本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑果腺肋花楸果實花青素提取物的制備方法。

背景技術(shù)：

黑果腺肋花楸，又名野櫻莓，不老莓，是集食用、藥用、園林和生態(tài)價值于一身的薔薇科落葉灌木。其果實甜酸略有微澀味，球形，果皮紫黑色，果肉暗紅色。黑果腺肋花楸果實富含大量營養(yǎng)物質(zhì)，如膳食纖維、糖類、蛋白質(zhì)、多酚類化合物，多酚類化合物是已知植物中含量最高的，多酚類化合物如酚酸、原花青素、花青素、黃酮醇等含量豐富，且與黑果腺肋花楸的生物活性密切相關(guān)?；ㄇ嗨睾忘S酮類化合物具有特殊的保健作用，可保護(hù)機(jī)體免受自由基損傷，有防癌、護(hù)肝等多種作用。因此黑果腺肋花楸果實具有明顯的保健作用。

黑果腺肋花楸果實常用于加工果汁飲料、果酒、果醬、果奶、糖果等產(chǎn)品，但由于黑果腺肋花楸果實中含有大量單寧，生食果實味道酸澀，口感不佳，不易被消費者接受，因此，迫切需要尋找一種能夠利用黑果腺肋花楸果有效成分，特別是花青素，同時克服黑果腺肋花楸果的不良口感的深加工方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種黑果腺肋花楸果實花青素提取物的制備方法，包括以下步驟：

1)對黑果腺肋花楸果實進(jìn)行脫脂處理；

2)然后經(jīng)混合酸水溶液提??；

3)樹脂純化提取浸液，獲得黑果腺肋花楸果實的干浸膏。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述黑果腺肋花楸果實花青素提取物的制備方法中，所述步驟1)中黑果腺肋花楸果實的脫脂處理為將黑果腺肋花楸果實自然晾干，使含水量低于7％重量，然后以液料比5：1(體積:質(zhì)量比)的石油醚(60℃～90℃)回流脫脂，低溫干燥，使含水量低于4％重量，得到預(yù)處理好的黑果腺肋花楸果實；更優(yōu)選地，所述石油醚回流脫脂次數(shù)為2次，每次30分鐘；更優(yōu)選地，所述低溫干燥的溫度為低于50℃。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述黑果腺肋花楸果實花青素提取物的制備方法中，所述步驟2)中混合酸為乙酸與蘋果酸按質(zhì)量比1：1混合而成，所述混合酸的ph為2～3；更優(yōu)選地，所述步驟2)混合酸水溶液提取方法為混合酸與預(yù)處理好的黑果腺肋花楸果實按液料比(體積:質(zhì)量)6：1進(jìn)行混合，于室溫條件下避光浸泡48h，過濾，獲得濾液與濾渣。

更優(yōu)選地，本發(fā)明所述黑果腺肋花楸果實花青素提取物的制備方法中，所述步驟2)中獲得的濾渣再以液料比5：1(體積:質(zhì)量)加入蒸餾水，調(diào)ph值至5～6，于避光條件下微波500w處理10min，然后轉(zhuǎn)移至水浴50℃保溫2h，再用所述混合酸將體系ph值調(diào)至2～3，水浴溫度調(diào)至60℃提取1h，過濾，將二次濾液合并，濾液減壓濃縮至與黑果腺肋花楸果實初始質(zhì)量的重量體積比為1，得到黑果腺肋花楸果實的提取浸液。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述黑果腺肋花楸果實花青素提取物的制備方法中，所述步驟3)中所述樹脂為d-101型大孔吸附樹脂，吸附速率為1.0ml/min，乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮得到黑果腺肋花楸果實的清膏，噴霧干燥即得黑果腺肋花楸果實的干浸膏。

更優(yōu)選地，本發(fā)明所述黑果腺肋花楸果實花青素提取物的制備方法中，所述黑果腺肋花楸果實的干浸膏粉碎后可進(jìn)一步獲得黑果腺肋花楸果實的粉劑。

本發(fā)明提供了上述方法獲得的黑果腺肋花楸果實花青素提取物——黑果腺肋花楸果實的干浸膏或粉劑，其中，所述黑果腺肋花楸果實的花青素提取物(干浸膏或粉劑)中花青素含量大于55％。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：黑果腺肋花楸果實可以作為提取花青素、多酚、黃酮等藥物及保健食品原料，但是由于果實中大量單寧等物質(zhì)，生食果實味道酸澀，口感不佳，不易被消費者接受；本發(fā)明創(chuàng)造性地在提取步驟前使用適當(dāng)脫脂等預(yù)處理方法，并獲得盡可能保留花青素的黑果腺肋花楸果實花青素提取物(干浸膏或粉劑)，其中花青素含量大于55％。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的一個實施例中的吸附流速對吸附率的影響示意圖；

圖2為本發(fā)明的一個實施例中的洗脫流速對解吸率的影響示意圖；

圖3為本發(fā)明的一個實施例中的乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響示意圖；

圖4為本發(fā)明的一個實施例中的洗脫液用量的考察示意圖；

具體實施方式

本發(fā)明的實施例中提供了一種黑果腺肋花楸果實花青素提取物的制備方法，包括以下步驟：

1)對黑果腺肋花楸果實進(jìn)行脫脂處理；

2)然后經(jīng)混合酸水溶液提取；

3)樹脂純化提取浸液，獲得黑果腺肋花楸果實的干浸膏。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟1)中黑果腺肋花楸果實的脫脂處理為將黑果腺肋花楸果實自然晾干，使含水量低于7％重量，然后以液料比5：1(體積:質(zhì)量比)的石油醚(60℃～90℃)回流脫脂，低溫干燥，使含水量低于4％重量，得到預(yù)處理好的黑果腺肋花楸果實。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實施例中，所述石油醚回流脫脂次數(shù)為2次，每次30分鐘。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實施例中，所述低溫干燥的溫度為低于50℃。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟2)中混合酸為乙酸與蘋果酸按質(zhì)量比1：1混合而成，所述混合酸的ph為2～3。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實施例中，所述步驟2)混合酸水溶液提取方法為混合酸與預(yù)處理好的黑果腺肋花楸果實按液料比(體積:質(zhì)量)6：1進(jìn)行混合，于室溫條件下避光浸泡48h，過濾，獲得濾液與濾渣。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實施例中，所述步驟2)中獲得的濾渣再以液料比5：1(體積:質(zhì)量)加入蒸餾水，調(diào)ph值至5～6，于避光條件下微波500w處理10min，然后轉(zhuǎn)移至水浴50℃保溫2h，再用所述混合酸將體系ph值調(diào)至2～3，水浴溫度調(diào)至60℃提取1h，過濾，將二次濾液合并，濾液減壓濃縮至與黑果腺肋花楸果實初始質(zhì)量的重量體積比為1，得到黑果腺肋花楸果實的提取浸液。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟3)中所述樹脂為d-101型大孔吸附樹脂，吸附速率為1.0ml/min，乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮得到黑果腺肋花楸果實的清膏，噴霧干燥即得黑果腺肋花楸果實的干浸膏。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實施例中，將得到的黑果腺肋花楸果實的提取浸液，加入乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為70％，靜置24h，過濾，濾液濃縮至相對密度為1.18～1.25(60℃)的清膏，加蒸餾水分散成濃度為0.50g/ml(相當(dāng)于原黑果腺肋花楸果實)的分散液，經(jīng)過d-101型大孔吸附樹脂吸附，吸附速率為1.0ml/min，然后用4倍柱體積的體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇水溶液(用混合酸調(diào)ph值為2～3)以2.0ml/min的流速洗脫，收集洗脫液，濃縮至相對密度為1.15～1.20(60℃)的清膏，噴霧干燥制成干浸膏，將上述干浸膏粉碎成細(xì)粉，即得黑果腺肋花楸果實花青素提取物，其花青素含量為58.48％。

在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，所述提取步驟中，提取溶劑為ph值為2～3的混合酸水溶液；液料比優(yōu)選為6:1；微波功率優(yōu)選為500w；微波時間優(yōu)選為10min；水浴保溫時間為2h；水浴提取時間為1h；提取水浴溫度優(yōu)選為60℃。

在本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施例中，所述純化步驟中，上樣液質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.50g/ml(相當(dāng)于原黑果腺肋花楸果實)；吸附流速優(yōu)選為1.0ml/min；洗脫液為ph值為2～3的50％乙醇水溶液；洗脫流速優(yōu)選為2.0ml/min；洗脫液體積優(yōu)選為4倍柱體積。

在本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施例中，所述純化步驟中，醇沉中的乙醇體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為70％。

下面將結(jié)合本發(fā)明中的實施例，對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實施例1黑果腺肋花楸果實花青素提取物的制備

1、黑果腺肋花楸果實的預(yù)處理：將黑果腺肋花楸果實自然晾干，使含水量低于7％，然后以液料比5：1(體積ml:質(zhì)量g)的石油醚(60～90℃)回流處理2次，每次30min，主要除去黑果腺肋花楸果實中的脂類、色素等，將脫脂后的黑果腺肋花楸果實在干燥箱中低于50℃進(jìn)行干燥，使含水量低于4％，得到預(yù)處理好的黑果腺肋花楸果實；

2、提?。簩㈩A(yù)處理好的黑果腺肋花楸果實與混合酸水溶液(混合酸水溶液的ph值為2～3，混合酸為乙酸與蘋果酸按質(zhì)量比1：1混合而成)按液料比(體積ml:質(zhì)量g)6：1進(jìn)行混合，于室溫條件下避光浸泡48h，過濾，濾液備用，濾渣以液料比6：1(體積ml:質(zhì)量g)加入蒸餾水(以上述混合酸調(diào)至ph值為5～6)，于避光條件下微波500w處理10min，然后轉(zhuǎn)移至水浴50℃保溫2h，再用混合酸將體系ph值調(diào)至2～3，水浴溫度調(diào)至60℃提取1h，過濾，將上述二次濾液合并，濾液減壓濃縮至相對密度為1.20～1.35(60℃)，得到黑果腺肋花楸果實的提取浸液；

3、純化：將步驟2中得到的黑果腺肋花楸果實的提取浸液，加入乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為70％，靜置24h，過濾，濾液濃縮至相對密度為1.18～1.25(60℃)的清膏，加蒸餾水分散成濃度為0.50g/ml(相當(dāng)于原黑果腺肋花楸果實)的分散液，經(jīng)過d-101型大孔吸附樹脂吸附，吸附速率為1.0ml/min，然后用4倍柱體積的體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇水溶液(用混合酸調(diào)ph值為2～3)以2.0ml/min的流速洗脫，收集洗脫液，濃縮至相對密度為1.15～1.20(60℃)的清膏，噴霧干燥制成干浸膏，將上述干浸膏粉碎成細(xì)粉，即得黑果腺肋花楸果實花青素提取物，其花青素含量為58.48％。

4、提取溶劑種類對提取效果的影響

提取溶劑設(shè)定為ph值為2～3的混合酸水溶液，分別于室溫條件下避光浸泡48h，微波功率500w，微波處理10min，50℃保溫2h，提取水浴溫度60℃，以液料比6:1加入提取溶劑進(jìn)行提取1h，總花青素提取率為20.52mg/g。

通過多次試驗發(fā)現(xiàn)提取溶劑為ph值為2～3的混合酸水溶液，微波功率為500w，微波時間為10min，選擇液料比(6:1、7:1、8:1)、水浴保溫時間(1.5、2.0、2.5h)、水浴提取時間(0.5、1.0、1.5h)、水浴提取溫度(55、60、65℃)進(jìn)行實驗。

5、正交試驗結(jié)果及工藝驗證試驗：正交試驗結(jié)果表明，最佳提取條件為a1b2c2d2，即提取溶劑為ph值為2～3的混合酸水溶液，微波功率為500w，微波時間為10min，液料比為6:1，水浴保溫時間為2h，水浴提取時間為1h，水浴提取溫度為60℃。三次工藝驗證試驗結(jié)果總花青素提取率分別為21.25mg/g、20.18mg/g、21.05mg/g，表明工藝穩(wěn)定可行。

6、大孔吸附樹脂類型的選擇：取已預(yù)處理好的ads-17、ads-f8、lsa-21、lsa-10、ab-8、lx-36、d-101、lsa-33濕樹脂各4g，分別加入100ml具塞三角瓶中，各加入上述質(zhì)量濃度已知的黑果腺肋花楸果供試品溶液60ml。25～30℃搖床震蕩吸附2h，靜置24h，分別取各樹脂吸附后的上清液3ml，置于10ml容量瓶或比色管中，加入0.1m檸檬酸水溶液定容。將上述靜態(tài)吸附的樹脂抽濾至干，放回至原來的具塞三角瓶中，25～30℃條件下各加入100ml80％乙醇解吸，25～30℃搖床震蕩吸附2h，靜置24h，分別取各解吸液的上清液5ml，置于10ml容量瓶中，加入0.1m檸檬酸水溶液定容。對照空白試管吸取相同量的黑果腺肋花楸果供試品溶液，在定容前加入0.5ml10％na2so3溶液?；靹颍o置5min后分別于1cm的比色皿中。按照紫外可見分光光度法，在517nm處測定其吸光度值a，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中總花青素的含量，計算各樹脂對總花青素的吸附率及解吸率，吸附率為96.55％、解吸率為98.78％。結(jié)果表明d-101型大孔吸附樹脂對黑果腺肋花楸果的純化效果最理想。

動態(tài)吸附曲線的考察：取處理好的樹脂30g于樹脂柱內(nèi)，精密吸取黑果腺肋花楸果供試品溶液500m，緩慢上柱，以1.0ml/min的流速進(jìn)行動態(tài)吸附，收集流出液，開始每15ml為1個流份，共8個，從第9個開始每30ml為一個流份，共12個，吸取不同流份過柱液適量，置于10ml容量瓶中，加入0.1m檸檬酸水溶液定容。對照空白試管吸取相同量的黑果腺肋花楸果總花青素溶液，在定容前加0.5ml10％na2so3溶液?；靹?，靜置5min后分別于1cm的比色皿中。按照紫外可見分光光度法，在517nm處測定其吸光度值a，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中總花青素的含量。以過柱液體積為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)作圖，即得動態(tài)吸附曲線。由試驗結(jié)果可知，當(dāng)收集到第10個流份時，流出液中總花青素的質(zhì)量濃度已大于原黑果腺肋花楸果供試品溶液中總花青素的質(zhì)量濃度的10％，認(rèn)為達(dá)到了目標(biāo)物的泄漏點。所以黑果腺肋花楸果供試品溶液的體積與樹脂質(zhì)量的比值(l：kg)為6：1。

吸附流速的考察：如圖1所示，取6份處理好的樹脂30g，分別加入到樹脂柱內(nèi)，精密吸取6份黑果腺肋花楸果供試品溶液180ml，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml/min的流速進(jìn)行吸附，吸附完全后，分別收集過柱液，記錄體積，分別測定流出液中總花青素含量，計算各流速下的吸附率，吸附率分別為94.34％、92.58％、88.37％、82.14％、74.64％、68.53％。由試驗結(jié)果可知，吸附流速越慢，吸附率越高。吸附流速越大，吸附率越低，在吸附速率為0.5～1.0ml/min范圍內(nèi)，吸附率較高，且吸附率變化不明顯，考慮到吸附流速越慢耗費的時間也就越長，上樣過程周期就越長，所以綜合考慮將上樣液吸附流速確定為1.0ml/min，既保證了上樣進(jìn)度，又能得到較好的吸附率。

洗脫流速的選擇：如圖2所示，取6份處理好的樹脂30g，分別加入到樹脂柱內(nèi)，精密吸取6份黑果腺肋花楸果供試品溶液180ml，以1.0ml/min的流速進(jìn)行吸附，吸附完全后，然后以50％乙醇水溶液100ml為洗脫劑，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml/min流速洗脫，吸取不同洗脫液適量，置于10ml容量瓶中，加入0.1m檸檬酸水溶液定容。對照空白試管吸取相同量的黑果腺肋花楸果總花青素溶液，在定容前加入0.5ml10％na2so3溶液?；靹颍o置5min后分別于1cm的比色皿中。按照紫外可見分光光度法，在517nm處測定其吸光度值a，計算解吸率，解吸率分別為97.27％、96.48％、95.15％、93.28％、86.23％、80.58％。實驗結(jié)果表明洗脫流速在0.5～2.0ml/min范圍內(nèi)時解吸量、解吸率較高，且變化不大，只有當(dāng)洗脫流速＞2.0ml/min時的解吸量、解吸率才會出現(xiàn)明顯下降。所以綜合考慮將洗脫液洗脫流速確定為2.0ml/min。

洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇：如圖3所示，取6份處理好的樹脂30g，分別加入到樹脂柱內(nèi)，精密吸取6份黑果腺肋花楸果供試品溶液180ml，以1.0ml/min的流速進(jìn)行吸附，吸附完全后，然后分別以水、10％、30％、50％、70％、90％乙醇100ml為洗脫劑進(jìn)行洗脫，吸取不同洗脫液適量，置于10ml容量瓶中，加入0.1m檸檬酸水溶液定容。對照空白試管吸取相同量的黑果腺肋花楸果總花青素溶液，在定容前加入0.5ml10％na2so3溶液。混勻，靜置5min后分別于1cm的比色皿中。按照紫外可見分光光度法，在517nm處測定其吸光度值a，計算解吸率，解吸率分別為37.46％、45.57％、70.39％、97.08％、86.23％、74.47％。結(jié)果表明隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率呈現(xiàn)先逐漸升高而后下降的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50％時，解吸率最大，選用50％乙醇水溶液作為洗脫液。

洗脫液ph值的選擇：取6份處理好的樹脂30g，分別加入到樹脂柱內(nèi)，精密吸取6份黑果腺肋花楸果供試品溶液180ml，以1.0ml/min的流速進(jìn)行吸附，吸附完全后，然后將50％乙醇水溶液用混合酸分別調(diào)ph值為1～2、2～3、3～4、4～5、5～6、6～7，以2.0ml/min流速洗脫，吸取不同洗脫液適量，置于10ml容量瓶中，加入0.1m檸檬酸水溶液定容。對照空白試管吸取相同量的黑果腺肋花楸果總花青素溶液，在定容前加入0.5ml10％na2so3溶液。混勻，靜置5min后分別于1cm的比色皿中。按照紫外可見分光光度法，在517nm處測定其吸光度值a，計算解吸率，解吸率分別為80.85％、97.11％、92.31％、88.24％、84.62％、82.53％。實驗結(jié)果表明洗脫液ph值在2～3范圍內(nèi)解吸率較高。

洗脫液用量的考察：如圖4所示，取6份處理好的樹脂30g，分別加入到樹脂柱內(nèi)，精密吸取6份黑果腺肋花楸果供試品溶液180ml，以1.0ml/min的流速進(jìn)行吸附，吸附完全后，然后用ph值為2～3的50％乙醇水溶液以2.0ml/min流速洗脫，按每個15ml收集洗脫液，共收集20個流份，吸取不同流份洗脫液適量，置于10ml容量瓶中，加入0.1m檸檬酸水溶液定容。對照空白試管吸取相同量的黑果腺肋花楸果總花青素溶液，在定容前加入0.5ml10％na2so3溶液，混勻，靜置5min后分別于1cm的比色皿中。按照紫外可見分光光度法，在517nm處測定其吸光度值a，計算不同流份洗脫液中總花青素的質(zhì)量濃度，質(zhì)量濃度分別為0.59mg/ml、2.28mg/ml、1.54mg/ml、0.72mg/ml、0.22mg/ml、0.067mg/ml、0.044mg/ml、0.015mg/ml、0.013mg/ml、0.013mg/ml、0.014mg/ml、0.011mg/ml、0.010mg/ml、0.011mg/ml、0.09mg/ml、0.09mg/ml、0.011mg/ml、0.09mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml。試驗結(jié)果表明第8個流份以后洗脫液中總花青素質(zhì)量濃度基本不變，故用120ml(約相當(dāng)于樹脂柱體積的4倍)50％乙醇水溶液(ph值為2～3)即可將總花青素基本洗脫完全。即洗脫液體積與樹脂質(zhì)量之比(l：kg)為4：1。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。