本發(fā)明涉及的是恢復(fù)精索靜脈曲張血清性激素水平技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種巴戟天多糖提取物通過刺激gnrh釋放有效恢復(fù)精索靜脈曲張血清性激素水平的方法。

背景技術(shù)：

精索靜脈曲張是指精索靜脈和蔓狀靜脈叢擴張，迂曲而引起的血管性疾病，好發(fā)于左側(cè)(85％–90％)，并導(dǎo)致雙側(cè)睪丸病理損傷和生精障礙(57％–85.7％)。精索靜脈曲張可能通過睪丸溫度升高、灌注不足、缺氧、氧化應(yīng)激、腎上腺代謝物逆流等機制造成生精上皮退行性變和生精細胞凋亡增多，但其具體病因目前尚不明確。目前，精索靜脈曲張已成為已知的男性不育的主要病因，嚴重威脅男性生殖健康。

下丘腦-垂體-睪丸軸是機體生殖調(diào)控的主要通路，通過合成和釋放生殖相關(guān)激素，調(diào)控性腺分化和成熟，調(diào)節(jié)性激素分泌和男性生精功能。下丘腦-垂體-睪丸軸主要由三部分組成：1)下丘腦：主要通過合成和脈沖式釋放促性腺激素釋放激素(gnrh)，調(diào)節(jié)垂體前葉細胞；2)垂體：垂體前葉細胞釋放卵泡刺激素(fsh)和黃體生成素(lh)對睪丸生精上皮及間質(zhì)細胞進行調(diào)控；3)睪丸：是男性最主要的生殖腺，負責產(chǎn)生精子，分泌睪酮。此三部分之間彼此關(guān)聯(lián)，相互影響。上一層次的激素能夠刺激和調(diào)控下游腺體功能和激素水平，而下游激素水平能夠負反饋調(diào)節(jié)上游激素水平，以此維持動態(tài)平衡。有臨床資料顯示，精索靜脈曲張患者血清性激素水平顯著降低，提示精索靜脈曲張可能引起患者下丘腦-垂體-睪丸軸分泌功能損傷。

gnrh是下丘腦肽能神經(jīng)元分泌的一種10肽激素，是節(jié)律性以脈沖式釋放的一種神經(jīng)激素，參與調(diào)控脊椎動物生殖活動，是生殖中樞(下丘腦)調(diào)控生殖內(nèi)分泌的最終信號。gnrh神經(jīng)元起源于梨鼻器嗅基板的內(nèi)皮細胞，與嗅神經(jīng)軸突一并形成含有g(shù)nrh的神經(jīng)束，隨著嗅覺神經(jīng)束進行移動，最終遷徙到下丘腦內(nèi)側(cè)底部。gnrh神經(jīng)元胞體主要位于視前區(qū)，其喙側(cè)數(shù)目最多。嚙齒類動物gnrh神經(jīng)元主要位于視前內(nèi)側(cè)區(qū)，內(nèi)側(cè)隔核和broca斜角帶，以broca斜角帶最為集中，其纖維主要終止于正中隆起(medianeminence,me)和終板血管器。gnrh直接刺激垂體前葉黃體生成素(lh)和卵泡刺激素(fsh)的釋放，繼而促進男性睪酮(t)分泌。

中藥“巴戟天”，為茜草科植物巴戟天的干燥根，主要產(chǎn)地為我國海南、福建、廣東，為“四大南藥”之一，有“南國人參”之稱，并為《中國藥典》收錄。本草正義言巴戟天“味辛，氣溫，專入腎家，為鼓舞陽氣之用。溫養(yǎng)元陽，則邪氣自除，起陰痿，強筋骨，益精，治小腹陰中相引痛，皆溫腎散寒之效”。巴戟天作為傳統(tǒng)的“補腎要劑”，可補腎陽，強筋骨，袪風濕?，F(xiàn)代醫(yī)學研究也發(fā)現(xiàn)其有提高免疫功能、降低血壓、抗炎、抗抑郁和類皮質(zhì)激素等作用。臨床中藥復(fù)方中常使用巴戟天治療陽痿、少精等男科疾病，目前尚無研究證實巴戟天多糖對維持下丘腦-垂體-睪丸軸激素平衡的作用和機制。

綜上所述，本發(fā)明設(shè)計了一種巴戟天多糖提取物通過刺激gnrh釋放有效恢復(fù)精索靜脈曲張血清性激素水平的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)上存在的不足，本發(fā)明目的是在于提供巴戟天多糖提取物通過刺激gnrh釋放有效恢復(fù)精索靜脈曲張血清性激素水平的方法，50mg/kg–100mg/kg巴戟天粗多糖能夠有效修復(fù)實驗性精索靜脈曲張早期下丘腦gnrh合成和分泌能力。其機制可能與修復(fù)的樹突棘可塑性和上調(diào)kiss1-gpr54系統(tǒng)有關(guān)?？傊?，巴戟天粗多糖能夠通過刺激下丘腦gnrh的分泌而修復(fù)精索靜脈曲張所致血清性激素水平降低，這對垂體和睪丸功能的維持和修復(fù)至關(guān)重要。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種巴戟天多糖提取物通過刺激gnrh釋放有效恢復(fù)精索靜脈曲張血清性激素水平的方法，其包括以下步驟：1、建立實驗性精索靜脈曲張動物模型；

2、早期給予巴戟天粗多糖治療，觀察下丘腦arc神經(jīng)元形態(tài)變化及gnrh分布和含量變化，探討巴戟天粗多糖通過修復(fù)gnrh神經(jīng)元而恢復(fù)機體性相關(guān)激素內(nèi)分泌的功能和機制。

3、結(jié)果表明：50mg/kg–100mg/kg巴戟天粗多糖能夠有效修復(fù)實驗性精索靜脈曲張早期下丘腦gnrh合成和分泌能力。

所述的步驟1具體包括:a動物分組和給藥方法；b巴戟天粗多糖的制備和純化；c巴戟天多糖含量測定；d巴戟天粗多糖光譜分析；eturner法制作實驗性精索靜脈曲張大鼠模型；f精索靜脈曲張大鼠模型鑒定；g動物血清制備；h大鼠心臟灌注，取材和冰凍切片；i腦冰凍切片尼氏染色；j高爾基染色；k腦免疫組織熒光染色；lgnrhmrna原位雜交實驗；m免疫印跡實驗(westernblot)；n統(tǒng)計學方法。

本發(fā)明具有以下有益效果：1、巴戟天粗多糖促進gnrh合成；2、巴戟天粗多糖恢復(fù)神經(jīng)元接收外界信號的能力；3、巴戟天粗多糖增強kiss1-gpr54信號通路；4、50mg/kg–100mg/kg巴戟天粗多糖能夠有效修復(fù)實驗性精索靜脈曲張早期下丘腦gnrh合成和分泌能力。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施方式來詳細說明本發(fā)明；

圖1為本發(fā)明的巴戟天粗多糖紫外(a)和紅外(b)吸收光譜圖；

圖2為各實驗組下丘腦arc尼氏染色(bar＝100μm)圖；

圖3為各實驗組下丘腦arc神經(jīng)元高爾基染色(bar＝100μm)圖；

圖4為各實驗組下丘腦arc神經(jīng)元高爾基染色(bar＝50μm)圖；

圖5為各實驗組下丘腦arc和megnrh-kiss1-gpr54-dapi免疫熒光染色和下丘腦arcgnrhmrna原位雜交。a&c，gnrh-kiss1-gpr54-dapi免疫熒光染色及熒光強度分析；b&d，gnrhmrna原位雜交及陽性染色細胞數(shù)分析?！鳎簆<0.05，與假手術(shù)組相比；*：p<0.05，與曲張組相比；

圖6為各實驗組下丘腦arcgnrh，kiss1-gpr54系統(tǒng)和磷酸化mapk水平的變化圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施方式，進一步闡述本發(fā)明。

實施例1：a動物分組和給藥方法:

70只雄性sd大鼠按體重，以隨機數(shù)字法，隨機分為7組，每組10只，分別為假手術(shù)組(so)，實驗性精索靜脈曲張模型組(vc)，溶劑對照組，25mg/kg巴戟天粗多糖治療組(m25組)，50mg/kg巴戟天粗多糖治療組(m50組)，100mg/kg巴戟天粗多糖治療組(m100組)，200mg/kg巴戟天粗多糖治療組(m200組)。除假手術(shù)組外，均進行實驗性精索靜脈曲張手術(shù)。術(shù)后動物單籠飼養(yǎng)休息3天。

于術(shù)后第4天，對實驗動物給予巴戟天粗多糖藥液治療。假手術(shù)組和曲張組動物不給藥；溶劑對照組動物給予雙蒸水，1.5ml/天；余巴戟天粗多糖治療組給予相應(yīng)藥量的巴戟天多糖藥液(100mg/ml)，不足2ml的，以雙蒸水補足至1.5ml。持續(xù)治療4周，即28天。

b巴戟天粗多糖的制備和純化:

(1)巴戟天干燥根剪斷，粉碎，烘干(45℃，24h)。

(2)加入3倍量95％乙醇，煮沸2h，棄上清；重復(fù)一次。

(3)自然揮發(fā)干燥，用6倍量雙蒸水，煮沸2h，收集藥液(上清)；重復(fù)兩次。

(4)藥液冷卻至室溫，以6層紗布過濾后，65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得相對密度1.2g/ml的流浸膏。

(5)加入無水乙醇，使醇含量達到60％，4℃靜置24h，收集沉淀。

(6)脫蛋白：沉淀以雙蒸水溶解，取1/3體積sevage試劑(氯仿：正丁醇＝4:1)，二者混合加入分液漏斗，顛倒混勻5-8次，靜置分層1h。去除下層的氯仿液和中層變性蛋白。重復(fù)此步驟4次。

(7)向已脫蛋白的粗多糖液中加入無水乙醇，使醇含量達到60％，4℃靜置24h，收集沉淀。

(8)沉淀以無水乙醇，丙酮，乙醚分別洗滌一次，抽濾干燥，60℃干燥24h后，得巴戟天粗多糖粉末。

c巴戟天多糖含量測定：

(1)制作葡萄糖標準曲線

a，配制葡萄糖原液：

稱0.1g葡萄糖，溶解于50ml左右雙蒸水中，以100ml容量瓶定容，得1.0mg/ml的葡萄糖原液。

b，配制0.2％蒽酮：

稱0.2g蒽酮，少量濃h2so4溶解，以100ml容量瓶定容，得0.2％蒽酮試劑。

c，制作葡萄糖標準曲線：

葡萄糖原液分別取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.8ml、1ml于ep管，加雙蒸水稀釋至5ml。取2ml以上葡萄糖液，分別加入0.2％蒽酮試劑4ml，速浸冰水浴中冷卻。各管加完后一起煮沸10min，自來水冷卻，室溫平衡20min。以雙蒸水為空白，測定625nm處吸光度(120min內(nèi)顯色結(jié)果穩(wěn)定)。每管測定4次取平均值，以od值為橫坐標(x)，葡萄糖液濃度為縱坐標(y)，制作標準曲線。

(2)巴戟天粗多糖純度(碳水化合物含量)測定：

稱巴戟天粗多糖0.1g，少量雙蒸水溶解，以100ml容量瓶定容，得估計濃度為1.0mg/ml的巴戟天粗多糖原液。

巴戟天粗多糖原液分別取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml于ep管，加雙蒸水稀釋至5ml。取2ml以上巴戟天粗多糖液，分別加入0.2％蒽酮試劑4ml，速浸冰水浴中冷卻。各管加完后一起煮沸10min，自來水冷卻，室溫平衡20min。測定625nm處吸光度(120min內(nèi)顯色結(jié)果穩(wěn)定)。每管測定4次取平均值，帶入葡萄糖標準曲線中得巴戟天粗多糖濃度。

巴戟天粗多糖純度＝巴戟天粗多糖濃度/估計濃度(1.0mg/ml)

d巴戟天粗多糖光譜分析：

巴戟天粗多糖7mg，加7mlddh2o充分溶解，過濾膜，進樣紫外可見分光光度計分析，波長范圍190nm-400nm。進樣紅外光譜分析儀spectrum65，波長范圍400-4000cm-1。

eturner法制作實驗性精索靜脈曲張大鼠模型：

sd大鼠給予3.3ml/kg體重的7％水合氯醛腹腔注射，約5min后，大鼠處于深麻狀態(tài)。將動物保定于手術(shù)臺，腹部備皮，碘伏消毒一次，75％酒精消毒3次。鋪無菌手術(shù)巾，暴露術(shù)區(qū)(劍突下至髂前上棘平面腹中間區(qū))。于劍突下一橫指(約1.5cm)，沿腹白線縱行切開皮膚約3cm，而后切開腹白線，鈍性分離腹膜，進入腹腔。用浸過溫生理鹽水的紗布將左側(cè)腸管撥至右側(cè)，暴露腹后壁筋膜。鈍性分離腹后膜，暴露下腔靜脈，主動脈，腎蒂，腎上腺上靜脈，精索內(nèi)靜脈。于腎靜脈匯入下腔靜脈處，放置一與腎靜脈走行方向一致的探針。探針直徑0.8mm。以眼科彎鑷將4號手術(shù)線繞到腎靜脈后方，將腎靜脈和探針一起結(jié)扎。注意結(jié)扎點需緊靠腎靜脈匯入下腔靜脈處，結(jié)扎點需位于精索內(nèi)靜脈匯入腎靜脈之后。緩緩抽出探針，見腎靜脈遠端因血壓增高而擴張。觀察無活動性出血，將腸管復(fù)位，用3號手術(shù)縫線3層縫合腹前壁。術(shù)后動物單只單籠飼養(yǎng)三天。

f精索靜脈曲張大鼠模型鑒定：

sd大鼠給予3.3ml/kg體重的7％水合氯醛腹腔注射，約5min后，大鼠處于深麻狀態(tài)。將動物保定于手術(shù)臺，腹部備皮，碘伏消毒一次，75％酒精消毒3次。于劍突下一橫指(約1.5cm)，沿腹白線縱行切開皮膚約5cm，而后切開腹白線，鈍性分離腹膜，進入腹腔。用浸過溫生理鹽水的紗布將腸管撥至腹腔外，鈍性分離腹后膜，暴露下腔靜脈，主動脈，雙側(cè)腎，腎蒂，精索內(nèi)靜脈。觀察左右側(cè)腎形態(tài)，大小；觀察左側(cè)精索內(nèi)靜脈是否存在迂曲和曲張；用游標卡尺測量左右側(cè)精索內(nèi)靜脈管徑。以左側(cè)腎無萎縮，左側(cè)精索內(nèi)靜脈管徑大于右側(cè)3倍視為建模成功。

g動物血清制備：

動物麻醉后右心房剪開采血，收集12-15ml靜脈血，冰上靜置30min后，4℃凝集過夜。5000g，4℃離心15min，收集上清；重新離心一次，5000g，4℃10min，收集上清。在超凈臺內(nèi)以0.22μm濾器過濾兩次，分裝為1.5ml/管，凍存于-80℃。

h大鼠心臟灌注，取材和冰凍切片：

sd大鼠給予3.3ml/kg體重的10％水合氯醛腹腔注射，約5min后，大鼠處于深麻狀態(tài)。從劍突處剪開胸腔，暴露心臟。用管徑約1.6mm的靜脈穿刺針從左心室插入升主動脈，快速灌注0.01mpbs，與此同時，剪開右心耳。在10min內(nèi)快速灌注500ml0.01mpbs，見右心耳流出液變清澈。緩慢滴注300-400ml4％多聚甲醛(0.01mpbs稀釋)，約50min，直到四肢僵直。

止血鉗從枕骨大孔撬開顱蓋，慢慢剝出腦，小心剪開視交叉處連接的視神經(jīng)。所有組織浸泡于≧10倍體積的4％多聚甲醛中固定24h。

梯度脫水：組織浸泡于梯度濃度的蔗糖液(0.01mpbs稀釋)，10％蔗糖24h→20％蔗糖24h→30％蔗糖24h。

組織修塊，包埋：切除視交叉前，菱形窩后腦組織。組織以o.c.t.包埋，在-20℃恒冷箱切片機中至少冷凍半小時。在-20℃切片，厚度20μm，貼片于陽離子粘附載玻片。

i腦冰凍切片尼氏染色：

采用pischinger氏亞甲藍染色法對下丘腦弓狀核神經(jīng)元進行染色。

(1)試劑配制：

①0.2n醋酸鹽緩沖液：冰醋酸1.2ml，雙蒸水100ml。

②亞甲基藍醋酸鹽緩沖液：亞甲基藍0.064g，0.2n醋酸鹽緩沖液2ml，雙蒸水98ml。

③4％鉬酸銨溶液：鉬酸銨4g，雙蒸水100ml。

(2)染色步驟：

①大鼠腦冠狀面冰凍切片，室溫平衡30min。

②浸入0.01mpbs中水化5min；浸入亞甲基藍醋酸鹽緩沖液中染色15min，室溫。

③以0.2n醋酸鹽緩沖液分色3min左右，顯微鏡下控制尼氏體清晰為止。

④浸入4％鉬酸銨溶液處理3min。

⑤雙蒸水洗滌，瀝干。

⑥梯度濃度酒精脫水(80％，90％，95％，100％，100％，每梯度3min)，二甲苯透明(二甲苯ⅰ5min，二甲苯ⅱ10min)，中性樹膠封片。

在200×顯微鏡下拍照，照片嵌入1cm×1cm網(wǎng)格，計數(shù)弓狀核位置細胞數(shù)量。每個動物觀察5張切片，每張切片觀察左側(cè)和右側(cè)弓狀核。比較各組單位面積(1cm2)神經(jīng)元數(shù)量。

j高爾基染色：

(1)配制高爾基染色液：

①a液(5％重鉻酸鉀)：稱取10g重鉻酸鉀溶于少量雙蒸水，并定容至200ml。

②b液(5％氯化汞)：稱取10g氯化汞溶于少量雙蒸水，并定容至200ml。

③c液(5％鉻酸鉀)：稱取8g鉻酸鉀溶于少量雙蒸水，并定容至160ml。

④將a液和b液混合，變混合邊攪拌。

⑤c液中加入400ml雙蒸水后，將a、b液的混合液緩慢倒入c液，不斷攪拌，避免沉淀產(chǎn)生，配制成高爾基染液。

⑥以上高爾基染液避光保存5天后使用。

(2)動物取材和染色：

①灌注：采用心臟灌注，灌注針從左心室插入大鼠主動脈并剪開右心房。先用300ml0.01mpbs快速沖凈血液(約10min)，再用200ml0.5％多聚甲醛(0.1mpb配制，ph7.2-7.4)緩慢灌注固定(約30min)。

②取大鼠腦，整腦浸入高爾基染液，避光，37℃，72h。

(3)包埋，切片，制片：

①修塊：冠狀切除視交叉前和菱形窩后腦組織后，4％瓊脂包埋。

②振蕩切片：在6％蔗糖溶液(0.1mpb配制)中冠狀切片，厚度200μm。

③0.1mpb中漂洗后，將切片裱至陽離子粘附載玻片，室溫晾干。

(4)脫水透明：切片浸入雙蒸水10min，50％酒精5min，75％氨水5min，雙蒸水5min，梯度酒精脫水(50％，50％，70％，80％，95％，100％，100％，每梯度7min)，二甲苯ⅰ10min，二甲苯ⅱ30min。中性樹膠封片。

在高倍鏡630×觀察弓狀核神經(jīng)元樹突棘，觀察的神經(jīng)元胞體必須位于弓狀核，選擇樹突在觀察全程無分支。計數(shù)20μm樹突上棘突的個數(shù)。計數(shù)每個樹突上50個樹突棘，觀察其形態(tài)，區(qū)分為細小形(絲狀)和短粗形(短粗、菌狀、杯狀)(表1)，計算每種樹突棘的百分比。每個動物觀察5張弓狀核位置的切片，每張切片每側(cè)弓狀核隨機觀察5個神經(jīng)元樹突。

表1高爾基染色樹突棘形態(tài)分類

k腦免疫組織熒光染色：

①取冰凍切片室溫平衡30min，浸入0.01mpbs水化5min。

②加10％山羊血清(0.01mpbs稀釋)，60ul/組織，室溫孵育30min。

③用一抗稀釋液稀釋一抗：山羊抗kiss1(稀釋度1:100)，兔抗gpr54(稀釋度1:100)和小鼠抗gnrh(稀釋度1:100)，60ul/組織，4℃，48h。

④0.01mpbs洗片，3min/次，3次。

⑤用0.01mpbs稀釋二抗(抗體信息和稀釋度見前)，60ul/組織，室溫孵育1h。

⑥0.01mpbs洗片，3min/次，3次。

⑦dapi染核3min，0.01mpbs洗片，3min/次，3次。

⑧避光晾干，用抗熒光淬滅劑封片。-20℃避光保存染色切片。lgnrhmrna原位雜交實驗

使用博士德gnrh原位雜交檢測試劑盒檢測腦冰凍切片gnrhmrna表達。

(1)工作液配制

3％檸檬酸：100mlddh2o溶解檸檬酸(c6h8o7·h2o)3g，ph2.0左右。

2×ssc：1000mlddh2o溶解氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(c6h5o7na3·2h2o)8.8g。

0.5×ssc：300mlddh2o加100ml2×ssc。

0.2×ssc：270mlddh2o加30ml2×ssc。

20％甘油：20ml甘油加入80mlddh2o，混勻。

原位雜交用pbs：1000mlddh2o加氯化鈉30g，na2hpo4·12h2o6g，nah2po4·2h2o0.4g，ph7.2-7.4。

(2)實驗步驟

①原位雜交實驗所使用的組織，在動物灌注的固定液中已經(jīng)加入0.1％depc，組織沉糖的蔗糖液中也加入0.1％depc，冰切所使用的陽離子粘附載玻片預(yù)先以0.1％depc浸泡。

冰凍切片室溫復(fù)溫30min，以原位雜交用pbs(此后簡稱為pbs)水化5min。

②30％h2o2：甲醇＝1:50混合，100μl/樣本，室溫處理30min。蒸餾水洗滌3次。

③暴露mrna核酸片段：1ml3％檸檬酸加2滴(100μl)濃縮型胃蛋白酶，混勻。100μl/樣本，37℃消化2min。pbs洗5min×3次，蒸餾水洗滌1次。

④后固定：固定液為1％多聚甲醛/0.1mpbs(ph7.2-7.6)，含1/1000depc。100μl/樣本，室溫固定10min，蒸餾水洗滌3次。

⑤預(yù)雜交：準備濕盒，在干的雜交盒底部加20％甘油20ml以保持濕度。按每個樣本20μl滴加預(yù)雜交液，40℃4h。吸取多余液體，不做洗滌。

⑥雜交：按每個樣本50μl滴加雜交液，濕盒中于40℃雜交過夜。

⑦洗滌：37℃預(yù)熱的2×ssc洗滌5min×2次；37℃預(yù)熱的0.5×ssc洗滌15min；37℃預(yù)熱的0.2×ssc洗滌15min×2次。

⑧封閉：滴加封閉液，80μl/樣本，37℃，30min，吸取多余液體，不洗滌。

⑨滴加生物素化鼠抗地高辛，80μl/樣本，37℃，60min。pbs洗滌5min×4次。

滴加sabc，80μl/樣本，37℃，20min。pbs洗滌5min×3次。

滴加生物素化過氧化物酶，80μl/樣本，37℃，20min。pbs洗滌5min×4次。

dab顯色：1mlddh2o加顯色劑a、b、c各一滴，混勻，100μl/樣本，顯色15min。

mayer蘇木素復(fù)染，充分水洗。

梯度酒精脫水：70％酒精1min→70％酒精1min→80％酒精1min→80％酒精1min→95％酒精3min→95％酒精3min→100％酒精3min→100％酒精3min。

二甲苯透明：二甲苯ⅰ5min→二甲苯ⅱ10min。中性樹膠封片。

⑩在200×顯微鏡下拍照，照片嵌入1cm×1cm網(wǎng)格，計數(shù)弓狀核位置陽性物數(shù)量。每個動物觀察5張切片，每張切片觀察左側(cè)和右側(cè)弓狀核。比較各組單位面積(1cm2)陽性物數(shù)量。

m免疫印跡實驗(westernblot)

(1)取材

切除視交叉前和菱形窩后腦組織，在恒冷箱切片機內(nèi)，-20℃，50μm厚度，切除弓狀核前腦組織。觀察到第三腦室下方開始由直線狀，過渡到下端圓形擴大時，以9號脊髓穿刺針(內(nèi)徑0.8mm)，以第三腦室為中線，正中隆起下邊緣為切線，向下扎入4mm。以注射器吸取200μlripa裂解液，推注入脊髓穿刺針，將組織推至1.5mlep管內(nèi)，冰上研磨，裂解30min。4℃離心(18000g)20min，取上清。

(2)蛋白濃度測定

蛋白濃度測定采用bca蛋白濃度測定試劑盒。

①蛋白標準品制備

以1ml0.01mpbs溶解蛋白標準品(5mg)，再取10μl稀釋至100μl，得終濃度0.5mg/ml的蛋白標準。

②bca工作液配制：

根據(jù)樣品數(shù)量，bca試劑a：試劑b＝50:1配制適量bca工作液，充分混勻。

③蛋白濃度測定：

a，將蛋白標準按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板的標準品孔中，每個標準品孔設(shè)置三個復(fù)孔，加0.01mpbs補足到20μl。

b，加1μl樣品(每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔)到樣品孔中，加0.01mpbs補足到20μl。

c，各孔加入200μlbca工作液，37℃孵育1h。

d，用酶標儀測定a562，根據(jù)標準品濃度和od值繪制標準曲線，再根據(jù)樣品od值帶入標準曲線求出濃度值，該濃度值乘以20得樣品濃度。

(3)tricine-sds-page凝膠配制

①緩沖液配制

a，10×陰極緩沖液：

tris12.114g

tricine17.920g

sds1g

ph約8.25，直接雙蒸水定容至100ml，無需另調(diào)ph。

b，10×陽極緩沖液：

tris12.114g

濃hcl1.88ml

調(diào)ph至8.9，雙蒸水定容至100ml。

c，3×gelbuffer(gb3×)

tris36.342g

濃hcl8.36ml

sds0.3g

調(diào)ph至8.45，雙蒸水定容至100ml。

d，ab-3(49.5％t，3％t)

丙烯酰胺48g

甲叉雙丙烯酰胺1.5g

雙蒸水定容至100ml。

e，ab-6(49.5％t，6％t)

丙烯酰胺46.5g

甲叉雙丙烯酰胺3g

雙蒸水定容至100ml。

②制膠

(4)電泳

采用伯樂垂直電泳儀，目的蛋白分子量1-20kd選用16％分離膠電泳，目的蛋白分子量20-100kd選用10％分離膠電泳。tricine專用陰極電泳液加滿卡槽內(nèi)，陽極電泳液加入卡槽外，保證陰極電泳液不外泄且電路通暢。單孔上樣30μg樣本蛋白，左側(cè)1號泳道上樣蛋白分子量標準。

穩(wěn)壓30v電泳到積層膠和分離膠分界處，穩(wěn)壓80v繼續(xù)電泳1h，穩(wěn)壓140v跑到玻板底部。

(5)轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜緩沖液：tris-base3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，加d.dw至1000ml。

切取合適分子量范圍的凝膠，切取與凝膠等大的pvdf膜(預(yù)先以甲醇活化)。取伯樂轉(zhuǎn)膜夾，按照黑面-海綿-三層濾紙-凝膠-pvdf膜-三層濾紙-海綿-白面的順序制作轉(zhuǎn)膜“三明治”，盡量避免氣泡。將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽，加滿電轉(zhuǎn)液，冰上電轉(zhuǎn)，小分子量(1-20kd)30min，穩(wěn)壓100v；大分子量(20-100kd)80min，穩(wěn)壓100v。

(6)麗春紅染色，切膜

將pvdf膜浸沒于麗春紅染色液，搖床搖動3min，以麗春紅染出條帶和蛋白分子量標準為參考，切膜，于tbst中漂洗至無紅色。

(7)封閉

pvdf條帶以5％脫脂奶粉(tbst稀釋)室溫搖床封閉1h。

(8)一抗孵育

以tbst稀釋一抗，pvdf膜浸沒于相應(yīng)的一抗，搖床孵育，4℃過夜。

(9)二抗孵育，檢測

tbst洗滌pvdf條帶，10min/次，3次。

以tbst稀釋hrp標記的二抗，pvdf膜浸沒于相應(yīng)的二抗，搖床孵育，室溫，2h。

tbst洗滌pvdf條帶，10min/次，3次。

向待檢測的pvdf條帶滴加適量ecl發(fā)光液，于生物分子成像儀檢測拍照。

條帶以imagej分析平均灰度值。以目的條帶與內(nèi)參β-actin的比值表示該目的蛋白的含量。

n統(tǒng)計學方法

使用imagepro-plus對免疫熒光圖片的單位熒光強度進行分析，使用imagej對免疫印跡實驗灰度值進行分析，使用ibmspss22.0進行統(tǒng)計分析。連續(xù)性計量資料使用z檢驗進行正態(tài)性檢驗，以p＞0.05視為正態(tài)分布總體。使用均數(shù)±標準差描述正態(tài)分布的總體特征，以單因素方差分析進行多組正態(tài)分布總體的比較，對于存在統(tǒng)計學差異的，以lsd法行兩兩比較。以p＜0.05視為存在統(tǒng)計學差異。結(jié)果：1巴戟天粗多糖提取和鑒定

5000g巴戟天干燥根經(jīng)水提醇沉和脫蛋白純化后，得393g灰色巴戟天粗多糖粉末。以葡萄糖為標準，檢定該巴戟天粗多糖中碳水化合物含量達91％。

紫外光譜顯示，在260nm和280nm處無明顯的蛋白和核酸的吸收峰(圖1)。紅外光譜也顯示，在3391(-oh),2931(c-h),1636(-oh),1385(酰胺中的c-h),1130(環(huán)上c-o),1032(醇羥基),936,873(α-型糖苷鍵)and818(甘露糖)cm-1處有多個多糖特征性吸收峰(括號中為該波數(shù)對應(yīng)的常見結(jié)構(gòu))(圖1).

2、血清激素水平

曲張組血清t、fsh、lh、gnrh水平較假手術(shù)組均顯著下降(p<0.05)。巴戟天粗多糖25-100mg/kg治療組大鼠血清t、fsh、lh、gnrh水平較曲張組均有所升高，其中：mop25組大鼠血清上述激素水平較曲張組升高，但無統(tǒng)計學意義；mop50組大鼠血清上述激素水平較曲張組升高(p<0.05)，但較假手術(shù)組仍有所降低(p<0.05)；mop100組大鼠血清上述激素水平基本達到假手術(shù)組水平(表2)。

mop200組大鼠血清t、fsh、lh水平較假手術(shù)組顯著增高(p<0.05)，而gnrh水平則表現(xiàn)為較假手術(shù)組顯著降低(p<0.05)(表2)。

表2各實驗組血清性激素水平

ap＜0.05：與假手術(shù)組相比；

bp＜0.05：與曲張組相比。

3、下丘腦弓狀核神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量

尼氏染色示曲張組下丘腦弓狀核神經(jīng)元密度較假手術(shù)組有所下降，100mg/kg巴戟天粗多糖治療組神經(jīng)元密度較曲張組有所增多(圖2，表3)。

高爾基染色示曲張組樹突棘密度較假手術(shù)組顯著下降(p<0.05)；曲張組短粗型樹突棘較假手術(shù)組顯著減少(p<0.05)。mop25組樹突棘密度較曲張組顯著增加(p<0.05)，且絲狀偽足較曲張組顯著增多(p<0.05)。mop50組和mop100組樹突棘密度較曲張組均顯著升高(p<0.05)；mop100組短粗型棘突較曲張組顯著增多(p<0.05),而絲狀偽足較假手術(shù)組顯著減少(p<0.05)；mop200組樹突棘密度較曲張組無明顯差別，短粗型棘突較曲張組明顯增多(p<0.05)(圖3，4，表2)。

表3各實驗組神經(jīng)元數(shù)量和突觸形態(tài)(均數(shù)±標準差)

ap＜0.05：與假手術(shù)組相比；

bp＜0.05：與曲張組相比。

4、弓狀核gnrh表達和轉(zhuǎn)錄

免疫熒光組織化學染色示gnrh陽性產(chǎn)物主要分布于弓狀核外側(cè)部和正中隆起。曲張組gnrh熒光強度較假手術(shù)組顯著降低(p<0.05)。巴戟天粗多糖50mg/kg和100mg/kg給藥組gnrh熒光強度較曲張組均顯著升高(p<0.05)，100mg/kg給藥組gnrh熒光強度在四個巴戟天粗多糖給藥組中最高(p<0.05)(圖5)。

westermblot示曲張后下丘腦gnrh蛋白含量較假手術(shù)組顯著下降(p<0.05)。100mg/kg巴戟天粗多糖顯著增加曲張后下丘腦gnrh蛋白水平(p<0.05)(圖6)。

原位雜交實驗示gnrhmrna主要分布于弓狀核中間部和外側(cè)部。曲張組gnrhmrna陽性產(chǎn)物密度較假手術(shù)組顯著降低(p<0.05)；mop50和mop100組gnrhmrna陽性產(chǎn)物密度較曲張組顯著增高(p<0.05)(圖5)。

熒光定量pcr示曲張組gnrh轉(zhuǎn)錄水平較假手術(shù)組顯著降低(p<0.05)；mop50和mop100組gnrh轉(zhuǎn)錄水平較曲張組顯著增高(p<0.05)；mop100組gnrh轉(zhuǎn)錄水平顯著高于mop50組(p<0.05)(圖5)。

5、弓狀核kiss1-gpr54系統(tǒng)

如圖5，免疫熒光示kiss1陽性產(chǎn)物主要分布于弓狀核中間部、外側(cè)部和正中隆起，而gpr54陽性產(chǎn)物主要分布于弓狀核中間部、外側(cè)部。曲張組kiss1和gpr54熒光強度較假手術(shù)組顯著增強(p<0.05)；mop50組和mop100組kiss1和gpr54熒光強度較曲張組更強(p<0.05)。

westermblot示曲張組kiss1和gpr54蛋白水平較假手術(shù)組顯著增高(p<0.05)；mop50組和mop100組kiss1和gpr54蛋白水平較曲張組更高(p<0.05)；mop100組kiss1和gpr54蛋白水平在4個巴戟天粗多糖給藥組中最高(p<0.05)。

westermblot示曲張組弓狀核磷酸化mapk(p38，p42/44)水平較假手術(shù)組顯著降低(p<0.05)；巴戟天粗多糖給藥組磷酸化mapk水平較曲張組均有顯著增高(p<0.05)；mop50組磷酸化p38水平在巴戟天粗多糖給藥組中最高(p<0.05)；mop50和mop100組磷酸化p42/44水平顯著高于其余2個巴戟天粗多糖給藥組(p<0.05)。

a，免疫印跡檢測細胞內(nèi)各蛋白水平；b，免疫印跡條帶灰度值分析?！鳎簆<0.05，與假手術(shù)組相比；*：p<0.05，與曲張組相比。

本實施例產(chǎn)生了以下效果：1、巴戟天粗多糖促進gnrh合成

本實驗發(fā)現(xiàn)50mg/kg和100mg/kg巴戟天粗多糖能夠有效提高實驗性精索靜脈曲張大鼠arc和megnrh水平，以100mg/kg巴戟天粗多糖的效果更佳。下丘腦gnrh是生殖調(diào)控的最終信號，直接調(diào)控垂體促性腺激素的合成，進而調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育，成熟及性激素的釋放。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，實驗性精索靜脈曲張可以導(dǎo)致下丘腦gnrh轉(zhuǎn)錄水平降低，gnrh表達下降，而巴戟天粗多糖給藥能夠在精索靜脈曲張進展期有效抑制gnrh的下降。

在實驗中，發(fā)現(xiàn)調(diào)控下丘腦gnrh轉(zhuǎn)錄的主要轉(zhuǎn)錄因子oct-1和scip的轉(zhuǎn)錄水平在實驗性精索靜脈曲張后顯著下降，與gnrh轉(zhuǎn)錄水平的下降相互印證，證實gnrh表達的下降來源于gnrh神經(jīng)元內(nèi)gnrh相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平的下降。而50-100mg/kg巴戟天粗多糖能夠明顯上調(diào)oct-1和scip的轉(zhuǎn)錄水平，相應(yīng)的，這兩組動物下丘腦和血清中g(shù)nrh含量也有明顯升高。以上實驗證實50-100mg/kg巴戟天粗多糖能夠有效修復(fù)實驗性精索靜脈曲張導(dǎo)致的gnrh合成下降。

2、巴戟天粗多糖恢復(fù)神經(jīng)元接收外界信號的能力

樹突棘是樹突上棘狀小突起，是神經(jīng)元之間形成突觸的主要部位，接受外界刺激，將信號傳入神經(jīng)元胞體。樹突棘形態(tài)各異，大致包括絲狀偽足，蘑菇狀突起，杯狀突起和短粗突起。其中絲狀偽足是幼稚樹突棘，其比例反應(yīng)樹突棘新生，而其余幾種樹突棘形態(tài)在本次研究中合并成為短粗樹突棘，為成熟樹突棘，其比例反映樹突接受外界信號的能力。本實驗觀察到，實驗性精索靜脈曲張術(shù)后下丘腦神經(jīng)元樹突棘密度顯著下降，短粗樹突棘顯著減少，提示實驗性精索靜脈曲張可能抑制下丘腦弓狀核神經(jīng)元樹突棘新生，減少功能性樹突棘數(shù)量，影響神經(jīng)元對外界信號的接收。而低劑量(25mg/kg)巴戟天粗多糖給藥就表現(xiàn)出明顯的提高絲狀樹突棘數(shù)量的作用，而50-100mg/kg巴戟天粗多糖能夠有效增加樹突棘數(shù)量和功能性樹突棘比率。因此，巴戟天粗多糖可能修復(fù)實驗性精索靜脈曲張對arc神經(jīng)元樹突棘可塑性的不良影響，恢復(fù)神經(jīng)元接收外界信號的能力。

3、巴戟天粗多糖增強kiss1-gpr54信號通路

本實驗檢測了arckiss1-gpr54系統(tǒng)的主要參與元件kiss1、gpr54、mapk在各實驗組的變化，發(fā)現(xiàn)實驗性精索靜脈曲張能夠增多arckiss1的表達，這與kiss1于病理條件下發(fā)揮促gnrh神經(jīng)元合成和分泌的作用一致。但磷酸化mapk水平在elv后顯著下降，這可能與樹突棘數(shù)量銳減，功能性樹突棘不足有關(guān)。而50-100mg/kg巴戟天粗多糖給藥后，arcgpr54表達上調(diào)，磷酸化mapk增多，提示kiss1-gpr54系統(tǒng)在巴戟天多糖給藥后更加活躍。而樹突棘密度的增多和功能性樹突棘數(shù)量的增多更有助于神經(jīng)元接收kiss1-gpr54系統(tǒng)的信號，從而能夠解釋gnrh神經(jīng)元合成分泌能力修復(fù)的現(xiàn)象。

此外，結(jié)合血清激素水平測定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)200mg/kg巴戟天粗多糖給藥能夠最大程度提高血清促性腺激素和睪酮的水平，但arcgnrh含量較其他給藥組低，且gpr54無明顯上調(diào)，磷酸化mapk水平也較其他給藥組低。這種現(xiàn)象可能與促性腺激素和性激素對gnrh的負反饋有關(guān)，提示200mg/kg巴戟天粗多糖可能對上調(diào)kiss1-gpr54系統(tǒng)和促進gnrh釋放的作用不佳。

綜上所述，50mg/kg–100mg/kg巴戟天粗多糖能夠有效修復(fù)實驗性精索靜脈曲張早期下丘腦gnrh合成和分泌能力。其機制可能與修復(fù)的樹突棘可塑性和上調(diào)kiss1-gpr54系統(tǒng)有關(guān)?？傊?，巴戟天粗多糖能夠通過刺激下丘腦gnrh的分泌而修復(fù)精索靜脈曲張所致血清性激素水平降低，這對垂體和睪丸功能的維持和修復(fù)至關(guān)重要。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。