專利名稱:難治性創(chuàng)傷的治療劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含具有人類白細胞彈性蛋白酶抑制活性的物質作為有效成分的難治性創(chuàng)傷的治療劑。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)具有人類白細胞彈性蛋白酶抑制活性的物質對于難治性創(chuàng)傷的治療有效，從而完成了本發(fā)明。
(1)WS7622A單或二硫酸酯以及它們的藥學上可接受的鹽其中WS7622A二硫酸酯的二鈉鹽和WS7622A二硫酸酯的二鉀鹽分別是具有下述物理化學性質的已知物質(特開平4-279600號公報)WS7622A二硫酸酯的二鈉鹽外觀無色結晶溶解性可溶水、甲醇不可溶氯仿、正己烷熔點257-263℃(分解)比旋光度[α]23D+37.5°(C＝1，甲醇)分子式C17H61N9O19S2Na2元素分析計算值(相對于C17H61N9O19S2Na2·6H2O)C 44.30，H 5.77，N 9.89， S 5.03，Na 3.61％實測值C 44.98，H 5.90，N 10.09，S 5.00，Na 3.98％分子量FAB-MS m/z 1188(M+Na)+薄層色譜法固定相展開溶劑Rf值硅膠 CHCl3-CH3OH-H2O 0.11MerckArt 5715 (65∶25∶4)正丁醇-乙酸-水 0.29(4∶2∶1)紅外吸收光譜νKBrmax3360，2960，1735，1660，1640，1530，1500，1380，1250，1200，1060，1030，940，890cm-11H核磁共振波譜(400MHz，D2O)δ7.50 (1H，s)7.27 (1H，s)7.33-7.24 (3H，m)6.94 (1H，q，J＝7Hz)6.85 (2H，br，d，J＝8Hz)5.53 (1H，m)5.37 (1H，m)4.80 (1H，br，s)4.63-4.57 (2H，m)4.53 (1H，m)4.06 (1H，m)3.99 (1H，d，J＝10Hz)3.56 (1H，br，d，J＝14Hz)3.46 (1H，m)2.97 (3H，s)2.97-2.88 (2H，m)2.72 (1H，m)2.59 (1H，m)2.51-2.38 (2H，m)2.09-1.91 (4H，m)1.82-1.60 (3H，m)1.77 (3H，d，J＝7Hz)1.50 (3H，d，J＝6.5Hz)1.40 (1H，m)1.11 (6H，d，J＝7Hz)0.99 (3H，d，J＝6.5Hz)0.97 (3H，d，J＝6.5Hz)13C核磁共振波譜(100MHz，D2O)δ183.6 (s)177.9 (s)177.7 (s)174.8 (s)173.8 (s)173.3 (s)172.4 (s)167.8 (s)161.5 (s)145.5 (s)144.9 (s)139.6 (d)139.0 (s)137.0 (s)136.0 (s)132.3 (d)×2131.0 (d)×2129.6 (d)127.4 (d)125.9 (d)77.4 (d)75.1 (d)63.8 (d)62.7 (d)59.1 (d)55.9 (d)54.9 (d)51.9 (d)41.9 (t)37.2 (d)36.9 (t)34.1 (q)32.3 (d)31.9 (t)31.8 (t)
31.2 (t)27.5 (t)23.7 (t)21.7 (q)21.4 (q)×221.3 (q)21.1 (q)15.5 (q)氨基酸分析將WS7622A二硫酸酯的二鈉鹽(1mg)在6N鹽酸(1ml)、110℃、20小時的條件下進行水解，用日立835型自動氨基酸分析儀測定減壓干燥得到的混合物。使用和光純藥工業(yè)(株)的H型(和光代碼013-08391)與B型(016-08641)作為氨基酸標準樣品。
結果，檢測出了蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、氨和幾種未知茚三酮陽性成分。
