g/mol。靶向穿透肽br2-sh的氨基酸序列表如seqidno.1所示，sirna的核苷酸序列如seqidno.2或seqidno.3(反義rna序列)所示。

進(jìn)一步地，在步驟(4)中，靶向穿透肽br2-sh與磷脂-聚乙二醇-馬來酰亞胺與的摩爾比為1:20-30。

進(jìn)一步地，在步驟(4)中，sirna與載藥功能化碳納米管的n/p比為1-30:1。

進(jìn)一步地，在步驟(4)中，葡萄糖水溶液中葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3-5％。

本發(fā)明還提供了上述制備方法所制備的化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管在制備治療腫瘤靶向藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，上述制備方法所制備的化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管的直徑為10-20nm，長度為150-250nm。

本發(fā)明首先通過邁克爾加成反應(yīng)，將甜菜堿嫁接到pei表面，合成pb聚合物單體，將聚合物單體以酰胺鍵的形式共價連接在酰氯化碳納米管表面，然后通過物理吸附及π-π作用成功將具有芳環(huán)類結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物、sirna負(fù)載到功能化的單壁碳納米管上，并將靶向穿透肽br2-sh通過dspe-peg-mal非共價修飾在碳納米管的表面，使碳納米管同時負(fù)載抗癌藥物與sirna，增加載體的分散性和生物相容性，具有較好的靶向作用。該制備方法操作簡單可行可靠，原料易得。所得到的碳納米管載體載藥量高，藥物、sirna具有明顯的ph響應(yīng)性釋放，且具有明顯的腫瘤細(xì)胞靶向能力，體內(nèi)外抗腫瘤效果好，為化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)靶向納米載體的研究提供了理論依據(jù)。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明將甜菜堿嫁接到pei表面，合成新型pb聚合物單體；與pei相比，pb聚合物單體中的pei正電荷得到中和，降低了pei的毒性；同時pb聚合物單體可在溶酶體酸性環(huán)境中吸收h⁺，使其滲透壓快速增高破裂，加速溶酶體的逃逸速度，使載體具有腫瘤ph微環(huán)境響應(yīng)性溶酶體逃逸能力。

(2)本發(fā)明將pb聚合物以酰胺鍵的形式共價連接在酰氯化單壁碳納米管的表面，制備pb聚合物修飾的碳納米管(以下簡稱spb)；該載體不僅能夠提高swcnts的分散性，并利用其巨大比表面積，將結(jié)構(gòu)中存在芳環(huán)的抗腫瘤藥物通過π-π鍵的相互作用吸附于spb的內(nèi)腔或表面，使其具有較高的載藥量。

(3)采用一種新型靶向穿透肽br2-sh，通過dspe-peg-mal非共價連接在負(fù)載了藥物的spb表面，同時將sirna靜電吸附在spb表面，形成化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)靶向納米載體。

(4)本發(fā)明首次公開了腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管，其在水中分散性較好，生物相容性好，藥物負(fù)載能力高；并且該遞藥系統(tǒng)具有ph敏感性，抗腫瘤效果好，具有明顯的腫瘤細(xì)胞靶向能力和控制藥物、基因釋放的能力。

(5)本發(fā)明公開的腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米中，pb改善了碳納米管的分散性和生物相容性；同時使得遞藥系統(tǒng)具有ph響應(yīng)性，將藥物及基因同時遞送至腫瘤細(xì)胞中，提高腫瘤胞內(nèi)的有效藥物濃度，改善藥物及基因的治療效果。

(6)本發(fā)明制備的腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管利用強(qiáng)的穿透細(xì)胞的能力和主動靶向性將藥物與基因帶入癌細(xì)胞中，在溶酶體酸性環(huán)境中吸收h^十，使其滲透壓快速增高破裂，加速溶酶體的逃逸速度，使載體具有腫瘤ph微環(huán)境響應(yīng)性溶酶體逃逸能力，使藥物與基因在腫瘤組織濃度增加，提高了載體向腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)和胞內(nèi)藥物的高濃度釋放，增加了體內(nèi)外的抗腫瘤作用，從而提高藥物及基因的治療效果，并能減少對正常組織的毒性。

(7)本發(fā)明公開的制備方法操作簡單、制備條件溫和，產(chǎn)物易得、可靠，后處理簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1是實施例1中單壁碳納米管，氧化單壁碳納米管，pb聚合物修飾的功能化碳納米管和pei修飾的功能化碳納米管的紅外譜圖；

圖2是實施例1中單壁碳納米管，氧化單壁碳納米管，pb聚合物修飾的功能化碳納米管和pei修飾的功能化碳納米管的熱重分析圖；

圖3為實施例2中功能化碳納米管對a549和293t細(xì)胞毒性結(jié)果圖；

圖4為實施例4中負(fù)載dox和sirna的功能化swcnts在a549細(xì)胞中的攝取結(jié)果；

圖5圖示了實施例4中負(fù)載dox和sirna的功能化swcnts共定位結(jié)果；

圖6為實施例5中腫瘤微環(huán)境影響性化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)載體在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤試驗結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1pb聚合物修飾的碳納米管

(1)稱取dmapaa(二甲胺基丙基丙烯酰胺)，加入無水丙酮溶液溶解，后轉(zhuǎn)移至干燥的圓底燒瓶中。再稱取1,3-丙磺酸內(nèi)酯，加入無水丙酮溶液溶解至澄清，半小時內(nèi)逐滴加入到上述燒瓶中，并不斷攪拌，室溫反應(yīng)16h。將反應(yīng)產(chǎn)生的白色沉淀用丙酮沖洗過濾，35℃下真空干燥后即得到甜菜堿(betaines)。

(2)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下向反應(yīng)瓶中加入分子量為25kda的pei，并加入甲醇溶解至澄清，將步驟(1)合成好的betaines加入反應(yīng)瓶中，室溫攪拌反應(yīng)3天后，采用透析袋(mwco＝3500)在去離子水中進(jìn)行透析，每12小時更換一次雙蒸水，透析兩天后，將透析袋中液體收集并冷凍干燥，即得pb聚合物單體。

(3)將長度為1-5μm的單壁碳納米管加入強(qiáng)酸混合溶液中(98％h2so4和65％hno3體積比為1:1)，超聲分散30min，80℃油浴中機(jī)械攪拌下冷凝回流8h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻靜置一段時間，去除上層酸液并用蒸餾水稀釋，經(jīng)0.22μm混合纖維素濾膜真空抽濾，濾餅用大量去離子水洗滌至濾液ph值為中性，50℃下真空干燥，得到截短的氧化單壁碳納米管(o-swcnts)；取干燥的o-swcnts，放入圓底燒瓶中，加入無水dmf和socl2，60℃條件下劇烈攪拌反應(yīng)24h，得到的產(chǎn)物15000r/min高速離心15min，棄去棕紅色上清液，沉淀用無水thf洗滌3次，洗滌后的固體粉末置于真空干燥箱中60℃干燥12h，得到酰氯化的swcnts(swcnts-cocl)。

(4)將swcnts-cocl加入無水dmf中，超聲分散均勻后，加入步驟(2)合成好的pb聚合物單體，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在80℃條件下超聲反應(yīng)24h。得到的反應(yīng)液15000r/min高速離心15min。棄去上清液，沉淀用去離子水洗滌3次，洗滌后置于真空干燥箱中40℃干燥12h，得到pb聚合物修飾的功能化碳納米管(swcnts-pei-betaines，spb)。

圖1為上述單壁碳納米管，氧化單壁碳納米管(o-swcnts)，pb聚合物修飾的功能化碳納米管(spb)和作為對照的pei修飾的功能化碳納米管的(sp)紅外譜圖，從紅外圖譜中可看出，pb以酰胺共價鍵的形式連接在單壁碳納米管上。

圖2為上述o-swcnts，spb和sp的熱重分析結(jié)果，熱重分析圖譜表明pb及pei以酰胺共價鍵的形式部分連接在單壁碳納米管上。

實施例2功能化碳納米管的安全性評價

采用wst-1試劑盒對細(xì)胞存活率進(jìn)行檢測。將對數(shù)生長期的a549細(xì)胞和293t細(xì)胞，按8×10⁴個/ml接種于96孔板，每孔100μl，調(diào)零孔中加入相同體積的pbs，孵育24h。細(xì)胞長滿后吸出培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度(3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)swcnts、o-swcnts、sp和spb的培養(yǎng)基，每孔100μl。空白對照組加入等體積的不含swcnt的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育24h和48h后，吸取孔中培養(yǎng)基，用pbs(ph7.4)沖洗兩遍，每孔加入100μl培養(yǎng)基，再每孔加入10μlwst-1溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2h，置于微型振蕩器振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀分別于450nm和630nm處測定其吸光度值。實驗重復(fù)3次。作為對照的未加入樣品的細(xì)胞存活率定位100％，加入wst-1試劑(無細(xì)胞)的孔被用來校準(zhǔn)分光光度計，定義為零吸光度。

計算各組吸光度值平均值，根據(jù)下列公式計算細(xì)胞存活率。

od＝od450nm-od630nm

圖3為a549和293t細(xì)胞經(jīng)功能化碳納米管處理24h和48h后的細(xì)胞存活率圖，其中，人腎上皮細(xì)胞系293t細(xì)胞模擬正常細(xì)胞，人肺腺癌細(xì)胞a549模擬腫瘤細(xì)胞分別進(jìn)行了細(xì)胞毒性實驗。圖3a代表采用a549細(xì)胞處理24h后的結(jié)果，圖3b代表a549細(xì)胞處理48h后的結(jié)果，圖3c代表293t細(xì)胞處理24h后的結(jié)果，圖3d代表293t細(xì)胞處理48h后的結(jié)果。圖3表明，經(jīng)混酸處理后，o-swcnts的安全性得到了顯著改善。與sp載體相比，spb的生物安全性顯著提高，說明pb共價修飾在swcnts表面后，能顯著改善生物安全性。當(dāng)載體濃度為100μg/ml時，spb的細(xì)胞存活率在80％以上，且兩種細(xì)胞株之間無顯著性差異。上述結(jié)果表明，pb修飾的swcnts在濃度100μg/ml以內(nèi)對293t細(xì)胞和a549細(xì)胞無明顯毒性，具有良好的生物安全性。

實施例3化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管的制備

(1)將抗癌藥物(dox)溶解在pbs緩沖液中，再將實施例1制備的spb固體加入ph＝7.4的pbs緩沖液。將上述溶液用細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲直至spb均勻分散在溶液中，再加入到抗癌藥物溶液中，抗癌藥物dox與spb的質(zhì)量比為3:1，室溫下磁力攪拌反應(yīng)16h。所得產(chǎn)物離心10min，收集上清液體，加入pbs緩沖液，重復(fù)離心多次，直至上清液體為無色，得到載藥功能化碳納米管。

(2)將載藥功能化碳納米管粉末，加入5％的葡萄糖溶液，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲30min，得到黑色液體，然后向黑色液體中加入100μl濃度為1mg/ml的dspe-peg2000-mal水溶液，渦旋15min。在步驟(1)制備的載藥功能化碳納米管的溶液中加入濃度為1mg/ml的br2-sh水溶液)，其中，br2與dspe-peg2000-mal的摩爾比為1:20，渦旋5min，室溫恒溫震蕩12h，靶向載藥功能化碳納米管成功構(gòu)建。取20μl的sirna與載體進(jìn)行混合，sirna與spb的n/p比為25:1，渦旋5min，室溫靜置30min后孵育完畢，即腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管(dox-spbb-sirna)。靶向穿透肽br2-sh的氨基酸序列表如seqidno.1所示，sirna的核苷酸序列如seqidno.2或seqidno.3(反義rna序列)所示。

實施例4化藥與sirna在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的共攝取

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌細(xì)胞株a549培養(yǎng)于含10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基中，常規(guī)添加1％青霉素-鏈霉素，培養(yǎng)箱溫度保持在37℃，co2濃度保持為5％。每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，對增殖狀況良好的細(xì)胞用0.25％的胰酶消化并傳代，待穩(wěn)定后開始實驗。

(2)負(fù)載dox和sirna的功能化swcnts在a549細(xì)胞中的攝取：將a549細(xì)胞按1×10⁵個/ml濃度鋪于6孔板，培養(yǎng)24h(37℃，5％co2)。給藥前棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入2ml含有各組藥物的新鮮無血清培養(yǎng)基，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)6h(37℃，5％co2)，棄培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收集，pbs洗3次，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞對dox及sirna的攝取率。為了比較dox和sirna共轉(zhuǎn)運(yùn)效果，分別考察單獨(dú)負(fù)載dox(dox-spbb-sirna)、單獨(dú)負(fù)載sirna(spbb-sirna)和共負(fù)載sirna和dox的spbb(dox-spbb-sirna)(實施例3中最終產(chǎn)物)在a549細(xì)胞中的攝取情況。流式細(xì)胞定量分析的結(jié)果如附圖4，a圖為dox和sirna在a549細(xì)胞中共攝取比較，各組給藥情況分別為dox-spbb(圖4a(a))、spbb-sirna(圖4a(b))和dox-spbb-sirna(圖4a(c)、圖4a(d))。b圖所示的是不同功能化碳納米管在a549細(xì)胞中攝取的定量分析，從圖中所示a549細(xì)胞對dox-spbb中dox的攝取高達(dá)95％；對spbb-sirna中sirna的攝取高達(dá)93％；在共轉(zhuǎn)運(yùn)dox-spbb-sirna載體中dox的攝取為99％，與單獨(dú)負(fù)載組相當(dāng)，而sirna的攝取為69％。以上說明構(gòu)建的化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管能將化藥與sirna同時遞送至細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。

(3)負(fù)載dox和sirna的功能化swcnts在a549細(xì)胞內(nèi)的定位：將a549細(xì)胞按1×10⁵個/ml濃度鋪于6孔板，培養(yǎng)24h(37℃，5％co2)。給藥前棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入2ml含有dox-spbb-sirna藥物的新鮮無血清培養(yǎng)基，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)6h(37℃，5％co2)，棄培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用pbs洗3次，加入hoechst33342(10μg/ml)染核，37℃孵育15min，pbs洗3次，加入固定液室溫固定20min，pbs洗3次，50％甘油封片，通過共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中sirna和dox在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。結(jié)果如附圖5，hoechst33342下的兩幅圖代表細(xì)胞核，顯藍(lán)色熒光，dox下的兩幅圖代表化藥在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，顯紅色熒光，fam-sirna下的兩幅圖代表基因在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，顯綠色熒光，merge代表化藥與基因在細(xì)胞內(nèi)的共定位。從圖中可以看出，2h時紅色熒光信號和綠色熒光信號很弱，主要分布在細(xì)胞核周圍。隨著時間的延長，4h時二者信號強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，重疊之后呈棕黃色熒光。且紅色信號開始向細(xì)胞核中遷移，綠色信號主要分布在細(xì)胞核周圍。說明功能化修飾的spbb載體能夠有效遞送dox和sirna于細(xì)胞內(nèi)，并在胞漿中與dox、sirna分離，sirna分布在細(xì)胞胞漿中，dox逐漸向細(xì)胞核中遷移。dox-spbb-sirna為化療藥物和基因藥物共同發(fā)揮作用創(chuàng)造了有利條件。

實施例5體內(nèi)抗腫瘤活性的檢測

(1)荷瘤裸鼠模型的建立：健康雌性balb/c裸鼠24只，體重18-20g，4-6周齡裸鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，于spf環(huán)境下飼養(yǎng)。取對數(shù)生長期人非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞，加一定的pbs將離心后的細(xì)胞吹散成細(xì)胞懸液，懸液的濃度調(diào)整為5×10⁷cells/ml。在4-6周齡的balb/c裸鼠的右上腋窩處皮下注射200μl細(xì)胞懸液，共接種balb/c裸鼠24只。接種后balb/c裸鼠飼養(yǎng)于spf環(huán)境中；

(2)抗腫瘤試驗：接種2-3周后裸鼠的腫瘤形成，待皮下瘤組織長至50-80mm³大小時入組進(jìn)行實驗。隨機(jī)選取24只荷瘤裸鼠分為4組，每組分別依次為生理鹽水空白組(ns組)、spbb-sirna組、dox-spbb組和dox-spbb-sirna組。尾靜脈每隔兩天分別注射4組藥物，sirna的給藥濃度為2mg/kg，dox的給藥濃度為5mg/kg。對照組注射等體積的生理鹽水。治療當(dāng)天開始隔日用游標(biāo)卡尺測量裸鼠腫瘤最長直徑a和最短直徑b，稱體重，直到第10天結(jié)束試驗。按下列公式計算腫瘤體積：v＝a×b²×0.5，根據(jù)測量的結(jié)果計算出相對腫瘤體積(relativetumorvolume，rtv)，計算公式為：rtv＝vd/v0，其中vd為給藥后測量所得腫瘤體積，v0為第0天時測量所得腫瘤體積。腫瘤抑制率計算公式：抑瘤率＝(對照組平均腫瘤體積-實驗組組平均腫瘤體積)/對照組平均腫瘤體積×100％。根據(jù)測得腫瘤體積分別繪制腫瘤體積變化曲線，見附圖6。從附圖6可以發(fā)現(xiàn)ns組腫瘤生長較快，而spbb-sirna、dox-spbb和dox-spbb-sirna給藥組腫瘤生長得到抑制，各給藥組的抑瘤率分別為14.48％、48.31％和69.22％。在給藥10天時，ns組的rtv為6.01±2.05，spbb-sirna、dox-spbb和dox-spbb-sirna組的rtv分別為5.14±1.15(p＝0.3868vsns)，3.11±0.85(p＝0.0095vsns)，1.85±0.39(p＝0.0006vsns)。dox-spbb組、dox-spbb-sirna組均可明顯抑制腫瘤的生長，而spbb-sirna組抑瘤效果不明顯。說明共轉(zhuǎn)運(yùn)載體spbb能將dox及sirna運(yùn)輸至腫瘤組織中，發(fā)揮聯(lián)合效應(yīng)，達(dá)到抑制腫瘤增長的作用。

本發(fā)明制備了負(fù)載dox和sirna共轉(zhuǎn)運(yùn)靶向納米載體，該共轉(zhuǎn)運(yùn)靶向納米載體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，能在溶酶體的酸性環(huán)境中吸收h⁺，使其滲透壓快速增高破裂，加速溶酶體的逃逸速度，從而使基因及化藥物蓄積在腫瘤組織中，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞，提高了藥物治療效果的作用。對給藥10天后各組的裸鼠的臟器和腫瘤組織進(jìn)行切片觀察。與ns組比較，各種心臟結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維及心肌細(xì)胞未見明顯病理改變；肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，中央靜脈及匯管區(qū)無異常；腎小球分布正常；脾臟未見明顯的病理損傷。這說明在此治療方案下未產(chǎn)生明顯的毒性。在腫瘤組織中，ns組和spbb-sirna組的腫瘤細(xì)胞邊界明顯，染色清晰，兩者無顯著性差異，而dox-spbb、dox-spbb-sirna組腫瘤組織發(fā)生了不同程度的細(xì)胞破碎和細(xì)胞碎片，其中dox-spbb-sirna組細(xì)胞破碎明顯，產(chǎn)生明顯的空洞現(xiàn)象。說明負(fù)載sirna和dox的共轉(zhuǎn)運(yùn)載體dox-spbb-sirna能夠顯著增強(qiáng)抑瘤效果，具有協(xié)同作用。

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管的制備方法。本發(fā)明通過邁克爾加成反應(yīng)，將甜菜堿單體(betaines)嫁接到pei表面，合成新型pei-betaines(pb)聚合物單體，接著將pb聚合物單體以酰胺鍵的形式共價連接在酰氯化單壁碳納米管的表面，制備spb。該載體不僅能夠提高swcnts的分散性，并利用其巨大比表面積，將抗腫瘤藥物通過π-π鍵的相互作用吸附于spb的內(nèi)腔或表面，使其具有較高的載藥量，最后采用一種新型靶向穿透肽br2-sh，通過dspe-peg2000-mal非共價連接在dox-spb表面，同時將sirna靜電吸附在其表面，形成化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)納米載體。制備的共轉(zhuǎn)運(yùn)的功能化碳納米管同時負(fù)載化藥與基因，促進(jìn)藥物及基因在低ph的腫瘤細(xì)胞環(huán)境中的釋放，使藥物在腫瘤組織濃度增加，殺傷腫瘤細(xì)胞，增加抗腫瘤效果，降低毒副作用。本發(fā)明公開的制備方法操作簡單、制備條件溫和，產(chǎn)物易得、可靠，后處理簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110>蘇州大學(xué)

<120>化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)功能化碳納米管的制備方法及應(yīng)用

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