專利名稱：重組球蟲病疫苗的制作方法
球蟲病是一種由細(xì)胞內(nèi)的艾美球蟲屬(Eimeria)原生動(dòng)物寄生蟲引起的家禽疾病。這種疾病是大型密集家禽繁殖場中的一種地方性疾病。據(jù)估計(jì)，光是在美國，每年用化療法防治這種疾病的費(fèi)用就超過1億美元。由于對(duì)抗球蟲藥物產(chǎn)生抗性，因而要不斷開發(fā)新的藥劑，但現(xiàn)在藥物的開發(fā)所需的費(fèi)用越來越高，消費(fèi)者對(duì)食用家畜體內(nèi)殘留藥物的接受程度也越來越低。
現(xiàn)已有很多文獻(xiàn)描述了對(duì)天然球蟲病感染的保護(hù)性免疫?，F(xiàn)已證明，在受控條件下每天服用少量活的卵囊，幾星期后便可對(duì)通常毒性劑量的侵染產(chǎn)生完全的免疫(Rose et al，Parasitology 73∶25，1976;Rose et al，Parasitology 88∶199，1984)。對(duì)感染具有獲得性抗性表明有可能建立一種疫苗而在雛雞體內(nèi)誘導(dǎo)免疫，從而無需采用化學(xué)抑球蟲劑。事實(shí)上，這樣一種想法已經(jīng)用Coccivac 制劑(Sterwin Laboratories，Opelika，Alabama，U.S.A)進(jìn)行了驗(yàn)證。
為了生產(chǎn)球蟲病疫苗，Murray等人(歐洲專利申請(qǐng)公告167.443)從禽艾美球蟲的子孢子或形成孢子的卵囊中制備了各種提取液，這些提取液中至少含有15種多肽，其中許多多肽都連結(jié)在子孢子表面。將這些提取液注射到小雞體內(nèi)，則在用形成孢子的毒性禽艾美球蟲卵囊口服接種后盲腸損傷減輕。最近，Schenkel等人(美國專利4，650，676)公開了抗禽艾美球蟲裂殖子的單克隆抗體的制備方法。利用這些抗體，Schenkel等人鑒定出了這些抗體所針對(duì)的多種抗原。Schenkel等人將禽艾美球蟲子孢子與這些抗體一起預(yù)保溫，然后把這些經(jīng)過處理的子孢子引入小雞的盲腸，證明盲腸損傷程度與未經(jīng)處理的子孢子對(duì)照相比有所減輕。
重組DNA技術(shù)的進(jìn)展提供了另一種可能的途徑，即亞單位疫苗。在應(yīng)用現(xiàn)有的重組DNA方法時(shí)，是將特異的DNA順序插入一個(gè)適當(dāng)?shù)腄NA載體中。形成能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的重組DNA分子。常常用稱為質(zhì)粒的環(huán)狀雙鏈DNA分子作載體。制備這種形式的重組DNA，必須使用能夠在特異的堿基順序位點(diǎn)切割DNA的限制性核酸內(nèi)切酶。用限制酶在質(zhì)粒和所要插入的外源DNA片段中進(jìn)行切割后，就可以用一種稱為連接酶的酶把這兩個(gè)DNA分子共價(jià)連接起來。制備這類重組DNA分子的一般方法已有敘述(Cohen等人，美國專利4，237，224;Collins等人，美國專利4，304，863;Maniatisetal，MolecularCloningALaboratoryManual，1982，ColdSpringHarborLaboratory)。因?yàn)檫@些參考文獻(xiàn)在很大程度上說明了本領(lǐng)域的技術(shù)狀態(tài)，所以在此列為參考文獻(xiàn)。
制備出重組DNA分子后，只有滿足若干條件才能用這些分子來產(chǎn)生由插入的基因順序確定的產(chǎn)物。最重要的條件是，該重組分子應(yīng)與宿主細(xì)胞相容，并因而能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。最近的許多工作利用了大腸桿菌作為宿主細(xì)胞，因?yàn)樗c廣泛圍的重組質(zhì)粒相容。根據(jù)所用的載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)，將重組DNA分子引入宿主的方法可以是轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染。
對(duì)宿主細(xì)胞中是否存在重組質(zhì)粒的檢測，可以方便地利用質(zhì)粒標(biāo)記活性(如抗生素抗性)來進(jìn)行。例如，可以通過在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中選擇出攜有編碼氨芐青霉素降解酶的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。還可以利用兩個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，使質(zhì)粒在某個(gè)位點(diǎn)編碼第二種抗生素降解活性，而所選用的限制性核酸內(nèi)切酶能切割該位點(diǎn)，從而插入外源基因順序。這樣，含有正確重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞就能通過對(duì)第一種抗生素有抗性，而對(duì)第二種抗生素敏感來鑒定。
只是將重組質(zhì)粒插入宿主細(xì)胞并分離出轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，這本身并不能保證能產(chǎn)生大量的所需基因產(chǎn)物。為此，必須將外源基因順序與一個(gè)稱為啟動(dòng)子的信號(hào)區(qū)以正確的相互關(guān)系相融合才能進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)錄。此外，外源DNA也可以帶有其自身的啟動(dòng)子，只要它能被宿主細(xì)胞識(shí)別就行。無論來源如何，啟動(dòng)子都是一段DNA順序，該順序指導(dǎo)RNA聚合酶的結(jié)合，從而“啟動(dòng)”DNA轉(zhuǎn)錄出信使RNA(mRNA)。
如果有了能產(chǎn)生大量mRNA的強(qiáng)啟動(dòng)作用，則最終產(chǎn)生的所需基因產(chǎn)物將取決于從mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的有效性，而這一過程又取決于核糖體與mRNA結(jié)合的效率。在大腸桿菌中，mRNA上的核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括一個(gè)起始密碼子(AUG)和一個(gè)上游的Shine-Dalgarno(SD)順序。此順序含有3～9個(gè)核苷酸，位于從AUG密碼子算起3～11個(gè)核苷酸處。該順序與大腸桿菌16S核糖體RNA(rRNA)的分端互補(bǔ)(ShineandDalgarno，Nature254∶34，1975)。顯然，mRNA中的SD順序與16SrRNA3′端順序之間的堿基配對(duì)，有利于核糖體與mRNA的結(jié)合。有關(guān)增強(qiáng)基因表達(dá)的綜述見RobertsandLauer，MethodsinEnzymology68∶473，1979。
基于LacZ操縱子與λ噬菌體載體的結(jié)合建立了另一種表達(dá)系統(tǒng)(Huynhetal，inDNACloningvolumeI，D.M.Glover，Ed)。在此系統(tǒng)中，β-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因與控制其表達(dá)的可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子一起被插入到噬菌體載體中。只要在β-半乳糖苷酶基因3′端的獨(dú)特克隆位點(diǎn)插入含有蛋白編碼區(qū)的mRNA的cDNA拷貝或基因組DNA片段，就會(huì)導(dǎo)致基因融合。
β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)導(dǎo)致一種融合蛋白的生成，該蛋白含有114kd的β-半乳糖苷酶和一個(gè)由cDNA插入片段編碼的羧基末端多肽，但條件是該插入片段含有一個(gè)取向(register)與β-半乳糖苷酶讀碼相同的開放讀碼。這樣，在利用β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使LacZ阻遏蛋白失活而誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)后，通過基因文庫的免疫篩選能夠鑒定出一種噬菌體，該噬菌體含有一種基因，其產(chǎn)物能被單克隆或多克隆抗血清識(shí)別。這一表達(dá)載體系統(tǒng)結(jié)合了噬菌體系統(tǒng)在包裝DNA并將其引入大腸桿菌細(xì)胞過程中的高效率和多肽與β-半乳糖苷酶融合體的高穩(wěn)定性。
疫苗亞單位途徑是將完整感染性生物的一個(gè)亞單位以免疫相關(guān)狀態(tài)輸入到宿主動(dòng)物體內(nèi)。該亞單位可以是一種由寄生蟲純化出的蛋白、一種在雜合系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白或蛋白片段、一種含有單個(gè)中和決定簇的合成肽、或一種由病毒載體(如牛痘)引入的蛋白。宿主的免疫系統(tǒng)無需接觸過完整寄生蟲就能對(duì)該亞單位產(chǎn)生一個(gè)特異反應(yīng)。在受到有毒劑量的感染性生物侵襲時(shí)，宿主的免疫系統(tǒng)只需受到它以前曾接觸過的疫苗亞單位的指導(dǎo)，便能產(chǎn)生有效的防護(hù)。
在文獻(xiàn)中可以找到循環(huán)抗體、小腸上皮中的分泌性IgA(Davisetal，Immunology34∶879，1978)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)(Giambronietal，PoultryScience59∶38，1980)參與對(duì)球蟲病的獲得性抗性的證據(jù)。綜述見P.S.DavisinAvianImmunology，M.E.Rose，Ed.，BritishPoultryScience，Ltd.，Edenberg，361-385，1981。免疫系統(tǒng)的各種防護(hù)機(jī)制的可能參與，意味著要達(dá)到完全的、持續(xù)的保護(hù)作用，可能需要模擬天然感染過程的各個(gè)特殊方面的能力。這些方面包括在需要進(jìn)行保護(hù)的位點(diǎn)的局部接觸、誘發(fā)對(duì)起主導(dǎo)作用的抗原加工細(xì)胞的發(fā)炎反應(yīng)、適當(dāng)?shù)募纳x抗原的存在、可能還有與具有特定膜構(gòu)型的MHC決定簇的關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明提供具有艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇的純化蛋白或其片段。
更具體地說，本發(fā)明提供具有艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇的蛋白，所述表面抗原的表觀分子量約為28、37、120或高于200千道爾頓，該抗原能與保藏在美國典型培養(yǎng)物收集處(ATCC)并且指定登記號(hào)為HB9707至HB9712的一種或多種單克隆抗體特異結(jié)合。所述蛋白的例子有具有如

圖15、圖17、圖19和圖21所示的氨基酸順序的蛋白及其功能等價(jià)物。所述功能等價(jià)物是這樣一些蛋白，這些蛋白的氨基酸順序是由上述氨基酸順序通過加入、缺失、插入和氨基酸置換而衍生出來的，但條件是這些蛋白保留了艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇。所述蛋白可用于對(duì)家禽進(jìn)行抗球蟲病免疫。
本發(fā)明還提供針對(duì)上述蛋白的抗體，尤其是一些單克隆抗體，例如登記號(hào)為HB9707、HB9708、HB9709、HB9710、HB9711和HB9712的單克隆抗體。
本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的DNA順序;含有這些DNA順序的重組載體，尤其是能夠指導(dǎo)所述DNA順序在可相容的宿主生物中表達(dá)的重組載體;用這些重組載體轉(zhuǎn)化的宿主生物，尤其是能夠表達(dá)包含在上述重組載體中的、編碼上述蛋白的DNA順序的轉(zhuǎn)化宿主生物。
本發(fā)明還提供具有禽艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇的蛋白的制備方法，該方法包括(a)在能夠表達(dá)編碼所述蛋白的DNA順序的條件下，培養(yǎng)用含所述DNA順序的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主生物;
(b)從該培養(yǎng)物中分離該蛋白或片段。
本發(fā)明還提供上述團(tuán)體宿主生物的制備方法，該方法包括利用已知方法，用一個(gè)重組載體轉(zhuǎn)化宿主生物，所述載體含有編碼本發(fā)明蛋白的DNA順序。
本發(fā)明還提供預(yù)防家禽球蟲病的疫苗，其中含有一種或多種本發(fā)明的蛋白和一種生理上可接受的載體。
本發(fā)明還提供預(yù)防家禽球蟲病的疫苗，其中含有一種含編碼本發(fā)明蛋白的DNA順序或其片段的病毒載體和一種生理上可接受的載體，所述病毒載體能夠表達(dá)該DNA順序或片段。
本發(fā)明還提供一種預(yù)防家禽球蟲病的方法，該方法包括，給易患球蟲病的幼禽服用有效量的本發(fā)明疫苗。
對(duì)照附圖閱讀下列發(fā)明敘述部分和實(shí)施例能更容易地理解本發(fā)明。
在附圖中圖1顯示了禽艾美球蟲子孢子ELISA測定的結(jié)果。將免疫小鼠血清(MS 107-2;△)和對(duì)照小鼠血清(X)的稀釋液與4×104個(gè)純化的活的子孢子一起保溫。用結(jié)合有過氧化物酶的抗小鼠IgG抗體和過氧化物酶底物鄰苯二胺檢測結(jié)合在子孢子上的特異抗體。用Titertek Multiscan 板式測量儀測量OD492。
圖2顯示了用從禽艾美球蟲子孢子中溶解出的蛋白進(jìn)行Western吸印檢測的結(jié)果。將溶解出的子孢子蛋白用12.5%凝膠通過還原性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上使其與每種抗體反應(yīng)。用結(jié)合有過氧化物酶的抗小鼠IgG抗體和過氧化物酶底物4-氯-1-萘酚顯現(xiàn)由每種抗體識(shí)別出的特異蛋白。與每個(gè)膠條反應(yīng)的抗體可在膠條頂部見到。
圖3顯示了從禽艾美球蟲的子孢子和裂殖子及堆型艾美球蟲(E.acervulina)的子孢子中溶解出的蛋白進(jìn)行Western吸印檢測的結(jié)果。將各種不同的單克隆抗體和血清與結(jié)合在硝酸纖維素上的艾美球蟲蛋白一起保溫，用如圖2的說明中所述的方法進(jìn)行顯現(xiàn)。所用的單克隆抗體包括3A5(1)、20C6(2)、7D1(3)、13A6(4)、6A5(5)和一種不與艾美球蟲蛋白反應(yīng)的對(duì)照抗體。所用的血清包括小鼠107-2號(hào)免疫血清(7)和對(duì)照血清(8)。
圖4中，左圖顯示了用125I標(biāo)記的禽艾美球蟲子孢子表面蛋白進(jìn)行免疫沉淀檢測的結(jié)果。用IODOGEN或IODOBEADS方法標(biāo)記子孢子表面蛋白，溶解這些蛋白，用12.5%凝膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，利用放射自顯影法顯示這些蛋白。右圖顯示了用活的子孢子免疫的小鼠的血清對(duì)125I標(biāo)記子孢子表面蛋白進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果。將免疫小鼠血清(105-1、105-2、105-3、107-1、107-2、107-3)和對(duì)照小鼠血清(對(duì)照)與125I-子孢子表面蛋白一起保溫，用偶聯(lián)在瓊脂糖上的抗小鼠抗體俘獲免疫復(fù)合物。將免疫復(fù)合物用Laemmli樣品緩沖液溶解，用12.5%凝膠通過SDS-凝膠電泳進(jìn)行分離，用放射自顯影法進(jìn)行顯示，M代表標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記蛋白的分子量(千道爾頓)。
圖5顯示了用單克隆抗體對(duì)125I-子孢子表面蛋白進(jìn)行免疫沉淀的結(jié)果。鑒定由每種抗體結(jié)合的125I-蛋白的方法如圖4的說明中所述。在每個(gè)凝膠泳道的頂部標(biāo)出了所用的特異性子孢子單克隆抗體和對(duì)照抗體(對(duì)照)。標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記蛋白的分子量以千道爾頓給出。
圖6顯示了空氣干燥的禽艾美球蟲子孢子制片的相差顯微照片和使用了種種單克隆抗體的免疫螢光染色圖形顯微照片。圖A、B、C、D的左側(cè)為相差顯微照片，顯示了長形的完整子孢子，它有一個(gè)大的后折射體(PRB)、一個(gè)小的前折射體(ARB)和與后折射體相對(duì)的頂端(A)。圖A、B、C、D的右側(cè)分別顯示了用以下抗體處理的制片單克隆抗體14C3(特異于表面抗原)、6A5(特異于表面蛋白和折射體蛋白)、11D2(特異于子孢子頂端)和對(duì)照抗體。用結(jié)合有若丹明的抗小鼠抗體對(duì)結(jié)合在制片上的抗體進(jìn)行定位，并利用Leitz Dialux 22
顯微鏡通過表面螢光來顯示。所有顯微照片都放大630倍。
圖7顯示了雞腎細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)子孢子和發(fā)育中的寄生蟲的抗體染色。用子孢子感染雞腎細(xì)胞，感染后在指定的時(shí)間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理以進(jìn)行抗體染色。在固定前洗滌培養(yǎng)物以除去所有細(xì)胞外的子孢子。如圖所示，用抗體7D4、8A2、7B2和15A3制得相差顯微照片和相應(yīng)的免疫螢光顯微照片。用結(jié)合有若丹明的抗小鼠抗體對(duì)結(jié)合在制片上的抗體進(jìn)行定位，通過表面螢光進(jìn)行顯示。所有顯微照片都放大630倍。
圖8顯示了雞腎細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)子孢子和發(fā)育中的寄生蟲的抗體染色。利用單克隆抗體14B1和19D6、免疫雞血清和發(fā)熒光和第二抗體，在指定的時(shí)間制得相差顯微照片和相應(yīng)的免疫熒光顯微照片。
圖9顯示了抗子孢子抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)子孢子發(fā)育的抑制。將純化的禽艾美球蟲子孢子與對(duì)照抗體(X)或抗子孢子抗體7D4(□)、8A2(○)、14B1(●)、或6A5(■)一起于40℃下預(yù)保溫1小時(shí)，然后用來感染MDBK細(xì)胞培養(yǎng)物。此外，還將子孢子與培養(yǎng)基(△)或抗球蟲藥物拉沙里菌素(△)一起預(yù)保溫。
感染后，通過測定3H-尿嘧啶對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的摻入而測定細(xì)胞內(nèi)子孢子的發(fā)育。由于拉沙里菌素阻滯子孢子的細(xì)胞內(nèi)發(fā)育，所以用此藥物預(yù)處理的培養(yǎng)物顯示出3H-尿嘧啶的摻入最少。
圖10顯示了65kdβ-半乳糖苷酶融合蛋白樣品或所標(biāo)出的其它樣品的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳/Western吸印分析的結(jié)果。進(jìn)行Western吸印分析時(shí)，與羊抗小鼠HPOD結(jié)合物一起使用了鼠抗-β-半乳糖苷酶抗體(圖A)或混合在一起的單克隆抗體7D1、7D4和20C6(圖B)。A、B兩圖中的各泳道代表(1)β-半乳糖苷酶;(m)預(yù)染色的分子量標(biāo)記，其分子量(kd)在圖A的左側(cè)標(biāo)出;(2)總的細(xì)胞沉淀蛋白;(3)通過超聲處理從細(xì)胞沉淀中釋放出的蛋白;(4)超聲處理后用鹽酸胍從沉淀中溶解出的蛋白。
圖11是質(zhì)粒PEV/2-4的示意圖，該質(zhì)粒是含有噬菌體入m2-4的1.7kbEcoRIDNA插入片段的65kd蛋白表達(dá)質(zhì)粒。插入片段中各限制酶位點(diǎn)的位置相對(duì)于EcoRI位點(diǎn)給出，這些位點(diǎn)包括PstI(P，在bp53和766處)、KpnI(K，在bp202處)、BstNI(B，在bp584、1303和1412處)、Sau3A(S，在bp1017和1439處)。
圖12是pEV3-SEQ的圖譜，該質(zhì)粒含有一個(gè)帶有所標(biāo)出的位點(diǎn)和多連接子，該連接子插在pEV-vrf3的EcoRI和SalI位點(diǎn)之間。用虛箭頭所標(biāo)出的合成寡核苷酸CGGTCGACTCGAGCCA作為鏈終止DNA順序分析的引物。
圖13是編碼由單克隆抗體6A5識(shí)別的蛋白的cDNA克隆的限制圖譜。圖中給出了于1.1kbcDNA的Maxam-GilbertDNA順序分析的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。括號(hào)中的EcoRI位點(diǎn)位于0.9kbcDNA的末端。圖譜上方的橫杠表示由該DNA順序預(yù)測的開放讀碼，涂黑的部分為可能的信號(hào)肽。圖譜下部的直線表示用來進(jìn)行鏈終止順序分析的exoⅢ缺失。
圖14是1.1kdcDNA分子的核苷酸順序，該順序編碼由單克隆抗體6A5識(shí)別的20kd蛋白。
圖15是圖14蛋白的氨基酸順序，是從圖14的核苷酸順序推測的。
圖16是1.7kbcDNA分子的核苷酸順序，該順序編碼由單克隆抗體7D1、7D4和20C6識(shí)別的65kd蛋白。
圖17是圖16蛋白的氨基酸順序，是由圖16的核苷酸順序推測的，這個(gè)氨基酸順序已通過對(duì)由所表達(dá)的65kd蛋白所產(chǎn)生的胰酶水解肽進(jìn)行順序分析而加以驗(yàn)證。將總氨基酸順序中相應(yīng)于某些肽的區(qū)域畫下線表示。這些肽中已測定的順序畫了上線。
圖18是1.1kdcDNA分子的核苷酸順序，該順序編碼由單克隆抗體8A2識(shí)別的28kd蛋白。
圖19是圖18蛋白的氨基酸順序，是由圖18的核苷酸順序推測的。
圖20是3.2kdcDNA分子的核苷酸順序，該順序編碼由單克隆抗體7B2識(shí)別的蛋白。
圖21是圖20蛋白的氨基酸順序，是由圖20的核苷酸順序推測的。
圖22是經(jīng)過免疫親和純化的65kd蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。凝膠通過考馬斯藍(lán)染色和Western吸印分析來顯示。泳道2和4、3和5含有從兩個(gè)制備物中純化的蛋白。泳道1和6含有分子量標(biāo)記蛋白的混合物，這些蛋白分子量標(biāo)示在圖的左側(cè)和右側(cè)。
圖23是經(jīng)β-巰基乙醇還原的(圖A)和未還原的(圖B)65kd蛋白胰酶水解物的HPLC洗脫圖譜，顯示作為柱保留時(shí)間的函數(shù)的215nm光吸收。
圖24顯示了基本載體的四個(gè)成分的限制圖譜，該載體用于將編碼球蟲抗原的基因重組到牛痘病毒中。這些成分包括7.5k啟動(dòng)子成分(a和b，左)、TK座位(a和b，右)、質(zhì)粒pVC8的一部分(C)和來自M13tg131的多克隆位點(diǎn)(d)。病毒7.5k和TK啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向是從左至右(即從多連接子中的BglⅡ限制位點(diǎn)到EcoRI位點(diǎn))。
圖25顯示了由單克隆抗體8A2到識(shí)別的艾美球蟲抗原的N末端氨基酸順序，(A)中的單克隆抗體8A2是由一個(gè)在圖24載體的多連接子成分中含有AUG翻譯起始密碼子的構(gòu)建體表達(dá)的;(B)中的單克隆抗體8A2與瘧疾的190kd先導(dǎo)片段(頭34個(gè)氨基酸)和圖24克隆載體的多連接子下面13個(gè)氨基酸)融合。在該蛋白的成熟過程中，N末端的頭19個(gè)氨基酸可在冒號(hào)所標(biāo)出的位置被切除。
在附圖中，使用了標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫來表示核苷酸，使用了標(biāo)準(zhǔn)的一字母或三字母縮寫來表示氨基酸。這些縮寫的含義可以在一般的生化教科書中找到，例如Lehninger的《生化原理》一書的第96頁和798頁(PrinciplesofBiochemistry，1984，WorthPublishers，Inc.，NewYork)。
這里所用的下列術(shù)語將具有下列含義“20kd蛋白”指一種能與單克隆抗體6A5特異結(jié)合的重組或合成蛋白，在用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定時(shí)其表觀分子量約為20千道爾頓。該蛋白還特異地與在SDS凝膠中表觀分子量約為28千道爾頓的艾美球蟲表面抗原(來自艾美球蟲蛋白的全提取液)反應(yīng)。此抗原存在于子孢子的發(fā)育階段。編碼此蛋白的cDNA分子的核苷酸順序及由此推測出的氨基酸順序分別示于圖14和15。
“65kd蛋白”指一種能與單克隆抗體7D1、7D4和20C6特異結(jié)合的重組或合成蛋白，在用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定時(shí)其表觀分子量約為65千道爾頓。這些抗體還特異地與艾美球蟲提取液中其表觀分子量在SDS凝膠中約為120千道爾頓的表面抗原反應(yīng)。此抗原存在于子孢子、裂殖體和裂殖子發(fā)育的各階段中。編碼此蛋白的cDNA分子的核苷酸順序及由此推測的氨基酸順序分別示于圖16和17。
“28kd蛋白”指一種能與單克隆抗體8A2特異結(jié)合的重組或合成蛋白，在用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定時(shí)其表觀分子量約為28千道爾頓。此抗體還特異地與一種表觀分子量在SDS凝膠中約為37千道爾頓的艾美球蟲表面抗原反應(yīng)。此抗原存在于子孢子、裂殖體和裂殖子發(fā)育階段中。編碼此蛋白的cDNA分子的核苷酸順序及由此推測的氨基酸順序分別示于圖18和9。
“45kd蛋白”指能與單克隆抗體7B2特異結(jié)合的重組或合成蛋白，在用SDS聚丙酰胺凝膠電泳進(jìn)行測定時(shí)其表觀分子量約為45千道爾頓。此抗體還特異地與一種其表觀分子量在SDS凝膠中大于200千道爾頓的艾美球蟲表面抗原反應(yīng)。此抗原存在于子孢子發(fā)育的各階段中。編碼此蛋白的cDNA分子的核苷酸順序及由此推測的氨基酸順序分別示于圖20和21。
術(shù)語“具有艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇的蛋白”指一種蛋白，該蛋白具有一個(gè)或多個(gè)這樣的區(qū)域或決定基，這些區(qū)域或決定基能夠在免疫感受態(tài)宿主生物體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)和/或能夠與互補(bǔ)抗體特異結(jié)合。
由于遺傳密碼具有簡并性，所以應(yīng)當(dāng)理解，可能有許多核苷酸順序(功能等價(jià)物)都能編碼圖15、17、19和21所示的氨基酸順序。還應(yīng)當(dāng)理解，插入載體中的本發(fā)明DNA順序和片段的核苷酸順序可以包括并非實(shí)際結(jié)構(gòu)基因一部分的核苷酸，只要求含這些順序和片段的重組載體能夠在適當(dāng)?shù)乃拗魃镏兄笇?dǎo)一種蛋白或片段的生成，這種蛋白或片段具有艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇。
此外，已知在蛋白質(zhì)中可發(fā)生基本上不改變生物活性和免疫活性的氨基酸置換，Neurath等人的《蛋白質(zhì)》一書中(“TheProteins”，AcademicPress，NewYork，1979)，具體說是14頁的圖6，對(duì)此作了描述。最常見的氨基酸置換有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly，反之亦然。
本發(fā)明示例性實(shí)施方案的這些功能上等價(jià)的核苷酸順序變異和氨基酸置換，只要所產(chǎn)生的蛋白保留了艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇，就在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
術(shù)語“片段”指含有本發(fā)明的一段cDNA或蛋白亞順序的DNA順序或蛋白。這些片段可由較大分子經(jīng)酶切而產(chǎn)生，對(duì)DNA使用限制性核酸內(nèi)切酶，對(duì)蛋白使用蛋白酶。但本發(fā)明的片段并不限于任何形式的酶切產(chǎn)物，而包括其末端并不相應(yīng)于任何酶切點(diǎn)的亞順序。這些片段可利用這里所提供的順序資料通過例如化學(xué)合成法制得。DNA片段可以通過由分離的信使RNA(mRNA)合成不完全的互補(bǔ)DNA(cDNA)來產(chǎn)生。蛋白片段也可通過表達(dá)編碼蛋白片段的DNA片段來產(chǎn)生。如果這些蛋白片段含有足以構(gòu)成免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇的氨基酸殘基數(shù)，則可用于本發(fā)明。一般約需至少7或8個(gè)殘基。如下所述，可能需要把這些片段與免疫原性載體分子偶聯(lián)以使它們具有免疫反應(yīng)性。
本發(fā)明的蛋白可以用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來制備，如用重組DNA方法、化學(xué)合成法或從艾美球蟲制備物中分離。
制備本發(fā)明蛋白所需的DNA可以利用圖14、16、18和20所提供的核苷酸順序資料來化學(xué)合成。這種化學(xué)合成可以用任何已知的方法進(jìn)行，但優(yōu)選氨基亞磷酸酯(phosphoramidite)固相載體法(Matteuccietal.J.Am.Chem.Soc.103∶3185，1981)。
此外也可由艾美球蟲mRNA制備cDNA。信使RNA可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從形成孢子的艾美球蟲卵囊或裂殖子中分離。然后可利用這些mRNA樣品，如Maniatis等人(同上)所述產(chǎn)生雙鏈cDNA。然后可將該cDNA插入適當(dāng)?shù)目捎糜谵D(zhuǎn)化大腸桿菌的克隆載體中，以產(chǎn)生一個(gè)cDNA文庫。
接著，可以利用本發(fā)明的克隆基因或其片段作探針來篩選cDNA文庫。這些基因或片段可以利用DNA聚合酶Ⅰ通過(例如)缺刻翻譯而進(jìn)行放射標(biāo)記，標(biāo)記反應(yīng)在四種脫氧核糖核苷酸存在下進(jìn)行，其中一種核苷酸在α位含有32P作為探針(Maniatis等人，同上，第109頁)。
雖然在后面的實(shí)施例中是用禽艾美球蟲作mRNA的來源，但也可用這個(gè)種的克隆基因作探針而從其它種的艾美球蟲中分離基因，因?yàn)樵诟鞣N不同的種中DNA順序具有同源性。
鑒定并分離出本發(fā)明的艾美球蟲基因后，將其插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，該載體含有所插入的基因順序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的各成分。有用的克隆載體可以由染色體DNA順序、非染色體DNA順序和合成DNA順序的片段構(gòu)成，例如已知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、質(zhì)粒和噬菌體DNA的各種組合(如經(jīng)過修飾而引入了噬菌體DNA或其它表達(dá)控制順序的質(zhì)粒)、或酵母質(zhì)粒。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的、可用的特殊克隆載體包括(但并不限于)pEV-vrf質(zhì)粒(pEV-vrf1、pEV-vrf2和pEV-vrf3);SV40;腺病毒;酵母;λgt-WES-λB;Charon4A和Charon28;λgt11-λB;由M13衍生的載體，如pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pBR313、pBR322和pBR325;pAC105、pVA51;pACY177;pKH47;pACYC184;pUB110;pMB9;colE1;pSC101;pm121;RSF2124;pCR1或RP4。
如果基因和所需的克隆載體都用相同的限制酶切割，則易于將艾美球蟲基因插入克隆載體中，因?yàn)檫@種切割產(chǎn)生了互補(bǔ)的DNA末端。如果不能這樣做，則可能需要修飾切割后所產(chǎn)生的末端，方法是通過再消化單鏈DNA而產(chǎn)生平末端，或者通過用適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶填平單鏈末端而達(dá)到同樣的結(jié)果。采用這種方法時(shí)，可以用一種酶(如T4DNA連接酶)進(jìn)行平末端連接。此外，也可以通過在DNA末端上連接某些核苷酸順序(連接子)來產(chǎn)生任何所需的位點(diǎn)。這些連接子可以含有編碼限制位點(diǎn)識(shí)別順序的特定寡核苷酸順序。切割后的載體和艾美球蟲基因還可以通過接上均聚物尾巴而加以修飾(Morrow，Meth.Enzymol.68∶3，1979)。
可用于本發(fā)明的許多克隆載體都含有可用來選擇所需轉(zhuǎn)化體的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記活性，如pBR322中的氨芐青霉素和四環(huán)素抗性、pUC8中的氨芐青霉素抗性和β-半乳糖苷酶活性、pEV-vrf2中的氨芐青霉素抗性。如果宿主細(xì)胞反而缺少這些載體所具有的活性，則對(duì)已插入了上述載體的宿主細(xì)胞的選擇就大大簡化了。
應(yīng)當(dāng)理解，插在克隆載體中選定位點(diǎn)的艾美球蟲基因的核苷酸順序，可以包括并非實(shí)際結(jié)構(gòu)基因一部分的核苷酸。此外，該基因也可以只含有完整野生型基因的一部分。唯一的要求就是，插入克隆載體中的基因片段能夠指導(dǎo)具有艾美球蟲表面抗原的至少一個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇的多肽或蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗魃镏械漠a(chǎn)生。
適當(dāng)?shù)乃拗魃锏倪x擇受到本領(lǐng)域內(nèi)已知的幾個(gè)因素的影響。這些因素包括，例如，與所選用的載體的相容性、由雜交質(zhì)粒編碼的蛋白的毒性、所要的蛋白是否易于回收、表達(dá)特性、生物安全性和費(fèi)用。這些因素的平衡問題一定會(huì)遇到，因此必須理解，并非所有宿主對(duì)特定重組DNA分子的表達(dá)都是等效的。
可用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)膯渭?xì)胞宿主生物包括(但不限于)植物、哺乳動(dòng)物或酵母細(xì)胞及細(xì)菌，例如大腸桿菌、枯草桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)和放線菌。特別優(yōu)先的是大腸桿菌MC1061菌株，該菌株曾由Casadaban等人作了描述(J.Mol.Biol.138∶179，1980)。可以使用此菌株或含有質(zhì)粒pRK248cIts的大腸桿菌K12的任何其它菌株。用于其它大腸桿菌K12菌株的質(zhì)粒pRK248cIts可從ATCC得到，其登記號(hào)為ATCC33766。大腸桿菌MC1061菌株也已保藏，其登記號(hào)為ATCC53338。
可以用多種方法將重組克隆載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。根據(jù)所選用的特定載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)，這種轉(zhuǎn)移可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染來進(jìn)行。產(chǎn)生這樣一種轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，就可以培養(yǎng)該細(xì)胞，并可以從該培養(yǎng)物中分離蛋白表達(dá)產(chǎn)物。
產(chǎn)生本發(fā)明艾美球蟲蛋白的克隆可以用適當(dāng)標(biāo)記的、特異于這些蛋白的抗體來鑒定。優(yōu)選的單克隆抗體可以用如下的標(biāo)準(zhǔn)方法來制備。
用禽艾美球蟲的抗原蛋白來免疫諸如小鼠、大鼠、馬、綿羊、豬、兔等動(dòng)物，得到產(chǎn)生抗體的體細(xì)胞用于與骨髓瘤細(xì)胞融合。
具有產(chǎn)生抗體能力的體細(xì)胞，特別是B細(xì)胞，適于與骨髓瘤細(xì)胞系融合。這些體細(xì)胞可以從已接觸過抗原的動(dòng)物的淋巴結(jié)、脾和外周血中得到。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用小鼠脾細(xì)胞，這部分是因?yàn)檫@些細(xì)胞能與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系產(chǎn)生相對(duì)較高百分比的穩(wěn)定融合體。但也有可能使用大鼠、兔、蛙或其它細(xì)胞。
現(xiàn)已由淋巴瘤建立了特化的骨鏈瘤細(xì)胞系，用于產(chǎn)生雜交瘤的融合方法(KoehlerandMilstein，Eur.J.Immunol.6511，1976，Shulmanetal，Nature276∶269，1978，etal，J.Virol.42∶220，1982)。建立這些細(xì)胞系至少是由于三個(gè)原因。第一是為了有利于未融合的、不定地自我繁殖的骨髓瘤細(xì)胞及類似的細(xì)胞中選擇出融合的雜交瘤。這通常是利用有某些酶缺陷的骨髓瘤來進(jìn)行的，這些酶缺陷使骨髓瘤不能在支持雜交瘤生長的某些選擇性培養(yǎng)基中生長。第二個(gè)原因源于淋巴瘤細(xì)胞固有的產(chǎn)生其自身抗體的能力。使用單克隆技術(shù)的目的是為了得到壽命無限的融合雜交細(xì)胞系，這些細(xì)胞系在雜交瘤的體細(xì)胞成分的遺傳控制下，產(chǎn)生所需的單一抗體。為減少雜交瘤產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞抗體，可以使用不能產(chǎn)免疫球蛋白輕鏈或重鏈，或抗體分泌機(jī)制有缺陷的骨髓瘤細(xì)胞系。選擇這些細(xì)胞系的第三個(gè)理由是因?yàn)樗鼈兊倪m用性強(qiáng)，融合效率高。
許多骨髓瘤細(xì)胞系都可以用來產(chǎn)生融合的雜交細(xì)胞，這些細(xì)胞系包括例如P3/X63-Ag8、P3/NSI/1-Ag4-1、SP2/O-Ag-14和S194/5.XXOBU.1。P3/X63Ag和P3/NSI/1-Ag40-1細(xì)胞系已由Kohler和Milstein作了描述(Eur.J.Immunol.6511，1976)。Shulman等人(Nature276∶269，1978)建立了SP2/O-Ag14骨髓瘤細(xì)胞系。Trowbridge報(bào)導(dǎo)了S194/5.XXO.BU.1細(xì)胞系(J。Exp.Med.148∶313，1979)。在本發(fā)明的實(shí)施例中使用是的PAI-O小鼠細(xì)胞系(P3/X63-Ag8的一個(gè)不產(chǎn)生Ig的亞克隆)。
產(chǎn)生抗體的脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜交體的制備方法通常包括在能夠促進(jìn)細(xì)胞膜融合的一種或幾種因子(化學(xué)的、病毒的或電的)存在下，分別將這兩種體細(xì)胞以10∶1的比例與骨髓瘤細(xì)胞混合(但該比例也可以在201至1∶1間變化)。最好用同一個(gè)種的動(dòng)物作用于融合操作的體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的來源。有關(guān)融合方法已由Kohler和Milstein(Nature256∶495，1975;Eur.J.Immunol.6∶511，1976)、Gefter等人(SomaticCellGenet.3∶231，1977)和Volk等人(J.Virol.42∶220，1982)作了描述。這些研究人員使用的促融合因子是仙臺(tái)病毒和聚乙二醇(PEG)。本發(fā)明實(shí)施例的融合操作使用的是PEG。
由于融合操作產(chǎn)生的活雜交體的頻率很低(例如，用脾作體細(xì)胞來源時(shí)，大致每1105脾細(xì)胞只得到一個(gè)雜交體)，所以必須有一種手段從剩下的未融合細(xì)胞特別是未融合的骨髓瘤細(xì)胞中選擇出融合的雜交細(xì)胞。同時(shí)也需要有一種手段從所得的其它融合細(xì)胞中檢測所要的產(chǎn)生抗體的雜交瘤。
在選擇融合的雜交細(xì)胞時(shí)，一般是用支持雜交瘤生長但阻止骨髓瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞，而正常情況下骨髓瘤細(xì)胞將繼續(xù)不定地分裂。(用于融合的體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不能保持長期存活，因此不成為問題)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用了缺少次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的(HPRT陰性)骨髓瘤細(xì)胞。用次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)培養(yǎng)基選擇掉這些細(xì)胞。在HAT培養(yǎng)基中，融合的雜交細(xì)胞由于脾細(xì)胞具有HPRT陽性基因型而能夠存活。也可以使用帶有不同的遺傳缺陷(藥物敏感性等)的骨髓瘤細(xì)胞，從而能夠用支持基因型感受態(tài)雜交體生長的培養(yǎng)基選擇掉骨髓瘤細(xì)胞。
選擇性培養(yǎng)融合的雜交細(xì)胞需要幾周。在這段時(shí)間的初期，需要鑒定出那些產(chǎn)生所需抗體的雜交體，使它們可以在后續(xù)步驟中進(jìn)行克隆和繁殖。通常，所得雜交體中產(chǎn)生所需抗體的有10%左右，但在1%至30%范圍內(nèi)都是常見的。產(chǎn)生抗體的雜交體可以用幾種標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中的任一種進(jìn)行檢測，這些方法包括酶聯(lián)免疫檢測和放射免疫檢測技術(shù)，這些技術(shù)已見于文獻(xiàn)中[參見例如，Kennet等人(編者)，MonoclonalAntibodiesandHybridomasANewDimensioninBiologicalAnalyses，pp.376-384，1980，PlenumPress，NewYork)。本發(fā)明的實(shí)施例中使用了幾種檢測方法。
選擇出所需的融合雜交細(xì)胞并分別克隆出幾個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系后，每個(gè)細(xì)胞系都可以用兩種標(biāo)準(zhǔn)方法中的任一種進(jìn)行繁殖?？梢詫㈦s交瘤細(xì)胞的懸浮液注射到組織相容性動(dòng)物體內(nèi)。接受注射的動(dòng)物將因此而長出腫瘤，這些腫瘤分泌由融合的雜交細(xì)胞產(chǎn)生的特異性單克隆抗體。可以抽出動(dòng)物的體液，如血清或腹水液，從而提供高濃度的單克隆抗體。此外，也可以用實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿分別對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行體外繁殖。可以通過傾析、過濾或離心，收集含有高濃度的單一特異性單克隆抗體的培養(yǎng)基。
在大腸桿菌中產(chǎn)生艾美球蟲蛋白時(shí)，這些蛋白保留在細(xì)胞質(zhì)或包含體中。因此，為分離這些蛋白、需要破碎外膜。這最好利用超聲處理或其它機(jī)械破碎裝置(如法式壓力室或Gaulin勻漿器)來進(jìn)行。
也可以利用化學(xué)方法或酶法來破碎細(xì)胞。由于二價(jià)陽離子常常是維持細(xì)胞膜的完整性所必需的，所以用適當(dāng)?shù)尿蟿┤鏓DTA或EGTA進(jìn)行處理可以產(chǎn)生足夠的破碎作用，從而有利于蛋白從細(xì)胞中流出。同樣，曾用某些酶如溶菌酶來達(dá)到同樣的效果。該酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖骨架。
也可以應(yīng)用滲壓休克。簡單地說，這可通過如下過程來進(jìn)行首先將細(xì)胞置于高滲溶液中，使細(xì)胞失水而收縮。而后置于低滲的“休克”溶液中，使水快速流入細(xì)胞而逐出所需的蛋白。
從細(xì)胞中分離出艾美球蟲蛋白后，可以利用鹽析法(如用硫酸鈉或硫酸銨)、超濾法或本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員公知的其它方法來濃縮這些蛋白。進(jìn)一步的純化可以利用常規(guī)的蛋白純化技術(shù)進(jìn)行，這些技術(shù)包括(但不限于)凝膠過濾、離子交換層析、制備性圓盤凝膠電泳或垂直板電泳、等電聚焦、低濕有機(jī)溶劑分級(jí)分離、或逆流分配。但最好用如下所述的免疫親和層析法進(jìn)行純化。
本發(fā)明的蛋白或其片段也可以用適當(dāng)?shù)姆椒ɑ瘜W(xué)合成，如用完全固相合成法、部分固相法、片段縮合法或經(jīng)典的溶液合成法。優(yōu)選如Merrifield所述的固相合成法(J.Am.Chem.Soc.85∶2149，1963)。
這種合成用α氨基末端得到保護(hù)的氨基酸進(jìn)行。帶有不穩(wěn)定側(cè)鏈的三官能團(tuán)氨基酸也用適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)進(jìn)行保護(hù)，這些基團(tuán)將防止在肽合成過程中在該部位發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。選擇性地脫除α-氨基保護(hù)基，以便在氨基末端發(fā)生后續(xù)的反應(yīng)。脫除α-氨基保護(hù)基的條件不使側(cè)鏈保護(hù)基脫保護(hù)。
α-氨基保護(hù)基是那些已知可用于肽分步合成領(lǐng)域的保護(hù)基，包括?；捅Ｗo(hù)基(例如甲酰基、三氟乙酰基、乙?；?、芳族尿烷型保護(hù)基(例如芐氧羰基(Cbz)和取代的芐氧羰基)、脂族尿烷保護(hù)基(例如叔丁氧羰基(Boc)、異丙氧羰基、環(huán)己氧羰基)和烷基型保護(hù)基(例如芐基、三苯甲本)。優(yōu)選的保護(hù)基是Boc。Tyr的側(cè)鏈保護(hù)基包括四氫吡喃基、叔丁基、三苯甲基、芐基、Cbz、4-Br-Cbz和2，6-二氯芐基。(優(yōu)選的Tyr側(cè)鏈保護(hù)基是2，6-二氯芐基。)Asp的側(cè)鏈保護(hù)基包括芐基、2，6-二氯芐基、甲基、乙基和環(huán)己基。優(yōu)選的Asp側(cè)鏈保護(hù)基是環(huán)己基。Thr和Ser的側(cè)鏈保護(hù)基包括乙?；?、苯甲?；⑷郊谆?、四氫吡喃基、芐基、2，6-二氯芐基和Cbz。優(yōu)選的Thr和Ser的保護(hù)基是芐基。Arg的側(cè)鏈保護(hù)基包括硝基、Tos和Cbz、金剛烷氧羰基或Boc。優(yōu)選的Arg保護(hù)基是Tos。Lys的側(cè)鏈氨基可以用Cbz、2-CLCbz、Tos或Bos來保護(hù)。優(yōu)選的Lys保護(hù)基是2-CL-Cbz基團(tuán)。根據(jù)以下原則選擇側(cè)鏈保護(hù)基側(cè)鏈保護(hù)基在偶聯(lián)過程中保持不變，在氨基末端保護(hù)基脫保護(hù)過程中或在偶聯(lián)條件下不被切除。側(cè)鏈保護(hù)基必須在完成最終的肽合成后，能利用不改變目標(biāo)肽的反應(yīng)條件脫除。
固相合成通常是通過使α-氨基得到保護(hù)的(側(cè)鏈得到保護(hù)的)氨基酸與適當(dāng)?shù)墓滔噍d體偶聯(lián)而從羧基末端進(jìn)行。如果與氯甲基化的或羥甲基樹脂連接，則形成酯鍵，所得到目標(biāo)肽就將在C末端有一個(gè)游離羧基。此外，也可以用二苯甲基胺或?qū)谆郊谆窐渲?，在這種情況下形成一個(gè)酰胺鍵，所得到的目標(biāo)肽將在C末端具有一個(gè)羧酰胺基團(tuán)。這些樹脂可以買到，其制備方法由Stewart等人描述(“SolidPhasePeptideSynthesis，2ndEditien，PierceChemicalCo，Rockford，IL，1984)。
C末端氨基酸Arg的側(cè)鏈用Tos保護(hù)，其α氨基官能團(tuán)用Boc保護(hù)，用各種活化劑將該氨基酸偶聯(lián)到二苯甲基胺樹脂上，這些活化劑包括二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N′-二異丙基碳二亞胺和羰基二咪唑。連到樹脂載體上后，用三氟乙酸(TFA)或HCL的二惡烷溶液在0°到25℃的溫度下脫除α氨基保護(hù)基。引入甲硫氨酸(Met)后向TFA中加入二甲硫醚，以抑制可能的S-烷基化。脫除α氨基保護(hù)基后，將其余的被保護(hù)的氨基酸以所要求的順序分步偶聯(lián)，得到所需的肽順序。
進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)可以使用各種不同的活化劑，包括DDC、N，N′-二異丙基碳二亞胺、苯并三唑-1-基-氧-三(二甲胺基)-磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)和DCC-羥基苯并三唑(HOBt)。每種被保護(hù)的氨基酸的用量都是過量的(＞2.5當(dāng)量)，偶聯(lián)反應(yīng)通常在DMF、CH2Cl2或其混合物中進(jìn)行。在偶聯(lián)反應(yīng)的每個(gè)階段通過如Kaiser等人(Anal Biochem.34∶5951970)所述的茚三酮反應(yīng)監(jiān)測反應(yīng)完全程度。如果測得偶聯(lián)反應(yīng)不完全，則重復(fù)該偶聯(lián)反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)可以用Applied Biosystems Vega250型合成儀或其它市售儀器自動(dòng)進(jìn)行。完全合成出目標(biāo)肽后，將肽-樹脂用TFA/二硫乙烷脫保護(hù)，然后用一種試劑(如液體HF)于0℃下水解1-2小時(shí)，從樹脂上切下肽并脫除所有的側(cè)鏈保護(hù)基。
固相載體上側(cè)鏈與側(cè)鏈的環(huán)化作用要求使用正交保護(hù)方案，以便能夠選擇性地切除酸性氨基酸(如Asp)和堿性氨基酸(如Lys)的側(cè)鏈官能團(tuán)。Asp側(cè)鏈的9-芴基甲基(OFm)保護(hù)基和Lys側(cè)鏈的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)基可以用于此目的。在這些情況下，用哌啶的DMF溶液選擇性地脫除用Boc保護(hù)的肽-樹脂的側(cè)鏈保護(hù)基。環(huán)化反應(yīng)是用各種活化劑(包括DCC、DCC/HOBt或BOP)在固相載體上進(jìn)行。HF反應(yīng)則在如上所述的環(huán)化肽-樹脂上進(jìn)行。
合成蛋白的純化可以按如上所述的重組產(chǎn)生的蛋白純化方法進(jìn)行。
也可從禽艾美球蟲或其它種的艾美球蟲的膜蛋白提取物中，通過免疫沉淀或免疫親和層析來回收艾美球蟲蛋白。前已述及，這些方法能夠產(chǎn)生完整的野生型蛋白。在某些情況下，這些蛋白比用重組DNA方法產(chǎn)生的蛋白要大。用于此目的的單克隆抗體，可以利用合成的或天然的艾美球蟲蛋白作抗原按上述方法制備。
其它具有必需的免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇的有用蛋白是一些抗個(gè)體基因型抗體或其片段，它們針對(duì)本發(fā)明蛋白上的活性決定簇。這些抗個(gè)體基因型抗體可以針對(duì)其它特異于本發(fā)明蛋白上的決定簇的抗體而產(chǎn)生(即抗個(gè)體基因型抗體是抗抗體)。最好使用單克隆的抗個(gè)體基因型抗體。這些抗體可以作為疫苗而施用，使用方式與艾美球蟲蛋白本身所能夠采取的使用方式相同。
可以將一種或多種本發(fā)明的艾美球蟲蛋白和抗個(gè)體基因型抗體配成含有蛋白和生理上可接受載體的疫苗。合適的載體包括，例如中性PH的0.01至0.1M磷酸緩沖液或生理鹽水溶液。
可以以兩種方式之一產(chǎn)生抗球蟲病的增強(qiáng)免疫。首先可以將佐劑或免疫增強(qiáng)劑加到疫苗中。其次可以將本發(fā)明的蛋白以較大的形式給予所要免疫的動(dòng)物，這種形式既可以是交聯(lián)復(fù)合物，也可以是與載體分子結(jié)合。
適于接種動(dòng)物的佐劑包括(但不限于)佐劑65(含有花生油、二縮甘露醇單油酸酯和單硬脂酸鋁);無機(jī)凝膠，例如氫氧化鋁、磷酸鋁和明礬;表面活性劑，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基二(十八烷基)溴化胺、N，N-二(十八烷基)-N′，N′-雙(2-羥甲基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油、普盧龍尼克多元醇類;聚陰離子，如吡喃、硫酸葡聚糖、多聚IC、聚丙烯酸和carbopol;肽類，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和特夫素;油乳膠。這些蛋白還可以在摻入脂質(zhì)體或其它微載體之后施用。
摻入到脂質(zhì)體或其它微載體中的方法，提供了一種能夠在長時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放疫苗的手段。也可以用一種泵如ALza泵來達(dá)到同樣的目的。
本發(fā)明的蛋白特別是較小片段的免疫原性，可以通過與免疫原性載體分子(即一種具有在宿主動(dòng)物體內(nèi)獨(dú)立誘發(fā)免疫反應(yīng)特性的大分子，本發(fā)明的蛋白和蛋白片段可與之共價(jià)連接)交聯(lián)或偶聯(lián)而得以增強(qiáng)。之所以要與載體分子交聯(lián)或結(jié)合，是因?yàn)樾〉牡鞍灼斡袝r(shí)起到半抗原(能夠與抗體特異結(jié)合但不能誘發(fā)抗體產(chǎn)生的分子，即它們不具有免疫原性)的作用。這些片段與免疫原性載體分子的結(jié)合，使得這些片段由于通常所說的”載體效應(yīng)“而獲得了免疫原性。
合適的載體分子包括，例如，蛋白和天然或合成的聚合物，如多肽、多糖、脂多糖等。一種有用的載體是一種稱為QuilA的糖苷，它已由Morein等人作了描述(Nature308∶457，1984)。特別優(yōu)選的是蛋白載體分子，包括(但不限于)哺乳動(dòng)物血清蛋白，如鑰孔嘁血藍(lán)蛋白，人或牛γ球蛋白，人、?；蛎庋迩宓鞍?，或這些蛋白的甲基化衍生物或其它衍生物。其它蛋白載體對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說將是顯而易見的。對(duì)準(zhǔn)備在其體內(nèi)誘導(dǎo)出抗艾美球蟲蛋白抗體的宿主動(dòng)物來說，蛋白載體最好(但不一定)是外來的。
與載體分子進(jìn)行共價(jià)側(cè)聯(lián)時(shí)，可以采用本領(lǐng)域公知的方法，具體選擇哪一種方法將由所用載體分子的本質(zhì)決定。如果免疫原性載體分子是蛋白，則在偶聯(lián)本發(fā)明的蛋白或片段時(shí)可以采用(例如)水溶性碳二亞胺如二環(huán)己基碳二亞胺或戊二醛。
象這樣一些偶聯(lián)劑，也可以用來使蛋白和片段自身交聯(lián)，而無需使用另外的載體分子。這樣交聯(lián)成蛋白或蛋白片段的聚集體，也能增強(qiáng)免疫原性。
施用有效量的本發(fā)明疫苗能夠保護(hù)家禽不受禽艾美球蟲的感染。在體外，針對(duì)禽艾美球蟲抗原的單克隆抗體與堆型艾美球蟲和百型艾美球蟲(E.Maxima)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，表明這些抗體也可以賦予針對(duì)這些種的保護(hù)作用。蛋白或蛋白片段的有效劑量范圍為接種動(dòng)物每千克體重約10～50微克。優(yōu)選劑量為約25～50μg/kg。初次接種后，最好在一周至幾周后進(jìn)行加強(qiáng)接種。也可以多次加強(qiáng)接種。這些加強(qiáng)接種的劑量范圍一般為約5～50μg/kg，最好約20～50μg/kg?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)的給藥途徑，如皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服、肛門或卵內(nèi)給藥。
將本發(fā)明的球蟲抗原給予家禽的免疫系統(tǒng)時(shí)，可以將編碼這些抗原的基因克隆到細(xì)菌(例如大腸桿菌或沙門氏菌)或病毒(例如痘病毒或皰疹病毒)中，然后把這些活性載體系統(tǒng)通過口服、注射或其它常用的途徑施用于家禽。Carbit等人(Vaccines，1987，ColdSpringHarborLaboratory，PP.58～71)描述了大腸桿菌的使用，而Clements(Pathol.Immunopathol.Res.6∶137，1987)描述了沙門氏菌的使用。Moss等人(AnnRev.Immunol.5∶305，1987)綜述了采用重組痘病毒的病毒載體系統(tǒng)的使用。
有一種痘病毒，即牛痘病毒，可用來測試球蟲抗原在細(xì)胞培養(yǎng)物和動(dòng)物體中的釋放?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，對(duì)分析研究來說，雖然也可采用另一種痘病毒載體即鳥痘病毒，但牛痘病毒更為有效。這是因?yàn)榕６徊《颈萨B痘病毒繁殖快，并且其宿主范圍并不僅限于雞細(xì)胞?？梢詫⒋罅慨愒碊NA插入亍痘病毒基因組中而不抑制病毒的成熟和感染性(Smithetal，Gene25∶21，1983)。利用病毒插入并表達(dá)多個(gè)異源基因，可以誘導(dǎo)針對(duì)在感染動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的抗原的抗體產(chǎn)生(Rerkusetal，Science229∶981，1985)。
用于產(chǎn)生重組牛痘病毒的技術(shù)能夠容易地通過常規(guī)操作而沿用于鳥痘病毒或皰疹病毒系統(tǒng)。在抗球蟲病疫苗中使用這些重組病毒作載體特別有利，因?yàn)榻臃N的家禽對(duì)球蟲抗原和病毒載體都產(chǎn)生免疫(就是說，這類疫苗是二價(jià)的)。把另一些基因插入載體病毒中可以進(jìn)一步擴(kuò)大這類疫苗的用途。例如，可將新城疫病毒基因組的某些部分與球蟲抗原基因一起插入鳥痘病毒中，從而只用一種疫苗就能同時(shí)賦予針對(duì)新城疫、球蟲病和鳥痘的免疫。
施用本發(fā)明的活性載體疫苗時(shí)，可以采用本領(lǐng)域內(nèi)公知的多種方法。例如，可以采用對(duì)家禽進(jìn)行抗鳥痘病毒接種時(shí)常用的“刺份”法。此方法包括，用一個(gè)浸過疫苗的尖針刺進(jìn)翅膀的皮膚內(nèi)。該針通常象縫紉機(jī)針一樣在針尖附近有一個(gè)眼，這個(gè)眼能帶上一滴疫苗。此外，也可將活疫苗皮下或皮內(nèi)注射到翅膀或其它任何部位中。
重組活性載體疫苗還可以加到飲用水中，甚至可以噴到所要接種的雞身上。這些疫苗還可在飼料中施用，最好在保護(hù)性封裝后施用(Balancouetal，Nature322∶373，1986);或者在卵中施用。在后一種方法中，將病毒疫苗直接注射到雞胚中(Sharma，AvianDis.25∶1155，1985)。
實(shí)施例除非特別說明，下面給出的固體混合物中的固體、液體中的液體以及液體中的固體的百分比分別以wt/wt、vol/vol、wt/vol計(jì)。
1.抗艾美球蟲抗原的單克隆抗體的制備1.1、寄生蟲的制備利用標(biāo)準(zhǔn)方法，將禽艾美球蟲、堆型艾美球蟲、波氏艾美球蟲、百型艾美球蟲的子孢子從生成孢子的卵束中分離出。簡要地說，就是用蒸餾水和20%的漂白粉洗滌生成孢子的卵束，然后再用蒸餾水洗滌。將卵束在組織勻漿器中打碎，通過離心回收不溶物(包括孢子束)。將沉淀中的釋放出的孢子束和其它物質(zhì)再懸浮于含有0.25%胰酶和雞膽汁的Hank氏鹽溶液(pH8)中，在40℃保溫2小時(shí)。通過用含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640介質(zhì)洗滌兩次，然后用PBS在pH7.4下洗滌兩次而除去提取溶液。
然后將子孢子在metrazimide梯度上進(jìn)行純化[Wisheretal.，Parasitiology88∶515(1984)]。簡要地說，就是將子孢子再懸浮于2mlPBS(pH7.0)中，然后將1ml懸浮液鋪在15mlmetrazimide梯度上，該梯度的構(gòu)成為12%、18%和24%的metrazimide(在PBS中，pH7.0)各5ml。通過在900×g下離心40分鐘而沉淀子孢子。通過沿著試管壁插入-21號(hào)針頭并將子孢子吸入針管而將純化的子孢子從18%和24%metrazimide之間的介面中分離出。
將純化的子孢子用PBS(pH7.0)洗滌3次，并馬上用于免疫接種、感染試驗(yàn)、125I的表面標(biāo)記，免疫熒光分析成SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[Laemmli，Natune 227∶680(1970)]以及Western吸印實(shí)驗(yàn)。
禽艾美球蟲的裂殖子的分離如下面的6.2.3部分所述。將純化的裂殖子用于免疫接種，并用Laemmli樣品緩沖液溶解后用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western吸印實(shí)驗(yàn)。
1.2、免疫接種按下列日程，將8只雌性Balb/c小鼠(CharlesRiver，Wilmington，Mass.)用純化的活的子孢子免疫。
第1天 1×107個(gè)子孢子靜脈注射(i、v)第7天 6×106個(gè)子孢子腹膜內(nèi)注射(i.p.)第85天 6×106個(gè)子孢子i、p第120天 3×106個(gè)子孢子i、p第244天融合前加強(qiáng)免疫接種第1天 5×106個(gè)子孢子i.v.，5×106個(gè)子孢子i.p.
第2天同第1天第5天超免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合利用下列方法將每一只小鼠的血清都進(jìn)行抗子孢子抗體的測試用純化的子孢子蛋白進(jìn)行ELISA檢測、用溶解的子孢子蛋白進(jìn)行Western吸印檢測、用125I標(biāo)記的子孢子表面蛋白進(jìn)行免疫沉淀分析、用純化的子孢子進(jìn)行免疫熒光檢測。選擇具有最高子孢子抗體反應(yīng)活性的小鼠(小鼠107-2)進(jìn)行融合前加強(qiáng)免疫接種(見圖1該抗血清的ELISA分析)。第5天時(shí)，將小鼠殺死，取出脾臟用于制備脾細(xì)胞。
1.3、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞融合在融合前兩天，在完全培養(yǎng)基[Iscove氏修改的Dulbecco氏培養(yǎng)基(IMDM、Gibco)，加有10%FBS、谷氨酰胺(2.0mm)、以及2-巰基乙醇(100μM)]加上HAT(100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷)中，從幼年小鼠中制備脾細(xì)胞喂養(yǎng)細(xì)胞。利用修改的dest Grofh等人的方法[J、Immunol.Methods 35∶1(1980)]，將108個(gè)脾細(xì)胞與108個(gè)PAI-O小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。任何其它適于制備雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞都可利用。許多這類骨髓瘤細(xì)胞對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是已知的和可得的。
將這些細(xì)胞混合，離心沉淀并且在恒定的輕輕攪拌下，在37℃下1分鐘內(nèi)再懸浮于1.0ml含35%(vol/vol)聚乙二醇的IMDM中。在37℃下保溫3分鐘后，再次沉淀細(xì)胞，并再輕輕懸浮于10ml IMDM+HAT中。然后，在完全培養(yǎng)基+HAT中將細(xì)胞烯釋到1×106個(gè)細(xì)胞/ml，并將其分散到含有5×105個(gè)脾細(xì)胞喂養(yǎng)細(xì)胞/ml完全培養(yǎng)基的24孔微量滴定板上。
利用下列方法對(duì)雜交瘤上清液進(jìn)行抗子孢子抗體分析用純化的子孢子進(jìn)行ELISA分析、用子孢子蛋白進(jìn)行Western吸印分析、利用125I標(biāo)記的子孢子表面蛋白進(jìn)行免疫沉淀分析、用純化的子孢子和用子孢子感染的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光測定。通過有限稀釋將雜交瘤克隆。
1.4、子孢子的ELISA分析將純化的子孢子(4×104)加到96孔U型底PVC平板的每一個(gè)小孔中，這些小孔中事先已加入含1%BSA的PBS(pH7.0)。通過在1000×g下離心5分鐘，使子孢子沉入孔底。將子孢子再懸浮于100ml稀釋的抗血清或雜交瘤上清液中，并在室溫下恒定攪拌保溫2小時(shí)，然后用含1%BSA的PBS(pH7.0)洗滌子孢子，以除去未結(jié)合的抗體。
為了檢測結(jié)合到子孢子上的特異抗體，將100μl過氧化物酶結(jié)合的山羊抗小鼠IgG加入再懸浮的子孢子中，并將懸浮液在室溫下保溫2小時(shí)。洗滌子孢子，加入底物溶液(含有0.4%mg/ml鄰苯二胺的0.1M檸檬酸緩沖液，pH4.5，0.12%過氧化氫)，在室溫下保溫30分鐘，即可看見結(jié)合的抗體。通過加入含有50mM偏亞硫酸氫鈉的2.5MH2SO4而終止反應(yīng)。結(jié)合的抗體量通過有色底物的OD488讀數(shù)而確定。
在總共480個(gè)加有融合細(xì)胞的小孔中，有432個(gè)對(duì)雜交瘤生長呈現(xiàn)出陽性。其中，在初級(jí)子孢子ELISA測定中，358個(gè)雜交瘤對(duì)抗體產(chǎn)生呈現(xiàn)出陽性。在這些原始親本雜交瘤細(xì)胞的增殖和傳代過程中，有104個(gè)死亡或停止產(chǎn)生抗體，因此在隨后的用子孢子ELISA和Western吸印分析進(jìn)行的篩選中呈現(xiàn)陰性。子孢子ELISA鑒定出205個(gè)雜交瘤細(xì)胞系可產(chǎn)生10倍于背景水平的抗體。
1.5、子孢子蛋白的Western吸印分析將純化的子孢子(約5×107個(gè)子孢子/ml/凝膠)溶于Laemmli樣品緩沖液中，通過SDS-聚丙烯酰胺，凝膠電泳[或在12.5%的凝膠中，或在7.5-20%梯度凝膠(Laemmli，同上)中]進(jìn)行分離，并電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將纖維素膜在3%明膠緩沖液(3%明膠、Tris-Hcl，pH7.5、0.15MNacl)中封閉，并切成小條，再將小條在1%BSA緩沖液(1%BSA、50mM磷酸鈉，pH6.5、0.5MNacl、0.05%Tween-20)中4℃下與稀釋的抗血清或雜交瘤上清液反應(yīng)12小時(shí)。在PBS(pH7.4，0.05%Tween-20)中洗滌小條，并用過氧化物酶結(jié)合的抗小鼠抗體檢測特異性結(jié)合的抗體。通過加入底物溶液[4-氯-1-萘酚(30mg溶于10ml冰冷的甲醇和50mlTris-Hcl，pH7.5中)、0.15M Nacl、終縮度為0.015%的H2O2]，在室溫下保溫30分鐘，即可看見結(jié)合抗體。反應(yīng)通過用蒸餾水充分洗滌而終止。
在子孢子ELISA分析中呈現(xiàn)陽性的那些抗體中，有160個(gè)抗體在利用溶解出的子孢子蛋白進(jìn)行的Western吸印分析中，也呈現(xiàn)陽性。
Western吸印分析(見圖2)表明單克隆抗體的反應(yīng)方式有以下三種(a)與單個(gè)的艾美球蟲蛋白結(jié)合(例如，11A1和11D1)，(b)與2個(gè)或3個(gè)蛋白結(jié)合(例如，65A和20C6)，(c)與多個(gè)蛋白結(jié)合(例如，11A5、13A6、和14B5)。
利用禽艾美球蟲殖子和堆型艾美球蟲蛋白進(jìn)行Wescorn吸印分析(圖3)，進(jìn)一步鑒定抗體的特征。一些抗體，包括3A5、13A6、7D1和20C6，可識(shí)別從禽艾美球蟲和堆型艾美球蟲的子孢子和禽艾美球蟲的裂殖子中分離出來的蛋白。另一些抗體如6A5，表現(xiàn)出種和階段的特異性，只結(jié)合禽艾美球蟲子孢子蛋白。
從一些抗體得到的結(jié)果概括于表1，其中抗體的特異性以兩種方式表示(a)凝膠中被抗體結(jié)合的蛋白的來源和大小，(b)被抗體沉淀的125I標(biāo)記的禽艾美球蟲蛋白的大小(右欄)。表中還以同型物進(jìn)一步給出了抗體的特征。
表1Western吸印分析艾美球蟲蛋白(以kd表示凝膠中大小)被沉淀的抗體同型物禽堆型百型蛋白的大小SpzMrzSpzSpz(kd)7B2 G2a ＞200 - - - -7D4 G1120 120 120 - 1107D1 G1120 120 120 N.D. 11020C6 G1120 120 120 N.D. 1103A5M1201201201712019D6 G3180 180 - - 1208A2 G2a37 37 - - 376A5 G2b28/26 - - - 2514B5N.D.＞150N.D.N.D.
15B3N.D.＞150N.D.N.D.
14B1 G36 6 - - 24/1712B2 G328/26 - - - 24/1715A3 G128/6 - - - 17/15/615C4M28/26---105/15/612C3 G328 - N.D. N.D. 255B6 G3- N.D. 63C4Mmmm-7016D2Mmmm-70/8513A6Mmmm-11011B6 G3m m m - 10512A3 G3m m m - 24/1712D4 G1m N.D. N.D.
Spz和Mrz分別為子孢子和裂殖子的縮寫。
G和M分別代表IgG和IgM。
m表示抗體與多個(gè)蛋白結(jié)合，蛋白大小為24到大于200kd。
N.D表示的值未確定。
1.6、125I標(biāo)記的子孢子表面蛋白的免疫沉淀反應(yīng)利用IODOGEN方法(Pierce化學(xué)公司)或利用IODOBEADS(Pierce化學(xué)公司)，將純化的子孢子表面蛋白用125I標(biāo)記。對(duì)后一種方法而言，將4IODOBEADS用0.2M磷酸鈉(pH7.5)洗滌3次，加入1～3mCi的125I～Na，室溫下保溫5分鐘。向反應(yīng)瓶中加入200μl含有純化子孢子(3×108)的PBS(pH7.0)，繼續(xù)保溫15分鐘。保溫結(jié)束時(shí)，加入苯甲磺酰氯(PMSF)至終濃度為0.5mM。
在12，000Xg下離心30秒，回收保溫混合物中的子孢子，并溶解于1ml含有2%十二烷基硫酸鈉(SDS)或1%TritonX-100的PBS(pH7.0)中。在12，000Xg下離心3分鐘而除去不溶物。利用截止分子量為3，500的濾膜，將溶解的子孢子蛋白在4℃下對(duì)3升PBS(pH7.0)透析以除去殘余的游離125I。使用前，將125I標(biāo)記的子孢子蛋白(典型的是將1.5×108cpm摻入蛋白)在4℃下貯存?？杀籘DA沉淀的放射性一般超過總放射性的95%。125I標(biāo)記的子孢子蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析示于圖4的左圖。
通過向250μl含有125I標(biāo)記的子孢子蛋白(1×105cpm)的緩沖液I(0.25%NP40，10mM Tris-HCL，pH7.5，0.15MNaCl)中加入300μl雜交瘤上清液或稀釋的抗血清，而進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。在4℃下保溫16小時(shí)后，加入100-200μl50%的偶聯(lián)到瓊脂糖(Sigma化學(xué)公司)上的山羊抗小鼠IgG懸浮液。將混合物在一旋轉(zhuǎn)混合器上室溫下保溫2小時(shí)。通過在12，000Xg下離心1分鐘而沉淀瓊脂糖珠，并用洗滌緩沖液(0.1%SDS、0.5%NP-40、0.2%脫氧膽酸鈉、10mMPMSF、10mMTris-HCl、pH8.5、0.15MNaCl)洗滌3次。
通過加入60μl2×Laemmli樣品緩沖液并在95℃下加熱3分鐘而將結(jié)合在固相抗體上的125I標(biāo)記的蛋白釋放和變性。通過在12.5%凝膠中進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳而分離免疫沉淀的125I標(biāo)記的子孢子蛋白，并通過放射白顯影而觀察。
用免疫小鼠血清進(jìn)行的免疫沉淀分析的結(jié)果示于圖4的右圖。在子孢子ELISA分析中表現(xiàn)陽性的那些雜交瘤抗體中，有74個(gè)在免疫沉淀分析中也表現(xiàn)為陽性。如圖5所示，雜交瘤抗體分成兩類，一類是僅沉淀單個(gè)蛋白(如3C4、6A5、7D4、8A2、11D2和20C6)，另一類是沉淀2個(gè)或更多個(gè)蛋白(如12B2、15A3、15C4和19D6)。
1.7、用純化的子孢子進(jìn)行免疫熒光測定將PBS(pH7.0)中的子孢子(1×105)加到有8個(gè)小室的載玻片(LabTek)上，在37℃下空氣干燥12小時(shí)。用10%正常山羊血清于37℃下封閉載片2小時(shí)。向每個(gè)小室中加入稀釋的抗血清或雜交瘤上清液，并在室溫下保溫2小時(shí)。洗滌載玻片，加入若丹明結(jié)合的抗小鼠抗體(在PBS，pH7.0，0.3% Triton X-100中稀釋)，室溫下放置1小時(shí)。洗滌載玻片后，利用熒光觀察結(jié)合的抗體。
大多數(shù)抗體對(duì)空氣干燥的子孢子表面膜和/或折射體表現(xiàn)出特異的免疫熒光(圖6的圖A和B)。一些抗體在子孢子的頂端強(qiáng)列著色，而在其余的子孢子表面只輕度著色(FD圖6C)。代表性的空氣干燥的純化子孢子見于圖6A、B、C和D的左邊。純化的子孢子是完整的、長形的，表現(xiàn)出明顯的較大的后折射體(PRB)和較小的前折射體(ARB)。子孢子的頂端(A)與后折射體相對(duì)。在制備物中仍有完整孢子囊(圖B的左邊)和破碎的孢子束膜的輕度污染。
1.8、ELISA.Western吸印、免疫沉淀及免疫熒光分析結(jié)果的總結(jié)對(duì)55個(gè)單克隆抗體進(jìn)行上述分析，其結(jié)果概括于表2。
表2單克隆抗體分析的概括WESTERN吸印
表2(續(xù))單克隆抗體分析的概括Western吸印抗體禽艾美球蟲低量堆型艾美球蟲禽艾美球蟲免疫沉淀fSpz.aSpz.bSpz.cMz.dIFAe10A5＞150--7，510511A6＞150---3-7B2＞200+-＞20011B1＞150，200---1，7，62711D4120/24+--12711D6120/24+--2-12C3120/24+--1，8，22515B2120/24+++3-15A390/10-14+--1，628/14-1714C360---1，4614A5120/6--1，3，668A237++-1，4376A528，10-14+--1，625-2811A124+--1，6-11C124+----12B224+--1，524/12012C624+----16B124+--1，46/14-1718D524+--1，648/25/620C4241，35/14-1714B1＜6+--1，620-2410A2--1，2，46/1055B6-1，66/17/15a、所給出的值為Western吸印分析中被抗體識(shí)別的禽艾美球蟲子孢子(Spz)蛋白的分子量或分子量為40-150kd(M′)、120和80-150kd(M2)以及25和40-150kd(M3)的各組被識(shí)別蛋白的分子量。
b、用禽艾美球蟲子孢子蛋白常量的1/5進(jìn)行Western吸印分析。因而，顯示陽性反應(yīng)的抗體具有更高的親和性。
c、Western吸印反應(yīng)活性以對(duì)堆型艾美球蟲子孢子(Spz)蛋白的活性表示。
d、Western吸印反應(yīng)活性以對(duì)禽艾美球蟲裂殖子(Mz)蛋白的活性表示。
e、對(duì)空氣干燥的禽艾美球蟲子孢子進(jìn)行間接檢測而得到的免疫熒光檢測(IFA)染色圖型總結(jié)為以下部位的染色(1)表面，(2)頂端，(3)不完整表面，(4)明亮表面，(5)亮表面，(6)擴(kuò)散表面，(7)折射體，(8)點(diǎn)狀染色。
f、給出的是在免疫沉淀(Immunoppt)測定中被抗體捕獲的125I標(biāo)記的禽艾美球蟲子孢子蛋白的分子量。
優(yōu)選的單克隆抗體7D4、7D1、20C6、8A2、6A5和7B2已經(jīng)按照《布達(dá)佩斯條約》的有關(guān)條款，以分泌這些單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞形式保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland，U.S.A.)指定的登記號(hào)分別為HB9707、HB9708、HB9709、HB9710、HB9711和HB9712。
1.9、體外感染測定按Doran等人的方法(Doran等人，J.Protozool.25∶544，1978)建立初生雞腎上皮細(xì)胞，并在四室的Lab-Tek載玻片上培養(yǎng)到40～50%匯合。也可用MDBK(Madin-Darby牛腎)細(xì)胞(ATTC-CCL22)代替雞腎上皮細(xì)胞。
用50，000個(gè)或200，000個(gè)純化的子孢子接種細(xì)胞。感染16小時(shí)后，將細(xì)胞單層洗滌幾次，以除去未進(jìn)入細(xì)胞的所有子孢子。在感染后3、16、24、48、64、96和120小時(shí)時(shí)，分別用100%的甲醇固定有代表性的接種細(xì)胞培養(yǎng)物(室溫下5分鐘)。將固定后的載玻片于4℃下貯存于含1%BSA的PBS(pH7.0)中，直到進(jìn)行上述的免疫熒光測定前進(jìn)行處理。用各種抗體得到的染色結(jié)果示于圖7。
感染后的3-24小時(shí)之間，固定的培養(yǎng)物顯示了細(xì)胞內(nèi)的子孢子(圖7，3小時(shí)時(shí)的7D4，19小時(shí)時(shí)的8A2)。后來，子孢子解體，只剩下折射體(7D4，60小時(shí))。細(xì)胞內(nèi)子孢子的表面和頂端被抗體7D4明亮染色(圖7，7D4，3小時(shí))，但該抗體不染色感染細(xì)胞。
24小時(shí)后，子孢子開始解體并發(fā)育或裂殖體，裂殖體在隨后的48小時(shí)內(nèi)成熟?？贵w7D4繼續(xù)與解體的子孢子反應(yīng)，但不與未成熟的裂殖體反應(yīng)(圖7，7D4，60小時(shí))。但隨著裂殖體成熟，7D4開始與裂殖體內(nèi)的結(jié)構(gòu)反應(yīng)(圖7，7D4，100小時(shí))。這些結(jié)構(gòu)為發(fā)育中的裂殖子，抗體7D4繼續(xù)與釋放出的成熟裂殖子的表面抗原反應(yīng)。(圖7，7D4，120小時(shí))。
因此，7D4鑒定出一個(gè)120kd的膜抗原，它存在于禽艾美球蟲子孢子和裂殖子的表面。該抗原在寄生蟲發(fā)育的裂殖體階段不表達(dá)，直到在裂殖體中發(fā)育出未成熟的裂殖子。
抗體14B1的反應(yīng)方式與抗體7D4相同，即對(duì)細(xì)胞內(nèi)子孢子的表面和頂端染色(圖8，14B1，16小時(shí))，并擴(kuò)散染色細(xì)胞內(nèi)子孢子附近的細(xì)胞質(zhì)。被14B1識(shí)別的抗體存在于成熟裂殖體中的未成熟裂殖子的頂端(圖8，14B1，100小時(shí))，和成熟的釋放的裂殖子的頂端(圖8，14B1、120小時(shí))?？贵w7D4和14B1呈現(xiàn)的染色圖型是相似的，但被這兩個(gè)抗體識(shí)別的蛋白的分子量相去甚遠(yuǎn)，分別為120kd和6kd。
雖然抗體7D4和14B1與寄生蟲的大部分發(fā)育階段反應(yīng)，但其它抗體只與細(xì)胞內(nèi)子孢子的表面抗原(圖7，15A3)或折射體(圖7，7A2)反應(yīng)，而不與寄生蟲的裂殖體或裂殖子階段反應(yīng)。
通過感染測定，鑒定出兩個(gè)特殊的抗體8A2和19D6?？贵w8A2與-37kd蛋白反應(yīng)，該蛋白存在于子孢子表面(圖7C，8A2，19小時(shí))、發(fā)育中的裂殖體的所有階段(圖7C、8A2、120小時(shí))，以及釋放的裂殖子表面(圖7C，8A2，120小時(shí))。與被抗體7D4和14B1所識(shí)別的蛋白不同的是，37kd蛋白的合成貫穿于寄生蟲的細(xì)胞內(nèi)發(fā)育中。
抗體19D6不僅與一180kd子孢子表面蛋白反應(yīng)，還與子孢子感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的一種蛋白反應(yīng)(圖8，19D6，3小時(shí))。被抗體19D6識(shí)別的細(xì)胞質(zhì)蛋白可能是細(xì)胞感染后由子孢子排出的蛋白，因?yàn)樵摰鞍自谖闯墒炝阎丑w發(fā)育過程中消失，在成熟的裂殖體和釋放出的裂殖子中又出現(xiàn)。
得自用禽艾美球蟲感染后存活的小雞的血清抗體，以與抗體7D4相似的染色方式對(duì)細(xì)胞內(nèi)子孢子的頂端和表面染色(圖8B，免疫雞血清，3小時(shí))，但不染色細(xì)胞內(nèi)子孢子的折射體。
用子孢子感染的雞腎細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，鑒定出這樣一些抗原(a)特異于子孢子(如，分別被抗體7B2和6A5識(shí)別的大于200kd的蛋白和28kd的蛋白)，(b)見于細(xì)胞內(nèi)寄生蟲的所有階段(如，被8A2識(shí)別的37kd的蛋白)，(c)特異于子孢子和裂殖子，但不特異于裂殖體(如，分別被抗體7D4和14B1識(shí)別的120kd和6kd的蛋白)。
1.10體外子孢子中和測定在一種修改的Schmatz等人的方法(J.Protozool.33∶109，1986)中，將MDBK細(xì)胞用胰酶處理，然后以7.5×104個(gè)細(xì)胞/ml的密度懸浮于加有1%FBS的最低必需培養(yǎng)基(Gibco)中。向微量滴定板(經(jīng)組織培養(yǎng)處理，96孔)的每個(gè)小孔中加入1.5×104個(gè)細(xì)胞，于40℃下培養(yǎng)48小時(shí)。純化的子孢子或者在40℃下用抗體預(yù)處理1小時(shí)，或著在感染細(xì)胞單層前不處理。使用前，將抗體(組織培養(yǎng)上清液、腹水液或抗血清)對(duì)PBS(pH7.0)充分透析，在56℃下加熱30分鐘使之失活，并過濾滅菌。
感染后，立即向每個(gè)小井中加入[5，6]-3H-尿嘧啶，至終濃度的5μci/ml。感染19小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物用PBS洗滌一次。用胰酶-EDTA在40℃下釋放細(xì)胞15分鐘，并用玻璃纖維濾膜收集。將濾膜干燥，置于閃爍液(READY-SOLV
，New Engand Nuclear)中，對(duì)結(jié)合的放射性進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過摻入用未處理的子孢子感染的細(xì)胞中的放射性活性，與摻入用抗體處理的子孢子感染的細(xì)胞中的放射活性進(jìn)行比較來確定抗體抑制子孢子穿入和/或發(fā)育的能力。
將子孢子也與對(duì)照抗體，緩沖液或拉沙里菌素(一種抑球蟲劑)一起預(yù)保溫。拉沙里菌素在MDBK細(xì)胞中完全阻斷子孢子的發(fā)育，大大地減少了3H-尿嘧啶的摻入。
結(jié)果示于圖9，可以看見抗體7D4(□)、8A2(○)和14B1(●)明顯地抑制了3H-尿嘧啶摻入感染的MDBK培養(yǎng)物。抗體6A5(■)效果小些，但也表現(xiàn)出一定的抑制作用。在用緩沖液(△)和對(duì)照抗體(X)處理時(shí)，無抑制作用，而拉沙里菌素(X)幾乎產(chǎn)生完全的抑制。
2.cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建2.1、生成孢子的卵束的制備以50，000個(gè)禽艾美球蟲/雞進(jìn)行口服接種，7天后，從3周齡的小雞(HubbardCross;AvianServices，F(xiàn)renchtown，NewJersey，U.S.A)體內(nèi)摘除盲腸，在勻漿器(Waringblender)中用蒸餾水研磨一分鐘。用蒸餾水將體積調(diào)至1升，加入胃蛋白酶(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，Missouri，U.S.A)至3g/l。用濃Hcl將pH調(diào)至2.0，并將混合物在39℃下攪拌保溫2～3小時(shí)，或保溫至觀察到單個(gè)卵束的懸浮液。消化后，用10NNaOH將pH調(diào)至8.0，再加入3升蒸餾水。將混合物靜置過夜。然后除去上清液，用水洗滌沉淀，直至上清液清徹。通過在室溫下向蒸餾水懸浮液中吹入氣泡而使卵束生成孢子。24小時(shí)后終止孢子生成作用，進(jìn)行RNA的制備。
2.2、生成孢子的卵束的mRNA的分離利用Maniatis等人(同上196頁)描述的胍鹽/氯化銫方法的修改方法制備總RNA。將卵束用PBS(0.15MNaCl、20mM磷酸鈉，pH7.9)洗滌，并通過小心渦流混合再懸浮于10ml溶液中(pH7.4)中，該溶液含有5M異硫氰酸胍，50mMTris-Hcl、10mMEDTA、0.5%Sarkosyl(N-月桂酰肌氨酸鈉，Sigma化學(xué)公司)和0.1Mβ-巰基乙醇，溶液中最好加有5μl防泡劑A(UnionCarbide，Danbury，Connecticut，U.S.A)或其它防泡劑。將細(xì)胞懸浮液勻漿，直到在顯微鏡下觀察到卵束已基本破裂。
通過低速離心除去不溶的細(xì)胞碎片，并將勻漿液分成4份，鋪在12ml聚碳酸酯離心管中的1.2ml5.7MCsCL、0.1MEDTA(pH7.5)上。在15℃下，將離心管在BeckmanSW50.1轉(zhuǎn)子中以40，000rpm離心17小時(shí)。棄去上清液，將管壁干燥，將沉淀再懸浮于加有200μg/ml蛋白酶K(BoehringerMannheim)的1.25ml10mMTris-HCL、1mMEDTA、1%十二烷基硫酸鈉(pH7.5)中。在37℃下保溫30分鐘后，用苯酚提取溶液三次。將最終的水相中的RNA用乙醇沉淀3次，然后溶于1ml水中。
聚腺苷酸化[多聚(A)+]的制備，利用Maniatis等人(同上，197頁)的方法將約2mg總RNA通過一寡聚(dT)纖維素柱(Pharmacia Fine Chemicals)兩次而完成。將多聚(A)+RNA用乙醇沉淀兩次，并溶于200μl水中。由260nm處的光密度值算出，產(chǎn)生約26μg的產(chǎn)物。
2.3、裂殖子的制備以50，000個(gè)上述生成孢子的卵束/雞感染小雞，5天后，從50只感染小雞(3周齡，Hubbard Clss;Avian Services Frenehtown，NJ)的盲腸中收集禽艾美球蟲的裂殖子。將盲腸摘除，并在磁力攪拌器上用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)洗滌15分鐘。通過低速離心(50xg)部分地除去上皮細(xì)胞碎片，通過在4℃以2，000xg離心10分鐘而收集粗提的裂殖子。將沉淀再懸浮于溶解緩沖液(8.29g/l NH4CL、0.372g/l Na2DETA、1.0g/l KCO3，pH7.6)中，并在冰上保溫30分鐘。通過離心收集裂殖子，在PBS中洗滌一次，并在分液漏斗中通過一個(gè)含有1.0g紡制尼龍纖維(ScrubNylonFiber，F(xiàn)enwallLaboratories，Deerfield，Illinois，U.S.A)的柱。如上所述離心收集裂殖子，并在干冰上冰凍以分離RNA或在二乙胺乙基纖維素(DEAE，WhatmanDE52，Whatman，Clifton，NewJersey，U.S.A)上進(jìn)一步純化以進(jìn)行Western吸印分析。
為了在DEAE纖維素上進(jìn)行純化，將大約1×109個(gè)裂殖子(在PBS中)加不到10ml床體積的柱上，并用PBS洗脫。在頭100ml流出液中回收裂殖子，這些裂殖子基本上去除了紅血細(xì)胞和其它細(xì)胞碎片。
2.4、裂殖子mRNA的分離將含有1×109至1×1010個(gè)有機(jī)體的冰凍裂殖子沉淀融于10ml含有1mM二硫蘇糖醇(DTT)和300單位RNA酶抑制劑(Promega Biotec，Madison，Wisconsin，U.S.A)的TEL/SDS緩沖液(0.2M Tris-HCL，0.1MLiwl，25mM EDTA，1%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)，pH8.8)中，并在特氟龍包被的組織勻漿器中勻漿10～12次。通過在3，000xg下冷凍離心而分離不溶性碎片。用TEL緩沖液平衡的苯酚∶氯份∶異戊醇(24∶24∶1，V/V)將上清液提取兩次。
將水相用100μg/ml蛋白酶K在37℃下消化30分鐘，再用等體積的苯酚∶氯仿(1∶1)提取，將核酸用兩倍體積的乙醇在干冰上沉淀1小時(shí)，或者在-20℃下沉淀過夜。在10，000g下離心1小時(shí)后，將沉淀再懸浮于TE(10mM Tris，pH7.5，2mMEDTA)中，并在15℃，150，000xg下離心通過4ml的CsCL層(5.7MCsCl 0.1M EDTA)。用2.5倍體積的乙醇將RNA沉淀從0.2M乙酸鉀中再沉淀。利用Maniatis所述的方法(同上，197頁)，將此總RNA通過寡聚(dT)纖維素一次。以富集多聚(A)+RNA。從5×109個(gè)裂殖子產(chǎn)生的1.9mg總RNA中一般含有約20μg多聚(A)+RNA。
2.5、卵束和裂殖子cDNA的合成及插入噬菌體載體利用Gubler等人(Gene25∶263，1983)所述的方法，由6μg生成孢子的卵束的多聚(A)+RNA合成雙鏈cDNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶(BRL)延長寡聚(dT)引物，利用RNA酶H(BRL)和大腸桿菌DNA聚合酶I(New England Biolabs)合成互補(bǔ)鏈。然后用T4DNA聚合酶(BRL)將雙鏈cDNA消化成平末端，根據(jù)廠商的方法，用EcoRI甲基化酶(New England Biolabs)處理后，加入EcoRI連接子(GGAATTCC，Collaborative Research)。
用EcoRI消化上面制備的cDNA之后，利用Huynh等人所述的方法(Huynhetal，Approach，1985，IRLPress，Washington，D.C.，pp.49-78)，在λgt11(StratageneCloningSystems，SanDiego，California，U.S.A)中制備一個(gè)文庫。根據(jù)廠商的方法，將EcoRIcDNA片段連接到EcoRI消化的脫磷酸化的γgt11臂(StratageneCloningSystems)上，并用Gigapack藥盒(StratageneCloningSystems)將所得DNA包入噬菌體。
用所得文庫涂布Y1088宿主細(xì)胞(ATCCNo.37195)進(jìn)行擴(kuò)增。從在異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma化學(xué)公司)存在下X-gal平板上蘭色噬菌斑與無色噬菌斑的比例，估計(jì)重組體的百分比約為90%。
裂殖子多聚(A)+RNA的雙鏈cDNA拷貝基本上按上述方法合成。通過在變性凝膠中的遷移率(Bailey et al.，Anal.Biochem.70∶75，1976)判斷出用于構(gòu)建文庫的雙鏈cDNA含有約200到4，500個(gè)堿基對(duì)(bP)。
如上所述，將裂殖子cDNA甲基化，并連接到EcoRI連接子上，但用cCGAATTCGG連接子(CollaborativeResearch)。用EcoRI消化后，利用Huynh等人所述的方法(同上)將cDNA在BiogelA-50M柱上進(jìn)行分級(jí)分離，以除去過量的連接子分子和小于約300bp的cDNA。
如上所述，將cDNA連到λgt11臂上，并將DNA包入噬菌體。用所得的含有約50，000個(gè)噬菌體的文庫涂布Y1088宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。在IPTG存在下的X-gal平板上的噬菌斑分析，表明重組體約為90%。
3.cDNA文庫的免疫篩選以約10，000個(gè)噬菌斑/150mm平板的密度用λgt11裂殖子cDNA表達(dá)文庫涂布Y1090細(xì)胞(ATCCNo.37197)。將六塊上述平板在42℃下培養(yǎng)3.5小時(shí)，用預(yù)先在10mMIPTG中浸泡過的硝酸纖維素濾膜覆蓋，以誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶融合蛋白的表達(dá)，并在37℃下再培養(yǎng)4-5小時(shí)至過夜。從平板上取下濾膜，用TBS(20mMTris，pH8.0，0.15MNacl)分批洗滌幾次。通過在一旋轉(zhuǎn)搖床上于4℃下在含有20%胎牛血清(FCS)的TBS中保溫2-4小時(shí)，而阻斷非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
收集含有已知可與裂殖子抗原反應(yīng)的九個(gè)單克隆抗體(7D4、7D1、20C6、13A6、20C1、11B6、3A5、13A1和15B2)的腹水液，調(diào)至20%FCS、0.15MNacl，終體積為100ml，再加到培養(yǎng)皿中的每塊濾膜上，(每個(gè)培養(yǎng)皿兩塊濾膜)。將濾膜在一旋轉(zhuǎn)搖床上4℃下用初級(jí)單克隆抗體庫保溫過夜。未結(jié)合的抗體通過在室溫下用TBS洗滌濾膜5-6次而除去。結(jié)合的抗體如Hawkes等人所述(Anal.Biochem.119∶142，1982)，通過下述方法檢測，即將濾膜與山羊抗小鼠辣根過氧化物酶(HPOD)結(jié)合物(Boehringer-Mannheim)保溫，然后利用3mg/ml4-氯-1-萘酚(BioRad)和0.018%H2O2顯色。
將最初高密度篩選中鑒定出的陽性噬菌斑利用同樣的單克隆抗體庫進(jìn)行次級(jí)篩選，從而進(jìn)行噬菌斑純化。將陽性斑涂布在許多方格陣中，每個(gè)陽性斑都用IPTG誘導(dǎo)，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，并用庫中的一個(gè)單克隆抗體與之保溫，這樣，每個(gè)陽性斑都被指定與庫中的一個(gè)單克隆抗體反應(yīng)。鑒定出一個(gè)定名為λm2-4的陽性噬菌體，它被庫中8個(gè)抗體中的三個(gè)抗體(抗體7D1、7D4和20C6)識(shí)別。
用同樣的方法篩選生成孢子的卵束cDNA文庫，但用含有抗體6A5、7B2、15A3和20C6的單克隆抗體庫進(jìn)行第一次篩選;用7B2、15A3、20C6和8A2進(jìn)行第二次篩選;和15A3、7B2和20C6進(jìn)行第三次篩選;并且在保溫緩沖液中還含有0.05%Tween-20[聚氧乙烯(20)山梨糖單月桂酸酯]。這樣，便從卵束cDNA文庫中鑒定出定名為λS1-3、λS1-4和λS1-7的噬菌斑、定名為λS2-1、λS2-4和λS2-5的噬菌斑以及定名為λS3-1的噬菌斑，它們分別由單克隆抗體6A5、8A2和7B2識(shí)別。由噬菌體得到的DNA產(chǎn)生可與6A5抗體反應(yīng)的蛋白，將該DNA通過用EooRI消化以及在瓊脂糖凝膠中電泳而進(jìn)行分析(Maniatis等人，同上，150頁)。于是發(fā)現(xiàn)三個(gè)不同的插入片段，其大小分別約為1150、890和615bp。
4.艾美球蟲基團(tuán)在大腸桿菌中的表達(dá)分別從噬菌體λS1-7和λS1-3中分離1.1kb和0.9kb的EccRIDNA分子，并插入三個(gè)可變讀碼框表達(dá)載體(pEV-vrf1、pEV-vrf2和pEV-vrf3)每一個(gè)的EcoRI位點(diǎn)，這三個(gè)載體如Crowl等人所述方法(Gene38∶31，1985)進(jìn)行構(gòu)建。利用Mandel等人[J.Mol.Biol.53∶159(1970)]所述的方法，將含有兩種可能取向的插入片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1061菌株中，如Bernard等人所述[MethodsinEnzymology68∶482(1979)]，該菌株含有相容性質(zhì)粒pRK248cIts。MC1061菌株和質(zhì)粒pRK248cIts已保藏于美典型培養(yǎng)物保藏中心，指定的登記號(hào)分別為ATCC33766和53338。
將細(xì)菌轉(zhuǎn)化體在含有0.5%葡萄糖和0.5%酪蛋白氨基酸的M9培養(yǎng)基(Maniatis等人，同上，68頁)中30℃下培養(yǎng)，并如Crowl等人所述，在O.D.(550mμ)為0.5時(shí)，將溫度升到42℃以誘導(dǎo)λPL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。保溫2-3小時(shí)后，取出1ml樣品，離心收集樣品中的細(xì)胞。如Crowl等人(同上)所述處理細(xì)胞沉淀，并如Laemmli所述[Nature 227∶680(1970)]將溶菌物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將凝膠中的蛋白或用考馬斯亮藍(lán)染色，或轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上進(jìn)行Western吸印分析[Towbin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76∶4350(1979);Burnetti，Anal.Biochem.112∶195(1981)]，利用6A5單克隆抗體和山羊抗小鼠HPOD結(jié)合物進(jìn)行檢測。
上面的分析表明，在載體pEV-vrf1中一種取向的0.9kbcDNA分子產(chǎn)生能與6A5抗體反應(yīng)的20kd蛋白。未觀察到1.1kb分子的表達(dá)，這可能是因?yàn)樗?′非編碼順序。為了盡可能增加上述蛋白的產(chǎn)量，用各種表達(dá)介質(zhì)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的表達(dá)介質(zhì)為每升(±10%)含有6OgKH2PO4，4.0gKHP7O45.0g(NH4)2SO4、3.5gMgSO4-7H2O，21.0g酵母提取液，3.5g細(xì)胞胰化胨、1.0ml LB625防泡劑。25g葡萄糖。70mg硫胺素-HCL。2.5ml維生素溶液[GIBCO MEM(100X)維生素溶液]及1.0ml微量元素。LB625防泡劑是聯(lián)合碳化物公司的一種產(chǎn)品，它是乙烯和聚環(huán)氧丙烯的線性聚合物，它在37.8℃下的粘度為625賽氏通用粘度秒。
每升發(fā)酵液中所含的維生素包括D-泛酸鈣。氯化膽堿、葉酸、煙酰胺、吡哆醛-HCL、和另加的硫胺素-HCL各0.25mg;0.50mg異肌醇;0.025mg核黃素。每升發(fā)酵液中所含的微量元素包括2.7mg Fecl36H2O;ZnSO4-7H2O和CuSO4-5H2O各0.8mg;CoCL2-6H2O和Na2MoO4-2H2O各0.7mg;0.2mg H3BO3;以及0.5mg MnSO4-H2O。
首先在一種溶素原中研究噬菌體λm2-4所表達(dá)的有免疫活性的蛋白的本質(zhì)，該溶素原是從感染的Y1090細(xì)胞通過在允許溫度(30℃)和不允許溫度(42℃)下進(jìn)行差級(jí)生長而分離出來的。為了對(duì)該溶素原合成的蛋白進(jìn)行Western吸印分析，將50ml培養(yǎng)物在LB培養(yǎng)基[Maniatis等人，同上，69頁]中30℃下培養(yǎng)，直到O.D.(550mμ)為0.5小時(shí)，將溫度升至42℃，以誘導(dǎo)噬菌體的復(fù)制。在42℃下保溫15分鐘后，加入IPTG到10mM，繼續(xù)在37℃下保溫30分鐘。在4℃下離心收集細(xì)胞，并通過在Laemmli樣品緩沖液(0.125MTris，pH6.8，1%(w/v)，SDS，14M-巰基乙醇，001%澳酚蘭(W/V)20%(V/V)甘油)中煮沸5分鐘而使細(xì)胞溶解。
通過在12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，使相當(dāng)于1.0ml的培養(yǎng)物分離，然后電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，如上所述用鑒定λm2-4噬菌體的三個(gè)單克隆抗體(7D1、7D4和20C6)的抗體庫進(jìn)行探測。Western印跡的顯色揭示出一個(gè)大于150kd的融合蛋白，它存在于誘導(dǎo)出的溶素原中(圖10B，第2泳道)將異于β-半乳糖苷酶的抗體也與這個(gè)高分子量的蛋白反應(yīng)，并且與一個(gè)大約為114kd的蛋白反應(yīng)，這是預(yù)期的β-半乳糖苷酶的大小(見圖10A，第2泳道)。
用EcoRI消化噬菌體λm2-4，產(chǎn)生一個(gè)1.7kb的DNA分子。將此分子亞克隆入一個(gè)經(jīng)EcoRI線性化的含有質(zhì)粒pEV-VRF1、2和3的質(zhì)粒庫(Crowl等人，同上)中，并如上所述，轉(zhuǎn)化入含有質(zhì)粒pRK248cIts的大腸桿菌MC1061菌株中。利用在λm2-4溶素原中可與融合蛋白反應(yīng)的三個(gè)單克隆抗體，篩選可在溫度誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)有免疫活性蛋白的轉(zhuǎn)化體。利用庫中三個(gè)單克隆抗體之一的7D4，通過對(duì)大腸桿菌溶解物的Western吸印分析，進(jìn)一步鑒定有免疫活性的重組蛋白的特征。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析測定每發(fā)現(xiàn)一個(gè)陽性克隆都含有帶有預(yù)期的1.7kb插入片段的質(zhì)粒DNA，并且一經(jīng)誘導(dǎo)便可指導(dǎo)合成大約65kd的蛋白。
發(fā)現(xiàn)該65kd的蛋白的表達(dá)，對(duì)生長介質(zhì)和誘導(dǎo)方法的變化較不敏感。在細(xì)胞沉淀的超聲波破碎后，定量回收上清液中的該蛋白。
將含有1.7kb插入片段的表達(dá)質(zhì)粒用于后續(xù)的制備重組蛋白步驟，該質(zhì)粒圖示于圖11。將該質(zhì)粒在對(duì)λcI857具有溶原性的MC1061宿主細(xì)胞中30℃下進(jìn)行增殖(利用Arber等人所述的產(chǎn)生入噬菌體溶素原的標(biāo)準(zhǔn)方法制備宿主細(xì)胞(Arberetal.，inColdSpringHarborMonograph，LambdaⅡ，1983，Hendrixetal.，Eds.，ColdSpringHarbor Laboratories，Cold Spring Harbor，P.450)，以保持質(zhì)粒中的PL啟動(dòng)子處于阻遏狀態(tài)。
利用同樣的方法，表達(dá)28kd的蛋白，它是由約1.1kb的生成孢子的卵束cDNA片段所編碼的。該蛋白特異性地與單克隆抗體8A2結(jié)合。同樣進(jìn)行了45kd蛋白的表達(dá)，它是由約1.2kb的生成孢子的卵束cDNA編碼的。該蛋白特異性地與單克隆抗體7B2結(jié)合。
5、DNA順序分析一般利用Birnboim等人(NucleicAcidsResearch7∶1513，1979)的方法，從1ml飽和的過夜培養(yǎng)物中小規(guī)模地分離質(zhì)粒DNA。該方法可以從細(xì)菌菌落中分離少量的DNA，用于分析。較大量的質(zhì)粒DNA的制備，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，利用1升培養(yǎng)物進(jìn)行氯化銫離心(Maniatis等人，同上，93頁)。
利用Maxam等人的化學(xué)斷裂法(MethodsinEnzymology65∶499，1980)和Sanger等人的鏈終止法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5463，1977)，以及Smith等人(Cell16∶753，1979)和Wallace等人(Gene16∶21，1981)對(duì)雙鏈質(zhì)粒DNA修改的方法，測定得自形成孢子卵束的基因文庫的cDNA的DNA順序。在鏈終止法中，用7-脫氮-dGTP(Barretal.BioTechniques4∶428，1986)代替dGTP，以消除G-C擠壓現(xiàn)象。
為了便于順序分析，將得自λS1-7的1.1kbEcoRI分子轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pEV3-SEQ(圖12)，該質(zhì)粒在pEV-vrf3的EcoRI位點(diǎn)旁有一個(gè)多連接子。用該多連接子使質(zhì)粒在BamHI和KpnI位點(diǎn)線性化，以便用核酸外切酶Ⅲ產(chǎn)生單向缺失(Henikoff，Gene 28∶351，1984)。用多連接子的XbaI位點(diǎn)進(jìn)行3′-末端標(biāo)記，以對(duì)缺失產(chǎn)物進(jìn)行Maxam-Gilbert測序，用引物CGGTCGACTCGAGCCA進(jìn)行Sanger測序。如Maniatis等人所述(同上，122頁)，利用[γ-32P]ATP(ICN)和多核苷酸激酶標(biāo)記引物的5′端。
圖13顯示了用于Maxam-Gilbert測序的1.1kbEcoRI分子中的限制位點(diǎn)。也顯示了0.9kb分子中的EcoRI位點(diǎn)的位置，因?yàn)橐灿昧诉@些位點(diǎn)。還顯示了核酸外切酶Ⅲ造成的缺失的端點(diǎn)。進(jìn)行這些測序時(shí)或是利用Maxam-Gilbert方法從pEV3-SEQ多連接子的XbaI位點(diǎn)開始，或者利用Sanger法，用一引物延伸而進(jìn)行(圖12)。將整個(gè)cDNA的兩條鏈利用上述的一種或二種方法同時(shí)進(jìn)行測序。由于DNA中G-C含量高，Maxam-Gilbert反應(yīng)物通常在8%和15%的聚丙烯酰胺-脲凝膠中進(jìn)行分級(jí)分離。
引物的延伸通過下述方法進(jìn)行將1.5μg多聚(A)+RNA在一緩沖液中與2微微摩爾5′端標(biāo)記的合成寡核苷酸引物GAGGTCTGCCATTTTGC在42℃下保溫60分鐘，所述緩沖液為50mM Tris-HCL(pH8.0)8mM MgSO4、0.1M Nacl、2mM二硫蘇糖醇、每種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP，Pharmacia Fine Chemicals)各2mM、20單位RNA酶抑制劑(Promega Biotec.Madison，WI)和20單位AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Pharmacia，Piscataway，NJ，F(xiàn)PLC純)。將所得產(chǎn)物在用于順序分析的8%聚丙烯酰胺-脲凝膠中進(jìn)行分析，用32P-標(biāo)記的經(jīng)HpaⅡ消化的pBR322 DNA作為分子量標(biāo)記。
為了進(jìn)行順序分析，從凝膠上洗脫初級(jí)產(chǎn)物，并利用Maxam等人的化學(xué)斷裂法(同上)進(jìn)行分析，或?qū)dNTP用于延伸反應(yīng)(Tolanetal.，J.Biol.Chem.259∶1127，1984;Gravesetal.，J.Biol.Chem.261∶11409，1986)。反應(yīng)物在8%的聚丙烯酰胺-脲凝膠中進(jìn)行分析。
1.1kbcDNA分子的核苷酸順序示于圖14。在這個(gè)較大的分子中，0.9kb分子的順序從堿基188延伸至堿基1082。由該核苷酸順序的開放讀碼分析推測的氨基酸順序示于圖15。圖15所示的推測氨基酸順序的正確性證實(shí)如下。
制備其氨基酸順序相應(yīng)于圖15中41-54和145-164殘基的合成多肽。將針對(duì)這兩種多肽而制備的免抗血清用于子孢子總蛋白和表達(dá)0.9kbcDNA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體之溶解物的Western吸印分析。在這兩個(gè)Western吸印分析中，針對(duì)兩個(gè)多肽的抗體都與蛋白結(jié)合。
利用同樣的方法，測定噬菌體λm2-4中編碼65kd蛋白的1.7kb插入片段的核苷酸順序，其結(jié)果示于圖16。所推測的由該DNA順序編碼的蛋白的氨基酸順序示于圖17。如下所述，通過對(duì)所表達(dá)的65kd蛋白進(jìn)行胰酶消化而產(chǎn)生的多肽進(jìn)行氨基酸順序分析而證實(shí)上述順序。
奇怪的是，預(yù)期1.7kb分子的DNA順序開放讀碼編碼一個(gè)約33，349道爾頓的蛋白。然而，該DNA片段的表達(dá)產(chǎn)物在SDS凝膠中遷移的表觀分子量約為65kd。預(yù)期的和所觀察的蛋白分子量之間的差別的原因還不清楚。該蛋白在此稱為“65kd”蛋白。
以同樣的方式，測定編碼由單克隆抗體8A2識(shí)別的28kd蛋白的cDNA分子的核苷酸順序和推測的氨基酸順序，結(jié)果分別示于圖18和19。
同樣測定1.2kb7B2cDNA的核苷酸順序和推測的氨基酸順序。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了一個(gè)連續(xù)的開放讀碼，并且通過免疫沉淀從子孢子中分離出的蛋白大于200kd，所以利用1.2kbcDNA作為探針篩選基因文庫，以選擇更大的cDNA。于是得到一3.2kb的cDNA，其核苷酸順序和所推測的氨基酸順序分別示于圖20和21。
6、65kd蛋白的純化與特征鑒定6.1、蛋白純化在10升的發(fā)酵罐中，將含有pEV/2-4表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌MC1061(pRK248cIts)在1.5XM-9培養(yǎng)基中進(jìn)行高細(xì)胞密度發(fā)酵，在允許溫度下生長約4小時(shí)后，如上所述，利用溫度誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行發(fā)酵。誘導(dǎo)5小時(shí)后收集細(xì)胞群，得到500克細(xì)胞沉淀。
將50克大腸桿菌細(xì)胞沉淀均勻地懸浮于500ml10mMTris-HCL(pH8.0)、5mMEDTA中，并在2-8℃下攪拌2小時(shí)。將懸浮液在7000磅/平方英寸下通過Gaulin勻漿器(APVGaulin，Everett，Massachusetts，U.S.A)兩至三次。將細(xì)胞溶解物在SorvallRC-5離心機(jī)中24，000xg下離心1小時(shí)，棄去沉淀。向上清液中加入固體硫酸銨終濃度為80%。在4℃下靜置2小時(shí)在24000xg下離心1小時(shí)將沉淀溶于20mM磷酸鉀(pH6.8)中，離心后將上清液以20mM磷酸鉀(pH6.8)透析。
將一Pharmacia出品的玻璃柱(5cm直徑×10cm長度)裝上NuGelP-DE 200
(200埃，40-60μm，弱陰離子交換，Separation Industries，Metuchen，NJ)硅膠載體。用20mM磷酸鉀(pH6.8)平衡凝膠。上樣(10ml/分)，用平衡緩沖液洗滌，用含有0.4M Nacl(pH6.8)的20mM磷酸鉀洗脫。柱級(jí)分用抗體7D4進(jìn)行Western吸印分析而檢測65kd蛋白。
用免疫親和柱進(jìn)一步純化65kd蛋白。該柱所用的吸附劑通過在將單克隆抗體7D4固定在NuGel p-聚乙醛
(500埃，40-60μm，Separafionlndust ries，Metuchen，New Jersey，U.S.A)硅膠載體上而制備。固定方法如下將10克聚乙醛載體懸浮，并用0.1M磷酸鉀、0.1M NaCl(pH6.8)洗滌，然后定量移入錐形瓶中，該瓶中含有20ml蛋白濃度為8mg/ml的單克隆抗體7D4。然后向懸浮液中加入氰氫硼化鈉(4mg)。央4℃下輕輕震蕩混合物16小時(shí)。將凝膠過濾，并用0.1M磷酸鉀、0.1M NaCl(pH6.8)洗滌。檢查合并的濾液中未結(jié)合的抗體。結(jié)合密度為8mg/g載體。未偶聯(lián)的活化位點(diǎn)通過將凝膠懸浮于20ml 1M乙醇胺(pH7.5)中而阻斷。向懸浮液中加入氰氫硼化鈉(4mg)，然后在4℃下攪拌16小時(shí)。收集凝膠，并用冷的偶聯(lián)緩沖液徹底洗滌。
為了進(jìn)行免疫親和層析，用固定的7D4抗體裝柱(1cm×10cm)，并用含有0.1% Triton x-100的冷的砱酸緩沖鹽(PBS)平衡。從NuGelP-DE200
柱上洗下的含有65kd蛋白的級(jí)份的合并物，用含有0.1%Triton X-100的PBS稀釋兩倍，并上樣到一個(gè)流速為10ml/分的柱上。上樣后，用PBS洗滌凝膠，以除去未吸附的物質(zhì)。吸附的免疫活性物質(zhì)用0.3M乙酸、0.1M NaCl緩沖液(pH2.7)洗脫。然后利用YM10膜(Amicon，Div.W.R.Grace & Co.Danvers，Massachusetts，U.S.A.)在Amicon Stircell
裝置中濃縮蛋白。
如Laemmli所述(Nature227∶680，1970)。利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白的純度。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。還利用7D4單克隆抗體與山羊抗小鼠辣根過氧化物酶的結(jié)合物，進(jìn)行Western吸印分析。結(jié)果示于圖22。泳道2、3、4和5含有從兩種制備物中純化出的蛋白。泳道1和6含有分子量標(biāo)記蛋白的混合物，其分子量示于圖的左邊和右邊。每個(gè)泳道中加10μg蛋白進(jìn)行電泳。
在圖22中可以看見，純化的蛋白在SDS凝膠中以一個(gè)表觀分子量約為65kd的主要條帶而遷移，次要條帶的移動(dòng)比較高或較低。
6.2、等電點(diǎn)的測定將10μg純化的65kd蛋白在預(yù)制的等電聚焦凝膠(得自LKBInsfruments，Gaifhersburg，Mart，yland，U.S.A.)中進(jìn)行等電聚焦。將已知等電點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的混合物同時(shí)進(jìn)行電泳。按照廠商的說明，利用3.5-9.5pH梯度，在50mA、1，500V下電泳約2小時(shí)。
等電聚焦完成后，用考馬斯亮藍(lán)染料染色凝膠，檢測蛋白帶。然后，通過測量pH梯度中條帶的位置與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的位置進(jìn)行比較，確定純化蛋白的等電點(diǎn)。由此測出的蛋白等電點(diǎn)為4.6。
6.3、氨基酸組成分析如Pan等人所述(MethodsofProteinMicrocharacterization，1986，Shively，ed，TheHumanaPress，pp.105-119)，利用與熒光胺的柱后反應(yīng)進(jìn)行氨基酸組成分析。將含有3μg65kd蛋白的樣品在含有4%巰基乙酸的6NHCL中于110℃下真空水解20-40小時(shí)，將10%的水解產(chǎn)物用于分析。過甲酸氧化后，測定半胱氨酸值。結(jié)果示于表3。
表365kd蛋白的氨基酸組成分析氨基酸摩爾百分比Asp6.06Thr6.07Ser7.27Glu18.24Pro5.35Gly16.76Ala11.71Cys4.45Val4.88Met2.08Ile2.17Leu3.22Tyr2.20Phe2.13His1.07Lys2.72Arg3.61TrpNDND＝未確定6.4、N末端和C末端順序分析取200微微摩爾蛋白(通過氨基酸組成分析測定)，利用Hewick等人的方法(J.Biol.Chem.256∶7990，1981)和AppliedBiosystems470A型測序儀(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)osterCity，California，U.S.A)進(jìn)行N末端分析。由此測得的N末端順序?yàn)镸-N-K-N-S-？-L-G-G-F-？-S-M-Q-E-S-P-P-P-。用問號(hào)標(biāo)明的位置上為何種氨基酸尚不確定，因?yàn)镻TH-Cys的回收率低，并且半胱氨酸有可能參與形成二硫鍵(Hewicketal.，J.Biol.Chem.256∶7990，1981)。
如Hayashi所述(Meth.Enzymol.47∶84，1977)，通過羧肽酶Y的時(shí)程消化對(duì)1200微微摩爾的65kd蛋白進(jìn)行C末端分析。羧肽酶Y(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)是溶解在0.05M乙酸鈉緩沖液(pH5.9)中，使用時(shí)濃度為0.8μg/350μl。在0、2、5、10、20和30分鐘后取等分試樣進(jìn)行分析。將各等分樣品用鹽酸酸化以停止進(jìn)一步的反應(yīng)，然后如上述進(jìn)行氨基酸分析。這一分析表明，C末端氨基酸順序可能是(Met，Trp)-Ala-Ser。觀察到色氨酸與甲硫氨酸同時(shí)增加，但Trp難以用熒光胺分析儀定量，因?yàn)樗c熒光胺的反應(yīng)性低。所以，Trp和Met的相對(duì)位置不能用這種分析方法確切地測定。
6.5、胰蛋白酶肽分析部分是為了確認(rèn)由編碼65kd蛋白的cDNA核苷酸順序推測的氨基酸順序，取一些該蛋白用胰蛋白酶(CooperBiomedical，Philadelphia，Pennsylvania，U.S.A.)消化，所得的肽如下述進(jìn)行順序測定。
于37℃，在0.2M碳酸氫銨(pH8)中對(duì)148μg蛋白進(jìn)行胰酶消化過夜所采用的酶與底物的比例為1∶30(以重量或摩爾數(shù)計(jì))。所產(chǎn)生的肽以WatersHPLC系統(tǒng)用Altexulfrasphere250×4.6mmC-18柱(BeckmanInstruments，F(xiàn)ullerton，CA)進(jìn)行分離，用濃度逐漸升高(0-55%)的乙腈在0.1%(基礎(chǔ))三氟乙酸中的溶液進(jìn)行梯度洗脫。在進(jìn)行HPLC分離前，將消化產(chǎn)物于37℃下用β-巰基乙醇還原30分鐘，以斷裂這些肽中所有的二硫鍵。用實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)控制檢測儀(LaboratorgDataControl，RiveraBeach，florida，U.S.A.)于215nm處監(jiān)測柱流出液。HPLC柱分辯出8個(gè)主峰，如圖23A所示。
首先如上所述對(duì)每個(gè)峰進(jìn)行氨基酸分析，以測定這些肽的量和組成。然后用AppliedBiosystems470型氣相測序儀，通過自動(dòng)Edman降解測定得自HPLC柱的大部分肽峰的順序。乙內(nèi)酰苯硫脲(PTH)氨基酸衍生物的鑒定，是如Hawke等人(Anal.Biochem.120∶302(1982)所述用WatersHPLC系統(tǒng)并采用AltexultrasphereC-18柱，或用AppliedBiosystems120型聯(lián)機(jī)PTH氨基酸分析儀進(jìn)行的。
圖17在畫下線的區(qū)域下部，給出了上述肽中某些肽的氨基酸順序。每個(gè)肽的編號(hào)(相應(yīng)于HPLC峰號(hào))在相應(yīng)的順序旁邊用畫圈的數(shù)字給出。在這些肽順序中不確定的某些殘基，在這些位置上用問號(hào)標(biāo)明，但這些肽的氨基酸組成分析表明，在已推測出的順序的相應(yīng)位置上標(biāo)明的氨基酸存在于這些肽中。肽中的某些殘基不確定是由于色氨酸與熒光胺的反應(yīng)性低。
相應(yīng)于完整65kd蛋白N-末端的肽6，在N末端含有4個(gè)由表達(dá)質(zhì)粒中的某些核苷酸編碼的殘基。對(duì)肽8進(jìn)行分析得到的氨基酸順序與肽3相似，但沒有C末端的4個(gè)殘基，表明這可能是胰酶消化不完全的結(jié)果。肽5未進(jìn)行順序測定，因?yàn)樵撾牡陌被峤M成分析表明，它與肽6相同，只是缺少N末端的頭3個(gè)氨基酸殘基。
如上所述對(duì)胰酶消化產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，但預(yù)先不用巰基乙醇還原，所得到的洗脫曲線中沒有峰4、7和8(圖23B)。這一結(jié)果提示，這些含半胱氨酸的肽在未還原的蛋白中可能參與了二硫鍵的形成。
7、家禽的免疫7.1、使用65kd抗原為了確定施用純化的重組65kd蛋白是否能夠預(yù)防小雞受生成孢子的禽美球蟲卵囊的侵襲，進(jìn)行了一系列免疫實(shí)驗(yàn)。在這些實(shí)驗(yàn)中，取1日齡至3周齡的來航雞(AvianServices，F(xiàn)renchtown，NewJersey，U.S.A.)，放在潔凈的房間里，由未曾接觸過其它家禽的飼養(yǎng)員來喂養(yǎng)，直到進(jìn)行免疫時(shí)。將這些雞放在電熱育雛籠中，待它們長至3或4周齡后，再移入拉架籠內(nèi)。
在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，不限量供給未加藥的童子雞幼雛飼料和水。在用卵囊進(jìn)行免疫時(shí)，把這些雞移到另一個(gè)建筑物中，并且一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束都放在那里。免疫前，每周至少檢查動(dòng)物臨床癥狀3次，免疫后則每天檢查一次。在雞長至3或4周齡，隨機(jī)分成各試驗(yàn)組之前，用翅號(hào)分別給每只雞做上記號(hào)。
用各批如上所述免疫親和層析純化出的65kd蛋白作為免疫原。這幾批免疫原含有細(xì)菌內(nèi)毒素活性，活性范圍為每μg蛋白約0.3至約50內(nèi)毒素單位，這個(gè)活性按1985年第21次修訂版的《美國藥典》第1165-1167頁(United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockvill Md.)所述進(jìn)行測定和定義、使用前將蛋白溶于0.02M K2HPO4緩沖液(pH6.8)中，用同樣的緩沖液根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。
用牛血清清蛋白(BSA，Pentex)作為對(duì)照。由于所用的免疫原中有熱原活性，所以在所有BSA對(duì)照中都加入了大致等量的熱原活性，以便將這種活性可能引起的任何非特異性效應(yīng)考慮在內(nèi)。這種熱原活性是以未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的溶菌產(chǎn)物的形式加到BSA中的，這種溶菌產(chǎn)物的制備方法是利用超聲處理破碎大腸桿菌，然后用0.45μ濾膜(Millipore)過濾該材料。
將稀釋的對(duì)照BSA或艾美球蟲抗原樣品與等體積的佐劑合并，用帶有18號(hào)針頭的玻璃注射器充分混合，然后再施用。分別用弗氏完全佐劑和不完全佐劑進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫。這兩種佐劑都得自GIBCO(GrandIsland，NewYork，U.S.A.)。
在小雞長至4周齡時(shí)，在雞體后部的頸基部進(jìn)行初次皮下免疫。有些雞還在6周齡時(shí)接受加強(qiáng)免疫。所注射物質(zhì)的體積為約0.4至2.4ml。如果體積較大，則將此劑量分兩次注射。最后一次接種2或3周后，給小雞口服施用25，000或50，000個(gè)生成孢子的禽艾美球蟲卵囊。感染7天后，處死存活的小雞，解剖后對(duì)總損傷計(jì)分。對(duì)所有在實(shí)驗(yàn)過程中死亡的雞也進(jìn)行解剖。診斷后如下對(duì)腸損傷計(jì)分0＝正常;1＝輕度感染;2＝中度感染;3＝嚴(yán)重感染;4＝死亡。所得讀數(shù)總結(jié)為每組雞感染程度的平均值。在感染時(shí)和感7天后稱重這些雞。有些雞沒有用BSA或球蟲抗原接種，但也作為感染或未感染的未接種對(duì)照進(jìn)行處理。
兩個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表4。
表4用純化的重組65kd抗原接種一次或二次而對(duì)小雞進(jìn)行皮下免疫的作用不同周齡的小雞編號(hào)處理a劑量(μg) 損傷計(jì)分b增重/減重c(g)4周6周實(shí)驗(yàn)110IUC--2.8-258抗原3.15-2.4-4410抗原12.25-2.5-106BSA17.5-3.0+4010UUC--0+10710IUC--2.9-408 抗原 3.15 1.6 2.0e-1510 抗原 17.5 13.2 1.8e+58BSA12.2513.22.5-1310UUC--0+87實(shí)驗(yàn)28dIUC - - 2.6 -1110抗原4-2.2+6510抗原20-2.0+199抗原100-2.9+1410BSA100-2.4-710IUC--2.5+1510抗原442.1+3510原抗20202.0+748抗原1001002.1+8110BSA1001002.4+694UUC--0-3a-IUC、抗原、BSA和UUC分別指(用卵囊)感染的未免疫對(duì)照、純化的65kd蛋白、牛血清清蛋白和未感染的未免疫對(duì)照。
b-在實(shí)驗(yàn)1中，一次免疫3周后，用50，000個(gè)生成孢子的禽艾美球蟲卵囊對(duì)雞進(jìn)行免疫;加強(qiáng)接種2周后，對(duì)這些雞用25，000個(gè)卵囊進(jìn)行免疫。在實(shí)驗(yàn)2中，卵囊免疫的時(shí)間相同，但對(duì)只接種一次和經(jīng)過加強(qiáng)接種的雞都給予25，000個(gè)卵囊。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都保留感染的未免疫對(duì)照，在同樣的周齡時(shí)給予同樣數(shù)目的生成孢子的卵囊，7天后處死。結(jié)果以如上文所述的0-4計(jì)分表示。
c-所示數(shù)值為感染時(shí)體重與感染7天后體重之差。
d-這一組原有9只雞，但有一只在1周后死亡。
e-與IUC相比P≤0.05。
表4的數(shù)據(jù)表明，用65kd蛋白接種所產(chǎn)生的損傷計(jì)分，一般比感染但未免疫的對(duì)照要低。實(shí)驗(yàn)1中進(jìn)行加強(qiáng)接種的兩組雞(在表中用上標(biāo)e表示)表現(xiàn)出具有統(tǒng)計(jì)意義的損傷計(jì)分降低。在另一些情況下，損傷計(jì)分降低的程度沒有這么大，但接種雞的增重量一般都提高了。
為了確定第三次接種是否能進(jìn)一步增強(qiáng)預(yù)防作用，進(jìn)行了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在該實(shí)驗(yàn)中，以8只雞為一組，在3和5周齡或3、5或7周齡時(shí)作為感染或未感染的未接種對(duì)照，或用BSA或裂殖子蛋白接種的雞進(jìn)行處理。頭兩次接種用弗氏完全佐劑進(jìn)行。如果進(jìn)行第三次接種，則此次接種用弗氏不完全佐劑進(jìn)行。接種操作如上述在皮下進(jìn)行。
最后一次接種兩周后，對(duì)每只雞口服給予25，000個(gè)生成孢子的禽艾美球蟲卵囊進(jìn)行感染。在感時(shí)和感染7天后測量體重，最后一次測量體重后將雞處死，對(duì)盲腸損傷評(píng)分。結(jié)果示于表5。
表5用純化的65kd抗原進(jìn)行二或三次接種而對(duì)雞進(jìn)行皮下免疫的作用處理a不同周齡的劑量(μg) 損傷計(jì)分b增重/減重c(g)3周5周7周IUC---2.13+59抗原44-1.75+122抗原44-2.88+128原抗2020-1.88+87抗原2020-1.88+69BSA2020-3.13+106BSA2020-2.38+131UUC---0+131IUC---2.25+23抗原4442.25+91抗原2020202.25+86BSA2020201.75+78a-IUC、抗原、BSA和UUC分別指(用卵囊)感染的未免疫對(duì)照、純化的65kd蛋白、牛血清清蛋白和未感染的未免疫對(duì)照。
b-小雞在最后一次接種2周后用25，000個(gè)生成孢子的禽艾美球蟲卵囊感染，對(duì)感染的未免疫對(duì)照來說是在處死的前7天進(jìn)行感染。這些用于雙次免疫和三次免疫實(shí)驗(yàn)的對(duì)照，在感染時(shí)為7和9周齡。結(jié)果以如上文所述的0-4的計(jì)分表示。
c-所示數(shù)值為感染時(shí)體重與感染7天后體重之差。
表5的數(shù)據(jù)表明，進(jìn)行第三次接種并未改善免疫效果。與未經(jīng)處理的感染對(duì)照或用BSA接種的雞相比，抗原提供了較強(qiáng)的預(yù)防作用，這是由盲腸損傷計(jì)分降低證明的。
為了確定除皮下注射以外的施用途徑是否會(huì)產(chǎn)生更好的效果，以8只3周齡來航雞為一組，利用皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、口服和肛門施用途徑，給各組雞施用兩個(gè)劑量水平的65kd蛋白，共施用三次，每次間隔兩周。最后一次施用免疫原兩周后，給這些雞口服25，000個(gè)生成孢子的禽艾美球蟲卵囊進(jìn)行感染。感染一周后將雞處死，確定盲腸損傷計(jì)分。
如上所述進(jìn)行皮下注射。在左腿外側(cè)進(jìn)行深度肌肉內(nèi)注射。在右翅前側(cè)進(jìn)行皮內(nèi)注射。用5cm長的18號(hào)圓尖針頭進(jìn)行口服施用，使接種物沉積到雞嗉囊內(nèi)。用一根5cm長的18號(hào)橄欖尖針頭進(jìn)行肛門施用，將針頭伸入泄殖孔內(nèi)達(dá)最大長度。在口服和肛門施用，分別使雞站立和倒置幾分鐘，避免可能發(fā)生的接種物逐出。
皮下注射的劑型如上所述，初次注射時(shí)使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)注射時(shí)使用弗氏不完全佐劑。用于其它施途徑的劑型含有指定濃度的蛋白和0.02M K2HPO4緩中液(pH6.8)。
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表6。
表6各種施用途徑對(duì)用65kd抗原接種雞的影響
a-IUC、抗原、BSA和UUC分別指(用卵囊)感染的未免疫對(duì)照，純化的65kd蛋白、牛血清清蛋白和未感染的未免疫對(duì)照。SC、IM、A、O和ID分別提指皮下、肌肉內(nèi)、肛門、口服和皮內(nèi)施用途徑。
b-小雞在最后一次接種2周后，用25，000個(gè)生成孢子的禽艾美球蟲卵囊進(jìn)行感染，對(duì)感染的未免疫對(duì)照來說是在處死前7天進(jìn)行感染。這些對(duì)照在感染時(shí)為9周齡。結(jié)果以如上所述的0-4的計(jì)分表示。
c-所示數(shù)值為感染時(shí)體重與感染7天后體重之差。
d-與IUC比較，P＜0.05。
表6表明，在小雞用5μg抗原以口服途徑免疫，和用25μg抗原以皮內(nèi)途徑免疫時(shí)，觀察到的盲腸損傷計(jì)分最低。這些結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)意義。對(duì)其它施途徑和其它劑量水平觀察到損傷計(jì)分的數(shù)值較低，表明它們具有預(yù)防傾向。但這些計(jì)分與IUC雞的計(jì)分之差不具有統(tǒng)計(jì)意義。
在上述實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到線性劑量反應(yīng)，這可能是由于65kd抗原的各種制備物中痕量污染物和/或熱原含量不同或其它因素。
7.2、牛痘載體接種為得到用本發(fā)明的禽艾美球蟲抗原免疫小雞的更有效手段，將編碼由單克隆抗體6A5識(shí)別的20kd蛋白的1.1kbcDNA(圖14)和編碼由單克隆抗體8A2識(shí)別的28kd蛋白的1.1kbcDNA分子(圖18)，克隆到牛痘病毒中，并如下所述用來接種小雞。
7.2.1、載體的制備所制得的所有重組體都是通過用Mackett等人所述的方法(Proc.Natl.Sci.AcadUSA79∶7415，1982)同源重組到病毒胸苷激酶(TK)座位而得到的?，F(xiàn)已在牛痘病毒(VV)的HindⅢJ片段上畫出了TK座位的圖譜(Hrubyetal.，J.Virol.43∶403，1982)，此片段的部分順序已進(jìn)行了測定(Weiretal.，J.Virol.46∶530，1983)。
為構(gòu)建一個(gè)重組載體，將VVHindⅢJ片段亞克隆到pUC8中(圖24a)。用HpaⅡ切割此構(gòu)建體。所得片段用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段(Klenow)處理，用HindⅢ再切割，用低熔點(diǎn)瓊脂糖分離出含有病毒TK基因的片段。將分離出的片段連入pUC8載體的HindⅢ和平末端(S1處理)EcoRI位點(diǎn)中(圖24b右)。接著，用Klenow處理經(jīng)HindⅢ消化的DNA，并再連接該載體片段，從而去掉HindⅢ位點(diǎn)。為插入VV啟動(dòng)子(定名為7.5K啟動(dòng)子)，用ClaI和EcoRI切割該載體。
VV 7.5K啟動(dòng)子位于該病毒最小的SalI片段之一中(Venkatesan et al.，Cell 25∶805，1981)。將相應(yīng)的片段克隆到M13mp8中。選擇出一個(gè)克隆，其中的轉(zhuǎn)錄方向朝向M13mp8的EcoRI位點(diǎn)(圖24a，左)。用ScaⅠ和SmaⅠ切割該DNA，加入BglⅡ連接子，再連接該DNA(圖24b)。從該M13構(gòu)建體中分離出含病毒啟動(dòng)子片段的EcoRI-AccI片段，將其連入上述pUC8-TK片段中，產(chǎn)生載體pUC-TK-7.5K＊。用BglⅡ和EcoRI消化這個(gè)新載體。
為了得到帶有多具克隆位點(diǎn)的載體，將一個(gè)適當(dāng)?shù)亩噙B接子引入上述構(gòu)建體。為此選擇了M13tg131(Amersham)中所含的多連接子(圖24d)。通過用BglⅡ和EcoRI消化噬菌體DNA，分離出多連接子片段，將該片段插入到pUC8-TK7.5K＊構(gòu)建體中，產(chǎn)生用于將外源抗原重組到VV中的最終基本載體(圖24c)，即PUC8-TK-7.5K。
編碼能與單克隆抗體8A2結(jié)合的28kd蛋白的EcoRI片段，并不含有編碼該蛋白N末端部分的順序。因此該蛋白的原有起始密碼子和先導(dǎo)順序都缺失了。
為補(bǔ)償這些缺失區(qū)，制備了兩個(gè)不同的構(gòu)建體，并檢驗(yàn)了其表達(dá)情況。在第一個(gè)構(gòu)建體中，通過缺失基本表達(dá)載體PUC8-TK-7.5K(圖24d)中多連接子的一部分而產(chǎn)生了一個(gè)讀碼內(nèi)起始密碼子。用EcoRV和SmaⅠ消化此載體而缺失部分多連接子(圖24d)，然后再連接。通過這一操作，SphⅠ限制位點(diǎn)中所含的ATG密碼子被置于EcoRI片段上的卵囊蛋白編碼區(qū)的正確讀碼內(nèi)。測定新多連接子的順序，證實(shí)了操作是成功的。由此構(gòu)建體編碼的蛋白，其推測的N末端氨基酸順序示于圖25A。
為了在該DNA順序中不僅補(bǔ)償起始密碼子，而且補(bǔ)償缺失的先導(dǎo)順序，將EcoRI片段置于一種瘧蟲抗原的先導(dǎo)順序之后的正確讀碼內(nèi)。用于分離該先導(dǎo)順序的瘧蟲抗原為被稱為Ro-33的190kd蛋白(Certaetal.，EMBOJ.6∶4137，1987)。但必須指出，其它先導(dǎo)順序，如球蟲先導(dǎo)順序，也可用于同樣的目的。
為分離含有先導(dǎo)順序的DNA片段，用DraⅠ消化Ro-33DNA。分離出含有限制酶PvuⅡ和HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)的片段，并用HindⅢ消化。將原始載體構(gòu)建體PUC8-TK-7.5K(圖24c)用SalⅠ切割，用Klenow處理，然后用HindⅢ消化。在此載體片段中克隆所分離的DraⅠ-HindⅢ瘧蟲抗原先導(dǎo)片段。用此構(gòu)建體來表達(dá)一種融合蛋白，即惡性瘧蟲的190kd蛋白與由抗體8A2識(shí)別并由EcoRI片段編碼的禽艾美球蟲抗原之間的融合蛋白。此融合蛋白的推測N末端氨基酸順序示于圖25B。
將編碼28kd蛋白的EcoRI片段克隆到基本載體(圖24c)中所含的多連接子的EcoRI位點(diǎn)中。繁殖以正確取向含有上述片段的構(gòu)建體，并用來重組到牛痘病毒中。
由于上述片段的翻譯起始位點(diǎn)插入基本載體(見上)的方式不同，重組牛痘病毒所要表達(dá)的基因可能有兩種不同的N末端順序(圖25)。在第一個(gè)構(gòu)建體中只另入了3個(gè)額外的氨基酸(Met、Arg和Trp)(圖25A)，而在第二個(gè)構(gòu)建體中，總共有47個(gè)得自190kd瘧蟲抗原先導(dǎo)順序的氨基酸與由單克隆抗體8A2識(shí)別的多肽的N末端融合(圖25B)。在該先導(dǎo)順序的潛在切割位點(diǎn)處進(jìn)行加工后，除去了19個(gè)額外的氨基酸，從而產(chǎn)生一個(gè)以Val、Thr、His起始的成熟蛋白。
編碼由單克隆抗體6A5識(shí)別的20kd蛋白的EcoRI片段含有整個(gè)順序。不經(jīng)進(jìn)一步加工而將此片段如上所述克隆到VV載體的EcoRI位點(diǎn)中。
利用選擇重組病毒的兩步法，將上述編碼球蟲抗原的基因重組到牛痘病毒W(wǎng)R株中。
第一步是用培養(yǎng)基I[Eagle氏最低必需培養(yǎng)基(MEM)，5%胎牛血清(FCS;得自Amimed)，青霉素/鏈霉素(分別為100單位/ml和100μg/ml)，2mM谷氨酰胺;所有試劑都得自Gibco]在8cm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CV1猴細(xì)胞至80～90%匯合。除去培養(yǎng)基，換用0.2ml含有溫度敏感性牛痘病毒tsN7株(Drillen et al.，Virology 131∶385，1983)的病毒懸浮液，其濃度為0.1噬菌斑形成單位(pfu)/細(xì)胞。將培養(yǎng)皿在室溫下放置1小時(shí)，然后每皿加入2ml培養(yǎng)基I，將培養(yǎng)皿放在CO2培養(yǎng)箱中于33℃(允許該病毒生長的溫度)下培養(yǎng)2小時(shí)(Kieny et al.，Nature 312∶163，1984)。
在結(jié)束上述培養(yǎng)一個(gè)半小時(shí)前，制備含DNA的磷酸鈣沉淀。此沉淀含有HeBS緩沖液(280mMNaCL、1.5mM磷酸氫鈉、50mMHEPES)、200ng純化的牛痘WR株病毒DNA和200ng含質(zhì)粒DNA的純化球蟲抗原基因，總體積為0.55ml。每種DNA都是以1μlTE緩沖液(10mMTris-HCL，PH7.5，1mMEDTA)加入。向此溶液中滴加0.65ml250mM氯化鈣溶液并伴以輕輕旋轉(zhuǎn)。將此混合液于室溫下放置20分鐘。
培養(yǎng)2小時(shí)后，從培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基，換用0.25ml上述含DNA的磷酸鈣沉淀，并于室溫下放置1小時(shí)。然后每皿加入2ml培養(yǎng)基I，將培養(yǎng)皿放在5%CO2培養(yǎng)箱中于39.5℃下培養(yǎng)2小時(shí)(Kieny et al.，同上)。在此溫度下，ts N7病毒不能復(fù)制，因而便選擇出了至少在ts7座位中已經(jīng)重組的病毒。因?yàn)榱姿徕}最終將對(duì)細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用，所以在上述培養(yǎng)2小時(shí)后除去培養(yǎng)基，并在輕輕旋轉(zhuǎn)下將細(xì)胞用1ml PBS洗三次。吸出最后一次的PBS溶液，每皿加入2ml培養(yǎng)基I。繼續(xù)于39.5℃下在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。
經(jīng)過兩天的培養(yǎng)后，將含有培養(yǎng)基和細(xì)胞的培養(yǎng)皿短時(shí)間放置于-30℃下，然后融化，從皿底刮下仍然附著的細(xì)胞，將該懸浮液如上所述進(jìn)行超聲處理。將此勻漿液用于第二個(gè)選擇步驟。
在這一步驟中，從生長在8cm2培養(yǎng)皿中的L143B TK細(xì)胞(ATCCCRL 8303)的幾乎匯合的細(xì)胞苔中除去培養(yǎng)基，換用0.2ml末稀釋的勻漿液或用PBS以1∶5或1∶30(V/V)稀釋的勻漿液。使TK-細(xì)胞的感染在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。
培養(yǎng)后，向細(xì)胞中加入2ml含有0.1mg/ml溴代脫氧尿苷(BUdR，Sigman Chemical Co.)的半固體培養(yǎng)基Ⅱ(培養(yǎng)基I加非必需氨基酸(GIBCO;序號(hào)043-1140)、必需維生素(GIBCO;序號(hào)042-1120)和1%瓊脂糖)。然后把培養(yǎng)皿放在CO2培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)16-24小時(shí)。在細(xì)胞上鋪上第二層除上述成分外還含有0.2%中性紅的半固體培養(yǎng)基Ⅱ，把培養(yǎng)皿再培養(yǎng)16-24小時(shí)。出現(xiàn)了清晰可見的無色噬斑，用巴氏吸管穿破噬斑區(qū)，以單個(gè)的克隆回收病毒(噬斑純化)。將以這種方式回收的病毒如上所述培養(yǎng)在CV1細(xì)胞上，并在143B TK-細(xì)胞上進(jìn)行第二輪和第三輪噬斑純化。如上所述培養(yǎng)和純化這些由噬斑純化的病毒。
為檢驗(yàn)該重組病毒表達(dá)球蟲抗原的情況，將用重組病毒感染的CV1細(xì)胞用臺(tái)式離心機(jī)沉降(HettichMikrorapidK，于20℃下以100%離心3分鐘)，沉淀用PBS洗兩次，再離心后再懸浮于PBS中。交細(xì)胞懸浮液加到玻璃顯微鏡載片(Flow)上，使其干燥。第二種方法包括，在顯微鏡載片(MilesLab-Tek4808)上直接培養(yǎng)CV1細(xì)胞，用病毒感染細(xì)胞，培養(yǎng)1-2天。然后用PBS洗去細(xì)胞上的生長培養(yǎng)基，于室溫下使細(xì)胞在載片上干燥。為固定細(xì)胞，將載片于-30℃下浸在丙酮中至少一小時(shí)，使其在室溫下干燥。
將用PBS稀釋的小鼠抗球蟲抗原單克隆抗體鋪在顯微鏡載片上，使液體均勻地蓋在細(xì)胞上。把載片放在37℃的潮濕培養(yǎng)箱中1小時(shí)，然后用PBS洗滌幾次。無需使載片干燥，將也用PBS稀釋的第二抗體(FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，Nordic)鋪在載片上，把載片放在37℃的濕潤培養(yǎng)箱中1小時(shí)，使抗體起反應(yīng)。用PBS洗滌幾次后，使載片完全干燥。將幾滴20%(V/V)甘油水溶液吸到載片上，在上面放一張蓋玻片(Menzel24×60)。然后用顯微鏡(ZeissICM405、F10或Planapo63物鏡)在紫外光下觀察細(xì)胞制備物的熒光。
WR株病毒可以在幾乎所有類型的細(xì)胞中繁殖(Drillenetal.，J.Virology28∶843，1978)，其繁殖可通過空斑的形成而直接觀察到。但在多數(shù)情況下都是用雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞來制備大量的病毒。
為得到CEF細(xì)胞，從卵中分離出11日齡的胚，剔除其四肢，將其切成小片并于室溫下在0.25%胰蛋白酶溶液(Difco)中再懸浮2小時(shí)。用1倍體積的培養(yǎng)基1稀釋此懸浮液，用細(xì)胞篩(Bεllco，150目)過濾，然后沉降細(xì)胞(Hermie臺(tái)式離心機(jī)，5分鐘，2，000rpm，室溫)。將細(xì)胞沉淀再懸浮于1/4原體積的培養(yǎng)基I中，將此CEF細(xì)胞懸液接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中。根據(jù)細(xì)胞的起始密度，使培養(yǎng)物生長1-2天，直接用于感染或在再傳代1-2次后用于感染。有關(guān)建立這種初級(jí)培養(yǎng)物的簡要介紹可見Frehney的《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》一書的第11章99頁(CultureofAnimalCells，AlanR.LissVerlag，NewYork1983)。
為進(jìn)行感染，從生長在175cm培養(yǎng)瓶(Falcon 3028)中的80-90%匯合的CEF細(xì)胞中除去培養(yǎng)基，于室溫120℃下在含有病毒(0.1pfu/細(xì)胞，0.01ml/cm2)的PBS溶液中培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)(PBS/Dulbecco，Amlmed)然后加入培養(yǎng)基I(0.2ml/cm2)，將培養(yǎng)瓶于37℃下培養(yǎng)2-3天，直到約80%的細(xì)胞溶解。所得的母液直接與細(xì)胞和原始培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基一起于-30℃下貯存，準(zhǔn)備用于病毒純化。
利用下列純化步驟來得到去除了所有宿主細(xì)胞特有成分的病毒制備物。將貯存于-30℃下的感染細(xì)胞培養(yǎng)物融化，振蕩成刮下培養(yǎng)瓶表面殘留的細(xì)胞。從培養(yǎng)基中離心出細(xì)胞和病毒(Sorvall離心機(jī)，GSA轉(zhuǎn)子，于10℃下以5，000rpm離心1小時(shí))。將細(xì)胞和病毒顆粒的沉淀再懸浮于PBS(體積為沉淀的10-20倍)中，并如上所述再次離心。然后將此沉淀再懸浮于10倍體積的RSB緩沖液中(10mM Tris-HCL，pH8.0，10mM KCL，1mM MgCL2)。
為了溶解其余的完整細(xì)胞，并從細(xì)胞膜中除去病毒，對(duì)上述懸浮液進(jìn)行超聲處理(兩次，每次以60瓦處理10秒，室溫，帶有4mm探針的Labsonic1510)。然后在10℃下將該混合物用SorvalGSA轉(zhuǎn)子以3，000rpm離心3分鐘。這樣便得到了沒有細(xì)胞核和大的細(xì)胞碎片的病毒懸浮液。小心除去上清液，將沉淀再懸浮于RSB緩沖液中，再進(jìn)行超聲處理并如上所述進(jìn)行離心。
將第二次上清液與第一次上清液合并，鋪在10ml35%蔗糖層(Fluka，在10mMTris-HCL，pH8.0中)上，于10℃下以14，000rpm在KontronTST28.38/17轉(zhuǎn)子(類似于BekmanSW27)中離心90分鐘。倒出上清液，將病毒顆粒沉淀再懸浮于10ml10mMTris-HCL(pH8.0)中，進(jìn)行超聲處理以勻漿該混合液(如上所述勻漿2次，每次10秒)，然后加到加階式梯度上進(jìn)行進(jìn)一步的純化。
階式梯度由蔗糖在10mM Tris-HCL(pH8.0)中的不同濃度的溶液各5ml構(gòu)成，其濃度如下20%、25%、30%、35%和40%。于10℃下，將此梯度置于Kontron TST 28.38/17轉(zhuǎn)子中以14，000rpm離心35分鐘。在30%～40%蔗糖區(qū)內(nèi)可見若干條含病毒顆粒的條帶。移出該梯度的這一區(qū)域(10ml)，用PBS(20ml)稀釋蔗糖溶液，并沉降病毒顆粒(Kontron轉(zhuǎn)子，10℃下以14，000rpm離心90分鐘)。沉淀中幾乎只含有病毒顆料(通過O.D.測量結(jié)果與空斑檢測結(jié)果的比較而作出判斷，見下文)。將此沉淀再懸浮于PBS中，使病毒濃度平均為1-5×109pfu/ml。此病毒貯備物或者直接使用，或者用PBS稀釋后使用。
采用兩種方法來確定病毒濃度和病毒貯備物的純度。簡便的是，用分光光度計(jì)(Uvikon 860)測量貯液在260nm處的光密度(OD/260)，得到病毒顆粒的絕對(duì)濃度，其中1OD/260大約相當(dāng)于1.2×1010個(gè)顆粒/ml(Joklik，virology 18∶9，1962)。此外還通過在細(xì)胞上測定病毒的效價(jià)(空斑檢測)而得到病毒濃度，假定60個(gè)病毒顆粒中只有一個(gè)能感染細(xì)胞。
為在培養(yǎng)細(xì)胞上確定病毒濃度，用培養(yǎng)基I在8cm2塑料培養(yǎng)皿(Falcon 3001)上培養(yǎng)CEF細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至80-90%匯合時(shí)，除去培養(yǎng)基，換用0.2ml稀釋的病毒在PBS中的溶液，于室溫下放置1小時(shí)。將病毒貯液進(jìn)行10倍依次稀釋。室溫培養(yǎng)后，在每個(gè)平皿中加入2ml半固體培養(yǎng)基I(培養(yǎng)基I+1%瓊脂糖)，并將平皿在CO2培養(yǎng)箱中放置16-24小時(shí)。然后鋪上2ml含0.2%中性紅(Fluka 72210)的半固體培養(yǎng)基I，以染色活細(xì)胞，將平皿再培養(yǎng)16-24小時(shí)。然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)無色空斑。
7.2.2、小雞免疫進(jìn)行下列試驗(yàn)以確定一些牛痘病毒載體是否能預(yù)防小雞受致病性禽艾美球蟲品系(T2-750/7、T7-776/1或T6-771品系)生成孢子的卵囊的感染，這些載體所攜有的基因編碼能與單克隆抗體8A2和6A5特異結(jié)合的禽艾美球蟲蛋白。
所有試驗(yàn)都使用由孵化場(E.Wuthrich，Belp，Switzerland)供應(yīng)的產(chǎn)蛋白品種(Warren)的小公雞進(jìn)行。將日齡小雞飼養(yǎng)在加熱電池孵化器中，直至指定的日齡，然后把它們分成各個(gè)不同的試驗(yàn)組，并放在鐵絲籠中使其不受球蟲病感染。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，喂之以玉米、小麥和大豆粉(粗蛋白21.7%)為主的生長(broiler-grower)飼料。
在第一個(gè)試驗(yàn)中，在第42天將等重的小雞隨機(jī)分成三組，每組6只雞。3天后，用重組型或野生型牛痘病毒對(duì)小雞進(jìn)行免疫，免疫時(shí)在右翅膀下進(jìn)行兩次皮下注射，每次注射50μl病毒懸浮液(1010pfu/ml，在PBS中)。使用了兩種重組牛痘病毒，它們都含有編碼能與抗體8A2特異結(jié)合的禽艾美球蟲蛋白的DNA。其中一種病毒(定名為37K M3)含有190kd瘧蟲抗原的先導(dǎo)順序;另一種病毒(定名為37K K3)則缺少這個(gè)先導(dǎo)順序。用野生型牛痘病毒W(wǎng)R株作為陰性對(duì)照。
第一次注射1周后，在同樣的條件下進(jìn)行一次加強(qiáng)注射，此次注射用前一次所用相同類型的牛痘病毒在小雞的左翅膀下進(jìn)行。加強(qiáng)注射1周后(第59天)，從所有小雞體內(nèi)各取2ml血樣，利用ELISA法檢測血清中是否存在特異性抗體。簡言之，在一塊微量滴定板(NUNCImmunoplateF96)和各小孔中涂上禽艾美球蟲子孢子的懸浮液(10，000個(gè)細(xì)胞/ml)，并與稀釋倍數(shù)逐漸增加的雞血清一起保溫。所用的檢測試劑為與辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗雞免疫球蛋白(DirkegaardandPerryLaboratory，Gaithersburg，U.S.A.)，并同時(shí)使用四甲基聯(lián)苯胺作為其底物。效價(jià)定義為給出至少雙倍于背景值光密度的血清稀釋度的倒數(shù)值(表7)。
第一次注射四周后(第73天)，用50，000個(gè)生成孢子的卵囊感染小雞。將懸浮于1ml生理鹽水中的球蟲接種物利用一個(gè)帶有純針頭的帶刻度注射器經(jīng)口施用于小雞的嗉囊中。第80天，處死所有小雞，解剖后，對(duì)盲腸總損傷計(jì)分(0＝正常，1＝輕度感染，2＝中度感染，3＝嚴(yán)重?fù)p傷，4＝小雞死于球蟲病)。在感染周期的最后兩天內(nèi)，定量收集糞便，測定有代表性的糞便樣品中所有排泄出的卵囊的數(shù)目。結(jié)果示于表7。
表7用表達(dá)28kd蛋白的牛痘病毒接種45日齡的小雞病毒α小雞數(shù)抗體效價(jià)盲腸損傷計(jì)分卵囊日排泄量／雞(×10-637K3b4301.3314937M3b13601.50107野生型b2002.60271a-病毒37M3含有190kd瘧蟲抗原的先導(dǎo)順序，而病毒37K3不含此順序。野生型病毒為牛痘病毒W(wǎng)R株。
b-有兩只雞在感染球蟲病前死亡。
表7表明，與野生型對(duì)照病毒相比，兩種含有編碼28kd蛋白的DNA的病毒，都誘導(dǎo)特異于寄生蟲的抗體的產(chǎn)生，并賦予某種預(yù)防卵囊感染的作用，這都是根據(jù)盲腸損傷計(jì)分的下降和卵囊排泄量減少來判斷的。就預(yù)防球蟲病而言，這兩種病毒是等效的，但是，帶有瘧蟲先導(dǎo)順序(37M3)的構(gòu)建體在雞體內(nèi)產(chǎn)生的抗子孢子抗原的抗體效價(jià)比標(biāo)準(zhǔn)病毒構(gòu)建體(37K3)要高，這表明，融合構(gòu)建體有一定的優(yōu)點(diǎn)。
在第二個(gè)試驗(yàn)中，如上所述飼養(yǎng)并免疫小公雞，但從第22天開始。此時(shí)施用2×108pfu的病毒劑量(在100mlPBS中)。所用的病毒來自不同的牛痘病毒制備物，病毒中含有編碼28kd蛋白的DNA，該蛋白不帶有(定名為37KS)或帶有(定名為37M19)瘧蟲先導(dǎo)順序。用同樣的野生型WR株病毒作對(duì)照。在第一次注射1或2周后，以同樣的劑量在右翅膀下進(jìn)行加強(qiáng)注射。
第57天(第一次注射5周后)，用50，000個(gè)生成孢子的卵囊感染所有小雞。一周后，如上所述將雞處死，解剖并計(jì)分。還測定感染后的日增重和最后兩天期間的卵囊日排泄量。結(jié)果示于表8。
表8用表達(dá)28kd蛋白的牛痘病毒接種22日齡的小雞
a-病毒37M19含有190kd瘧蟲抗原的先導(dǎo)順序。病毒37KS不含此順序。野生型病毒為牛痘病毒W(wǎng)R株。
表8表明，與野生型對(duì)照病毒相比，兩種含有球蟲DNA的病毒都賦予針對(duì)致病性卵囊感染的某種預(yù)防作用，這是根據(jù)增重量、盲腸損傷計(jì)分和卵囊排泄量來判斷的。這兩種病毒大致等效。在初次注射一周后進(jìn)行加強(qiáng)注射，使增重量略高，卵囊排泄量略低，但盲腸損傷計(jì)分對(duì)這兩個(gè)加強(qiáng)計(jì)劃來說大致相同。
在第三個(gè)試驗(yàn)中，考察了三次接種的效應(yīng)。給21日齡的小雞注射(右翅膀)兩份50μl(3×109pfu/ml)的病毒懸浮液，該病毒為野生型牛痘病毒或含有編碼20kd蛋白的DNA的病毒，所述蛋白能與單克隆抗體6A5特異結(jié)合。在第28天，所有小雞都在左翅膀下進(jìn)行相同劑量的加強(qiáng)注射。有些雞還在第35天在翅膀兩側(cè)再進(jìn)行一次同樣劑量的加強(qiáng)注射。其它小雞未再接種，而作為進(jìn)一步的對(duì)照。
第42天，從所有小雞體內(nèi)取血樣，如前所述用ELISA法檢測是否存在針對(duì)寄生蟲的子孢子階段的特異抗體。第49天(第一次注射4周后)，用50，000個(gè)生成孢子的卵囊感染所有的小雞。一周后，如上所述處死這些小雞，解剖后對(duì)總的盲腸損傷計(jì)分。每周記錄體重以計(jì)算日增重量，在感染周期的最后兩天內(nèi)收集糞便，以測定卵囊排泄量。結(jié)果示于表9。
表9用表達(dá)20kd蛋白的牛痘病毒接種21日齡的小雞卵囊排泄量/gVV 注射次數(shù)小雞數(shù)抗體效價(jià)日增重(g) 盲腸損傷計(jì)分糞便(×10-6)rVV262102.92.331.69rVV3672004.21.671.32WT36560-4.12.672.09N-60-3.82.831.75
rVV含有球蟲DNAWT野生型N無表9的數(shù)據(jù)表明，注射三次時(shí)，產(chǎn)生球蟲抗原的病毒產(chǎn)生特異于子孢子蛋白的高效價(jià)抗體。此外。用這種類型的重組病毒進(jìn)行的兩組處理，都產(chǎn)生了針對(duì)卵囊感染的某種預(yù)防作用，這是根據(jù)增重量提高、盲腸損傷計(jì)分下降、和卵囊排泄量降低來判斷的。比較用來接種的對(duì)照得到的結(jié)果，表明野生型牛痘病毒接種不賦予預(yù)防作用。因此，由攜有球蟲DNA的病毒賦予的保護(hù)作用是特異性的，并不是由于與牛痘病毒本身接觸而引起的一般性免疫刺激。三次接種比兩次接種更為有效。
可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修改和變化而不偏離其要旨和范圍，這對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的。給出此處所述的具體實(shí)施方案只是舉例，本發(fā)明僅由所附的權(quán)利要求書來限定。
權(quán)利要求
1.一種具有艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇的蛋白的制備方法，該方法包括(a)培養(yǎng)含有重組載體的轉(zhuǎn)化宿主生物，所述重組載體含有編碼一種蛋白的DNA順序，所述蛋白具有艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇，所述表面抗原的表觀分子量約為28、37、120或大于200千道爾頓，并能夠與一種或多種保藏在ATCC、指定登記號(hào)為HB9707至HB9712的單克隆抗體特異結(jié)合；所述培養(yǎng)是在能表達(dá)所述DNA順序或片段的條件下進(jìn)行的；(b)從培養(yǎng)物中分離所述蛋白。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所用的轉(zhuǎn)化宿主生物中所含的重組載體中所含的DNA順序，編碼具有圖15所示的氨基酸順序或其功能等價(jià)順序的蛋白。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所用的轉(zhuǎn)化宿主生物中所含的重組載體中所含的DNA順序，編碼具有圖17所示的氨基酸順序或其功能等價(jià)順序的蛋白。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所用的轉(zhuǎn)化宿主生物中所含有重組載體中所含有DNA順序，編碼具有圖19所示的氨基酸順序或其功能等價(jià)順序的蛋白。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所用的轉(zhuǎn)化宿主生物中所含有重組載體中所含有DNA順序，編碼具有圖21所示的氨基酸順序或其功能等價(jià)順序的蛋白。
6.一種能夠表達(dá)一個(gè)DNA順序的轉(zhuǎn)化宿主生物的制備方法，所述DNA順序編碼如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所限定的蛋白，該方法包括，以已知方式用含有所述DNA的重組載體轉(zhuǎn)化宿主生物。
7.一種針對(duì)如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所限定的蛋白的抗體的制備方法，該方法包括，以已知方式給能夠誘發(fā)針對(duì)所述蛋白免疫反應(yīng)的動(dòng)物注射所述蛋白，并利用本領(lǐng)域已知方法分離所產(chǎn)生的抗體。
8.一種用于對(duì)家禽進(jìn)行抗球蟲病免疫的疫苗的制備方法，該方法包括，將如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所限定的蛋白與一種藥學(xué)上可接受的載體混合。
9.一種用于對(duì)家禽進(jìn)行抗球蟲病免疫的疫苗，該疫苗含有一種或多種如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所限定的蛋白和一種生理上可接受的載體。
10.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所限定的蛋白在制備能夠預(yù)防家禽球蟲病的疫苗中的應(yīng)用。
11.一種用如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法制備的蛋白，該蛋白具有艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇。
12.一種用如權(quán)利要求6所述的方法制備的轉(zhuǎn)化宿主生物，該宿主生物能夠表達(dá)一個(gè)DNA順序，該順序編碼如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所限定的蛋白。
13.一種用如權(quán)利要求7所述的方法制備的抗體，該抗體針對(duì)如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所限定的蛋白。
14.如以上所述的發(fā)明。
15.一種蛋白，該蛋白具有艾美球蟲表面抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇和/或抗原決定簇，所述表面抗原的表觀分子量約為28、37、120或大于200千道爾頓，并能與保藏在ATCC、指定登記號(hào)為HN9707至HB9712的一種或多種單克隆抗體特異結(jié)合。
16.權(quán)利要求15的蛋白，其特征在于，該蛋白具有圖15所示的氨基酸順序，或者是其功能等價(jià)物。
17.權(quán)利要求15的蛋白，其特征在于，該蛋白具有圖17所示的氨基酸順序，或者是其功能等價(jià)物。
18.權(quán)利要求15的蛋白，其特征在于，該蛋白具有圖19所示的氨基酸順序，或者是其功能等價(jià)物。
19.權(quán)利要求15的蛋白，其特征在于，該蛋白具有圖21所示的氨基酸順序，或者是其功能等價(jià)物。
20.一個(gè)DNA順序，該順序編碼根據(jù)權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)的蛋白。
21.權(quán)利要求20的DNA順序，其特征在于，該順序含有圖14所示的全部或部分核苷酸順序。
22.權(quán)利要求20的DNA順序，其特征在于，該順序含有圖16所示的全部或部分核苷酸順序。
23.權(quán)利要求20的DNA順序，其特征在于，該順序含有圖18所示的全部或部分核苷酸順序。
24.權(quán)利要求20的DNA順序，其特征在于，該順序含有圖20所示的全部或部分核苷酸順序。
25.一種重組載體，它含有根據(jù)權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)的DNA順序。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求25的重組載體，其特征在于，該重組載體能夠指導(dǎo)所述DNA順序在可相容的宿主生物中的表達(dá)。
27.權(quán)利要求25或26的重組載體，其特征在于，該載體為痘病毒載體。
28.權(quán)利要求25或26的重組載體，其特征在于，該載體為一種大腸桿菌載體。
29.權(quán)利要求28的重組載體，其特征在于，該載體為pEV/2-4。
30.一種用根據(jù)權(quán)利要求25至29中任一項(xiàng)的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主生物。
31.一種根據(jù)權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)化宿主生物，其特征在于，該轉(zhuǎn)化宿主生物能夠表達(dá)包含在所述重組載體中的一個(gè)DNA順序，該順序編碼如權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所限定的蛋白。
32.一種抗體，該抗體針對(duì)一種如權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所述的蛋白。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求32的抗體，其特征在于，該抗體是一種單克隆抗體。
34.一種根據(jù)權(quán)利要求33的抗體，其特征在于，該抗體選自ATCCHB9707、HB9708、HB9709、HB9710、HB9711、HB9712。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼艾美球蟲表面抗原的DNA順序、含有這些DNA順序的重組載體、含有這些載體的轉(zhuǎn)化宿主生物、以及利用轉(zhuǎn)化的微生物制備抗原的方法。還提供了用艾美球蟲表面抗原預(yù)防家禽球蟲病的方法。施用這些表面抗原進(jìn)行預(yù)防時(shí)，該抗原可以是純化的蛋白，也可以是編碼這些蛋白的DNA形式，該DNA位于合適的病毒載體如牛痘病毒中。
文檔編號(hào)A61K39/012GK1038837SQ89104278
公開日1990年1月17日 申請(qǐng)日期1989年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1988年6月3日
發(fā)明者沃納·阿爾滕貝格, 瑪麗·海倫·賓格, 理查德·安東尼·奇宗奈特, 理查德·艾倫·史蘭馬, 彼得·托馬斯·隆梅迪科, 斯蒂芬·J·麥安德魯 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司