專利名稱:中藥野馬追有效部位在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥野馬追有效部位在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備抗SARS病毒的口服或注射藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
呼吸系統(tǒng)感染性疾病包括上呼吸道感染和肺部感染，是由病毒與病菌引起的炎癥，多伴隨頭痛、發(fā)熱、咳嗽、痰咯等癥狀，包括常見(jiàn)的普通感冒、流感、氣管炎、支氣管炎、肺炎、腺病毒疾病、合胞病毒疾病等。目前，西醫(yī)對(duì)病毒感染性疾病無(wú)特效藥，治療僅以支持對(duì)癥治療為主。由于病毒種類繁多，感染范圍廣，免疫不持久，須依賴多次再感染方能維持，因此，廣泛使用疫苗來(lái)預(yù)防不現(xiàn)實(shí)。而中醫(yī)藥防治本類疾病較西醫(yī)有一定的優(yōu)勢(shì)。呼吸道感染在中醫(yī)臨床中多屬“發(fā)熱”、“頭痛”、“感冒”、“咳嗽”、“痰飲”等范疇，有外感與內(nèi)因之分，且往往內(nèi)外因素共同作用于人體而致病。在臟腑功能方面，開(kāi)始病在肺，經(jīng)反復(fù)發(fā)作，勢(shì)必累及脾、腎，甚至影響心臟功能。在疾病的發(fā)展過(guò)程中，由于人體的體質(zhì)有強(qiáng)弱不同，稟賦有陰陽(yáng)之分，疾病發(fā)展的趨勢(shì)有快有慢，因此，臨床治療以辨證施治為主。臨床研究表明，某些中藥對(duì)肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌等有明顯的殺菌抑菌作用，某些中藥對(duì)細(xì)菌尸體類毒素有拮抗作用，某些中藥對(duì)病毒有抑制作用，諸多研究工作挖掘了中藥對(duì)呼吸系統(tǒng)感染性疾病治療的確定性和廣泛性。
野馬追為菊科植物林澤蘭(Eupatorium lindleyanum DC.)的全草，秋季采收，揀凈，曬干或陰干。江蘇民間常用野馬追作清熱解毒藥，味苦，性平，有清肺止咳，化痰平喘，降血壓之功效，主治支氣管炎痰多咳嗽，高血壓病。臨床上主要用于慢性支氣管炎，咳嗽痰多。
野馬追全草含黃酮類、生物堿類、香豆素類與揮發(fā)油等成分。藥理研究表明，總黃酮和總生物堿均有明顯的鎮(zhèn)咳作用?？偵飰A有降壓功效。其100％煎液1∶4，1∶8，1∶32，1∶64可分別抑制流感桿菌，甲型鏈球菌金黃色葡萄球菌及卡他球菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是研究中藥野馬追有效部位在制備抗病毒尤其是抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用，并確定有效部位的基本組成，以便于研究制備工藝以及建立藥材和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從而確保野馬追抗病毒藥物治療效果可靠、質(zhì)量穩(wěn)定。同時(shí)在此基礎(chǔ)上，研制含野馬追有效部位的用于哺乳動(dòng)物的抗病毒的口服制劑或注射劑。
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。
野馬追總黃酮及其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽在制備防治病毒藥物中的用途。
野馬追總黃酮主要包括棕矢車菊素、金絲桃甙和黃芪甙。野馬追總黃酮中還有槲皮素。野馬追總黃酮中還有山萘酚和/或三葉豆甙?？傸S酮中黃酮甙的含量≥20％(重量百分?jǐn)?shù))野馬追總黃酮防治病毒是指流感病毒、仙臺(tái)病毒和/或SARS病毒。
所述野馬追總黃酮及其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽在制備防治病毒藥物中的用途，其野馬追總黃酮可以任選地與一種或多種其它抗病毒劑組合。例如，可與傳統(tǒng)抗病毒中藥金銀花、野菊花、石膏、黃芩和/或苡仁的提取物(如水提物或醇提取)組配，也可與中藥黃芩、虎杖的提取物(如水提物或醇提取)和/或牡荊油等組合抗病毒藥物組配。
野馬追總黃酮及其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽在制備防治病毒藥物中的用途，所述藥物為含治療有效量野馬追總黃酮或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽，和藥學(xué)上可接受組分和/或載體。藥學(xué)上可接受組分為與野馬追總黃酮聯(lián)合防治病毒的化合物或組合物。所述藥物為含治療有效量的野馬追總黃酮和藥學(xué)上可接受組分和/或載體的口服制劑、胃腸外給藥制劑，具體為片劑、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊、注射劑或靜脈滴注劑。
藥學(xué)上可接受載體有，崩解劑如羥丙基淀粉、羥丙纖維素、羧甲基淀粉鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；填充劑如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纖維素、糊精、淀粉、磷酸鈣、磷酸氫鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、環(huán)糊精、微粉纖維素等；潤(rùn)濕劑和粘合劑如預(yù)膠化淀粉、聚維酮、羧甲基纖維素鈉、羥丙甲纖維素；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、微粉硅膠、氫化植物油、聚乙二醇4000和6000；潤(rùn)濕劑如十二烷基硫酸鈉、吐溫80；骨架材料如羥丙甲纖維素、乙基纖維素等。
軟膠囊的載體，油相用大豆油、聚乙二醇400、棉籽油、花生油、麻油、玉米油、橄欖油等；增溶劑或潛溶劑如吐溫80、聚氧乙烯醚蓖麻油、苯甲酸芐酯、乳酸乙酯等；抗氧劑如沒(méi)食子酸丙酯、特丁基苯酚(BHT)、維生素E等。膠殼中明膠、甘油與水的比例可適當(dāng)調(diào)節(jié)，膠殼中還可添加其他成分，如防腐劑對(duì)羥基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯等；增塑劑如山梨醇等；穩(wěn)定劑如阿拉伯膠等；遮光劑如二氧化鈦、硫酸鋇、沉降碳酸鈣等。
注射劑輔料有，增溶劑如吐溫類、普流羅尼F-68、聚乙二醇、聚氧乙烯醚蓖麻油、聚維酮等；助溶劑如亞硫酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉；酰胺類化合物如尿素、乙酰胺、硫脲、苯甲酰胺等，氨基酸類如精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、組氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸，含羥基或羧基的化合物如蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、枸櫞酸及其鈉鹽、乳酸、水楊酸鈉等；助懸劑如羧甲基纖維素鈉、聚維酮、羥丙甲基纖維素等；防腐劑如尼泊金甲、乙、丙和丁酯；pH調(diào)節(jié)劑如枸櫞酸及枸櫞酸鹽、磷酸鹽等；溶劑如注射用水、注射用乙醇、丙二醇等。
一、大孔樹(shù)脂柱層析不同洗脫部分化學(xué)成分比較(薄層層析法)藥材經(jīng)80％乙醇提取得浸膏，以蒸餾水溶解，過(guò)濾，濾液濃縮，上大孔樹(shù)脂柱(浸膏量的十倍大孔樹(shù)脂濕法裝柱，D101、DA201、D301、LD605、AB-8、S-8、HPD-100、HPD-600、NK-9、ZTC-I皆可)，依次以蒸餾水，10％乙醇，20％乙醇，30％乙醇，40％乙醇，50％乙醇，60％乙醇，70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇洗脫得水洗脫部分，10％乙醇部分，20％乙醇部分，30％乙醇部分，40％乙醇部分，50％乙醇部分，60％乙醇部分，70％乙醇部分，80％乙醇部分，90％乙醇部分，95％乙醇部分，進(jìn)行硅膠薄層層析，展開(kāi)劑為氯仿∶甲醇(5∶1)，噴三氯化鋁顯色劑，黃酮成分在365nm紫外燈下呈黃色，見(jiàn)圖1。
附圖表明，從30％C2H5OH至70％C2H5OH洗脫部分均有較多黃酮類成分，故采用大孔樹(shù)脂柱層析(H2O，20％C2H5OH，70％C2H5OH，95％C2H5OH分別洗脫)來(lái)富集分離黃酮類成分。
二、活性篩選部位制備野馬追為菊科植物林澤蘭(Dendranthema nankingense X.D.Cui)的干燥地上部分。取野馬追藥材1.2kg，80％乙醇加熱回流提取2次，回收溶劑，得浸膏144g，加水溶解浸膏后，用石油醚萃取，回收萃取溶劑后，石油醚部分29g，經(jīng)硅膠(100-200目)層析分離，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得三個(gè)單體化合物，通過(guò)分析其理化性質(zhì)與波譜學(xué)數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比較，確認(rèn)了其結(jié)構(gòu)，為蒲公英甾醇乙酸酯(96mg)、偽蒲公英甾醇(54mg)、偽蒲公英甾醇棕櫚酸酯(66mg)。
取石油醚萃取后的母液，用大孔樹(shù)脂(D101、DA201、D301、LD605、AB-8、S-8、HPD-100、HPD-600、NK-9、ZTC-I)柱層析，依次以水與不同濃度的乙醇梯度洗脫，收集水、20％乙醇、70％乙醇、95％乙醇洗脫部分，干燥后分別得到53g、34.6g、21g、3g。其中，70％乙醇洗脫部分為野馬追總黃酮，真空干燥后重21g，稱取野馬追總黃酮154mg作為抗SARS病毒實(shí)驗(yàn)樣品，見(jiàn)實(shí)施例1、2；同時(shí)將余野馬追總黃酮(70％乙醇洗脫部分)進(jìn)行硅膠柱層析(100-200目)，先用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，再用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫(所謂梯度洗脫是指二種溶劑組成的洗脫液中，極性大溶劑的比例逐漸加大，使得洗脫液的極性從小到大逐漸增加)，分離得到6個(gè)單體化合物，通過(guò)分析其理化性質(zhì)與波譜學(xué)數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比較，確認(rèn)了六個(gè)有效成分，為槲皮素(31mg)、山萘酚(14mg)、棕矢車菊素(58mg)、金絲桃甙(36mg)、三葉豆甙(18mg)、黃芪甙(36mg)。
目前，野馬追藥材的研究基本上局限于藥理、療效與毒副作用，因此，對(duì)其有效成分的提取、分離與結(jié)構(gòu)鑒定是當(dāng)務(wù)之急。申請(qǐng)人對(duì)野馬追總黃酮、總生物堿類等有效部位進(jìn)行系統(tǒng)分離，得到眾多單體化合物，用作篩選工藝，以及建立藥材和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。



圖1大孔樹(shù)脂柱層析不同洗脫部分(10％乙醇部分，20％乙醇部分，30％乙醇部分，40％乙醇部分，50％乙醇部分，60％乙醇部分，70％乙醇部分，80％乙醇部分，90％乙醇部分，95％乙醇部分)化學(xué)成分比較的薄層層析圖。
具體實(shí)施方式
野馬追總黃酮藥效學(xué)試驗(yàn)實(shí)施例1野馬追總黃酮體外抗SARS病毒藥物初篩試驗(yàn)結(jié)果
(一)實(shí)驗(yàn)材料1.細(xì)胞VeroE6細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)。
2.病毒SARS病毒，BJ-01株。
3.培養(yǎng)液含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
4.藥物野馬追總黃酮提取物，江蘇省中醫(yī)藥研究院提供(二)實(shí)驗(yàn)步驟1.CPE法測(cè)定病毒對(duì)VeroE6細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TCID50)。
1.CPE法結(jié)合MTT法確定藥物對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒濃度。
2.藥物的最大無(wú)毒濃度對(duì)SARS病毒的藥效測(cè)定。
(三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.病毒的TCID50為10-7。
2.藥物取4個(gè)濃度即200、100、10和1ug/ml進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定，每濃度做4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。結(jié)果顯示最大無(wú)毒濃度為100ug/ml。
3.取100ug/ml藥液，做4個(gè)復(fù)孔，觀察對(duì)SARS病毒的抑制作用。試驗(yàn)設(shè)病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。結(jié)果顯示該濃度對(duì)SARS病毒有抑制作用。
結(jié)論在本試驗(yàn)條件下，野馬追總黃酮對(duì)VeroE6細(xì)胞的無(wú)毒濃度為100ug/ml，此濃度對(duì)SARS病毒有完全抑制作用。
實(shí)施例2野馬追總黃酮抗病毒試驗(yàn)(一)材料來(lái)源藥物野馬追總黃酮提取物，所含濃度10.64mg/ml，江蘇省中醫(yī)藥研究院提供。
病毒株(1)流感病毒A/FMl/47/H1N1(屬正粘病毒，本室保存，雞胚傳代)；(2)仙臺(tái)病毒(屬副粘病毒，本室保存)。
細(xì)胞MDCK，人胚肺二倍體傳代株。
(二)方法所用病毒預(yù)先傳代，滴定后取100TCID50為感染量。
藥物和病毒相互作用處理方法①藥物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml先作用細(xì)胞，24小時(shí)后再加100TCID50的流感病毒或仙臺(tái)病毒；②藥物100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml加100TCID50的流感病毒或仙臺(tái)病毒4℃過(guò)夜，第二天接種細(xì)胞；③藥物100ug/mi、301lg/mi、10ug/ml加100TCID50的流感病毒或仙臺(tái)病毒時(shí)加入細(xì)胞；④病毒對(duì)照。
⑤藥物對(duì)照 利巴韋林100ug/ml⑥細(xì)胞對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
(三)試驗(yàn)結(jié)果表1、野馬追總黃酮提取物對(duì)流感病毒和仙臺(tái)病毒的抑毒作用藥物濃度 100ug/ml 30ug/ml 10ug/ml藥物先處理細(xì)胞24小時(shí)后加病毒 FMl病毒 藥物在三個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞均無(wú)毒性。
藥物對(duì)流感病毒FMl抑毒效果如下①藥物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml先處理細(xì)胞，然后再加100TCID50FMl病毒，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，均有顯著抑毒效果。
②藥物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml三個(gè)濃度，加100TCID50FMl病毒，置于4℃冰箱處理，然后再接種細(xì)胞，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，也有顯著抑毒效果。
③藥物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml三個(gè)濃度和100TCID50FMl，同時(shí)加入細(xì)胞，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，也有顯著抑毒效果。
藥物對(duì)仙臺(tái)病毒抑毒效果如下①藥物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml先處理細(xì)胞，然后再加100TCID50仙臺(tái)病毒，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，有效。
②藥物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml和仙臺(tái)病毒同時(shí)加入，置于4℃冰箱處理，然后再接種細(xì)胞，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，無(wú)抑毒效果，血凝和血吸附均陽(yáng)性。
③藥物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml三個(gè)濃度和100TCID50仙臺(tái)病毒同時(shí)加入細(xì)胞，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，無(wú)抑毒效果。
結(jié)論野馬追總黃酮提取物對(duì)流感病毒(亞甲型，H1N1)FMl株，三個(gè)不同藥濃度均有顯著抑毒效果。
野馬追總黃酮提取物對(duì)副流感病毒(仙臺(tái)病毒株)，三個(gè)不同濃度對(duì)藥物先處理細(xì)胞，24hr后加病毒有效，而對(duì)三個(gè)不同濃度對(duì)病毒和藥物放4℃處理，及同時(shí)加入細(xì)胞均無(wú)抑毒效果。
權(quán)利要求
1.野馬追總黃酮及其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽在制備防治流感病毒、仙臺(tái)病毒和/或SARS病毒藥物中的用途。
2.權(quán)利要求
1所述防治病毒藥物中的用途，其特征在于野馬追總黃酮主要包括棕矢車菊素、金絲桃甙和黃芪甙。
3.權(quán)利要求
2所述防治病毒藥物中的用途，其特征在于野馬追總黃酮中還有槲皮素。
4.權(quán)利要求
3所述防治病毒藥物中的用途，其特征在于野馬追總黃酮中還有山萘酚和/或三葉豆甙。
5.權(quán)利要求
1所述防治病毒藥物中的用途，其特征在于所述野馬追總黃酮與一種或多種其它抗病毒劑混合成組合物。
6.權(quán)利要求
1-3之一所述防治病毒藥物中的用途，其特征在于所述藥物為含治療有效量野馬追總黃酮或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽，和藥學(xué)上可接受組分和/或載體。
7.權(quán)利要求
6所述防治病毒藥物中的用途，其特征在于藥學(xué)上可接受組分為與野馬追總黃酮聯(lián)合防治病毒的化合物或組合物。
8.權(quán)利要求
7所述防治病毒藥物中的用途，其特征在于所述藥物為含治療有效量的野馬追總黃酮和藥學(xué)上可接受組分和/或載體的口服制劑、胃腸外給藥制劑。
9.權(quán)利要求
8所述防治病毒藥物中的用途，其特征在于所述藥物為片劑、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊、注射劑、靜脈滴注劑。
專利摘要
野馬追總黃酮及其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽在制備防治病毒尤其是防治SARS病毒藥物中的用途，野馬追總黃酮主要選自槲皮素、山萘酚、棕矢車菊素、金絲桃甙、三葉豆甙、黃芪甙，或者槲皮素、山萘酚、棕矢車菊素、金絲桃甙、三葉豆甙和黃芪甙的混合物，野馬追總黃酮對(duì)VeroE6細(xì)胞無(wú)毒濃度為100ug/ml，此濃度對(duì)SARS病毒有完全抑制作用。
文檔編號(hào)A61P31/12GKCN1202834SQ03152938
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年9月4日
發(fā)明者段金廒, 楊念云, 錢士輝, 沈明勤, 錢大瑋, 彭蘊(yùn)茹 申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)藥研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan