本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及野生型IDH2基因作為靶標(biāo)在制備非小細(xì)胞肺癌治療藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展與疾病譜的改變，我國肺癌等腫瘤的發(fā)病率明顯上升。根據(jù)中國腫瘤登記年報(2012)，我國全國腫瘤登記地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病第一位的是肺癌。其發(fā)病率為53.57/10萬，人口標(biāo)化后為25.34/10萬，五年生存率只有10％-15％。肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。在我國，約80％的肺癌被診斷為非小細(xì)胞肺癌。

異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)是細(xì)胞代謝途徑中參與三羧酸循環(huán)的酶，位于染色體15q26.1，亞細(xì)胞定位于線粒體基質(zhì)。其生理功能是正向催化異檸檬酸氧化產(chǎn)生α-酮戊二酸，同時還原NADP+產(chǎn)生NADPH。其逆向反應(yīng)催化α-酮戊二酸產(chǎn)生異檸檬酸，并消耗NADPH產(chǎn)生NADP+。

近來，在WHO二期和三期膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)大于70％的IDH1/2突變，IDH1R132和IDH2R140/172突變位點(diǎn)也在其它腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，如急性粒細(xì)胞白血病、甲狀腺癌、軟骨肉瘤、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、前列腺癌、急性B淋巴細(xì)胞白血病、副神經(jīng)節(jié)瘤、結(jié)直腸癌和黑色素瘤等腫瘤。IDH1/2突變后獲得了新的功能，即催化a-酮戊二酸產(chǎn)生致癌代謝物2羥基戊二酸(2-HG)。IDH1/2突變一方面消耗a-酮戊二酸，另一方面產(chǎn)生2羥基戊二酸，最終抑制以a-酮戊二酸為底物反應(yīng)的一系列脫雙氧酶的活性，從而增強(qiáng)細(xì)胞代謝，抑制細(xì)胞膠原蛋白形成和細(xì)胞分化。目前，突變型IDH2靶向藥物已進(jìn)入I期臨床實(shí)驗(yàn)階段，IDH2口服選擇性抑制劑AG-221在擴(kuò)展I期研究發(fā)現(xiàn)，158名晚期血液腫瘤患者中63名病情緩解(40％)，76％的患者療效持續(xù)超過6個月，部分患者超過15個月。

野生型IDH2的序列已公開，genebank編號為NG_023302.1。研究表明野生型IDH2也在腫瘤細(xì)胞增殖和死亡中具有重要功能。IDH2基因敲除小鼠體內(nèi)的黑色素瘤細(xì)胞移植瘤形成受到明顯抑制，腫瘤血管生成標(biāo)志物明顯減少。IDH2逆向反應(yīng)可以在低氧條件通過谷氨酰胺代謝經(jīng)過a-酮戊二酸產(chǎn)生檸檬酸，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和增加細(xì)胞活力。乳腺癌細(xì)胞Myc基因驅(qū)動逆向IDH1/2反應(yīng)產(chǎn)生2羥基戊二酸，抑制細(xì)胞凋亡。目前野生型和突變型IDH2在肺癌中的研究尚未有文獻(xiàn)報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人研究表明IDH2信使RNA在肺癌組織中高表達(dá)，提示IDH2可能是肺癌的治療靶標(biāo)。發(fā)明人在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460和A549過表達(dá)及敲減IDH2，使用MTS、細(xì)胞計數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)手段檢測IDH2對于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長、增殖和死亡等生物學(xué)行為的影響。進(jìn)一步接種免疫缺陷小鼠，觀察IDH2對裸鼠移植瘤生長的作用。發(fā)現(xiàn)IDH2能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，抑制細(xì)胞死亡。敲減IDH2可以有效抑制細(xì)胞增殖和肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，增加細(xì)胞死亡。IDH2過表達(dá)降低細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸(α-KG)含量，采用添加α-酮戊二酸的方式可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，IDH2過表達(dá)也增加了細(xì)胞內(nèi)的2-羥基戊二酸的含量，可能抑制細(xì)胞死亡。即，本發(fā)明提出野生型IDH2可作為非小細(xì)胞肺癌的潛在治療靶標(biāo)。野生型IDH2基因可作為靶標(biāo)用于制備非小細(xì)胞肺癌治療藥物、用于制備抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的藥物、用于制備誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞死亡的藥物。

IDH2在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，野生型IDH2促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，抑制細(xì)胞死亡。敲減野生型IDH2可以有效抑制細(xì)胞增殖和肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，增加細(xì)胞死亡。IDH2過表達(dá)降低細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸含量，采用添加α-酮戊二酸的方式可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，IDH2過表達(dá)也增加了細(xì)胞內(nèi)的2-羥基戊二酸的含量，可能抑制細(xì)胞死亡。本發(fā)明為臨床肺癌的治療提供了靶標(biāo)基因IDH2，為相關(guān)藥物靶點(diǎn)的研究提供了理論依據(jù)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖：圖1顯示了IDH2在肺癌組織與癌旁組織中的信使RNA表達(dá)；

圖2、3、4、5為實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖：

圖2a顯示了H460及A549細(xì)胞IDH2熱點(diǎn)突變序列測序與NCBI數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果；

圖2b顯示了IDH2過表達(dá)細(xì)胞IDH2蛋白含量的western檢測結(jié)果，圖2c顯示了IDH2敲減細(xì)胞IDH2蛋白含量的western檢測結(jié)果；

圖3a顯示了IDH2過表達(dá)細(xì)胞增殖活性的檢測結(jié)果；圖3b顯示了IDH2敲減細(xì)胞增殖活性的檢測結(jié)果；

圖4a顯示了IDH2過表達(dá)細(xì)胞增殖數(shù)目的檢測結(jié)果；圖4b顯示了IDH2敲減細(xì)胞增殖數(shù)目的檢測結(jié)果；圖4c顯示了IDH2過表達(dá)細(xì)胞α-酮戊二酸含量；圖4d顯示了IDH2敲減細(xì)胞α-酮戊二酸含量；如圖4e顯示了在過表達(dá)IDH2的肺癌細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2的細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加α-酮戊二酸，抑制了細(xì)胞的增殖；

圖5a顯示了IDH2過表達(dá)細(xì)胞死亡比例的檢測結(jié)果；圖5b顯示了IDH2敲減細(xì)胞死亡比 例的檢測結(jié)果；圖5c顯示了IDH2過表達(dá)的肺癌細(xì)胞的2-HG含量；

圖6為實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖：

圖6a顯示了IDH2過表達(dá)后，肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤體積的變化；圖6b顯示了IDH2過表達(dá)后，肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤重量的變化；

圖6c顯示了IDH2敲減后，肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤體積的變化；圖6d顯示了IDH2敲減后，肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤重量的變化。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.IDH2信使RNA表達(dá)在肺癌組織中增加

目前多個數(shù)據(jù)庫包含大量腫瘤臨床樣本數(shù)據(jù)，如美國癌癥“登月計劃”近期已公布1.2萬名癌癥患者的原始數(shù)據(jù)，供研究者分析。為分析IDH2在肺癌組織與癌旁組織的表達(dá)差異，申請人調(diào)取臨床樣本數(shù)據(jù)庫中IDH2肺癌組織與癌旁組織的信使RNA表達(dá)，進(jìn)行分析統(tǒng)計。

實(shí)驗(yàn)方法：

通過查詢oncomine數(shù)據(jù)庫中IDH2表達(dá)數(shù)據(jù)。采用t-test函數(shù)分析表達(dá)數(shù)據(jù)，繪制IDH2表達(dá)差異數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

IDH2在數(shù)據(jù)庫多個芯片數(shù)據(jù)中在肺癌組織中相對癌旁組織均高表達(dá)，沒有低表達(dá)的樣本。其中樣本數(shù)目最多的實(shí)驗(yàn)組如圖1所示，IDH2在肺癌組織中高表達(dá)，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＝2.8E-13)。

實(shí)施例2.IDH2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞死亡。

本部分以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460和A549為母細(xì)胞，以慢病毒導(dǎo)入的方式構(gòu)建了H460和A549過表達(dá)及敲減野生型IDH2的細(xì)胞模型。檢測IDH2過表達(dá)及敲減后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和死亡的改變。

1.H460和A549過表達(dá)及敲減野生型IDH2的細(xì)胞模型構(gòu)建

我們首先對H460和A549細(xì)胞的IDH2熱點(diǎn)突變區(qū)域進(jìn)行測序，確認(rèn)細(xì)胞模型中IDH2為野生型。為研究IDH2對細(xì)胞增殖與死亡的作用，采用慢病毒導(dǎo)入的方式構(gòu)建了H460和A549過表達(dá)及敲減野生型IDH2的細(xì)胞模型。

實(shí)驗(yàn)方法：

H460和A549細(xì)胞細(xì)胞經(jīng)過RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA后，PCR擴(kuò)增IDH2熱點(diǎn)區(qū)域序列，送華大基因進(jìn)行測序，最后與NCBI數(shù)據(jù)庫中野生型IDH2序列進(jìn)行比對。

過表達(dá)、敲減細(xì)胞的母細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)后，將待感染的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿后，待細(xì)胞生長至80％-90％的融合度時棄培基。慢病毒溶液按1:3與新鮮培養(yǎng)基混合后加入培養(yǎng)皿中，同時加入終濃度為1ug/ml的polybrene促進(jìn)病毒感染。24小時后消化細(xì)胞，加入終濃度為1ug/ml的puromycine篩選細(xì)胞，設(shè)置對照組。約72小時后，對照組細(xì)胞大量死亡，實(shí)驗(yàn)組中殘留的細(xì)胞為病毒感染成功的細(xì)胞。通過Western檢測IDH2蛋白表達(dá)確定細(xì)胞模型是否構(gòu)建成功。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖2a所示，H460與A549細(xì)胞中IDH2熱點(diǎn)突變序列與數(shù)據(jù)庫中野生型序列462個堿基100％相同，證明H460與A549細(xì)胞IDH2為野生型。如圖2b所示，過表達(dá)野生型IDH2細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2相對其對照細(xì)胞H460-EV和A549-EV，IDH2的蛋白含量增加。如圖2c所示，IDH2野生型敲減細(xì)胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相對其對照細(xì)胞H460-shcon和A549-shcon，IDH2的蛋白含量降低。證明IDH2過表達(dá)及敲減細(xì)胞構(gòu)建成功。

2.IDH2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖活性

MTS是四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)改良方法，是常用于檢測細(xì)胞增殖活性的方法?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTS還原為可溶性的藍(lán)紫色甲臢結(jié)晶物－Formazan，而無活性的細(xì)胞無此功能，用酶標(biāo)儀測定其在490nm波長的吸收值，可間接反映細(xì)胞增殖活性，該方法已廣泛應(yīng)用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選。

實(shí)驗(yàn)方法：

使用已構(gòu)建的肺癌細(xì)胞模型，收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μl細(xì)胞懸液(設(shè)置3個以上的復(fù)孔)，使待測細(xì)胞調(diào)密度1000-10000孔，置于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，各樣品孔加MTS溶液20μl，生化培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5小時。在酶標(biāo)儀490nm波長處測定各孔的吸光值并繪制生長關(guān)系曲線。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖3a所示，過表達(dá)IDH2的肺癌細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2增殖活性相對對照細(xì)胞H460-EV和A549-EV增加。如圖3b所示，敲減IDH2的肺癌細(xì)胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相對其對照細(xì)胞H460-shcon和A549-shcon增殖活性降低。

3.IDH2增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖數(shù)目

細(xì)胞損傷或死亡時，臺盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。嚴(yán)格來說，臺盼藍(lán)染色檢測的是細(xì)胞膜的完整性，通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。

IDH2突變蛋白降低細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸的含量，為確定野生型IDH2消耗α-酮戊二酸， 從而促進(jìn)細(xì)胞存活與增殖。我們采用biovision公司的α-酮戊二酸含量檢測試劑盒(K677-100)，對野生型IDH2過表達(dá)及敲減細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸含量進(jìn)行檢測。并采用外源添加可以進(jìn)入細(xì)胞利用的α-酮戊二酸類似物辛基化α-酮戊二酸，驗(yàn)證α-酮戊二酸對細(xì)胞增殖的作用。

實(shí)驗(yàn)方法：

用Hanks液配制0.1％臺盼藍(lán)溶液；用0.5％胰蛋白酶和0.2％EDTA 1：1混合液來消化培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞；再加入適量細(xì)胞培養(yǎng)基液終止消化，Hanks液漂洗3次后制成細(xì)胞懸液；將待染色細(xì)胞稀釋至所需濃度(方法及濃度范圍與細(xì)胞計數(shù)相同)；每0.1ml細(xì)胞懸液約加新鮮配制的染液一小滴，室溫下染3—5min；染色過的細(xì)胞材料，取一滴細(xì)胞懸液置血球計數(shù)板，加蓋玻片后放高倍鏡下觀察并計數(shù)；死亡的細(xì)胞著淺藍(lán)色并膨大，無光澤?；罴?xì)胞不著色并保持正常形態(tài)，有光澤。

構(gòu)建的野生型IDH2過表達(dá)及敲減H460和A549模型細(xì)胞接種于6孔板，12小時后添加1mM辛基化α-酮戊二酸(cayman)，使用血球計數(shù)板不同時間點(diǎn)檢測細(xì)胞數(shù)目變化，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖4a所示，過表達(dá)野生型IDH2的肺癌細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2的細(xì)胞數(shù)目相對對照細(xì)胞H460-EV和A549-EV增加。如圖4b所示，敲減IDH2的肺癌細(xì)胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相對其對照細(xì)胞H460-shcon和A549-shcon細(xì)胞數(shù)目降低。

如圖4c所示，過表達(dá)IDH2的肺癌細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2的細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸含量相對對照細(xì)胞H460-EV和A549-EV增加，如圖4d所示，敲減IDH2的肺癌細(xì)胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相對其對照細(xì)胞H460-shcon和A549-shcon細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸含量降低。

如圖4e所示，在過表達(dá)IDH2的肺癌細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2的細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加α-酮戊二酸，抑制了細(xì)胞的增殖。

4.野生型IDH2抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞死亡

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。可以通過流式細(xì)胞術(shù)檢測PI陽性細(xì)胞的比例確定細(xì)胞的死亡比例。

2-羥基戊二酸是突變型IDH2的產(chǎn)物，在乳腺癌中IDH2逆向反應(yīng)可以產(chǎn)生2-HG并抑制細(xì)胞凋亡。我們對野生型IDH2過表達(dá)H460和A549模型細(xì)胞中2-HG含量進(jìn)行了檢測。

實(shí)驗(yàn)方法：

用不含EDTA的胰酶消化收集后，于室溫2000rpm離心5～10分鐘，收集細(xì)胞；用預(yù)冷1×PBS(4℃)重懸細(xì)胞一次，2000rpm離心5～10分鐘，洗滌細(xì)胞；加入300μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞；上機(jī)前5分鐘再加入5μL的PI染色進(jìn)行流式檢測。

2-HG含量檢測使用biovision公司的試劑盒(K213-100)進(jìn)行檢測，操作按照說明書步驟進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖5a所示，過表達(dá)IDH2的肺癌細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2的死亡細(xì)胞比例相對對照細(xì)胞H460-EV和A549-EV降低。如圖5b所示，敲減IDH2的肺癌細(xì)胞H460-sh1、H460-sh2和A549-sh1、A549-sh2相對其對照細(xì)胞H460-shcon和A549-shcon死亡細(xì)胞比例增加。

如圖5c所示，過表達(dá)IDH2的肺癌細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2的2-HG含量相對對照細(xì)胞H460-EV和A549-EV增加。

實(shí)施例3.野生型IDH2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長

動物實(shí)驗(yàn)，由于其更能模擬人類的生理和病理?xiàng)l件，動物實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果，又稱臨床前證據(jù)。裸鼠移植瘤模型是腫瘤研究最常用的動物模型。

實(shí)驗(yàn)方法：

4周齡免疫缺陷小鼠Bclb購自中南大學(xué)動物學(xué)部，經(jīng)本室飼養(yǎng)一周后，過表達(dá)實(shí)驗(yàn)每只裸鼠注射2x10⁶個細(xì)胞，敲減細(xì)胞成瘤每只注射1x10⁶個細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)裸鼠均在接種后第四天開始測量裸鼠體重及瘤體體積，每2-3天測量一次，對應(yīng)分組檢測到三次差異后處死小鼠，剝離瘤體，并稱量瘤體重量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.野生型IDH2過表達(dá)增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞移植瘤體體積和重量

如圖6a所示，IDH2過表達(dá)肺癌細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2的裸鼠移植瘤體積相對對照細(xì)胞H460-EV和A549-EV增加。

如圖6b所示，IDH2過表達(dá)肺癌細(xì)胞H460-IDH2和A549-IDH2的裸鼠移植瘤重量相對對照細(xì)胞H460-EV和A549-EV增加。

2.野生型IDH2敲減降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞移植瘤體積和重量

如圖6c所示，敲減IDH2的肺癌細(xì)胞H460-shIDH2相對其對照細(xì)胞H460-shcon體積減少。

如圖6d所示，敲減IDH2的肺癌細(xì)胞H460-shIDH2相對對照細(xì)胞H460-shcon重量降低。