提出WS7622A二硫酸酯的二鈉鹽的部分化學結構式為下式 WS7622A二硫酸酯的二鉀鹽外觀無色無定形粉末溶解性可溶水、甲醇不可溶氯仿、正己烷熔點230-237℃(分解)比旋光度[α]23D+34°(C＝1，甲醇)分子式C17H61N9O19S2K2元素分析計算值(相對于C17H61N9O19S2K2·6H2O)C 43.21，H 5.63，N 9.65，S 4.91，K 5.99％實測值C 43.96，H 5.44，N 9.97，S 5.09，K 4.49％分子量FAB-MS m/z 1236(M+K)+薄層色譜法固定相展開溶劑Rf值硅膠 CHCl3-CH3OH-H2O 0.13Merck Art 5715 65∶25∶4紅外吸收光譜νKBrmax3360，2960，1735，1660，1640，1530，1500，1405，1380，1250，1200，1050，1030，940，890cm-11H核磁共振波譜(400MHz，D2O)67.52 (1H，s)7.28 (1H，s)7.34-7.25 (3H，m)6.96 (1H，q，J＝7Hz)6.87 (2H，br，d，J＝8Hz)5.56 (1H，m)5.40 (1H，m)4.84 (1H，br，s)4.70-4.55 (3H，m)4.10 (1H，m)
4.03 (1H，m)3.60 (1H，br，d，J＝14Hz)3.50 (1H，m)3.00 (3H，s)3.00-2.85 (2H，m)2.76 (1H，m)2.62 (1H，m)2.55-2.40 (2H，m)2.12-1.95 (4H，m)1.90-1.65 (3H，m)1.79 (3H，d，J＝7Hz)1.53 (3H，d，J＝6.5Hz)1.45 (1H，m)1.14 (6H，d，J＝7Hz)1.02 (3H，d，J＝6.5Hz)1.00 (3H，d，J＝6.5Hz)氨基酸分析將WS7622A二硫酸酯的二鉀鹽(1mg)在6N鹽酸(1ml)、110℃、20小時的條件下進行水解，用日立835型自動氨基酸分析儀測定減壓干燥得到的混合物。使用和光純藥工業(yè)(株)的H型(和光代碼號013-08391)與B型(016-08641)作為氨基酸標準樣品。
結果，檢測出了蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、氨和幾種未知茚三酮陽性成分。
提出WS7622A二硫酸酯的二鉀鹽的部分化學結構式為下式 WS7622A單或二硫酸酯的藥學上可接受的鹽的例子有堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽(如鈣鹽等)、銨鹽、乙醇胺鹽、三乙胺鹽、二環(huán)己胺鹽、吡啶鹽等與無機堿或有機堿的單或二鹽。
用于合成上述WS7622A單或二硫酸酯的原料WS7622A物質也具有人類白細胞彈性蛋白酶抑制活性，可以作為難治性創(chuàng)傷的治療劑使用。該物質作為具有下述物理化學性質的物質是已知的(特開平3-218387號公報、特開平4-279600號公報)。
WS7622A物質的物理化學性質外觀無色棱晶物質的性質酸性顯色反應陽性硫酸鈰反應、碘蒸氣反應、氯化鐵反應陰性茚三酮反應、莫里斯反應、德拉根道夫反應溶解性可溶甲醇、乙醇、正丁醇微溶氯仿、丙酮、乙酸乙酯不可溶水、正己烷薄層色譜法(TLC)氯仿-甲醇(5∶1體積比)Rf值0.51丙酮-甲醇(10∶1)Rf值0.62(Kiesel gel 60F251硅膠板，Merck公司)熔點250-252℃(分解)比旋光度[α]23D+36°(C＝1，甲醇)UV光譜λMeOHmax287nm(ε＝3600)λMeOH-HClmax287nmλMeOH-NaOHmax298nm分子式C17H63N9O13元素分析計算值(相對于C17H63N9O13·2H2O)C 56.56，H 6.77，N 12.63％實測值C 56.65，H 6.62，N 12.27％分子量FAB-MS m/z 984(M+Na)+紅外吸收光譜νKBrmax3400，3300，3060，2980，2940，1735，1710，1690，1670，1660，1640，1540，1520，1470，1380，1330，1300，1260，1220，1200，1160，1130，1090，1000，980，940，920cm-11H核磁共振波譜(400MHz，CD3OD)δ7.22-7.09 (3H，m)6.88-6.77 (3H，m)6.74 (1H，s)6.46 (1H，s)5.46 (1H，m)5.18 (1H，s)4.85 (1H，s)4.77 (1H，m)4.65 (1H，m)4.50 (1H，m)3.96 (1H，m)3.91 (1H，d，J＝9Hz)3.60-3.47 (2H，m)3.03 (1H，m)2.90 (3H，s)2.86 (1H，m)2.59-2.49 (2H，m)2.39 (1H，m)2.29-2.16 (2H，m)2.00 (1H，m)1.84 (1H，m)1.74 (3H，d，J＝6Hz)1.72-1.53 (4H，m)1.44 (3H，d，J＝6Hz)1.12 (1H，m)1.10 (6H，d，J＝6Hz)0.99 (3H，d，J＝6Hz)0.94 (3H，d，J＝6Hz)13C核磁共振波譜(100MHz，CD3OD)δ179.7 (s)176.3 (s)174.7 (s)173.3 (s)172.4 (s)171.4 (s)170.3 (s)165.8 (s)160.2 (s)145.7 (s)145.6 (s)137.5 (s)134.0 (d)131.4 (s)130.6 (d)×2129.8 (s)129.1 (d)×2129.1 (s)127.6 (d)119.1 (d)118.0 (d)76.0 (d)73.4 (d)63.1 (d)61.4 (d)57.1 (d)53.6 (d)52.7 (d)50.5 (d)39.9 (t)36.1 (t)35.8 (d)31.8 (q)31.0 (t)30.8 (d)29.9 (t)29.7 (t)
25.2 (t)22.3 (t)20.2 (q)20.0 (q)×219.7 (q)19.5 (q)13.3 (q)氨基酸分析將WS7622A(1mg)在6N鹽酸(1ml)、110℃、20小時的條件下進行水解，用日立835型自動氨基酸分析儀測定減壓干燥得到的混合物。使用和光純藥工業(yè)(株)的H型(和光代碼013-08391)與B型(016-08641)作為氨基酸標準樣品。
結果，檢測出了蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、氨和幾種未知茚三酮陽性成分。
提出WS7622A的部分化學結構式為下式 WS7622A物質的鹽的例子有堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽(如鈣鹽等)、銨鹽、乙醇胺鹽、三乙胺鹽、二環(huán)己胺鹽等與無機堿或有機堿形成的鹽。
同樣，具有人類白細胞彈性蛋白酶抑制活性的WS7622B、C和D物質以及它們的衍生物(特開平3-218387號公報)也可以作為難治性創(chuàng)傷的治療劑使用。
上述WS7622A物質(WS7622B、C和D物質也同樣)可以通過例如拒霉素鏈霉菌(streptomyces resistomycificus)7622號菌株的培養(yǎng)來制造。該菌株保藏在布達佩斯條約的國際保存單位工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所，保藏號為FERM BP-2306。
(2)式 [式中R1表示具有1個或2個選自羧基、酯化羧基和二低級烷基氨基甲?；娜〈牡图壨榛?；苯基部分上可以具有鹵原子、氨基或硝基、烷基部分上可以具有羧基或酯化羧基的苯基(低級)烷基；鹵代苯基；嗎啉基；或者嗎啉基(低級)烷基，R2和R3分別表示低級烷基，X表示-或-NH-，Y表示 或
]所示三氟甲基酮衍生物及其藥學上可接受的鹽。
(3)式 [式中R1-R3與上述(2)的化合物的含義相同]所示三氟甲基酮衍生物及其藥學上可接受的鹽。
(4)3(RS)-[[4-(羧甲基氨基羰基)苯基羰基]-L-纈氨?；?L-甫氨酰基]氨基-1，1，1-三氟-4-甲基-2-氧代戊烷或其鈉鹽。
上述(2)-(4)中所述化合物是例如特開平4-297446號公報中記載的已知化合物。此外，(2)-(4)的化合物的藥學上可接受的鹽的例子有堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽(如鈣鹽等)、銨鹽、乙醇胺鹽、三乙胺鹽、二環(huán)己胺鹽等與無機或有機堿形成的鹽；以及甲磺酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等有機或無機酸加成鹽。
以下對前面定義的適合的例子進行詳細說明。除特別指出外，“低級”是指碳原子數(shù)為1-6。適合的“鹵素”的例子有氟、氯、溴和碘。適合的“低級烷基”的例子為具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷烴的殘基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基等，優(yōu)選具有1-4個碳原子的基團。適合的“酯化羧基”的例子為烷基酯即烷氧羰基，例如低級烷氧羰基(如甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、丁氧羰基、叔丁氧羰基等)、苯基(低級)烷基酯即苯基(低級)烷氧羰基如芐氧羰基以及苯甲?；?低級)烷基酯即苯甲酰基(低級)烷氧羰基如苯甲?；籽豸驶取?br> 適合的“低級亞烷基”的例子有亞甲基、亞乙基、亞丙基、異亞丙基等。適合的“二低級烷基氨基甲?；钡睦佑蠳，N-二甲基氨基甲?；，N-二乙基氨基甲?；取?br> (5)具有下述物理化學性質的FR901451物質及其藥學上可接受的鹽外觀白色粉末顯色反應陽性硫酸鈰、碘蒸氣、Ehrlich、茚三酮陰性Molisch溶解性可溶水、甲醇、二甲基亞砜難溶丙酮不溶乙酸乙酯熔點243-245℃(分解)比旋光度[α]23D-15°(C＝0.65，H2O)紫外線吸收光譜λMeOHmaxnm(ε)275(4300)，281(4500)，290(3900)分子式C60H79N13O18元素分析相對于C60H79N13O18·10H2O計算值C 49.68，H 6.88，N 12.55實測值C 49.95，H 6.28，N 12.42分子量FAB-MS m/z 1270(M+H)+薄層色譜法固定相展開溶劑Rf值硅膠 CHCl3∶MeOH∶NH4OH 0.60(Merck) (15∶11∶5)RP-18 70％含水甲醇 0.32(Merck)FT紅外吸收光譜νKBrmax3390，3070，2970，2880，1740，1660，1530，1450，1410，1380，1350，1250，1190，1110，1080，1010，750， 700，670， 660， 620，600cm-11H核磁共振波譜(400MHz，D2O)δ7.70 (1H，d，J＝7Hz)7.52 (1H，d，J＝7.5Hz)7.44-7.23 (7H，m)7.22 (1H，s)5.59 (1H，q，J＝7Hz)4.94 (1H，t，J＝4.5Hz)4.85-4.74 (3H，m)
4.58 (1H，dd，J＝6Hz，10Hz)4.45-4.35 (3H，m)4.30 (1H，dd，J＝4Hz，7Hz)4.07 (1H，m)3.99 (1H，dd，J＝10Hz，4.5Hz)3.66-3.50 (3H，m)3.44-3.25 (4H，m)3.16-2.93 (4H，m)2.87 (1H，d，J＝18Hz)2.80-2.68 (2H，m)2.56-2.48 (2H，m)2.08 (1H，dd，J＝16Hz，4Hz)1.87-1.53 (9H，m)1.43 (3H，d， J＝7Hz)1.30 (3H，d，J＝6.5Hz)1.45-1.17 (4H，m)0.95 (3H，d，J＝6Hz)0.84 (3H，d，J＝6Hz)13C核磁共振波譜(100MHz，D2O)δ177.2(s) 130.0(d)×2 56.0(d) 31.4(t)176.5(s) 129.8(d)×2 54.1(d) 28.8(t)174.6(s) 128.5(d) 53.8(d) 26.6(t)174.2(s) 127.8(s) 53.2(d) 25.1(d)174.0(s) 125.5(d) 53.1(d) 23.2(q)173.2(s) 123.2(d) 52.9(d) 23.2(t)173.0(s) 120.9(d) 52.8(d) 23.1(t)172.8(s) 118.7(d) 49.5(d) 20.8(q)172.6(s) 113.1(d) 48.6(t) 19.4(q)172.5(s) 108.8(s) 40.1(t) 18.3(q)172.1(s) 73.3(d) 39.6(t)171.7(s) 69.7(d) 39.4(t)171.4(s) 64.3(t) 38.9(t)170.3(s) 62.1(d) 35.3(t)137.2(s) 60.9(d) 34.8(t)136.0(s) 57.1(d) 31.7(t)已知上述FR901451物質是屈撓桿菌(flexibacter)屬的FR901451物質生產(chǎn)菌所生產(chǎn)的物質(例如國際公開號WO93/02203號公報)。該生產(chǎn)菌的一株屈撓桿菌種名待定的758號菌株保藏在布達佩斯條約的國際保存單位工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所，保藏號為FERM BP-3420。
上述FR901451物質的藥學上可接受的鹽的例子為作為上述(2)-(4)中記載的化合物的藥學上可接受的鹽的例子所舉出的那些鹽。
除此之外，具有彈性蛋白酶抑制活性的物質的例子有α1-抗胰蛋白酶、SLP1(分泌性白細胞蛋白酶抑制劑)(American Review ofRespiratory Disease，147卷，1993，442-446頁)、尿抑素(urinastatin)、秋水仙堿、紅霉素、clarithromycin、IC1200、880、ONO-5046(AmericanJournal of Respiratory and Critical Care Medicine，153卷，391-397頁)、抗彈性蛋白酶抗體等。
本發(fā)明的難治性創(chuàng)傷的例子有皮膚(例如褥瘡、伴隨糖尿病的腳潰瘍等)、腳、胃及角膜等的潰瘍等，其中特別適合伴隨糖尿病的腳潰瘍等難治性皮膚潰瘍的治療。
本發(fā)明的難治性創(chuàng)傷的治療劑例如在難治性皮膚潰瘍的情況下通常作為外用劑(例如洗劑、軟膏劑、貼附劑、擦劑、氣霧劑、懸浮液、乳劑等)使用，除此之外，可以以粉劑、細顆粒劑、顆粒劑、片劑、糖衣片、注射劑、吸入劑、微膠囊劑、膠囊劑、栓劑、液劑、糖漿等常用的藥劑形式使用。必要時，可以混入稀釋劑或崩解劑(如蔗糖、乳糖、淀粉、結晶性纖維素、低取代羥丙基纖維素、合成硅酸鋁等)、結合劑(如纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚丙基吡咯烷酮、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、阿拉伯樹膠、聚乙二醇等)、著色劑、甜味劑、潤滑劑(如硬脂酸鎂等)等。
本發(fā)明的難治性創(chuàng)傷的治療劑的用量雖然根據(jù)癥狀不同而不同，但一般在作為外用劑時，在具有人類白細胞彈性蛋白酶抑制活性的物質或其藥學上可接受的鹽為0.001-10％的范圍內使用較為適當。
接下來通過試驗例對本發(fā)明的效果進行說明。
試驗例(對糖尿病大鼠腳潰瘍的治愈促進作用)目的使用正常大鼠與糖尿病大鼠研究本發(fā)明的化合物(涂抹)對乙酸引發(fā)的腳潰瘍的作用。
使用化合物3(RS)-[[4-(羧甲基氨基羰基)苯基羰基]-L-纈氨?；?L-脯氨?；鵠氨基-1，1，1-三氟-4-甲基-2-氧代戊烷的鈉鹽(FR136706)方法向7周大的雄性SD大鼠通過尾靜脈內給予60mg/kg的鏈脲霉素(STZ)來誘發(fā)糖尿病。給予STZ14天后，對糖尿病大鼠和同周大的對照大鼠進行乙醚麻醉，向左腳背部的皮內給予20μL冰醋酸，使該部分壞死。2天后，在殘留有壞死的表皮的情況下，用外科手術將其除去。之后，開始給予FR136706(0.2％溶液，溶解在PEG(聚乙二醇)400中)(向每個患處涂抹50μL)。用PEG400對對照組進行同樣涂抹。
從給予乙酸2天后開始到25天后結束，通過目視評價腫脹得分(0無；1輕度；2中度；3高度)，此外，用游標卡尺測定潰瘍的長徑和短徑。由潰瘍的長徑和短徑算出潰瘍的面積。
結果
結果如下表所示。
正常大鼠的腫脹得分在測定開始日為最大。之后慢慢恢復，給予醋酸22日后腫脹得分變?yōu)?。而另一方面，糖尿病大鼠在給予醋酸7日后出現(xiàn)腫脹的最大值，雖然之后慢慢恢復，但其經(jīng)過比正常大鼠延遲。FR136706對于正常大鼠沒有顯示出作用，而對于糖尿病大鼠則促進了其恢復。
糖尿病大鼠的潰瘍面積也大于正常大鼠，此外，潰瘍的縮小也比正常大鼠緩慢。認為FR136706對于正常大鼠沒有顯示出作用，而對于糖尿病大鼠則有促進潰瘍面積縮小的趨勢。
對于腳潰瘍模型的作用


平均值±標準誤差(例數(shù))&、&&分別在5％、1％顯著(Wilcoxon排列和測定)[得分][在每個測定日，糖尿病大鼠的PEG400組和糖尿病大鼠的FR136706、0.2％組的得分][得分][在每個測定日，正常大鼠的PEG400組和糖尿病大鼠的PEG400組的得分]
對于腳潰瘍模型的作用


平均值±標準誤差(例數(shù))*、**分別在5％、1％顯著(Student-t或Aspin-Welch)[潰瘍面積][正常大鼠的PEG400組和糖尿病大鼠的PEG400組的各個測定日]
權利要求
1.含具有人類白細胞彈性蛋白酶抑制活性的物質作為有效成分的難治性創(chuàng)傷的治療劑。
專利摘要
提供難治性創(chuàng)傷的治療劑。含具有人類白細胞彈性蛋白酶抑制活性的物質作為有效成分的難治性創(chuàng)傷的治療劑。
文檔編號C12N9/00GKCN1407902SQ00816740
公開日2003年4月2日 申請日期2000年10月2日
發(fā)明者高倉昭治, 箕浦恭子 申請人:藤澤藥品工業(yè)株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan