專利名稱:3′－[(2z)－[1－(3,4－二甲基苯基)－1,5－二氫－3－甲基－5－氧代－4h－吡唑－4 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種改進的血小板生成素(以下簡稱為TPO)類似物，其為3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基(ylidene)]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸的二-(單乙醇胺)鹽。該化合物以結構式I表示 本發(fā)明化合物用作TPO受體激動劑，特別是用于促進血小板的生成。
發(fā)明詳述3’-[N’-[1-(3，4-二甲基苯基)-3-甲基-5-氧代-1，5二氫吡唑-4-亞基]肼基}-2’-羥基-聯(lián)苯基-3-羧酸及其可藥用鹽、水合物、溶劑合物，及其酯用作TPO受體激動劑，特別是用于促進血小板的生成及治療血小板減少癥已在國際申請PCT/US01/16863中公開并要求保護，該申請的國際申請日為2001年5月24日，國際公開號為WO01/89457，國際
公開日為2001年11月29日，其所有公開在此引入，作為參考。國際申請PCT/US01/16863沒有具體公開其中任何一個化合物的鹽的形式。
如今，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸的二-(單乙醇胺)鹽比其游離酸具有許多優(yōu)點。游離酸水溶性很差(約5μg/ml)，不利于被制備成藥用劑型，并降低了化合物的體內生物利用度。
然而，該游離酸作為TPO受體的激動劑特別有用，特別是用于促進血小板的生成及治療血小板減少癥。3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸的二-(單乙醇胺)鹽具有溶解度及生物利用度提高的其他優(yōu)點。
本發(fā)明化合物3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸的二-(單乙醇胺)(以下簡稱為-″活性成分″)用作TPO受體的激動劑特別有用，特別是用于促進血小板的生成及治療血小板減少癥?；钚猿煞挚梢猿Ｓ脛┬徒o藥，其制備可按照本領域已知的技術，如國際申請PCT/US01/16863所述，將活性成分與常用藥用載體或稀釋劑結合。給藥途徑可以是口服，非腸胃給藥或局部給藥。此處的術語非腸胃給藥包括靜脈內、肌肉內、皮下、鼻腔內、直腸內、陰道內或腹膜內給藥。通常優(yōu)選口服給藥。
此處術語″單乙醇胺″指“2-氨基乙醇”。
上述藥用劑量單元的中本發(fā)明活性成分的劑量為有效、無毒劑量，優(yōu)選0.001-100mg/kg總體重，優(yōu)選0.001-50mg/kg。當治療需要TPO類似物治療的患者時，優(yōu)選口服或非腸胃給藥選定劑量1-6次每日。優(yōu)選的非腸胃給藥包括局部、直腸，經皮、注射或持續(xù)輸液。人類口服給藥劑量單元優(yōu)選包括0.05～3500mg活性成分，最優(yōu)選0.5～1,000mg活性成分。使用較低劑量的口服給藥形式為優(yōu)選。然而，在對患者安全方便時，也可以施用高劑量非腸胃給藥。上述劑量涉及優(yōu)選的以游離酸表示的活性成分的量。
本領域技術人員應當肯定，活性成分個體劑量的最佳給藥數(shù)量及間隔視治療疾病的性質及程度，給藥劑型、途徑及部位，治療的具體患者而定，并且該最佳方案可通過常用技術確定。本領域技術人員也應當明白，最佳療程，即既定時間內每天給予活性成分的劑量次數(shù)可經本領域技術人員使用常用的確定療程的試驗進行確定。
一般而言，本發(fā)明化合物的制備可通過將游離酸3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸溶解于合適的有機溶劑中，優(yōu)選四氫呋喃(以下簡稱為THF)或乙醇/IMS(工業(yè)用甲醇變性酒精)，過濾所得混合物以去除雜質，然后將此溶液加入到2或大于2當量的乙醇胺的有機溶劑溶液中，優(yōu)選水溶性溶劑，該溶劑可包含一定量的水，優(yōu)選達5倍游離酸體積的水。本發(fā)明化合物過濾后干燥，例如真空或高溫空氣干燥。
乙醇胺，99％，購自Aldrich Chemical Company，Milwaukee，Wisconsin。
四氫呋喃(THF)及工業(yè)用甲醇變性酒精74 O.P.(IMS)購自BDHLaboratory Supplies，Poole，England。
下述實施例進一步闡釋本發(fā)明。實施例不能理解為限制上述
發(fā)明內容
及權利要求
所述的本發(fā)明范圍。
實施例13’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸-羧酸二-(單乙醇胺)的制備 將1g的3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸橙色粗品加入16.75mlTHF中，在約30℃攪拌。緩慢加入水(2.0ml)并控制溫度高于28℃。加水完畢，將溫度恢復至30℃，以玻璃纖維墊(2xWhatman GFC濾器)過濾溶液以除去粒狀物質。THF(2.0ml)洗滌濾器，洗滌液加入濾液中。濾液冷卻至室溫。將乙醇胺(0.324g，2.35mol.當量)溶解于IMS(26ml)并于室溫氮氣氛下攪拌。將含游離酸的濾液用20～30分鐘加入至乙醇胺溶液中。攪拌所得深紅色懸液3小時，過濾分離固體并于50℃真空烘箱干燥過夜得1.22g(96％)目標化合物。
HNMR(400MHz，DMSO-d6+20ul TFA，內標DMSO-d5δ2.5)δ2.21(s，3H)，2.26(s，3H)，2.31(s，3H)，2.85(m，4H)，3.57(t，4H)，7.07(m)，7.14(s)，7.18(d，重疊的3H)，7.61(t)，7.63(dd，重疊的2H)，～7.7(m，重疊的2H)，7.79(d)，～7.8(br.s，重疊的2H)，7.96(d，2H)，8.13(s，1H)，13.8(br.s，不可測，與TFA共振重疊)，THF信號為1.76(m)，3.60(為乙醇胺信號掩蓋)，在1.05％w/w積分，乙醇信號為1.06(t)，3.44(q)，在1.3％w/w積分.
IR數(shù)據1636，1506，1466，1378，1348，1294，1273，1255，1228，1194，1127，1118，1066，1015，767，747cm-1.
實施例23’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸二-(單乙醇胺)的制備氮氣氛下，將8g 3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸橙色粗品室溫下溶解于盛有THF(240ml)的500ml圓底三頸燒瓶中。用5分鐘以注射器加入乙醇胺(2.2ml，2摩爾當量)。室溫攪拌所得深紅色懸液1.5小時，過濾分離固體并以THF(16ml×2)洗滌，于50℃真空烘箱干燥過夜得10.37g目標化合物(大于定量產率，是由于含有殘留溶劑-經NMR測定約2.4％w/w的殘留THF，其它同實施例1)。
實施例33’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸二-(單乙醇胺)的制備氮氣氛下，將8g 3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸橙色粗品室溫下懸浮于乙醇(800ml)中。用5分鐘以注射器加入乙醇胺(2.2ml，2摩爾當量)。室溫攪拌所得深紅色懸液45小時，過濾分離固體并以乙醇(10ml×2)洗滌，于50℃真空烘箱干燥過夜得9.83g(96％)目標化合物。NMR同實施例1；乙醇含量為1.3％w/w，無THF存在。
實施例43’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸二-(單乙醇胺)的制備室溫下，將1g的3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸(259.0g)加入THF(4660ml)中攪拌直至完全溶解。過濾溶液，通過濾器用THF(520ml)洗滌反應容器(合并濾液得溶液1)。
同時，準備另一個頂部裝有攪拌器的反應器裝置用于常壓蒸餾。依次向反應器中加入IMS74 O.P.(7770ml)、乙醇胺(354ml)。劇烈攪拌溶液，同時加熱直至內容物開始蒸餾(BP.76-77C)。
將溶液1轉移至反應器上裝有的滴液漏斗中。當反應器內容物恒速(約收集50ml蒸餾液時)蒸餾時，自滴液漏斗以與蒸餾速度相當或略低的速度滴加入溶液1。加料完畢，以IMS(260ml×2)洗滌滴液漏斗確保將所有游離酸洗入反應液。重搭儀器裝置回流，在氮氣氛下回流攪拌所得深紅色懸液30分鐘。氮氣氛下，攪拌使其緩慢(過夜)冷卻至室溫(約20℃)。
過濾懸液，于濾器上以IMS(520ml×2)洗滌所得深紫色固體。室溫真空干燥，然后50℃真空烘箱干燥過夜。產率323.9g，98％。殘留溶劑(GCS)THF＝＜0.05％，乙醇＝0.12％。
除微量的殘留溶劑存在，目標化合物的NMR及IR圖譜基本上同實施例1所示。
實施例5相對溶解度3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸的游離酸(化合物A)及二-(單乙醇胺)鹽(化合物B)在三種不同的系統(tǒng)中測其溶解度水，0.1HCl及甲醇中。數(shù)據總結于下表1。
表1溶劑 化合物A mg/ml 化合物B mg/ml溶解度25℃ mg/ml mg/ml水 ＜0.001 14.20.1％HCl ＜0.001 ＜0.001甲醇 1.9 6.4本發(fā)明范圍包括藥物組合物，該組合物包括作為活性成分的3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸二-(單乙醇胺)，以及可藥用的載體及稀釋劑。本發(fā)明化合物可口服或非腸胃給藥，可制成合適劑型包括片劑、丸劑、粉劑及顆粒劑用于各種給藥途徑。在這些固體劑型中，活性成分至少與一種惰性稀釋劑相混和。按照常規(guī)操作，口服制劑也可包括除惰性稀釋劑以外的其它物質，如潤滑劑、助流劑及抗氧化劑。若制成膠囊、片劑及丸劑，制劑中可包括緩沖劑。片劑及丸劑還可制成持續(xù)釋放劑型。
盡管也可采用乳劑的非水懸液，本發(fā)明的非腸胃給藥制劑包括無菌水溶液。這些劑型也可包括佐劑，如防腐劑、潤濕劑、滲透劑、緩沖劑、乳化劑及分散劑。其滅菌可采用細菌截留濾器(bacteria retaining filter)過濾，向組合物中加入滅菌劑，照射組合物或加熱組合物的方法滅菌。
下述實施例進一步闡釋具有本發(fā)明特征的藥物組合物。
實施例6片劑組合物將乳糖、微晶纖維素、羥基乙酸淀粉鈉，硬脂酸鎂及3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸二-(單乙醇胺)按照下表2的比例混和。然后將化合物壓成片劑。
表2


實施例7可注射的非腸胃給藥組合物可注射給藥的3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸二-(單乙醇胺)制劑的制備方法為，將5.0mg化合物于1.0ml生理鹽水中攪拌。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案如上所述，然而應當明白，本發(fā)明不局限于此處公開的具體說明，我們保留所有在權利要求
范圍內修改的權利。
權利要求
1.化合物3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸二-(單乙醇胺)。
2.一種藥物組合物，包括3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸二-(單乙醇胺)及可藥用載體或稀釋劑。
3.一種治療哺乳動物包括人類中血小板減少癥的方法，所述哺乳動物需要該治療，所述方法包括向該哺乳動物施用治療有效量的權利要求
1所述的化合物。
4.權利要求
3所述的方法，其中哺乳動物為人。
5.一種提高哺乳動物包括人類中血小板生成的方法，所述哺乳動物需要提高血小板生成，所述方法包括向該哺乳動物施用有效量的權利要求
1所述的化合物。
6.權利要求
5所述的方法，其中哺乳動物為人。
7.權利要求
3所述的方法，其中化合物為口服給藥。
8.權利要求
3所述的方法，其中化合物為非腸胃方式給藥。
9.一種激動受處理對象中TPO受體的方法，包括施用有效量的權利要求
1所述的化合物。
10.一種制備組合物的方法，該組合物包含可藥用載體或稀釋劑及有效量的權利要求
1所述化合物，所述方法包括將權利要求
1所述的化合物與可藥用載體或稀釋劑聯(lián)合。
11.權利要求
3所述的方法，進一步包括共同施用治療有效量的藥物，該藥物選自集落刺激因子、細胞因子、趨化因子、白介素或細胞因子受體激動劑或拮抗劑、可溶性受體、受體激動劑或拮抗劑抗體、或與一個或多個所述藥物具有同樣作用機制的小分子或肽類。
12.權利要求
11所述的方法，其中藥物選自G-CSF、GM-CSF、TPO、M-CSF、EPO、Gro-beta、IL-11、SCF、FLT3配體、LIF、IL-3、IL-6、IL-1、Progenipoietin、NESP、SD-01、IL-8、或IL-5或任何一種所述藥物的具有生物活性的衍生物。
13.權利要求
2所述的藥物組合物，進一步包括共同施用治療有效量的藥物，該藥物選自集落刺激因子、細胞因子、趨化因子、白介素或細胞因子受體激動劑。
14.權利要求
13所述的組合物，其中藥物選自G-CSF、GM-CSF、TPO、M-CSF、EPO、Gro-beta、IL-11、SCF、FLT3配體、LIF、IL-3、IL-6、IL-1、IL-5或任何一種所述藥物的具有生物活性的衍生物。
15.一種增加捐獻者血小板生成的方法，包括在血小板提取、獻血或獻血小板之前向該捐獻者施用治療有效量的權利要求
1所述的化合物。
16.一種增加捐獻者外周血干細胞數(shù)量的方法，包括在白細胞分離之前向該捐獻者施用治療有效量的權利要求
1所述的化合物。
17.權利要求
16所述的方法，進一步包括共同施用治療有效量的動員造血細胞的藥物，該藥物選自集落刺激因子、細胞因子、趨化因子、白介素或細胞因子受體激動劑、粘附分子拮抗劑或抗體。
18.權利要求
17所述的方法，其中動員藥物選自G-CSF、GM-CSF、TPO、EPO、Gro-beta、IL-8、環(huán)磷酰胺、VLA-4抑制劑、SCF、FLT3配體或G-CSF、GM-CSF、TPO、EPO、Gro-beta或IL-8的具有生物活性的衍生物。
19.一種體外提高刺激巨核細胞成熟和/或血小板生成的方法，包括向培養(yǎng)表達TPO受體的細胞培養(yǎng)基中加入有效量的權利要求
1所述化合物。
20.一種體外提高刺激巨核細胞成熟和/或血小板生成的方法，包括向培養(yǎng)干細胞、骨髓細胞、臍血細胞或外周血細胞的培養(yǎng)基中加入有效量的權利要求
1所述化合物。
21.權利要求
20所述的方法，其中巨核細胞或血小板在化療或放療后回輸于哺乳動物體內。
22.一種體外促進培養(yǎng)的干細胞、骨髓細胞、臍血細胞、外周血細胞或其它類型表達TPO受體的細胞存活和/或增殖的方法，包括在含有有效量的權利要求
1所述化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞。
23.權利要求
22所述的方法，進一步包括共同施用治療有效量的集落刺激因子、細胞因子、趨化因子、白介素或細胞因子受體激動劑。
24.權利要求
22所述的方法，其中干細胞在化療或放療后回輸于哺乳動物體內。
25.一種治療哺乳動物包括人類中性白細胞減少癥的方法，所述哺乳動物需要該治療，所述方法包括向該哺乳動物施用治療有效量的權利要求
1所述的化合物。
26.一種體外促進刺激中性粒細胞生成的方法，包括向培養(yǎng)干細胞、骨髓細胞、臍血細胞、外周血細胞或其它類型表達TPO受體的細胞的培養(yǎng)基中加入有效量的權利要求
1所述化合物。
27.權利要求
26所述的方法，其中中性粒細胞在化療或放療后回輸于哺乳動物體內。
28.權利要求
3所述的方法，其中血小板減少癥源于化療或放療后的骨髓抑制。
29.權利要求
3所述的方法，其中血小板減少癥源于器官移植。
30.權利要求
3所述的方法，其中血小板減少癥源于骨髓、干細胞或肝移植。
31.權利要求
3所述的方法，其中血小板減少癥源于特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)。
32.權利要求
3所述的方法，其中血小板減少癥源于骨髓異常增生綜合征(MDS)、再生障礙性貧血或白血病。
33.權利要求
3所述的方法，其中血小板減少癥源于病毒、真菌、微生物或寄生蟲感染。
34.權利要求
3所述的方法，其中血小板減少癥源于肝功能障礙。
35.權利要求
3所述的方法，其中血小板減少癥源于外科手術。
36.權利要求
3所述的方法，其中血小板減少癥源于抗病毒或抗生素藥物的治療。
37.一種制備權利要求
1所述化合物的方法，該方法包括i)將3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氫-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亞基]肼基]-2’-羥基-[1，1’-聯(lián)苯基]-3-羧酸溶解于合適的有機溶劑中，得到溶液；ii)向上述溶液中加入2或大于2當量的乙醇胺；及iii)分離制備的化合物。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種改進的血小板生成素類似物，其為3′－[(2Z)－[1－(3，4－二甲基苯基)－1，5－二氫－3－甲基－5－氧代－4H－吡唑－4－亞基]肼基]－2′－羥基－[1，1′－聯(lián)苯基]－3－羧酸二－(單乙醇胺)鹽。
文檔編號C12N5/06GKCN1652842SQ03811370
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月21日
發(fā)明者斯蒂芬·穆爾 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan