專利名稱：骨橋蛋白在制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及神經(jīng)疾病及神經(jīng)失調(diào)領(lǐng)域。本發(fā)明與神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)髓鞘化及髓磷脂產(chǎn)生細(xì)胞的生成與再生有關(guān)。本發(fā)明特別涉及脫髓鞘和神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)病、創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、腦卒中以及先天性代謝失調(diào)而引起的神經(jīng)疾病。本發(fā)明尤其涉及利用骨橋蛋白或其活性激動(dòng)劑制備藥物用于治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病。
背景技術(shù)：
神經(jīng)髓鞘化是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的形成及行使功能過程中的一種基本過程。軸突周圍的髓鞘是電脈沖信號(hào)沿神經(jīng)正確傳導(dǎo)所必須的。在許多疾病中都會(huì)出現(xiàn)髓磷脂的丟失，其中包括影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)性硬化癥(MS)，格-巴綜合征(急性感染性多神經(jīng)炎)，CIDP及其它疾病(見Abramsky和Ovadia，1997；Trojaborg，1998，Hartung等，1998)。雖然脫髓鞘疾病有各種原因，如感染性病原體或自身免疫性攻擊，但都可以引起神經(jīng)功能受損，甚至可能導(dǎo)致癱瘓和死亡。盡管現(xiàn)有的治療藥物可以多發(fā)性硬化癥中的炎性攻擊延緩疾病的進(jìn)展，但是依然需要開發(fā)出新的治療措施以使髓鞘再生并且使神經(jīng)功能恢復(fù)(Abramsky和Ovadia，1997，Pohlau等，1998)。
由急性刺激如創(chuàng)傷、缺氧和缺血引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷對(duì)神經(jīng)元和白質(zhì)都有影響。雖然多數(shù)注意力都集中在導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的過程上，但越來越多的證據(jù)表明使軸突髓鞘化的少突膠質(zhì)細(xì)胞受損也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的特異組成部分。實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠腦卒中(3小時(shí))后很快就會(huì)出現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的病理學(xué)改變，說明這些細(xì)胞比神經(jīng)元細(xì)胞更容易受興奮毒性的損害(Pantoni等，1996)。另外一個(gè)介導(dǎo)細(xì)胞死亡的潛在候選者是谷胺酰胺濃度的顯著升高，一般都伴隨有急性中樞神經(jīng)損傷(Lipton等，1994)。事實(shí)上，神經(jīng)元周圍的少突膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)功能性的谷胺酰胺受體，這些受體屬于α-氨基羥甲基惡唑丙酸/紅藻氨酸鹽亞型。而且少突膠質(zhì)細(xì)胞也表現(xiàn)出對(duì)谷胺酰胺的高度敏感性(McDonald等，1998)。
創(chuàng)傷是指神經(jīng)的損傷或損壞。可以是脊索創(chuàng)傷，即對(duì)脊索的損傷而影響損傷水平或以下的所有神經(jīng)系統(tǒng)功能，包括肌肉控制和感覺，或腦創(chuàng)傷，如閉合腦損傷引起的創(chuàng)傷。
腦缺氧這個(gè)術(shù)語(yǔ)是特指大腦半球缺氧，更典型的用法是指整個(gè)腦缺氧。根據(jù)缺氧嚴(yán)重程度的不同，癥狀可以包括從思維混亂到不可逆的腦損傷、昏迷及死亡。
腦卒中通常是由腦缺血引起的?？梢员环Q為腦血管病或腦血管事故。這是一組腦障礙，包括腦的任何一部分血液供應(yīng)中斷而導(dǎo)致的腦功能喪失。腦大約需要整個(gè)身體血液循環(huán)供應(yīng)的20％。對(duì)腦的血液供應(yīng)主要通過頸部的兩條動(dòng)脈(頸動(dòng)脈)，其在腦內(nèi)分支成多條動(dòng)脈，分別供應(yīng)腦的不同區(qū)域。即使一個(gè)短暫的血流中斷也可以引起腦功能的下降(神經(jīng)缺損)。所影響的腦區(qū)域不同出現(xiàn)的癥狀也不同，通常出現(xiàn)的問題包括視覺的改變，語(yǔ)言能力的改變，身體某一部分的運(yùn)動(dòng)功能或感覺功能降低，或者意識(shí)水平的改變。如果血流降低的時(shí)間超過數(shù)秒，該區(qū)域的腦細(xì)胞就會(huì)收到損傷(血管梗塞)，從而引起該區(qū)域的永久性改變甚至死亡。
每千人內(nèi)大約有4人會(huì)出現(xiàn)腦卒中。在大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家包括美國(guó)中是第三位的死亡原因。隨著年齡的增加，腦卒中發(fā)生的幾率迅速增加，35歲后每10年發(fā)生的幾率增加一倍。65歲以上的人中大約有5％的至少會(huì)出現(xiàn)一次腦卒中。男性發(fā)生的幾率通常大于女性。
如上面所提到的，腦卒中包括腦的某些區(qū)域血液循環(huán)丟失而導(dǎo)致的腦功能喪失(神經(jīng)缺損)。損傷的位置、程度及引發(fā)障礙的原因不同所導(dǎo)致的神經(jīng)缺損也不同。腦卒中發(fā)生的原因可以是血流減少(缺血)而導(dǎo)致的血液供應(yīng)不足從而引發(fā)該區(qū)域腦組織的死亡(梗死)。缺血性腦卒中可以是由在腦內(nèi)形成的血凝塊引起的，也可以是由在其它位置形成的血凝塊、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊或其它物質(zhì)到達(dá)腦部而引起的。腦內(nèi)出血(腦出血)所引起的癥狀與腦卒中相似。
最常見的腦卒中是由動(dòng)脈粥樣硬化(腦血栓形成)引起的腦卒中。動(dòng)脈粥樣硬化(動(dòng)脈的硬化)是指這樣一種病理狀態(tài)，其中在動(dòng)脈的內(nèi)壁形成脂肪沉淀，并且逐漸形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(由脂肪沉淀和血小板組成的塊狀物)。動(dòng)脈阻塞的形成是非常緩慢的。動(dòng)脈粥樣硬化不一定就會(huì)導(dǎo)致腦卒中。在各個(gè)腦動(dòng)脈之間有許多小的動(dòng)脈相連。如果血流逐漸減弱，這些小的連接動(dòng)脈就會(huì)逐漸增大從而繞過阻塞區(qū)域(側(cè)循環(huán))。如果有足夠的側(cè)循環(huán)，即使出現(xiàn)一個(gè)完全阻塞的動(dòng)脈也不會(huì)引起神經(jīng)缺損。腦內(nèi)的第二中安全保障機(jī)制是動(dòng)脈都足夠大，即使75％的血管閉塞也可以保證腦內(nèi)的相應(yīng)區(qū)域有足夠的血流供應(yīng)。
血栓性腦卒中(由血栓引起的腦卒中)在老年人中是最常見的，這些老年人通常都有動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病或糖尿病。這類腦卒中在任何時(shí)候都有可能發(fā)生，包括在休息時(shí)。發(fā)生腦卒中的人可能喪失意識(shí)，也可能不喪失。
由栓塞引起的腦卒中(流動(dòng)性血凝塊)是最常見的，通常由心源性栓塞、由于心臟功能障礙而形成血凝塊然后會(huì)到達(dá)腦部而引起。栓塞也可能起源于其它部位，特別是那些具有動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的區(qū)域。血栓隨血流運(yùn)動(dòng)，在腦內(nèi)的小動(dòng)脈中變成棒狀。這種腦卒中會(huì)突然發(fā)生，并且會(huì)立刻引起最嚴(yán)重的神經(jīng)缺損。這種腦卒中與運(yùn)動(dòng)是否劇烈沒有關(guān)系，在任何時(shí)間內(nèi)都可能發(fā)生。與這種障礙相伴隨的常常是心率失常，并且是血栓產(chǎn)生的原因。對(duì)腦造成的損傷常比由腦血栓形成導(dǎo)致的腦卒中嚴(yán)重的多。意識(shí)可能喪失，也可能不喪失。如果栓塞破裂造成血管損傷而出血(出血性腦卒中)則后果可能更嚴(yán)重。
周圍神經(jīng)病是一種綜合征，包括感覺喪失、肌無力和肌萎縮、深度腱反射減弱、血管舒張癥狀的一種或幾種癥狀的綜合。
這種疾病可以影響單個(gè)神經(jīng)(單一精神病變)，兩個(gè)或多個(gè)分離區(qū)域的神經(jīng)(多發(fā)性單一精神病變)，或者同時(shí)影響多個(gè)神經(jīng)(多神經(jīng)病)。最初主要是軸突受影響(如糖尿病，萊姆病，或尿毒癥或毒性藥物引起的疾病)，或者是髓鞘或施萬(wàn)細(xì)胞(如急性或慢性感染性多神經(jīng)病，腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，或格-巴綜合征)。對(duì)小的無髓或有髓神經(jīng)纖維造成的損傷主要是導(dǎo)致溫度及疼痛感覺喪失；對(duì)大的有髓神經(jīng)纖維造成的損傷主要是會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)及本體感覺障礙。某些神經(jīng)障礙(如由于鉛中毒，氨苯砜的應(yīng)用，蜱叮咬，卟啉病或格-巴綜合征)主要影響運(yùn)動(dòng)纖維；其它的神經(jīng)障礙(如由于腫瘤引起的背根神經(jīng)節(jié)炎，麻風(fēng)病，AIDS，糖尿病，或慢性吡哆醇中毒)主要影響背根神經(jīng)節(jié)或感覺纖維，產(chǎn)生感覺癥狀。有時(shí)候顱側(cè)神經(jīng)也可能收到影響(如格-巴綜合征，萊姆病，糖尿病，以及白喉)。確定那些神經(jīng)受影響有助于判斷病因。
創(chuàng)傷是導(dǎo)致單個(gè)神經(jīng)纖維收到局部損傷的最常見原因。劇烈的肌肉運(yùn)動(dòng)或關(guān)節(jié)的強(qiáng)迫過度伸張可能會(huì)造成局部神經(jīng)病，重復(fù)的小創(chuàng)傷也可能造成局部神經(jīng)病(如緊握小的工具，來自汽錘的過度振蕩)。壓力或內(nèi)陷麻痹通常影響骨隆突(如在深度睡眠時(shí)，瘦弱或惡病質(zhì)病人感覺缺失時(shí)，以及酒醉時(shí))或狹窄管道(如腕管綜合征)處的淺表神經(jīng)(尺骨的，橈骨的，腓側(cè)的)。壓力造成的麻痹也可能是由于腫瘤、骨肥厚、拄拐杖、或長(zhǎng)時(shí)間保持非正常姿勢(shì)(如在維護(hù)庭園時(shí))而引起的。血液流出后進(jìn)入神經(jīng)以及暴露于寒冷或輻射中也可能引發(fā)神經(jīng)疾病。單一精神病變也可能是由于腫瘤的直接侵潤(rùn)造成的。
多發(fā)性單一精神病變通常是由膠原性血管病(如結(jié)節(jié)性多發(fā)性動(dòng)脈炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，斯耶格倫綜合征(口眼干燥、關(guān)節(jié)炎綜合征)、結(jié)節(jié)病、代謝性疾病(如糖尿病，淀粉樣變性)、或感染性疾病(如萊姆病，HIV感染)引發(fā)的。微生物如果直接侵入神經(jīng)(如麻風(fēng)病)也可以引起多發(fā)性單一精神病變。
由急性發(fā)熱病引起的多神經(jīng)病通常都是由毒素(如白喉)或自身免疫反應(yīng)(如格-巴綜合征)造成的；有時(shí)伴隨免疫接種而出現(xiàn)的多神經(jīng)病可能也是自身免疫疾病。
毒性藥物通常造成的是多神經(jīng)病，但有時(shí)也會(huì)引發(fā)單一精神病變。這些藥物包括吐根堿、環(huán)幾巴比妥、巴比妥、三氯叔丁醇、磺胺類藥物、苯妥英、硝基呋喃妥英、長(zhǎng)春花生物堿、重金屬、一氧化碳、三鄰羥甲苯基磷酸、正二硝基苯酚、多種溶劑、其它工業(yè)毒物、以及某些抗AIDS藥物(如扎西他賓，二脫氧肌苷)。
營(yíng)養(yǎng)缺乏和代謝障礙也可能引發(fā)多神經(jīng)病。維生素B缺乏就是一種常見的原因(如酒精中毒，腳氣病，惡性貧血，異煙肼誘導(dǎo)的吡哆醇缺乏，吸收不良綜合征，以及孕期嘔吐)。多神經(jīng)病也可能發(fā)生于甲狀腺功能減退癥、卟啉病、結(jié)節(jié)病、淀粉樣變性以及尿毒癥時(shí)。糖尿病也可以引起感覺運(yùn)動(dòng)遠(yuǎn)端多神經(jīng)病(最常見)、多發(fā)性單一精神病變、以及局部單一精神病變(如動(dòng)眼神經(jīng)或外展腦神經(jīng)所發(fā)生的局部單一精神病變)。
惡性腫瘤也可以引發(fā)多神經(jīng)病，主要是通過單株性丙球蛋白病(多發(fā)性骨髓瘤，淋巴瘤)，淀粉樣侵潤(rùn)，或營(yíng)養(yǎng)缺乏，或者腫瘤相關(guān)病癥而引發(fā)。
特異性單一精神病變單發(fā)的和多發(fā)的單一精神病變的特征是疼痛、虛弱、以及受影響神經(jīng)分布區(qū)域內(nèi)的感覺異常。多發(fā)性單一精神病變是不對(duì)稱分布的；受影響的神經(jīng)可以是起始就是全部，也可以是逐漸增多的。如果許多神經(jīng)都收到影響可能會(huì)引發(fā)多神經(jīng)病。
尺骨神經(jīng)麻痹通常是由肘部尺骨溝內(nèi)的神經(jīng)創(chuàng)傷引起的，持續(xù)重復(fù)依靠肘部或兒童時(shí)期骨折后骨不對(duì)稱生長(zhǎng)(慢尺骨麻痹)都可以造成肘部尺骨溝內(nèi)的神經(jīng)創(chuàng)傷。尺骨神經(jīng)在肘管處也容易受到擠壓。第五手指或第四手指中間半截會(huì)出現(xiàn)感覺異常和感覺缺陷；拇指內(nèi)收肌、第五手指外展肌以及骨間肌肉變?nèi)鹾臀s。嚴(yán)重的慢性尺骨麻痹會(huì)導(dǎo)致爪形手畸形。神經(jīng)傳導(dǎo)檢查可以確定損傷的位置。在進(jìn)行外科手術(shù)修復(fù)前應(yīng)保守治療。
腕管綜合征是由于正中神經(jīng)受壓迫引起的，該神經(jīng)位于橫向淺表腕韌帶和屈伸手掌的前臂肌肉的縱向肌腱之間的腕關(guān)節(jié)掌側(cè)?？梢允菃蝹?cè)或雙側(cè)。該神經(jīng)受壓迫會(huì)導(dǎo)致手掌的橈骨掌側(cè)感覺異常以及腕和手掌的疼痛；有時(shí)疼痛發(fā)生在靠近前臂和肩部的受壓迫位置。疼痛可能在夜間更劇烈。然后前三個(gè)手指的掌側(cè)可能會(huì)出現(xiàn)感覺缺陷；控制拇指外展和內(nèi)屈的肌肉可能變?nèi)鹾臀s。這種綜合征應(yīng)該和頸神經(jīng)根病導(dǎo)致的C-6神經(jīng)根受壓區(qū)別開來。
腓神經(jīng)麻痹通常是由于靠腓骨頸側(cè)面的神經(jīng)受壓迫而引起的。這種情況常見于瘦弱的長(zhǎng)期臥床的病人或習(xí)慣性交叉雙腿的瘦人。足的背屈及外翻能力減弱(足下垂)。偶爾會(huì)有小腿和足背的前面偏一側(cè)及第一和第二跖之間的空隙出現(xiàn)感覺缺失。壓迫性神經(jīng)病的治療一般是保守的(如避免腿部交叉)。通常隨后出現(xiàn)不完全臨床神經(jīng)病，但一般都會(huì)自然消失。如果難以恢復(fù)可以考慮進(jìn)行手術(shù)探察。
橈神經(jīng)麻痹(周末晚麻痹)是由于壓迫背靠肱骨的神經(jīng)造成的，例如中毒或深度睡眠時(shí)將手臂靠在椅子背上。癥狀包括腕和手指的伸肌無力(腕下垂)，偶爾會(huì)有第一背骨間肌肉的背側(cè)感覺消失。治療方法與壓迫性腓側(cè)神經(jīng)障礙一樣。
多神經(jīng)病一般是相對(duì)對(duì)稱的，通常同時(shí)影響感覺、運(yùn)動(dòng)和血管舒張神經(jīng)纖維?？赡苡绊戄S突柱或髓鞘，或者同時(shí)受影響，可能是急性的(如格-巴綜合征)，也可能是慢性的(如腎衰竭)。
由代謝障礙(如糖尿病)或身衰竭造成的多神經(jīng)病進(jìn)展緩慢，一般要經(jīng)過數(shù)月或數(shù)年。通常首先出現(xiàn)下肢的感覺異常，一般來說遠(yuǎn)端比近端嚴(yán)重。外周麻刺感、麻木、燒灼感、關(guān)節(jié)本體感覺及震動(dòng)感消失是比較突出的。夜間一般疼痛比較嚴(yán)重，碰到受影響區(qū)域或溫度改變會(huì)導(dǎo)致癥狀加重。嚴(yán)重的病人出現(xiàn)感覺喪失的信號(hào)，呈典型的長(zhǎng)襪-手套(stocking-and-glove)分布。跟腱反射和其它深度腱反射減弱或消失。如果感覺缺失加重會(huì)導(dǎo)致指(跖)無痛潰瘍或夏氏關(guān)節(jié)(Charcot’s joint)。感覺或本體感覺缺失會(huì)造成步態(tài)異常。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)受影響則會(huì)造成遠(yuǎn)端肌無力和萎縮。自主神經(jīng)系統(tǒng)也可能被包括在內(nèi)，導(dǎo)致夜間腹瀉、大小便失禁、陽(yáng)痿或體位性低血壓。血管舒張癥狀有多種多樣。皮膚變得蒼白干燥，有時(shí)甚至灰暗；極易出汗。嚴(yán)重的慢性病人常會(huì)出現(xiàn)與營(yíng)養(yǎng)有關(guān)的癥狀(光滑而有光澤的皮膚，痘痕或脊?fàn)钪讣祝琴|(zhì)疏松)。
營(yíng)養(yǎng)性多神經(jīng)病通常出現(xiàn)于酒精中毒和營(yíng)養(yǎng)不良的人中。最初的軸突病變會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)大神經(jīng)纖維脫髓鞘和軸突損壞。原因是缺乏維生素B1或其它維生素(如維生素B6，泛酸，葉酸)還不清楚。維生素B6缺乏導(dǎo)致的神經(jīng)病常常只發(fā)生在使用異煙肼治療結(jié)核的病人身上；缺乏或依賴維生素B6的嬰幼兒可能會(huì)出現(xiàn)驚厥。遠(yuǎn)端肢體殘疾或?qū)ΨQ性無力通常是隱襲的并且快速發(fā)展，有時(shí)會(huì)伴隨感覺喪失、感覺異常和疼痛。觸碰時(shí)腓及足的疼痛、痙攣、冷感、燒灼感以及麻木等感覺會(huì)加重。當(dāng)病因不清時(shí)可以給予多種維生素，但其是否有效還未被證實(shí)。
很少的情況下，感覺神經(jīng)多神經(jīng)病從外周疼痛和感覺異常開始，從中央到所有形式的感覺喪失。其發(fā)生與癌癥的遠(yuǎn)期效應(yīng)類似(特別是支氣管的)，癥狀一般出現(xiàn)在過量攝入維生素B6(＞0.5克/天)，以及在淀粉樣變性、甲狀腺功能低下、骨髓瘤和尿毒癥中。在停止攝入維生素B6時(shí)也可能出現(xiàn)維生素B6誘導(dǎo)的神經(jīng)病。
遺傳性神經(jīng)病分為感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病和感覺神經(jīng)病。夏-馬-圖病(進(jìn)行性神經(jīng)性肌萎縮)是最常見的遺傳性感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病。很少見感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病起始于出生時(shí)期并導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾。感覺神經(jīng)病是很少見的，遠(yuǎn)端疼痛及溫度感覺喪失出現(xiàn)的幾率要大于震動(dòng)和位置感覺喪失的幾率。主要的問題是由于對(duì)疼痛不敏感而造成的足部殘疾，并且常常發(fā)生感染和骨髓炎。
遺傳性運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)病I型和II型(夏-馬-圖病，腓側(cè)肌肉萎縮)相對(duì)較常見，通常是常染色體顯性遺傳病，其癥狀是肌無力和萎縮，主要影響腓側(cè)的和下肢肌肉。病人還可能患有其它退化性疾病(如弗氏共濟(jì)失調(diào)(Friedreich’s ataxia))或具有家族史。I型病人一般出現(xiàn)在兒童中期，有足下垂，并且伴有緩慢的進(jìn)行性遠(yuǎn)端肌肉萎縮，導(dǎo)致“鹮形腿”。稍后會(huì)出現(xiàn)手部的內(nèi)在肌肉萎縮。出現(xiàn)長(zhǎng)襪-手套(stocking-glove)模式的震動(dòng)、疼痛及溫度感覺減弱。深度腱反射缺失。高足弓或錘狀趾可能只是患有該病的家族成員受影響輕微的標(biāo)志。神經(jīng)傳導(dǎo)速度緩慢，遠(yuǎn)端潛伏期延長(zhǎng)。出現(xiàn)節(jié)段性的脫髓鞘和髓鞘再生。增大的外周神經(jīng)可以通過觸診查到。病程進(jìn)展緩慢緩慢并且不影響壽命。II型神經(jīng)病進(jìn)展更緩慢，在其生命晚期通常會(huì)出現(xiàn)肌無力。病人具有相對(duì)正常的神經(jīng)傳導(dǎo)速度，但其激發(fā)勢(shì)能的振幅較低?；罱M織檢查發(fā)現(xiàn)有wallerian變性。
遺傳性運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)病III型(肥大性間質(zhì)性神經(jīng)病，代-索病(進(jìn)行性肥大性間質(zhì)性神經(jīng)病))是一種少見的常染色體隱性遺傳病，從兒童期開始出現(xiàn)進(jìn)行性肌無力、感覺喪失及深度腱反射缺乏。開始時(shí)類似于夏-馬-圖病，但其運(yùn)動(dòng)功能減弱速度很快。發(fā)生脫髓鞘和髓鞘再生現(xiàn)象，導(dǎo)致外周神經(jīng)膨大，神經(jīng)活組織檢查可見洋蔥泡。
根據(jù)運(yùn)動(dòng)性肌無力的特征性分布、足畸形、家族史及電生理異?？纱_診此病?？梢酝ㄟ^基因分析，但無特異的治療措施。年輕病人通過專業(yè)咨詢以了解病程進(jìn)展情況可能會(huì)有幫助。安裝矯形支架有助于矯正足下垂；通過矯形外科手術(shù)以穩(wěn)定足部也可能有幫助。
神經(jīng)變性疾病包括阿爾茨海默病，帕金森病，亨庭頓舞蹈病和肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)。
阿爾茨海默病是一種由腦組織改變而引起的心里功能衰退障礙。其中包括非血管病變引起的腦組織萎縮、初級(jí)變性性癡呆及彌散性腦萎縮。阿爾茨海默病也叫老年癡呆/阿爾茨海默型(SDAT)。是老年人智力下降的最常見原因。每10000人中大約有9人會(huì)有此病。這種疾病對(duì)女性的影響比男性稍弱并且主要發(fā)生在老年人身上。
引起該病的原因還部清楚。造成此疾病的神經(jīng)化學(xué)因素包括神經(jīng)細(xì)胞傳輸神經(jīng)沖動(dòng)的物質(zhì)(神經(jīng)遞質(zhì))的缺乏，如乙酰膽堿、生長(zhǎng)抑素、P物質(zhì)及去甲腎上腺素。環(huán)境因素包括與鋁、錳及其它物質(zhì)接觸。感染性因素包括影響腦和脊索(中樞神經(jīng)系統(tǒng))的朊病毒(病毒樣微生物)感染。在某些家族中(代表5-10％的病例)具有遺傳性的易感性而發(fā)生這種疾病，但并不符合遺傳法則(孟德爾定律)。通常是排除癡呆的其它原因才能診斷為這種疾病。
研究人員發(fā)現(xiàn)在一個(gè)多位成員患有阿爾茨海默病的家族中出現(xiàn)一種特異的基因變異，該變異幾乎發(fā)生在所有患此疾病的成員身上。這個(gè)基因編碼一種叫載脂蛋白E4的物質(zhì)，但并不是說這個(gè)基因是引起此病的原因，只是它的存在可以增加最終患此病的幾率。因?yàn)橛性S多具有E4基因的人并沒有受阿爾茨海默病的折磨。
患者最初的特征是記憶損害，伴有進(jìn)行性智力減退。隨著疾病的進(jìn)展會(huì)出現(xiàn)情緒改變、語(yǔ)言能力改變、步態(tài)的改變及其它變化。還會(huì)出現(xiàn)腦組織變小(腦萎縮)、腦室(腦內(nèi)腔隙)擴(kuò)大、以及腦組織內(nèi)出現(xiàn)沉淀物。
帕金森病是一種腦病，其特征是搖擺及行走、運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)困難。該病與控制肌肉運(yùn)動(dòng)的腦組織受損有關(guān)。也叫震顫麻痹或震顫性麻痹。
每1000人中大約有2人受此病影響，大多數(shù)在50歲以后患病。對(duì)男性和女性都有影響，是老年人最常見的一種神經(jīng)障礙。術(shù)語(yǔ)“帕金森氏綜合征”是指具有帕金森氏病所表現(xiàn)出的運(yùn)動(dòng)變化類型群的任何狀態(tài)，帕金森氏病恰好是引起這群癥狀的最常見疾病。帕金森氏綜合征也可由其它疾病或外部因素引起(繼發(fā)性帕金森氏綜合征)。
帕金森氏病是由于腦控制肌肉運(yùn)動(dòng)部分(基底核和錐體束外區(qū)域)的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行性退變引起的。多巴胺是細(xì)胞用來傳導(dǎo)脈沖信號(hào)的一種物質(zhì)(神經(jīng)遞質(zhì))，通常在此區(qū)域產(chǎn)生。該區(qū)域的退變會(huì)減少體內(nèi)多巴胺的含量。
多巴胺含量的不足會(huì)破壞多巴胺與其它神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿之間的平衡。沒有多巴胺神經(jīng)細(xì)胞無法正確傳遞信號(hào)，這會(huì)導(dǎo)致肌肉功能的喪失。腦細(xì)胞退變的準(zhǔn)確原因還不清楚。這種疾病會(huì)影響一側(cè)或雙側(cè)身體，其功能喪失的程度千變?nèi)f化。
除了肌肉控制功能喪失外，有些帕金森氏病病人還可能變得嚴(yán)重抑郁。盡管早期精神異常還不常見，但嚴(yán)重的帕金森氏病病人可能會(huì)表現(xiàn)出全面的精神頹廢(包括癡呆、幻覺等等)。癡呆也可能是某些治療藥物的副作用。
亨庭頓舞蹈病是一種遺傳性常染色體顯性神經(jīng)疾病。這種疾病不常見，發(fā)生的幾率大約為萬(wàn)分之一(Breighton和Hayden，1981)。該疾病在50歲以前通常不會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為精神紊亂、不隨意運(yùn)動(dòng)障礙及認(rèn)知能力下降知道死亡。典型的病程是從開始發(fā)病到死亡約為17年。
與亨庭頓舞蹈病相關(guān)的基因叫亨庭頓基因(huntingtin)。它位于4號(hào)染色體的長(zhǎng)臂，是潛伏期診斷及產(chǎn)前診斷的有效方式?；虍惓Ｊ且环N大量的隨機(jī)CAG重復(fù)核苷酸序列。
亨庭頓舞蹈病病人染色體上CAG重復(fù)序列長(zhǎng)度的增加與開始出現(xiàn)臨床癥狀的年齡高度相關(guān)。這種相關(guān)程度在那些在青少年時(shí)期就開始出現(xiàn)亨庭頓舞蹈病癥狀的病人身體表現(xiàn)的尤其突出，其重復(fù)序列的數(shù)目通常超過50個(gè)。亨庭頓舞蹈病家族成員的CAG重復(fù)序列數(shù)目也表現(xiàn)出某些程度的不穩(wěn)定，尤其是當(dāng)孩子從其父親那里遺傳到亨庭頓基因時(shí)特別明顯。
還不清楚亨庭頓舞蹈病病人中這個(gè)廣泛表達(dá)的基因是如何選擇性地導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的。而且序列分析也沒有發(fā)現(xiàn)該基因與其它已知基因具有明顯的同源性，還沒有鑒別出結(jié)構(gòu)基序和功能域來研究其功能。特別是這個(gè)廣泛表達(dá)的基因是如何選擇性地導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的問題還沒有答案。
肌萎縮性側(cè)索硬化癥是一種由神經(jīng)對(duì)隨意運(yùn)動(dòng)肌肉的控制進(jìn)行性喪失所引起的，其主要原因是腦和脊索的神經(jīng)細(xì)胞受到破壞。肌萎縮性側(cè)索硬化癥也叫LouGehrig病，是一種包括使用及控制肌肉功能喪失的疾病。這些神經(jīng)控制的肌肉萎縮或消失，結(jié)果肌肉組織由于缺乏神經(jīng)刺激而消失。肌肉強(qiáng)度和協(xié)調(diào)能力下降，開始是隨意肌肉(那些受意識(shí)控制的肌肉，如臂和腿上的肌肉)。肌肉控制喪失的范圍持續(xù)擴(kuò)大，越來越多的肌肉群受到影響。刺激半隨意肌肉的神經(jīng)也可能受影響，如那些控制呼吸和吞咽的肌肉。但對(duì)其思維和推理能力沒有影響，其原因還不清楚。
ALS發(fā)病的幾率大約為十萬(wàn)分之一。某些病例具有家族性。這種疾病發(fā)生的幾率男性大于女性。成年時(shí)期一般不發(fā)病，通常是在50歲以后。
創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷可能涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也可能涉及外周神經(jīng)系統(tǒng)。創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)也被簡(jiǎn)單地稱為頭損傷或閉合性頭損傷(CHI)，是指由于外力擊打頭部造成腦受損的損傷。最常見的是汽車或自行車事故，但也可能是近乎溺死、心急梗死、腦卒中及感染的結(jié)果。這類創(chuàng)傷性腦損傷通常都是由于缺氧或腦供血不足引起的，因此也被稱為“缺氧損傷”。
腦損傷或閉合頭損傷是在頭部受到打擊的情況下發(fā)生的，比如機(jī)動(dòng)車車禍或從高空墜下。在這種情況下，頭顱撞擊到靜止的物體上，頭顱內(nèi)的腦沿樞椎(腦干)轉(zhuǎn)動(dòng)扭曲，造成局部或廣泛損傷。由于腦組織是由使其漂浮的液體包圍著的一大團(tuán)軟組織，因此在撞到物體上后可能會(huì)反彈從而使損傷加重。
在受到創(chuàng)傷后可能會(huì)立即出現(xiàn)一段意識(shí)喪失期，可能持續(xù)數(shù)分鐘、數(shù)周或數(shù)月。由于扭曲和反彈，病人的受創(chuàng)傷腦組織通常會(huì)受到損壞或挫傷腦的大部分組織。這就是所謂的腦彌漫性損傷，或“非槍彈傷”。這類非槍彈類腦損傷可以分類為初級(jí)或次級(jí)。
初級(jí)腦損傷發(fā)生在損傷時(shí)，主要是位于受撞擊位點(diǎn)，特別是在有顱骨破裂時(shí)。大的挫傷一般有大腦內(nèi)出血或皮質(zhì)撕裂傷。彌散性軸索損傷是由于顱內(nèi)腦旋轉(zhuǎn)造成神經(jīng)束斷裂或拉伸而形成的。軸突也會(huì)有小的出血性損傷或彌漫性損傷，但只有在顯微鏡下才能觀察到。
次級(jí)腦損傷是損傷瞬間過后并發(fā)癥的結(jié)果。其中包括腦內(nèi)出血、對(duì)大腦外動(dòng)脈的創(chuàng)傷性損壞、顱內(nèi)疝出、缺氧性腦損傷、或者腦膜炎。
開放性頭損傷在檢查頭部時(shí)可以看到，可能是槍傷、事故、或物體穿過顱骨到達(dá)腦組織(腦槍彈傷)。這類頭損傷比較容易傷及腦的特定區(qū)域。
所謂的輕微腦損傷可能不會(huì)有意識(shí)的喪失，只是持續(xù)一小段時(shí)間的茫然感覺或混亂狀態(tài)。雖然所能采取的醫(yī)療措施很少，但未昏迷的腦損傷病人可能也會(huì)有一些與昏迷創(chuàng)傷存活者相似的癥狀及缺陷。
對(duì)于創(chuàng)傷來說需要檢測(cè)腦的變化以防止進(jìn)一步的損傷。嚴(yán)重頭損傷后腦通常會(huì)變大。這就是所謂的腦腫脹，是由于腦內(nèi)的血量增加引起的。病程的后期腦內(nèi)可能會(huì)出現(xiàn)積水，被稱為腦水腫。腦腫脹和腦積水都會(huì)導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，被稱為顱內(nèi)壓(ICP)。
脊索損傷占到因截癱和四肢麻痹而住院病人的大多數(shù)。超過80％的是因?yàn)檐嚨?。損傷可在臨床上分為兩組開放性損傷及閉合性損傷。
開放性損傷直接損壞脊索和神經(jīng)根。貫穿傷可能導(dǎo)致廣泛的斷裂和出血。閉合性損傷占脊索損傷的大多數(shù)，并且通常與脊柱的骨折脫位有關(guān)，一般通過放射檢查就可以證實(shí)。對(duì)脊髓的損傷依賴于骨損傷的程度，可以分為兩個(gè)階段初級(jí)損傷是挫傷，神經(jīng)纖維橫切和出血壞死；次級(jí)損傷是硬膜外腫瘤(extradural heamatoma)、梗死、感染和水腫。
脊索損傷的晚期效應(yīng)包括受損神經(jīng)纖維的上行和下行順向變性、創(chuàng)傷后脊髓空洞癥以及截癱的全身效應(yīng)，如尿道及胸腔感染、褥瘡和肌肉萎縮。
神經(jīng)障礙還可以由先天性的代謝疾病引起。髓鞘包裹這許多神經(jīng)纖維，是由生命早期形成的脂蛋白層組成的。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的少突膠質(zhì)細(xì)胞形成的髓磷脂在化學(xué)及免疫學(xué)意義上與外周神經(jīng)系統(tǒng)中施萬(wàn)細(xì)胞形成的髓磷脂是不同的，但其功能是相同的促進(jìn)神經(jīng)脈沖沿軸突傳遞。
許多先天性代謝病(如苯丙酮尿癥和其它氨基酸尿癥；泰-薩病，尼-皮病(類脂組織細(xì)胞增多癥)和高歇??；胡爾勒綜合征；克拉伯病和其它腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良)都可以影響髓磷脂的發(fā)育，主要是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。除非其生化缺陷得到矯正或補(bǔ)償，否則就會(huì)造成永久性的并且常常是廣泛的神經(jīng)缺陷。
例如，克拉伯病或球狀體細(xì)胞白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良是一種涉及外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的疾病。編碼溶酶體酶半乳糖腦苷脂酶(GALC)的基因突變，結(jié)果導(dǎo)致酶活性降低，其降解腦苷脂的能力下降，這些腦苷脂幾乎都存在于髓磷脂中。病人體內(nèi)持續(xù)的髓鞘化和/或髓鞘再生需要具有功能的內(nèi)源性少突膠質(zhì)細(xì)胞，或者將正常少突膠質(zhì)細(xì)胞或能分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞植入以提供足量的GALC表達(dá)(Wenger等，2000)。
神經(jīng)纖維瘤病1(NF1)是一種常見的染色體異常疾病，具有多種神經(jīng)學(xué)上的臨床癥狀。
多系統(tǒng)萎縮是一種偶發(fā)的成年開始發(fā)病的神經(jīng)變性疾病，其病因還不清楚。少突膠質(zhì)細(xì)胞在病理遺傳學(xué)過程中所起的作用如果說不是唯一的也是極其突出的，這一特征在神經(jīng)變性疾病中是很獨(dú)特的。其與帕金森病的主要區(qū)別在于多系統(tǒng)萎縮用L-多巴治療無效。
在生命晚期脫髓鞘是許多神經(jīng)疾病的一個(gè)特征；這可能是由于局部創(chuàng)傷、毒性藥物或代謝障礙損傷神經(jīng)或髓磷脂造成的。也有證據(jù)表明精神分裂癥也可能導(dǎo)致脫髓鞘。大面積的髓磷脂丟失通常會(huì)導(dǎo)致軸突和胞體退化，二者都是不可逆的。但是，在許多情況下髓鞘可以再生，因而神經(jīng)功能得以迅速修復(fù)、再生乃至完全恢復(fù)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(即脊索、腦或視神經(jīng))脫髓鞘在初級(jí)脫髓鞘病中是最常見的，但其病因還不清楚。了解最多的是MS。
急性播散性腦脊髓炎和感染后腦脊髓炎的特征是血管周圍的中樞神經(jīng)脫髓鞘，這種脫髓鞘可能會(huì)自然發(fā)生，但多數(shù)情況下是在病毒感染或病毒疫苗接種后(極少情況下是在細(xì)菌疫苗接種后)，說明是免疫學(xué)的因素在起作用。病毒疫苗接種后或患有格-巴綜合征后出現(xiàn)的急性炎性周圍神經(jīng)病具有相同脫髓鞘病癥，因此推測(cè)也有免疫發(fā)病機(jī)理，但它只影響周圍神經(jīng)。
異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良是另外一種脫髓鞘疾病。腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥和腎上腺脊髓神經(jīng)病是少見的性染色體連鎖隱性代謝疾病，其特征是腎上腺功能障礙和廣泛的神經(jīng)脫髓鞘。腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥發(fā)生在年輕男性身上；腎上腺脊髓神經(jīng)病發(fā)生在青少年時(shí)期。精神頹廢、痙攣及失明可能發(fā)生。腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥常常是致命的。飲食療法及免疫調(diào)節(jié)療法正在研究中。
Leber遺傳性視神經(jīng)萎縮及其相關(guān)的線粒體疾病的主要特征是雙側(cè)中央視覺喪失，通常是影響二十歲左右的年輕人。Leber遺傳性視神經(jīng)萎縮類似于MS所導(dǎo)致的視神經(jīng)炎。通過母系遺傳的線粒體DNA上的突變已被鑒定出來。
HTLV相關(guān)的脊髓病是一種與人T淋巴病毒感染相關(guān)的慢性進(jìn)行性脊索疾病，其特征是雙腿強(qiáng)直性肌無力。
其它的神經(jīng)疾病包括異常髓鞘化神經(jīng)病，下面對(duì)其作一概述。
免疫性的急性多神經(jīng)病、格-巴多神經(jīng)病、慢性多神經(jīng)病、慢性免疫脫髓鞘性多神經(jīng)病(CIDP)、多病灶的CIDP、多病灶的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病(MMN)、抗髓磷脂相關(guān)蛋白綜合征、抗硫腦酯抗體綜合征(含有血清M-蛋白)、抗神經(jīng)節(jié)苷脂2(GM2)抗體綜合征、POEMS綜合征、多神經(jīng)病器官巨大癥(Polyneuropathy Organomegaly)、內(nèi)分泌病或水腫、M蛋白、皮膚變化、神經(jīng)束膜炎、IgM抗GD1b抗體綜合征(偶發(fā))。
毒素白喉，藥鼠李，六氯酚，氰酸鈉，碲。
藥物主要是脫髓鞘氯喹，F(xiàn)K506(免疫抑制劑)，哌克昔林，普魯卡因胺，齊美定；混和脫髓鞘及軸突胺碘酮，嗜酸細(xì)胞增多性即痛綜合征，金，蘇拉明，紫杉醇。
遺傳性的碳水化合物缺乏性糖蛋白，白內(nèi)障及面部畸形，科凱恩綜合征(侏儒-視網(wǎng)膜萎縮-耳聾綜合征)，先天性髓鞘化程度低，先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良分層蛋白缺乏，法伯病(脂肪肉芽腫病)，遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺神經(jīng)病和夏-馬-圖三氏綜合征，顯性遺傳的IA，IB，III，HNPP，EGR2，熱敏性的，隱性遺傳的III(代-索病)；4A；4B；4B2；4C；4D(LOM)；4E；4F；HMSN-R；CNS，性染色體連鎖的IX，克拉伯病，馬-斯綜合征(遺傳性共濟(jì)失調(diào)、白內(nèi)障、侏儒及智力缺陷綜合征)，異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，尼-皮病，佩-梅病(家族性腦白質(zhì)病)(PLP)，雷夫敘姆病(植烷酸貯積癥)，朊病毒蛋白(PrP27-30)Glu200Lys突變，克-雅病(傳染性海綿樣腦病)，鼠模型朊病毒過表達(dá)，Salla病，SOX10，細(xì)胞粘合素-XA，周圍髓鞘不均勻包裹，Ehlers-Danlos表型。
代謝性的(不常見)糖尿病(由于并發(fā)CIDP)，甲狀腺功能低下，肝病。
線粒體性的MNGIE綜合征，肌病及外眼肌麻痹，神經(jīng)病，胃腸腦病，NARP綜合征，共濟(jì)失調(diào)，視網(wǎng)膜炎，色素性視網(wǎng)膜炎(Pigmentosa)。
感染性的克-雅病，白喉，HIV相關(guān)性CIDP，麻風(fēng)病麻風(fēng)結(jié)節(jié)(Lepromatous)；混合型軸突脫髓鞘化；克隆化的施萬(wàn)細(xì)胞，變異的克-雅病。
其它詳細(xì)內(nèi)容可在下列網(wǎng)址中查到http//www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/myelin.html多發(fā)性硬化癥(MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性脫髓鞘疾病，具有復(fù)發(fā)-緩和(relapsing-remitting)或進(jìn)行性疾病過程。MS不僅僅是一種脫髓鞘疾病，其在外周神經(jīng)系統(tǒng)中所對(duì)應(yīng)的是慢性炎癥性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病(CIDP)。另外，還有急性單相病變，如外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病也叫做格-巴綜合征(GBS)，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性散播性腦脊髓炎(ADEM)。MS和GBS都是異質(zhì)性綜合征。對(duì)于MS來說，外源性攻擊加上遺傳因素就會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生并最終達(dá)到該病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。在這兩個(gè)疾病中，除了主要的脫髓鞘損傷外還都有軸突的損傷，最終導(dǎo)致永久性的神經(jīng)缺損。
在上述脫髓鞘疾病中MS是最常見的一種。其特征與自身免疫疾病相類似，其中免疫系統(tǒng)的白細(xì)胞攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)分白質(zhì)?；屹|(zhì)也可能被攻擊。盡管MS發(fā)病的準(zhǔn)確機(jī)制還不清楚，但致病因子可能包括遺傳因素，細(xì)菌及病毒感染。其典型的臨床表現(xiàn)(超過85％的病例)是發(fā)作/緩解相發(fā)生改變，相應(yīng)的模式是神經(jīng)障礙發(fā)作先持續(xù)數(shù)周，然后明顯緩解或完全恢復(fù)(Noseworthy，1999)，隨著得病時(shí)間的延長(zhǎng)緩解期逐漸縮短。然后許多病人進(jìn)入疾病后期，臨床表現(xiàn)為神經(jīng)功能逐漸喪失，有部分恢復(fù)或者無法恢復(fù)。這被稱為次級(jí)進(jìn)行性MS。只有一小部分MS病人(大約15％)從開始發(fā)病后逐漸而持續(xù)的出現(xiàn)神經(jīng)功能下降(初級(jí)進(jìn)行性MS)。從嚴(yán)格意義上來說到目前為止MS還沒有明確的治愈措施，因此MS常常是致命的。
MS的基本標(biāo)志是帶有神經(jīng)膠質(zhì)斑的脫髓鞘斑塊形成，見于腦和脊索的白質(zhì)束。與脫髓鞘相聯(lián)系的是神經(jīng)脈沖傳導(dǎo)出現(xiàn)功能性的減弱或阻斷。MS病人也可能出現(xiàn)軸突橫斷和死亡(Bjartmar等，1999)。病理學(xué)研究表明受影響的主要限于視神經(jīng)，腦室周圍白質(zhì)，腦干和脊索(Storch等，1998)這些中樞神經(jīng)受損所產(chǎn)生效應(yīng)包括急性癥狀如復(fù)視、麻木和不穩(wěn)定步態(tài)，還有一些慢性癥狀如強(qiáng)直性下身輕癱和不能自制。
MS發(fā)病的分子機(jī)制好像是有遺傳及環(huán)境因素，包括病毒和細(xì)菌感染。這些因素促使T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞穿過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)組織。
脫髓鞘是由于活化的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞攻擊髓磷脂造成的，F(xiàn)as-Fas配基信號(hào)和補(bǔ)體或抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用對(duì)髓磷脂生成細(xì)胞的損害也是造成脫髓鞘的原因。因此對(duì)髓鞘的直接攻擊以及產(chǎn)生和維護(hù)髓磷脂的細(xì)胞減少都可以造成脫髓鞘。
遺傳和環(huán)境因素可以導(dǎo)致通過血腦屏障進(jìn)入大腦的炎癥細(xì)胞增多。這會(huì)使進(jìn)入中樞神經(jīng)組織的自身活化T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增多。T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子活化抗原提呈細(xì)胞(APCs)。在APC上MHC II類分子存在的情況下當(dāng)自身活化T細(xì)胞遇到推斷的MS蛋白時(shí)，這些T細(xì)胞就被活化了，MS蛋白常常是髓鞘的蛋白組分。還有幾種次要機(jī)制參與對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓磷脂造成損傷。補(bǔ)體或抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用在某些病人中可能是引起損傷的主要因素，而在另外一些病人中，F(xiàn)as-Fas配基信號(hào)和CD4+T細(xì)胞釋放的前炎癥因子如TNF-α可能會(huì)攻擊白質(zhì)?；罨木奘杉?xì)胞通過其增強(qiáng)的吞噬作用以及因子分泌也發(fā)揮重要作用。這會(huì)造成廣泛的脫髓鞘從而導(dǎo)致神經(jīng)脈沖沿中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軸突傳導(dǎo)的效率下降。但是一旦炎癥反應(yīng)消失隨后的修復(fù)機(jī)制可能會(huì)使髓鞘再生。MS病人再生的軸突在病理學(xué)上的表現(xiàn)為沿再生的軸突周圍出現(xiàn)一層薄的鞘。在脫髓鞘的軸突膜上常?？梢钥吹讲逵懈郊拥拟c離子通道以補(bǔ)償傳導(dǎo)效率的下降。少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞可以促進(jìn)MS損傷的髓鞘再生。
少突膠質(zhì)細(xì)胞具有與髓鞘的生成及維護(hù)相關(guān)的多種功能。它可以絕緣、支持和傳導(dǎo)維護(hù)多種神經(jīng)元的軸突。一個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞就可以使多達(dá)50不同的軸突髓鞘化。髓鞘化只限于某些大直徑的軸突；樹突及其它細(xì)胞的突起如星形膠質(zhì)細(xì)胞依然是無髓鞘的。軸突好像具有控制少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的能力，因?yàn)榇笫笠暽窠?jīng)軸突橫斷模型中髓磷脂的再生及少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的生成都受到抑制(Barres和Raff的綜述，1999)。在發(fā)育過程中軸突釋放的因子可以刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移。少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸突以這種方式在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)密切配合。
少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞，可以使軸突束髓鞘化從而促進(jìn)神經(jīng)脈沖的傳導(dǎo)。他們?cè)谳S突的存活以及發(fā)揮功能中發(fā)揮作用。如這個(gè)圖中所顯示的那樣，一種少突膠質(zhì)細(xì)胞一般只使一種軸突髓鞘化。
在某些神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞漿膜的某些特殊區(qū)域髓鞘是多層的，富含脂質(zhì)而蛋白較少。它主要是通過組織電荷進(jìn)入周圍組織來支持軸突和促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的電信號(hào)傳導(dǎo)。神經(jīng)纖維結(jié)是沿軸突髓鞘的位點(diǎn)，在該位點(diǎn)出現(xiàn)跳躍性傳導(dǎo)。
在成年腦中，少突膠質(zhì)細(xì)胞來自于腦和脊索亞腦室區(qū)的還未準(zhǔn)確定義的前體細(xì)胞(Nait-Oumesmar等，1999)。這些前體細(xì)胞是可以增殖的，并且表達(dá)髓磷脂轉(zhuǎn)錄子和蛋白，首先出現(xiàn)在髓鞘化前數(shù)周的胚胎脊索的腹側(cè)區(qū)域(Hajihosseini等，1996)。髓鞘化的過程發(fā)生在出生后的腦中。在出生后發(fā)育過程中這些前體細(xì)胞遷移到已髓鞘化的神經(jīng)元束中。
少突膠質(zhì)細(xì)胞已一種已詳細(xì)定義的特定的方式由其前體細(xì)胞發(fā)育成熟(綜述見Rogister等，1999)。少突膠質(zhì)細(xì)胞按照下列確定的途徑發(fā)育，其中每一階段由幾種細(xì)胞特異性的標(biāo)記物來劃分內(nèi)皮神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(E-NCAM)，波形蛋白，A2B5，POU轉(zhuǎn)錄因子Tst-1/Oct6/SCIP，原少突膠質(zhì)母細(xì)胞抗原(POA)，半乳糖腦苷脂(GalC)，O1，O4，以及髓磷脂特異性擔(dān)保PLP、MBP和MOG。神經(jīng)干細(xì)胞生成雙極性的pre-CD3+細(xì)胞，后者再變成O2A前體細(xì)胞。這些細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞或2型星形膠質(zhì)細(xì)胞。在最終分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞前還要經(jīng)過原少突膠質(zhì)細(xì)胞和原半乳糖腦苷脂陽(yáng)性細(xì)胞階段。在少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育體系的最后階段其特征是這些細(xì)胞不再增殖。成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞特異性標(biāo)記物半乳糖腦苷脂和硫酸腦苷脂(SUL)，還表達(dá)髓磷脂特異性蛋白質(zhì)。
因此少突膠質(zhì)細(xì)胞是從處于有絲分裂狀態(tài)的遷移的前體細(xì)胞分化而來的。一旦這些細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂后階段，他們就會(huì)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)編碼髓磷脂特異性蛋白的基因。包裹髓鞘的軸突是通過成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸突自身直接接觸而形成的。通過髓鞘壓緊中樞神經(jīng)的軸突而完成髓鞘化，最后形成一種復(fù)合物形式的含大分子的液晶態(tài)髓鞘(Scherer，1997)。促進(jìn)髓鞘化需要考慮髓鞘各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白之間的精確化學(xué)計(jì)量關(guān)系，因?yàn)橐粋€(gè)組分的增加和減少就可能導(dǎo)致整個(gè)髓鞘結(jié)構(gòu)的改變。
維持脫髓鞘軸突修復(fù)功能的少突膠質(zhì)細(xì)胞的不穩(wěn)定會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的累積，形成MS。促進(jìn)MS病人髓鞘再生可以避免軸突喪失從而限制由中樞神經(jīng)軸突死亡而導(dǎo)致的功能障礙的進(jìn)一步發(fā)展。
MS出現(xiàn)的脫髓鞘表型引起了對(duì)活動(dòng)MS損傷性質(zhì)的多方面研究。裸露的軸突及產(chǎn)生髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞的缺乏說明正常的髓磷脂分解以及髓鞘再生過程的畸變。大約由40％的MS損傷表現(xiàn)出髓鞘再生障礙，特別是在疾病的早期(Prineas等，1993)。這為我們提供了一個(gè)現(xiàn)實(shí)的前景就是開發(fā)促進(jìn)髓磷脂修復(fù)的治療措施可能能夠組織神經(jīng)系統(tǒng)的永久性損傷。年輕的中樞神經(jīng)損傷患者中成功的可能性特別高，因?yàn)檫@些患者在早期髓鞘再生現(xiàn)象確實(shí)存在。但是負(fù)責(zé)髓鞘化和髓鞘再生的少突膠質(zhì)細(xì)胞處于極端的代謝壓力下，在這種壓力下即使再加上一些微小的刺激就可能導(dǎo)致不可逆損傷(Scolding和Lassmann，1996)。這就會(huì)使對(duì)活動(dòng)MS損傷的任意修復(fù)的可能性下降，其中一些炎癥及其它因素會(huì)阻礙髓鞘再生。因此促進(jìn)活動(dòng)MS損傷髓磷脂修復(fù)的策略要綜合考慮髓鞘的再生和軸突的保護(hù)。
成年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)含有能增殖的少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，這些細(xì)胞成熟分化成負(fù)責(zé)髓鞘化的少突膠質(zhì)細(xì)胞。另外，MS損傷在其慢性期內(nèi)源性的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞表現(xiàn)出衰竭的現(xiàn)象，這是因?yàn)檫@些前體細(xì)胞的增殖和分化能力受到抑制(Wolswijk，1998)。在慢性MS損傷的環(huán)境中這些前體細(xì)胞一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，因此使其無法進(jìn)行髓鞘再生。因此慢性MS損傷可能包含阻止少突膠質(zhì)細(xì)胞再生的因子或缺乏刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞群增殖所必須的因子(Wolswijk，1998)。這一概念導(dǎo)致形成了一種假說，對(duì)MS的有效治療不應(yīng)僅僅限于抑制炎癥還應(yīng)該促進(jìn)髓鞘的再生。髓鞘再生細(xì)胞有各種來源，包括損傷中存活下來的少突膠質(zhì)細(xì)胞、來源于這些幸存者的細(xì)胞、或鄰近的前體細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞因子如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的誘導(dǎo)下可以從新分化和增殖，說明發(fā)生了脫髓鞘疾病后體內(nèi)依然存在使少突膠質(zhì)細(xì)胞鏈再生的機(jī)制(Grinspan等，1996；Grinspan等，1993)。
通過用神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子治療動(dòng)物模型的研究還發(fā)現(xiàn)了一些證據(jù)證明髓鞘再生對(duì)脫髓鞘疾病具有有益的效果。神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子2(神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/GGF-2)是一種已知的能促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖和存活的中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)因子，在MS的EAE鼠模型中它可以延遲疾病的起始，緩解臨床癥狀以及降低疾病發(fā)作的頻率(Marchionni等，1999)。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是由軸突產(chǎn)生的，具有促進(jìn)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞存活的功能(Fernandez等，2000)。
其它生長(zhǎng)因子如血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1在EAE模型中也被證實(shí)具有促軍髓鞘再生的功能以及具有治療作用(綜述見Dubois-Dalcq和Murray，2000)。通過誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞鏈上細(xì)胞的增殖和/或分化從而成功地刺激了髓鞘的再生，說明以髓鞘再生作為MS的治療策略還是具有良好前景的。另外確定抑制髓磷脂合成的分子也是非常重要的，因?yàn)檫@些分子可能會(huì)降低修復(fù)策略如MS的少突膠質(zhì)細(xì)胞移植的效果。
髓鞘再生策略可以抗炎癥策略一起使用以修復(fù)損傷和保護(hù)軸突以免斷裂和死亡。
少突膠質(zhì)細(xì)胞可以被誘導(dǎo)使中樞神經(jīng)軸突束從新髓鞘化，因此可以改善病癥。促進(jìn)髓鞘再生可以抵消如上面所述的免疫細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)組織攻擊髓鞘而導(dǎo)致的損傷。
利用檢測(cè)不同基因表達(dá)的芯片已經(jīng)分析了少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化以及多發(fā)性硬化癥(DGE，Scarlato等，2000；Whitney等，1999)。這種芯片利用不同的微陣列技術(shù)分析不同族基因的表達(dá)。分化少突膠質(zhì)細(xì)胞和多發(fā)性硬化癥的基因表達(dá)分析表明髓磷脂特異性基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯的變化。另外，所分析的一些其它基因也出現(xiàn)表達(dá)的變化，其中許多都是已知的參與細(xì)胞活動(dòng)如細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞骨架的再造和膜運(yùn)輸?shù)幕?Scarlato等，2000)。
骨橋蛋白是一種高度磷酸化的唾液蛋白，是骨和牙齒礦化的細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分。OPN的特征是具有多聚天冬氨酸序列和介導(dǎo)羥磷灰石結(jié)合的Ser/Thr磷酸化位點(diǎn)，以及具有一個(gè)介導(dǎo)細(xì)胞黏附和信號(hào)傳導(dǎo)的高度保守的RGD基序。由于還沒有一個(gè)OPN敲除小鼠模型因此還無法確定骨橋蛋白在各種組織中的功能，最近的研究發(fā)現(xiàn)了一些新的有趣的現(xiàn)象可以使我們了解這個(gè)蛋白在各種生物學(xué)事件包括發(fā)育過程、創(chuàng)傷修復(fù)、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、骨吸收以及骨鈣化中功能的多樣性。骨橋蛋白通過幾個(gè)相互作用的信號(hào)通路中的多個(gè)受體刺激細(xì)胞的活動(dòng)，可以解釋這個(gè)蛋白功能的多樣性(Sodek等)。
骨橋蛋白在大鼠的脊索和三叉神經(jīng)系統(tǒng)的初級(jí)感覺神經(jīng)元中有表達(dá)，其中神經(jīng)元胞體和軸突上都有表達(dá)(Ichikawa等，2000)。
通過原位雜交發(fā)現(xiàn)成年人腦中有骨橋蛋白mRNA的表達(dá)。在嗅球和腦干的神經(jīng)元中都有表達(dá)，在腦干中發(fā)現(xiàn)mRNA表達(dá)于各種功能區(qū)包括運(yùn)動(dòng)相關(guān)區(qū)、感覺系統(tǒng)區(qū)以及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)區(qū)(Shin等，1999)。
另外的研究發(fā)現(xiàn)大鼠前腦一過性缺血模型中有骨橋蛋白mRNA的空間及瞬時(shí)表達(dá)。球形缺血后出現(xiàn)的OPN mRNA瞬時(shí)表達(dá)出現(xiàn)在紋狀體的時(shí)間比出現(xiàn)在海馬的時(shí)間要早。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞變得更活躍前在靠近側(cè)腦室的背內(nèi)側(cè)紋狀體和海馬下下托有OPN mRNA的表達(dá)。另外在齒狀門到CA3邊緣的區(qū)域也有表達(dá)(LeeMY，Shin SL，Choi YS，Kim EJ，Cha JH，Chun MH，Lee SB，Kim SY，Neurosci Lett1999年8月20日2712 81-4)。
骨橋蛋白也叫Eta-1。WO 00/63241描述了調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法，特別是利用Eta-1(早期T淋巴細(xì)胞活化因子-1)/骨橋蛋白調(diào)節(jié)I型免疫反應(yīng)的方法。骨橋蛋白調(diào)節(jié)子據(jù)說可用于治療感染、免疫失調(diào)和疾病、自身免疫疾病包括MS、各種免疫缺陷以及癌癥。骨橋蛋白的所有調(diào)節(jié)子在WO 00/63241中都有描述，這些調(diào)節(jié)子被用于治療自身免疫疾病，包括MS，這些調(diào)節(jié)子是骨橋蛋白/Eta-1的抑制劑，該專利說明書的V部分“本發(fā)明調(diào)節(jié)方法的臨床應(yīng)用”和D部分″自身免疫疾病″有詳細(xì)說明，見WO 00/63241的51-53頁(yè)。
干擾素是一類具有抗炎、抗病毒和抗增殖活性的細(xì)胞因子。根據(jù)其生物化學(xué)和免疫學(xué)特性天然人干擾素可以分為三類干擾素α(白細(xì)胞型)、干擾素β(成纖維細(xì)胞型)和干擾素γ(免疫型)。α干擾素現(xiàn)在在美國(guó)及其它國(guó)家已被批準(zhǔn)用于治療毛細(xì)胞白細(xì)胞、性病疣、卡波西肉瘤(一種惡性腫瘤，常見于獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)病人)和慢性非A、非B型肝炎。
干擾素還是肌體應(yīng)對(duì)病毒感染而產(chǎn)生的一種糖蛋白?？梢砸种撇《驹诒槐Ｗo(hù)細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。干擾素是有低分子量組成的蛋白質(zhì)，其作用是非特異性的，也就是說一種病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素可以有效對(duì)抗多種其它病毒的感染。但是干擾素也是種特異性的，也就是說一個(gè)物種產(chǎn)生的干擾素只能在同種或近似物種的細(xì)胞內(nèi)刺激產(chǎn)生抗病毒活性。干擾素是第一組被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤和抗病毒活性的細(xì)胞因子。
三類主要的干擾素被稱為干擾素α、干擾素β和干擾素γ。這些主要種類的劃分最初是根據(jù)其細(xì)胞來源(白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或T細(xì)胞)。但是現(xiàn)在越來越清楚地顯示一種細(xì)胞可以產(chǎn)生幾種類型的干擾素。因此白細(xì)胞干擾素現(xiàn)在被稱為干擾素α，成纖維細(xì)胞干擾素被稱為干擾素β，T細(xì)胞干擾素被稱為干擾素γ。干擾素還有第四種類型，淋巴漿細(xì)胞型干擾素，是由″Namalwa″細(xì)胞系產(chǎn)生的(來源于Burkitt淋巴瘤)，該細(xì)胞好像能產(chǎn)生白細(xì)胞型干擾素和成纖維細(xì)胞型干擾素的混合物。
據(jù)報(bào)道干擾素的一個(gè)活性單位被定義(有些武斷的)為能保護(hù)50％的細(xì)胞免受病毒損傷所需要的量。
每一類干擾素又包括幾種不同的亞類。干擾素β和干擾素γ是單基因產(chǎn)物。每一類之間的差別主要在于其糖基化的不同。
干擾素α包括的亞類最多，大約有15個(gè)。9號(hào)染色體上有一簇干擾素α基因，至少含有23個(gè)成員，其中25個(gè)是活動(dòng)的，可以被轉(zhuǎn)錄。成熟的干擾素α是沒有糖基化的。
干擾素α和干擾素β具有相同的長(zhǎng)度(165或166個(gè)氨基酸)及相同的生物學(xué)活性。干擾素γ含有146個(gè)氨基酸，與干擾素α和干擾素β的相似程度較低。只有干擾素γ能活化巨噬細(xì)胞或誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的成熟。效果上這些新型的治療藥物被稱為生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRMs)，因?yàn)樗麄冊(cè)谟袡C(jī)體對(duì)腫瘤的反應(yīng)過程中發(fā)揮效應(yīng)，通過免疫調(diào)節(jié)影響肌體對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別。
特別是人成纖維細(xì)胞型干擾素(干擾素β)具有抗病毒活性，能夠刺激天然殺傷細(xì)胞對(duì)抗惡性腫瘤細(xì)胞。它是一種由病毒和雙鏈RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的分子量大約為20000Da的多肽。根據(jù)成纖維細(xì)胞型干擾素基因的核苷酸序列，通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行克隆，Derynk等人(Derynk R等，1980)推算出該蛋白的完整氨基酸序列。它是166個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)。
Shepard等人(shepard H.M.等，1981)描述了一個(gè)在842位堿基突變的突變體(141位氨基酸由Cys變成Tyr)，該突變體的抗病毒活性消失，還描述了一個(gè)1119-1121位核苷酸缺失的突變克隆。
Mark等人(Mark D.F.等，1984)通過將469位的T替換成A插入了一個(gè)人工突變，使17位的氨基酸由Cys變成Ser。所得到的IFN-β的活性與天然IFN-β一樣，并且在-70℃條件下長(zhǎng)期儲(chǔ)存更穩(wěn)定。
Rebif(重組人干擾素β)是最新開發(fā)出的用于治療多發(fā)性硬化癥(MS)的一種干擾素，其治療效果顯著提高。Rebif是IFN-β1a，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中制備，與天然人干擾素基本一致。
IFN發(fā)揮作用的機(jī)制還不是完全清楚。但是在大多數(shù)情況下他們是通過影響某些特定基因的誘導(dǎo)與表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用的。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IFN能夠誘導(dǎo)或抑制大約20種基因產(chǎn)物。IFN-β在MS中可能通過三種途徑發(fā)揮作用
■調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能如活化、增殖或抑制細(xì)胞功能；■調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生下調(diào)炎癥前細(xì)胞因子的表達(dá)和上調(diào)抑制、抗炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)；■調(diào)節(jié)T細(xì)胞通過BBB(血腦屏障)遷移和滲入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
通過PRISMS研究確立了利用干擾素β-1a每周三次皮下注射治療發(fā)作/緩解型多發(fā)性硬化癥(RR-MS)的有效性。本研究表明干擾素β-1a對(duì)長(zhǎng)病程MS具有積極的療效，通過MRI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可以減少疾病的發(fā)作次數(shù)和發(fā)作的嚴(yán)重程度，并且可以減輕疾病的負(fù)擔(dān)和疾病的活動(dòng)(“干擾素β-1a治療發(fā)作/緩解型多發(fā)性硬化癥的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照研究”(Randomised，Double-Blind，Placebo-Controlled Studyof Interferon beta-la in Relapsing-remitting Multiple Sclerosis))，TheLancet 1998；352(11月7日，1998)1498-1504.)。
本文對(duì)任何文獻(xiàn)的引用都不代表承認(rèn)該文獻(xiàn)在本領(lǐng)域中是更重要的，也不是為了說明該申請(qǐng)書的權(quán)利要求的專利性。對(duì)任何文獻(xiàn)的內(nèi)容及日期的陳述都是基于申請(qǐng)人填寫時(shí)所提供的信息，并不表示承認(rèn)該陳述的正確性。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于提供一種治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的新方法。
本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)骨橋蛋白可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，因而促進(jìn)神經(jīng)的髓鞘化和再生。與本發(fā)明相一致的是還發(fā)祥骨橋蛋白在多發(fā)性硬化癥和周圍神經(jīng)病的動(dòng)物模型中有積極的治療效果。
因此，本發(fā)明涉及骨橋蛋白或其活性的激動(dòng)劑用于神經(jīng)疾病如創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、腦卒中、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病、神經(jīng)病以及神經(jīng)變性疾病的治療。
根據(jù)本發(fā)明的描述，骨橋蛋白還可以和干擾素聯(lián)合以治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病。利用核酸分子、含有骨橋蛋白基因的表達(dá)載體以及能表達(dá)骨橋蛋白的細(xì)胞治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明還提供含有骨橋蛋白和干擾素以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥用組合物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A顯示的是用直方圖描述的cuprizone治療后不同時(shí)間點(diǎn)上骨橋蛋白的表達(dá)水平，測(cè)量方法是用TaqMan分析。3/5w.Cup＝cuprizone治療3周或5周，5w.cup+1/3/6w.＝cuprizone治療5周然后cuprizone減少到三分之一或在6周后恢復(fù)。
圖1B顯示的是在小腦發(fā)育的不同階段用TaqMan檢測(cè)骨橋蛋白、MBP和PLP mRNA與對(duì)照C1水平相比所達(dá)到的調(diào)節(jié)倍數(shù)。C1至20＝出生后1到20天的小腦，CA＝成年小腦。
圖2用示意圖描述了骨橋蛋白的結(jié)構(gòu)和已知的亞型以及其C端和N端顯示的是結(jié)構(gòu)。
圖3描述了含骨橋蛋白編碼序列的質(zhì)粒Pac的示意圖。
圖4用直方圖說明了用cAMP處理少突膠質(zhì)細(xì)胞系oli-neu 6小時(shí)(1)，2天(2)，6天(3)或10天(4)后骨橋蛋白mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照相比上調(diào)的倍數(shù)。柱5和6描述了cuprizone實(shí)驗(yàn)的骨橋蛋白mRNA水平。(5)cuprizone治療3周，(6)cuprizone治療5周。
圖5是含有骨橋蛋白編碼序列的質(zhì)粒pDEST 12.2的示意圖。
圖6是含有骨橋蛋白編碼序列和熒光標(biāo)記物EGFP編碼序列的質(zhì)粒pDEST 12.2的示意圖。
圖7是含有帶HIS-tag的骨橋蛋白編碼序列的質(zhì)粒pDEST 12.2的示意圖。
圖8顯示的是胰島素饑餓及用桿狀病毒表達(dá)的骨橋蛋白(Baculo-OPN)或表達(dá)骨橋蛋白的HEK細(xì)胞(HEK-OPN)處理24小時(shí)后oli-neu細(xì)胞的增殖情況。所讀取的是活細(xì)胞染料Alamar藍(lán)所發(fā)出的熒光。
圖9顯示的是用表達(dá)骨橋蛋白的桿狀病毒(Baculo-OPN)或表達(dá)骨橋蛋白的HEK細(xì)胞(HEK-OPN)處理24小時(shí)后胰島素饑餓的oli-neu細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng)曲線。
圖10顯示的是胰島素饑餓及用桿狀病毒表達(dá)的全長(zhǎng)骨橋蛋白(Baculo-OPN)或骨橋蛋白的N端片段(N端BacOPN)處理后oli-neu細(xì)胞的增殖情況。
圖11顯示的是用100nM的桿狀病毒表達(dá)的骨橋蛋白處理混和皮質(zhì)培養(yǎng)物的MBP免疫組化結(jié)果。A＝對(duì)照；B＝OPN處理；C＝B的放大；D＝另一個(gè)視野的OPN處理混和皮質(zhì)培養(yǎng)物，此視野內(nèi)看不見軸突。
圖12顯示的是用ELISA方法檢測(cè)到的髓鞘化混和皮質(zhì)培養(yǎng)物內(nèi)的MBP蛋白增加情況，該培養(yǎng)物是用LIF和表達(dá)骨橋蛋白的桿狀病毒處理過的。
圖13顯示的是用不同劑量(10pM，10nM，100nM)的表達(dá)骨橋蛋白的大腸桿菌(OPN-E-coli)或桿狀病毒(OPN Bac)處理后的CG4細(xì)胞的增殖情況。
圖14顯示的是EAE小鼠脊索內(nèi)血管周圍的炎癥浸潤(rùn)情況，該小鼠皮下分別注射溶劑(PBS)，溶劑加0.1％BSA，1、10或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)加上20000U/每只鼠鼠干擾素β(mIFNβ)，或者單獨(dú)的20000U/每只鼠mIFNβ。
圖15顯示的是EAE小鼠脊索內(nèi)脫髓鞘面積的百分?jǐn)?shù)，該小鼠皮下分別注射溶劑(PBS)，溶劑加0.1％BSA，1、10或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)加上20000U/每只鼠鼠干擾素β(mIFNβ)，或者單獨(dú)的20000U/每只鼠mIFNβ。
圖16顯示的是治療結(jié)束后的臨床積分、EAE小鼠炎癥浸潤(rùn)以及脫髓鞘情況，該小鼠皮下分別注射溶劑(PBS)，溶劑加0.1％BSA，1、10或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)加上20000U/每只鼠鼠干擾素β(mIFNβ)，或者單獨(dú)的20000U/每只鼠mIFNβ。
圖17顯示的是通過壓迫坐骨神經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)病小鼠的體重，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽(yáng)性對(duì)照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖18顯示的是神經(jīng)病小鼠復(fù)合肌肉動(dòng)作潛勢(shì)的振幅，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽(yáng)性對(duì)照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖19顯示的是神經(jīng)病小鼠復(fù)合肌肉動(dòng)作潛勢(shì)的潛伏期，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽(yáng)性對(duì)照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖20顯示的是神經(jīng)病小鼠復(fù)合肌肉動(dòng)作潛勢(shì)的持續(xù)時(shí)間，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽(yáng)性對(duì)照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖21顯示的是神經(jīng)病小鼠內(nèi)變性纖維的百分?jǐn)?shù)，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽(yáng)性對(duì)照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖22顯示的是神經(jīng)病小鼠內(nèi)每個(gè)區(qū)域內(nèi)神經(jīng)纖維的總數(shù)，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽(yáng)性對(duì)照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的基礎(chǔ)在于發(fā)現(xiàn)在少突膠質(zhì)細(xì)胞分化及小腦發(fā)育過程中骨橋蛋白表達(dá)是不同的這一現(xiàn)象。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)在少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入骨橋蛋白的cDNA使其表達(dá)可以導(dǎo)致這些細(xì)胞在體外呈現(xiàn)出不同的表型。只要有骨橋蛋白的表達(dá)，少突膠質(zhì)細(xì)胞就會(huì)呈現(xiàn)出與分化的髓鞘形成細(xì)胞相同的表型。除此以外還發(fā)現(xiàn)在體外骨橋蛋白，尤其是骨橋蛋白與干擾素聯(lián)合使用時(shí)對(duì)已知的多發(fā)性硬化癥模型具有有益的效果。在一個(gè)周圍神經(jīng)病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，骨橋蛋白?duì)神經(jīng)活性具有顯著的療效，可以明顯降低變性的百分率，增加髓鞘化的程度。
因此本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了一種新的治療神經(jīng)疾病的可能性，特別是對(duì)于那些與神經(jīng)及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能相關(guān)的疾病。這些發(fā)現(xiàn)是十分令人驚奇的，因?yàn)閃O00/63241是通過抑制骨橋蛋白來治療多發(fā)性硬化癥的。
因此本發(fā)明涉及利用骨橋蛋白或骨橋蛋白活性激動(dòng)劑來制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病藥物的方法。
本文中的術(shù)語(yǔ)“骨橋蛋白”是指全長(zhǎng)人骨橋蛋白，含有已知的從后80個(gè)氨基酸開始的氨基酸序列(Oldberg等，1986；Kiefer等，1989)。人骨橋蛋白的序列在本文中用附加序列表中的SEQ ID NO1表示。本文中的術(shù)語(yǔ)“骨橋蛋白”還表示任何動(dòng)物來源的骨橋蛋白，如鼠、牛或大鼠骨橋蛋白，只要其序列足以維持其骨橋蛋白活性，以及得到的分子在人體內(nèi)無免疫原性。
本文中的術(shù)語(yǔ)“骨橋蛋白”還表示具有生物活性的突變蛋白及蛋白片段，如骨橋蛋白的天然亞型。骨橋蛋白通過在轉(zhuǎn)錄水平(選擇性剪接)及翻譯后修飾(磷酸化，糖基化)可以表達(dá)出具有不同功能的形式?，F(xiàn)在已知有三個(gè)剪接突變體，分別命名位OPN-a(本文也稱為“全長(zhǎng)”骨橋蛋白)、OPN-b和OPN-c(附加序列表中的SEQ IDNO1，2和3，在圖2中也有描述)。Kon等人(2000)描述了其亞型，Saitoh等(1995)和Kon等(2002)描述了亞型的特征。
凝血酶在體內(nèi)可以將骨橋蛋白裂解為含有N端部分和C端部分的蛋白片段。骨橋蛋白，特別是其C端部分的磷酸化對(duì)于骨橋蛋白的功能維持是十分重要的。因此本文所用的術(shù)語(yǔ)“骨橋蛋白”也包含那些蛋白裂解片段及具有不同磷酸化的形式。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“骨橋蛋白”還包括亞型、突變蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)、功能衍生物、活性部分或片段、或者環(huán)行排列的衍生物及其鹽。這些亞型、突變蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)、功能衍生物、活性部分或片段、或者環(huán)行排列的衍生物保持了骨橋蛋白的生物學(xué)活性。較好的是其生物學(xué)活性與野生型的骨橋蛋白一樣。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“骨橋蛋白活性激動(dòng)劑”是指能刺激或模仿骨橋蛋白活性的分子，如骨橋蛋白受體的拮抗性抗體，或能通過骨橋蛋白受體激活信號(hào)的小分子激動(dòng)劑。骨橋蛋白通過兩類抗體介導(dǎo)其功能。首先它通過RGD(Arg-Gly-Asp)細(xì)胞附著基序在錳的正信號(hào)影響下與αv-整合素(αvβ3和αvβ5整合素)受體相互作用(Kunicki等，1997)。其次，它與CD44變異體亞型v6-v10相互作用。骨橋蛋白的C端部分被認(rèn)為是參與和CD44相互作用的部分，而其N端部分被認(rèn)為是參與和整合素受體相互作用以及參與巨噬細(xì)胞的增殖、存活和分化的部分。骨橋蛋白的N端部分也可以誘導(dǎo)IL-12和IL-10的釋放。這些受體的任何激動(dòng)劑、刺激因子或增強(qiáng)因子都包括在本文所用術(shù)語(yǔ)“OPN活性激動(dòng)劑”的范圍之內(nèi)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“骨橋蛋白活性激動(dòng)劑”還指能增強(qiáng)骨橋蛋白所介導(dǎo)活性的因子，如促進(jìn)細(xì)胞黏附到細(xì)胞外基質(zhì)上，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞鏈上的細(xì)胞分化成髓磷脂生成細(xì)胞，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞鏈上細(xì)胞(如祖細(xì)胞或前體細(xì)胞)的充實(shí)、增殖、分化或成熟，阻止少突膠質(zhì)細(xì)胞鏈上的細(xì)胞調(diào)亡或受損。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”和“預(yù)防”應(yīng)該被理解為阻止、抑制、減輕、改善或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)疾病的一種或多種癥狀或病因，或者神經(jīng)疾病所導(dǎo)致的癥狀、疾病或并發(fā)癥。當(dāng)治療神經(jīng)疾病時(shí)，在疾病開始后給予本發(fā)明的物質(zhì)，而預(yù)防是指在病人出現(xiàn)癥狀前給予本發(fā)明的物質(zhì)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)疾病”包括所有已知的神經(jīng)疾病或神經(jīng)障礙，或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，包括本發(fā)明背景部分所詳細(xì)描述的那些疾病。
神經(jīng)疾病包括與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙有關(guān)的疾病，如與神經(jīng)傳導(dǎo)有關(guān)的疾病、頭疼、頭部創(chuàng)傷、CNS感染、神經(jīng)-眼科及顱神經(jīng)病癥、腦葉的運(yùn)動(dòng)功能障礙、木僵和昏迷、脫髓鞘疾病、譫語(yǔ)和癡呆、顱頸接合異常、癲癇、脊索障礙、睡眠障礙、周圍神經(jīng)系統(tǒng)障礙、腦血管疾病或肌肉疾病。這些疾病的定義參加網(wǎng)址http//www.merck.com/pubs/mmanual/section14/sec14.htm本發(fā)明的神經(jīng)疾病優(yōu)選自下列疾病創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、腦卒中、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病以及神經(jīng)變性疾病。
創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷可以涉及外周神經(jīng)系統(tǒng)，也可以涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以是腦或脊索的創(chuàng)傷，包括本發(fā)明背景部分所描述的截癱。
腦卒中是由腦缺氧或缺血引起的。也叫腦血管病或腦血管意外。腦卒中可能會(huì)由于腦內(nèi)某些區(qū)域血液供應(yīng)不足而導(dǎo)致腦功能喪失。腦血液供應(yīng)不足可以是由腦內(nèi)形成的血栓(腦血栓)、或其它部位形成的運(yùn)行到腦部的動(dòng)脈粥樣斑塊或其它物質(zhì)(血栓)引起的。腦內(nèi)出血(腦出血)可能會(huì)導(dǎo)致與腦卒中相似的癥狀。腦卒中最常見的原因是動(dòng)脈粥樣硬化引起的腦卒中(腦血栓形成)，因此本發(fā)明也涉及動(dòng)脈粥樣硬化的治療。
周圍神經(jīng)病可能會(huì)導(dǎo)致感覺喪失、肌無力和萎縮、深度腱反射減弱以及血管舒張癥狀的一種或多種。神經(jīng)病可能影響單個(gè)神經(jīng)(單一精神病變)、不同區(qū)域的兩個(gè)或多個(gè)神經(jīng)(多發(fā)性單一精神病變)或多個(gè)神經(jīng)同時(shí)受影響(多神經(jīng)病)。受影響的可能主要是軸突(如糖尿病，萊姆病，或尿毒癥及其它毒性藥物導(dǎo)致的損傷)，或者是髓鞘或施萬(wàn)細(xì)胞(如急性或慢性炎癥性多神經(jīng)病，腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，或格-巴綜合征)。按照本發(fā)明的方法還可以治療由下列原因引起的神經(jīng)病鉛中毒、氨苯砜的使用、蜱咬、卟啉病或格-巴綜合征，這些疾病可能主要影響運(yùn)動(dòng)纖維。其它的如由腫瘤的背根神經(jīng)節(jié)炎、麻風(fēng)病、AIDS、糖尿病或慢性維生素B6中毒引起的疾病可能主要影響背根神經(jīng)節(jié)或感覺神經(jīng)纖維，導(dǎo)致感覺障礙。腦神經(jīng)也可能被影響，如格-巴綜合征、萊姆病、糖尿病和白喉。
阿爾茨海默病是一種由腦組織改變而引起的心里功能衰退障礙。其中包括腦組織萎縮、初級(jí)變性性癡呆及彌散性腦萎縮。阿爾茨海默病也叫老年癡呆/阿爾茨海默型(SDAT)。
帕金森病是一種腦病，其特征是搖擺及行走、運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)困難。該病與控制肌肉運(yùn)動(dòng)的腦組織受損有關(guān)。也叫震顫麻痹或震顫性麻痹。
亨庭頓舞蹈病是一種遺傳性常染色體顯性神經(jīng)疾病。
肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)是一種由神經(jīng)對(duì)隨意運(yùn)動(dòng)肌肉的控制進(jìn)行性喪失所引起的，其主要原因是腦和脊索的神經(jīng)細(xì)胞受到破壞。肌萎縮性側(cè)索硬化癥也叫Lou Gehrig病，是一種包括使用及控制肌肉功能喪失的疾病。
多發(fā)性硬化癥(MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性脫髓鞘疾病，具有發(fā)作/緩解或進(jìn)行性疾病過程。MS不僅僅是一種脫髓鞘疾病，其在外周神經(jīng)系統(tǒng)中所對(duì)應(yīng)的是慢性炎癥性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病(CIDP)。另外，還有急性單相病變，如外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病也叫做格-巴綜合征(GBS)，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性散播性腦脊髓炎(ADEM)。
其它的神經(jīng)疾病還有異常髓鞘化引起的神經(jīng)病如上面發(fā)明背景中所列出的那種，以及腕管綜合征。脊柱矯形并發(fā)癥可能會(huì)伴有創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷，這些損傷也在本發(fā)明所包括的范圍之內(nèi)。
神經(jīng)疾病還可以是由先天性代謝障礙引起的。因此本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式就描述了這種由先天性代謝缺損引起的神經(jīng)疾病。
本發(fā)明所包括的先天性代謝障礙可以是苯丙酮尿癥和其它氨基酸尿癥、泰-薩病、尼-皮病和高歇?。缓鸂柪站C合征；克拉伯病和其它腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。這些疾病可以影響髓鞘的發(fā)育，主要是影響CNS的髓鞘發(fā)育。
先天性代謝障礙引起的神經(jīng)疾病已在發(fā)明背景中作了詳細(xì)描述。
那些不太被人熟知的神經(jīng)疾病也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，如神經(jīng)纖維瘤病或多系統(tǒng)萎縮(MSA)。其它的一些疾病也可以根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療，這些疾病已在發(fā)明背景中作了詳細(xì)描述。
在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中神經(jīng)疾病是指周圍神經(jīng)病，最優(yōu)選的是糖尿病性神經(jīng)病。與化療相關(guān)的神經(jīng)病也是本發(fā)明所優(yōu)選的。
術(shù)語(yǔ)“糖尿病性神經(jīng)病”是指糖尿病性神經(jīng)病的任何形式，或者指糖尿病性神經(jīng)病伴隨的或由其引起的一種或多種癥狀或障礙，或者指上述發(fā)明背景所詳細(xì)描述的影響神經(jīng)的糖尿病并發(fā)癥。在糖尿病性多神經(jīng)病中，許多神經(jīng)同時(shí)受損。糖尿病性神經(jīng)病也可以是單一精神病變。例如在局部單一精神病變中疾病只累及單個(gè)神經(jīng)，如動(dòng)眼神經(jīng)或外展腦神經(jīng)。如果是不同區(qū)域的兩個(gè)或多個(gè)神經(jīng)受損也可以是多發(fā)性單一精神病變。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，神經(jīng)疾病是指脫髓鞘疾病。優(yōu)選的脫髓鞘疾病包括CNS的脫髓鞘疾病，如急性散播性腦脊髓炎(ADEM)和多發(fā)性硬化癥(MS)，也包括周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病。后者有慢性炎癥性脫髓鞘疾病多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病(CIDP)及急性單相疾病如炎癥性脫髓鞘疾病多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病也叫格-巴綜合征(GBS)。
本發(fā)明還有一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及神經(jīng)變性疾病的治療和/或預(yù)防。神經(jīng)變性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病、亨庭頓舞蹈病和ALS。
優(yōu)選的骨橋蛋白選自下列肽、多肽或蛋白(a)含有SEQ ID NO1的多肽；(b)含有SEQ ID NO1的1到168或1到170氨基酸的多肽；(c)含有SEQ ID NO1的1到16和170到314氨基酸的多肽；(d)含有SEQ ID NO1的170到314氨基酸的多肽；(e)含有SEQ ID NO2的多肽；(f)含有SEQ ID NO3的多肽；(g)(a)到(f)的任何一個(gè)突變體，其中的氨基酸序列與(a)到(f)中至少一個(gè)序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；(h)(a)到(f)的任何一個(gè)突變體，該突變體是由在溫和條件或嚴(yán)格條件下能與編碼(a)到(f)任何一個(gè)突變體的天然DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼的；(i)(a)到(f)的任何一個(gè)突變體，其中，所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)任何一個(gè)突變體的氨基酸；(j)(a)到(f)任何一個(gè)突變體的鹽或亞型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或環(huán)形排列的衍生物。
活性部分或片段可以指任何一個(gè)骨橋蛋白亞型的任一部分或區(qū)域，如N端部分或C端部分、以及如圖2所顯示的OPN-a、OPN-b或OPN-c的任何一個(gè)。GRGDS基序可以存在、可以缺失或突變?？梢詫⒏嗡亟Y(jié)合位點(diǎn)突變以使骨橋蛋白無法與肝素結(jié)合。而且全長(zhǎng)骨橋蛋白或任一活性片段都可以在下列絲氨酸殘基上有一個(gè)或多個(gè)被磷酸化8，10，11，33，46，47，60，62，65，83，86，89，92，101，104，107，110，113，153，155，175，179，199，203，208，212，218，223，227，238，242，247，251，254，259，264，275，287，292，294，295。另外，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)可以從絲氨酸突變成谷氨酸以模擬磷酸化。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員優(yōu)選即使是骨橋蛋白的一小部分也能足以維持其功能的分子，如含有維持骨橋蛋白基本功能所需的必須氨基酸殘基的活性肽。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還優(yōu)選與骨橋蛋白活性一樣、甚至更好的骨橋蛋白的突變蛋白質(zhì)、鹽、亞型、融合蛋白質(zhì)、功能衍生物、活性部分或片段、或者環(huán)行排列的衍生物。骨橋蛋白及其突變蛋白質(zhì)、亞型、融合蛋白質(zhì)、功能衍生物、活性部分或片段、或者環(huán)行排列的衍生物的活性可以用共培養(yǎng)分析檢測(cè)，如實(shí)施例8所描述的檢測(cè)方法。含有少突膠質(zhì)細(xì)胞和其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)源細(xì)胞(如神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞)的混和皮質(zhì)培養(yǎng)物與OPN或其突變體、亞型、片段、活性部分、功能衍生物及其鹽共孵育后可以上調(diào)典型髓鞘化基因的表達(dá)，如P0、MBP或MAG?；虻谋磉_(dá)可以通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR(TagManRT-PCR)檢測(cè)，該方法在下面的實(shí)施例中有詳細(xì)解釋。還有一種簡(jiǎn)單的分析OPN活性的方法是少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖試驗(yàn)，該方法是將適當(dāng)?shù)纳偻荒z質(zhì)細(xì)胞株如oli-neu或CG4細(xì)胞與OPN或其突變體、亞型、片段、活性部分、功能衍生物及其鹽共孵育，詳細(xì)描述見下面的實(shí)施例7。
優(yōu)選的活性片段是具有和全長(zhǎng)骨橋蛋白一樣或更好活性的片段，或者還有其它的優(yōu)點(diǎn)，如更好的穩(wěn)定性或更低的毒性或免疫原形，或者易于大量制備，或易于純化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員優(yōu)選那些能通過插入到適當(dāng)載體中的相應(yīng)cDNA克隆技術(shù)制備的并且能用上述共培養(yǎng)分析方法檢測(cè)的骨橋蛋白的突變體、活性片段及功能衍生物。
本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)可以是糖基化的，也可以是非糖基化的，可以來自天然資源如體液，也可以通過重組制備。重組表達(dá)可以在原核表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌中進(jìn)行，也可以在真核表達(dá)系統(tǒng)如昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行，優(yōu)選哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，如CHO細(xì)胞或HEK細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“突變體”是指骨橋蛋白的類似物，其中天然骨橋蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基替代，或者缺失，或者將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基添加到骨橋蛋白的天然序列上，但與野生型的骨橋蛋白相比其活性無明顯改變。這些突變體可以通過已知的合成技術(shù)和/或位點(diǎn)突變技術(shù)，或者其它任何已知的合適技術(shù)制備。
按照本發(fā)明的方法能夠使用的骨橋蛋白突變體或編碼這些突變體的核酸包括一組有限的實(shí)質(zhì)一致的序列作為替代多肽或多聚核苷酸，這些多肽或多聚核苷酸可以按照本文所提供的指導(dǎo)不需過度的實(shí)驗(yàn)通過本領(lǐng)域的任一普通技術(shù)制備。
本發(fā)明的突變體包括核酸如DNA或RNA編碼的蛋白質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明這些核酸在溫和的或嚴(yán)格的條件下能與編碼OPN的DNA或RNA雜交。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指雜交和隨后的洗滌條件，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常將這些田間稱為“嚴(yán)格的”。見Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3and 6.4(1987，1992)，和Sambrook等(Sambrook，J.C.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
嚴(yán)格的條件包括而不限于洗滌條件雜交Tm計(jì)算值下12-20℃，2×SSC和0.5％SDS洗滌5分鐘，2×SSC和0.1％SDS洗滌15分鐘；0.1×SSC和0.5％SDS 37℃洗滌30-60分鐘，然后用0.1×SSC和0.5％SDS 68℃洗滌30-60分鐘。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所謂的嚴(yán)格條件也要考慮DNA序列、寡核苷酸探針(如10-40個(gè)堿基)或混和寡核苷酸探針的長(zhǎng)度。如果用混和探針，優(yōu)選用四甲基氯化銨(TMAC)代替SSC。見Ausubel，同上。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，任何一個(gè)這種突變體與附加序列表的序列SEQ IDNO1、2或3至少都有40％的一致性或同源性。更好的是至少有50％、60％、70％、80％的一致性或同源性，最好的是有90％的一致性或同源性。
通過比較確定的一致性反映了兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或多聚核苷酸序列之間的關(guān)。一般來說一致性是指在所比較的序列長(zhǎng)度上兩個(gè)多聚核苷酸的核苷酸對(duì)核苷酸的精確性，或兩個(gè)多肽序列的氨基酸對(duì)氨基酸的精確性。
對(duì)于不是精確一致的序列來說可以確定其“％一致性”。通常情況下將所要比較的兩個(gè)序列排列在一起來得出兩個(gè)序列之間的最大相關(guān)性?？梢酝ㄟ^在一個(gè)或兩個(gè)序列上插入“空格”來增加排列的整齊程度。％一致性可以在所比較的每一序列的全長(zhǎng)上確定(所謂的通用排列)，這種排列方法特別適于長(zhǎng)度一致或很接近的序列，或者在較短的特定的長(zhǎng)度上確定(所謂的局部排列)，這種排列方法比較適于長(zhǎng)度不同的序列。
比較兩個(gè)或多個(gè)序列一致性和同源性的方法是本領(lǐng)域所熟知的。因此Wisconsin序列分析軟件包，9.1版(Devereux J等，1984)中的程序如BESTFIT和GAP可用于確定兩個(gè)多聚核苷酸的％一致性和兩個(gè)多肽序列的％一致性及％同源性。BESTFIT利用的是Smith和Waterman(1981)的“局部同源性”算法，找出兩個(gè)序列之間的最簡(jiǎn)單區(qū)域的相似性。其它確定序列一致性和/或相似性的程序也是本領(lǐng)域所熟知的，如BLAST家族的程序(Altschul S F等，1990，Altschul S F等，1997，可以通過NCBI的主頁(yè)查到，網(wǎng)址是www.ncbi.nlm.nih.gov)和FASTA(PearsonW R 1990Pearson 1988)。
根據(jù)本發(fā)明突變體優(yōu)選的變化是已知的“保守替代”。骨橋蛋白多肽的保守氨基酸取代可以包括同組氨基酸內(nèi)的同義氨基酸取代，同組氨基酸內(nèi)的氨基酸具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，其成員之間的替代可以保持分子的生物學(xué)功能(Grantham，1974)。現(xiàn)在已經(jīng)清楚氨基酸的插入和缺失也可以在預(yù)先確定的序列上進(jìn)行而不改變蛋白質(zhì)的功能，特別是插入或缺失的只是少量氨基酸，如30個(gè)以內(nèi)，優(yōu)選10個(gè)以內(nèi)，以及不刪除或替換維持功能的關(guān)鍵氨基酸，如半胱氨酸殘基。通過這種缺失和/或插入得到的蛋白質(zhì)和突變體也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
優(yōu)選的同義氨基酸組是表I所列的那些氨基酸。更優(yōu)選的是表II所列的那些氨基酸；最優(yōu)選的是表III所列的那些氨基酸。
表I優(yōu)選的氨基酸組氨基酸 同義氨基酸組SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，HisLeuIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，Cys His Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGln，Asp，Ser，Asn
LysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表II更優(yōu)選的氨基酸組氨基酸同義氨基酸組Ser SerArg His，Lys，ArgLeu Leu，Ile，Phe，MetPro Ala，ProThr ThrAla Pro，AlaVal Val，Met，IleGly GlyIle Ile，Met，Phe，Val，LeuPhe Met，Tyr，Ile，Leu，PheTyr Phe，TyrCys Cys，SerHis His，Gln，ArgGln Glu，Gln，HisAsn Asp，AsnLys Lys，ArgAsp Asp，AsnGlu Glu，GlnMet Met，Phe，Ile，Val，LeuTrp Trp表3最優(yōu)選的氨基酸組氨基酸同義氨基酸組Ser Ser
ArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValValGlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet在蛋白質(zhì)上進(jìn)行氨基酸替換以獲得用于本發(fā)明的骨橋蛋白突變體、多肽或蛋白質(zhì)可以通過任何已知的方法步驟，如Mark等人的美國(guó)專利4,959,314、4,588,585和4,737,462號(hào)；Koths等人的5,116,943號(hào)；Namen等人的4,965,195號(hào)；Chong等人的4,879,111號(hào)和Lee等人的5,017,691號(hào)；以及美國(guó)專利4,904,584號(hào)中所描述的賴氨酸替代蛋白質(zhì)(Shaw等)。
術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”是指由骨橋蛋白或其突變體及片段和其它蛋白融合而成的多肽，這種融合蛋白在體液內(nèi)的滯留期延長(zhǎng)。因此骨橋蛋白可與其它蛋白質(zhì)、多肽及其類似物質(zhì)如免疫球蛋白或其片段融合。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“功能衍生物”涵蓋骨橋蛋白及其突變體和融合蛋白的衍生物，這些衍生物可以用本領(lǐng)域的已知技術(shù)通過改變殘基的側(cè)鏈上的功能基團(tuán)或N末端及C末端基團(tuán)來制備，只要其保留藥用特性，即不破壞蛋白質(zhì)的活性，其活性與骨橋蛋白實(shí)質(zhì)上一致，并且不會(huì)導(dǎo)致含有該衍生物的組合物出現(xiàn)毒性就可以包括在本發(fā)明中。
例如，這些衍生物可以包括能遮蔽抗原位點(diǎn)并且能延長(zhǎng)骨橋蛋白在體內(nèi)治滯留期的聚乙二醇側(cè)。其它衍生物包括羧基的脂肪酯，通過與氨或者初級(jí)胺或次級(jí)胺反應(yīng)形成的羧基的酰胺，氨基酸殘基的游離氨基與?；?烷基或環(huán)碳芳基)形成的N?；苌?，以及游離羥基(如絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基)與酰基形成的O?；苌?。
本發(fā)明所述的骨橋蛋白及其突變體和融合蛋白的“活性片段”涵蓋蛋白分子或者蛋白分子與其相連的分子或殘基如糖鏈或磷酸基的多肽鏈的任何片段或前體，或者蛋白分子或糖鏈自身的聚集物，所述片段的活性與骨橋蛋白實(shí)質(zhì)上是一樣的。
本文的術(shù)語(yǔ)“鹽”是指羧基鹽和OPN分子及其類似物的氨基酸加成鹽。羧基鹽可以通過本領(lǐng)域已知的方式形成，包括有機(jī)鹽如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽，以及類似的鹽，有機(jī)堿鹽如與氨(如三乙醇胺，精氨酸或賴氨酸，哌啶，普如卡因及類似物質(zhì))形成的鹽。酸加成鹽包括與礦酸如鹽酸或硫酸形成的鹽，與有機(jī)酸如醋酸或草酸形成的鹽。當(dāng)然，所有這些鹽都必須保持本發(fā)明所需要的OPN的生物學(xué)活性，即刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，骨橋蛋白與載體分子、肽或蛋白融合以促進(jìn)其穿過血腦屏障(“BBB”)。這樣可以是這些分子具有正確的靶向作用以到達(dá)病人體內(nèi)的作用位點(diǎn)，這些病人所患疾病包括CNS的損傷。因?yàn)樗幬镄枰ㄟ^血腦屏障，因此給藥方式要求能透過血腦屏障，通過滲透的方式或用一些具有血管作用的物質(zhì)如緩激肽通過生物化學(xué)方式透過。通過血腦屏障的其它策略可以利用內(nèi)源性的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，包括載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)子，如葡萄糖載體和氨基酸載體；胰島素或運(yùn)鐵蛋白的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用；以及活性射流轉(zhuǎn)運(yùn)子如p-糖蛋白。通過BBB的藥物運(yùn)輸策略還包括腦內(nèi)植入。
骨橋蛋白的衍生物可以共價(jià)連接到多聚物上以改善蛋白的特性，如穩(wěn)定性、半衰期、生物利用度、人體的耐受性或免疫原性。為了達(dá)到這一目的，骨橋蛋白可以連接到聚乙二醇(PEG)上。PEG化可以通過已知的方法進(jìn)行，如WO 92/13095所描述的方法。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，骨橋蛋白是PEG化的。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，融合蛋白是一個(gè)免疫球蛋白融合子。融合可以是直接的，也可以同一個(gè)短連接肽，可以短到1至3個(gè)氨基酸殘基或更長(zhǎng)，例如13個(gè)氨基酸殘基。所謂的連接物是位于骨橋蛋白序列與免疫球蛋白序列之間的具有E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或者是含有Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13氨基酸連接序列。所得到的融合蛋白特性得以改善，如在體液中的滯留期延長(zhǎng)，特異性增高、表達(dá)水平升高等。免疫球蛋白融合子還有利于融合蛋白的純化。
在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，骨橋蛋白與免疫球蛋白的恒定區(qū)融合。優(yōu)選與重鏈區(qū)如人IgG1的CH2和CH3區(qū)融合。免疫球蛋白分子的其它亞型也適于按照本發(fā)明的方法制備融合蛋白，如IgG2或IgG4亞型，以及其它類的免疫球蛋白如IgM。融合蛋白可以是單體，也可以是多聚體，可以是異源多聚體，也可以是同源多聚體。融合蛋白中的免疫球蛋白部分可以進(jìn)一步修飾以避免激活補(bǔ)體結(jié)合或補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，或者結(jié)合到Fc受體上。
本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用骨橋蛋白和免疫抑制劑制造治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物，二者可以連續(xù)使用，也可以分別使用。免疫抑制劑可以是類固醇、氨甲蝶呤、環(huán)磷酰胺、抗白細(xì)胞抗體(如CAMPATH-1)以及類似藥物。
本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用骨橋蛋白和干擾素制造治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物，二者可以連續(xù)使用，也可以分別使用。
本專利申請(qǐng)書中所用的術(shù)語(yǔ)“干擾素”包括文獻(xiàn)中所定義為干擾素的任何分子，例如包括上述“發(fā)明背景”部分所提到的任何種類的IFN。優(yōu)選的是人源干擾素，但其它物種來源的干擾素也可以，只要其生物學(xué)活性與人源干擾素一樣，并且在人體內(nèi)沒有免疫原性。
特別是IFN-α、IFN-β和IFN-γ都包括在上述定義中。其中IFN-β是本發(fā)明優(yōu)選的干擾素。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“干擾素β(IFN-β)”指人成纖維細(xì)胞干擾素，通過從生物液體分離得到或通過DNA重組技術(shù)從原核或真核宿主細(xì)胞中獲得，也指干擾素的鹽、功能衍生物、突變體、類似物和片段。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“功能衍生物”涵蓋用本領(lǐng)域的已知技術(shù)通過改變殘基側(cè)鏈上的功能基團(tuán)或N末端及C末端基團(tuán)來制備的衍生物，只要其保留藥用特性，即不破壞如上所述的蛋白質(zhì)的活性，如與相應(yīng)受體的結(jié)合能力和啟動(dòng)受體信號(hào)的能力，不會(huì)導(dǎo)致含有該衍生物的組合物出現(xiàn)毒性就可以包括在本發(fā)明中。衍生物可以有化學(xué)基團(tuán)，如糖鏈或磷酸基，只要該衍生物保持蛋白的生物學(xué)活性并且可以作藥用。
例如，這些衍生物可以包括能遮蔽抗原位點(diǎn)并且能延長(zhǎng)骨橋蛋白在體內(nèi)治滯留期的聚乙二醇側(cè)。其它衍生物包括羧基的脂肪酯，通過與氨或者初級(jí)胺或次級(jí)胺反應(yīng)形成的羧基的酰胺，氨基酸殘基的游離氨基與?；?烷基或環(huán)碳芳基)形成的N?；苌铮约坝坞x羥基(如絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基)與?；纬傻腛?；苌?。這種衍生物也可以含有能遮蔽抗原位點(diǎn)的聚乙二醇側(cè)鏈以延長(zhǎng)其在體液內(nèi)的滯留期。
那些能在體內(nèi)滯留較長(zhǎng)時(shí)間的衍生蛋白或與復(fù)合藥物結(jié)合的蛋白是特別重要的。例如上面所提到的PEG化的衍生物，或在體內(nèi)能長(zhǎng)期保持活性的基因工程蛋白都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。
術(shù)語(yǔ)“衍生物”只包括那些20種常見天然氨基酸不發(fā)生改變的衍生物。
本文的術(shù)語(yǔ)“鹽”既指羧基鹽也指上述蛋白質(zhì)或其類似物氨基的酸加成鹽。羧基鹽可以通過本領(lǐng)域已知的方式形成，包括有機(jī)鹽如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽，以及類似的鹽，有機(jī)堿鹽如與氨(如三乙醇胺，精氨酸或賴氨酸，哌啶，普如卡因及類似物質(zhì))形成的鹽。酸加成鹽包括與礦酸如鹽酸或硫酸形成的鹽，與有機(jī)酸如醋酸或草酸形成的鹽。當(dāng)然，所有這些鹽都必須保持本發(fā)明所需要的蛋白質(zhì)(骨橋蛋白和IFN-β)的生物學(xué)活性，如與相應(yīng)受體結(jié)合的能力及啟動(dòng)受體信號(hào)的能力。
干擾素也可以被連接到多聚物上以增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。IFN-β和聚乙二醇(PEG)的連接在WO99/55377中已有描述。
本發(fā)明另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，干擾素是干擾素β(IFN-β)，更優(yōu)選的是IFN-β1a。
骨橋蛋白優(yōu)選與干擾素同時(shí)、連續(xù)或分別使用。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，干擾素的用量大約為每千克體重0.0001-100毫克、每千克體重0.01-10毫克、每千克體重1-5毫克、或每千克體重2毫克。
本發(fā)明還涉及利用核酸分子制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物，其中核酸分子含有的核酸序列能編碼具有如下氨基酸序列之一的多肽(a)含有SEQ ID NO1的多肽；(b)含有SEQ ID NO1的1到168或1到170氨基酸的多肽；(c)含有SEQ ID NO1的1到16和170到314氨基酸的多肽；(d)含有SEQ ID NO1的170到314氨基酸的多肽；(e)含有SEQ ID NO2的多肽；(f)含有SEQ ID NO3的多肽；(g)(a)到(f)的任何一個(gè)突變體，其中的氨基酸序列與(a)到(f)中至少一個(gè)序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；(h)(a)到(f)的任何一個(gè)突變體，該突變體是由在溫和條件或嚴(yán)格條件下能與編碼(a)到(f)任何一個(gè)突變體的天然DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼的；(i)(a)到(f)的任何一個(gè)突變體，其中，所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)任何一個(gè)突變體的氨基酸；(j)(a)到(f)任何一個(gè)突變體的鹽或亞型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或環(huán)形排列的衍生物。
核酸可以裸核酸分子的形式通過肌肉注射給予。
核酸還可以包含載體序列，如病毒序列，以利于核酸分子編碼的基因在人體內(nèi)表達(dá)，優(yōu)選在適當(dāng)細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)。
因此在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸還包括表達(dá)載體。表達(dá)載體序列是本領(lǐng)域熟知的，可以包含調(diào)控目的基因表達(dá)的元件。表達(dá)載體可以含有調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列、篩選標(biāo)記物序列、復(fù)制起點(diǎn)以及類似序列。因此基因治療方法可用于疾病的治療和/或預(yù)防。比較好的是骨橋蛋白在原位表達(dá)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，表達(dá)載體是豆?fàn)畈《緛碓吹妮d體。豆?fàn)畈《据d體已被證實(shí)用于基因轉(zhuǎn)移是十分高效的，尤其是在CNS內(nèi)。其它已知的病毒載體如腺病毒載體也可用于本發(fā)明中。
可以用靶向性載體以提高骨橋蛋白通過血腦屏障的能力。這種載體可以靶向如運(yùn)鐵蛋白受體或其它內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，表達(dá)載體通過肌肉注射的方式給予。
利用載體誘導(dǎo)和/或增加在正常情況下骨橋蛋白表達(dá)停止或骨橋蛋白表達(dá)量不足的細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性骨橋蛋白的表達(dá)也是本發(fā)明所涉及的范圍。載體含有調(diào)節(jié)骨橋蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。這種調(diào)節(jié)序列可以是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。將調(diào)節(jié)序列通過同源重組插入到基因組的適當(dāng)位點(diǎn)，人為的使調(diào)節(jié)序列與要誘導(dǎo)或要增強(qiáng)表達(dá)的基因相連。該技術(shù)通常被稱為“內(nèi)源性的基因活化(EGA)”，見WO 91/09955的描述。
本發(fā)明還涉及利用經(jīng)過基因改造的細(xì)胞產(chǎn)生骨橋蛋白用于制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物。
本發(fā)明還涉及能產(chǎn)生用于制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物-骨橋蛋白的經(jīng)過基因改造的細(xì)胞。因此細(xì)胞治療方法也可用于將藥物運(yùn)送到人體的適當(dāng)位置。
本發(fā)明還涉及藥用組合物，特別使用于預(yù)防和/或治療神經(jīng)疾病的藥用組合物，該組合物含有有效治療量的骨橋蛋白和有效治療量的干擾素，還可以選擇添加有效治療量的免疫抑制劑。
術(shù)語(yǔ)“藥用的”的意思包括任何載體，這些載體不會(huì)干擾活性組分生物學(xué)活性的效果，對(duì)于所給予的宿主也沒有毒性。例如，對(duì)于胃腸道外給藥途徑來說，活性蛋白質(zhì)可以制成包含在載體如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液中的適于注射的單位劑量形式。
根據(jù)本發(fā)明，藥用組合物的活性成分可以通過各種途徑給予個(gè)體。給藥途徑包括真皮內(nèi)注射、皮下埋植(即緩釋形式)、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、口服、硬腦膜外注射、滴眼、鞘內(nèi)注射、直腸內(nèi)給藥以及鼻內(nèi)給藥、其它任何有效的給藥途徑都可以使用，如通過上皮組織或內(nèi)皮組織吸收，或通過基因治療，其中編碼活性藥物的DNA分子注射給病人(如通過載體)使活性藥物在體內(nèi)表達(dá)和分泌。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以和生物活性藥物其它組分如藥用表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋劑和運(yùn)載媒介一起注射。
對(duì)于胃腸道外給藥途徑(如靜脈、皮下、肌肉注射)來說，活性蛋白質(zhì)可以制備成溶液、懸液、乳劑或凍干粉，這種凍干粉能溶于藥用胃腸外給藥途徑載體(如水、鹽水、葡萄糖溶液)并且含有能維持等滲性(如甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖液)的添加劑。
本發(fā)明所涉及蛋白質(zhì)的生物利用度也可以通過能提高分子在人體內(nèi)半衰期的接合作用來改善，例如在分子上連接聚乙二醇，見PCT專利申請(qǐng)WO 92/13095。
活性蛋白質(zhì)的有效治療劑量根據(jù)各種因素可以變化，其中包括蛋白質(zhì)類型、蛋白質(zhì)的親核性、激動(dòng)劑所表現(xiàn)出的殘留毒性、給藥途徑、病人的臨床狀況(包括希望所要維持的內(nèi)源性骨橋蛋白活性的非毒性水平)。
因此“有效治療劑量”是指給藥后骨橋蛋白能對(duì)神經(jīng)疾病產(chǎn)生積極療效的劑量。給藥劑量，不論單次劑量或重復(fù)給藥劑量，都依賴與各種因素，其中包括骨橋蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)特性、給藥途徑、病人的狀況和特征(性別、年齡、體重、健康狀況、身高)、癥狀的范圍、當(dāng)前的治療措施、治療的頻率及所要達(dá)到的效果。
如上所述，優(yōu)選骨橋蛋白的劑量是約為每千克體重0.0001-10毫克、0.01-5毫克、0.01-5毫克、0.1-3毫克或1-2毫克。更優(yōu)選骨橋蛋白的劑量是約為每千克體重0.1-1000微克、1-100微克或10-50微克。
本發(fā)明優(yōu)選的給藥途徑是皮下注射。更優(yōu)選的是肌肉注射。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，骨橋蛋白每日給藥或隔日給藥。
每日的劑量通常分次給藥或制成緩釋劑型以達(dá)到所預(yù)期的效果。第二次給藥或隨后的給藥可以給予同樣的劑量、小于或大于初次或前次給藥的劑量。第二次給藥或隨后的給藥可以在發(fā)病開始時(shí)或發(fā)病前。
根據(jù)本發(fā)明，骨橋蛋白可以在實(shí)施有效劑量的其它治療方案或給予有效劑量的其它治療藥物(多要治療方案)特別是干擾素前、同時(shí)或以后進(jìn)行預(yù)防性或治療性給藥。與其它治療藥物同時(shí)給予的活性藥物可以在一個(gè)組合物中，也可以在不同的組合物中。
本發(fā)明還涉及治療神經(jīng)疾病的方法，該方法包括給予需要的病人以有效劑量的骨橋蛋白或骨橋蛋白活性激動(dòng)劑，可以選擇性地添加藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及治療神經(jīng)疾病的方法，該方法包括給予需要的病人以有效劑量的骨橋蛋白或骨橋蛋白活性激動(dòng)劑，以及干擾素，可以選擇性地添加藥學(xué)上可接受的載體。
本文所引用的所有文獻(xiàn)，包括雜志的文章或摘要、出版的或未出版的美國(guó)或其它國(guó)家的專利申請(qǐng)，已公布的美國(guó)或其它國(guó)家的專利或其它任何文獻(xiàn)，都已完整地納入本文作為參考，其中包括引用文獻(xiàn)中的所有數(shù)據(jù)、表格、附圖及文字。另外，本文所引用參老文獻(xiàn)內(nèi)的完整內(nèi)容也被全部納入本文作為參考。
對(duì)已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)步驟的參考并不是表示承認(rèn)本發(fā)明的的任何方面、任何描述或?qū)嵤┓绞皆谙嚓P(guān)領(lǐng)域內(nèi)被包括、被指導(dǎo)或被建議。
前面對(duì)特定實(shí)施方式的描述可以全面地闡釋本發(fā)明的基本性質(zhì)，因此，在不需要額外實(shí)驗(yàn)及不背離本發(fā)明的基本概念的前提下，其它人通過運(yùn)用本領(lǐng)域的知識(shí)(包括本文所引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)可以很容易地修改和/或應(yīng)用這些特定實(shí)施方式。
因此，在本文的說明和指導(dǎo)的基礎(chǔ)上可以在所描述的實(shí)施方式等效的范圍內(nèi)進(jìn)行這些應(yīng)用和修改。很容易理解的是本文的措辭和術(shù)語(yǔ)是為了描述而不是限制，因此熟練技術(shù)人員應(yīng)按照本文的說明和指導(dǎo)，結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已有的知識(shí)來闡釋本說明書的措辭和術(shù)語(yǔ)。
根據(jù)到目前所描述的發(fā)明內(nèi)容，可以很容易地理解下面的實(shí)施例，這些實(shí)施例是以說明的方式來提供的，并不意味著對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。
實(shí)施例實(shí)施例1骨橋蛋白在脫髓鞘疾病的體內(nèi)和體外模型中的不同表達(dá)。
方法體外模型系統(tǒng)通過用編碼t-neu癌基因，一種活化的酪氨酸激酶，的復(fù)制子缺失的逆轉(zhuǎn)錄病毒處理少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞而使之永生化建立起Oli-neu細(xì)胞系該細(xì)胞系在培養(yǎng)液中存在1mM雙丁酰環(huán)磷腺苷的情況下能被誘導(dǎo)分化(Jung等，1995)。這就是使以該細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型來研究少突膠質(zhì)細(xì)胞稱為可能。
A2B5鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞來源的鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞系Oli-neu在未處理的條件下與用1-5mM雙丁酰環(huán)磷腺苷預(yù)分化處理6天后相比其細(xì)胞的形態(tài)及抗原性發(fā)生明顯變化。未處理的Oli-neu細(xì)胞是圓形的，與少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞一樣主要呈雙極性，而cAMP處理的細(xì)胞發(fā)生多形性的變化，呈扁平狀，甚至?xí)霈F(xiàn)扁平的伸展的“鞘狀”結(jié)構(gòu)。另外，通過混和皮質(zhì)培養(yǎng)進(jìn)行的體外髓鞘化分析可用于觀察體外功能性髓磷脂。這個(gè)系統(tǒng)使我們有可能研究少突膠質(zhì)細(xì)胞在其它類型的CNS細(xì)胞存在的情況下是如何與軸突接觸并使之髓鞘化的(Lubetzki等，1993)。本系統(tǒng)可用于檢測(cè)影響少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞增殖或少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和存活如影響髓磷脂片段形成的生物因子。研究體外髓鞘化過程的需要導(dǎo)致了一系列分析方法的出現(xiàn)，其中包括聚集腦細(xì)胞培養(yǎng)(Matthieu等，1992)、小腦切片培養(yǎng)(Notterpek等，1993)、以及共培養(yǎng)系統(tǒng)(Shaw等，1996；Barres等，1993)。這些模型的優(yōu)點(diǎn)在于可以研究少突膠質(zhì)細(xì)胞與其它類型細(xì)胞的接觸行為以及這些細(xì)胞是如何被刺激產(chǎn)生髓磷脂的。脫髓鞘現(xiàn)象在這種系統(tǒng)中也可以通過特異性的刺激來觀察，髓鞘再生過程也可用本系統(tǒng)進(jìn)行研究。
體內(nèi)模型系統(tǒng)現(xiàn)在已有各種各樣的多發(fā)性硬化癥的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀４蠖鄶?shù)體內(nèi)模型與經(jīng)典的MS及實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)動(dòng)物模型有關(guān)。對(duì)這種模型也作了許多改進(jìn)，運(yùn)用到各種哺乳動(dòng)物上，其中包括小鼠、大鼠以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物(綜述見Petry等，2000)。另外，模擬MS病毒組分動(dòng)物模型的方法學(xué)已經(jīng)建立，如MS的致腦炎Teiler鼠病毒模型(Dal Canto等，1995)。
研究CNS或PNS髓鞘化的專用動(dòng)物模型是不常見的。這些模型已被證明可用于觀察髓鞘化的發(fā)育過程以便了解其中的少突膠質(zhì)細(xì)胞或施萬(wàn)細(xì)胞的分化、遷移以及增殖機(jī)制，就是所謂的“重演假說”(Franklin和Hinks，1999)。但是要比較CNS或PNS形成過程中發(fā)生的髓鞘發(fā)育和成年后發(fā)生的髓鞘再生就需要制備能特異地觀察髓鞘再生過程的動(dòng)物模型。
Cuprizone模型最著名的并且是應(yīng)用最廣泛的一種髓鞘再生模型是小鼠的Cuprizone髓鞘再生模型。其中包括口服給予一種有機(jī)化合物Cuprizone，這是一種對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞有選擇性毒性的銅鰲合劑(Morell E T，1998)。
Cuprizone處理小鼠的胼胝體會(huì)出現(xiàn)脫髓鞘化和髓鞘再生現(xiàn)象。這些病理學(xué)變化可以通過抗-CNPase抗體和MBP抗體染色觀察到。髓磷脂可以用Luxol Fast Blue-高碘酸Schiff(LFB-PAS)染色。能使髓鞘再生的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞可以通過PDGFα受體或NG2的抗體染色來觀察。
給予小鼠3-5周的Cuprizone就可以導(dǎo)致小鼠胼胝體出現(xiàn)廣泛的脫髓鞘現(xiàn)象。Cuprizone給藥3周后，與脫髓鞘現(xiàn)象相伴隨的是髓磷脂特異性基因轉(zhuǎn)錄子的合成增加(Morell等，1998)。
停止給予Cuprizone能創(chuàng)造一個(gè)有利于恢復(fù)的環(huán)境，因此停止Cuprizone給藥6周后，小鼠的胼胝體出現(xiàn)廣泛的髓鞘再生現(xiàn)象。因而Cuprizone模型提供了一個(gè)完整的研究脫髓鞘和髓鞘再生的體內(nèi)模型。其優(yōu)點(diǎn)在于CNS組織內(nèi)無T細(xì)胞侵潤(rùn)，因此可以比較專一地研究髓鞘化過程，并且結(jié)果的重復(fù)性較好(Hiremath等，1998)。
Cuprizone處理的小鼠用C57BU6雌性鼠(8周齡，20±3g)，共分為6組，每組6只。
第1組對(duì)照組，喂養(yǎng)正常的粉狀飼料；第2組喂養(yǎng)3周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料(Cup3w)；第3組喂養(yǎng)5周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料(Cup3w)；第4組喂養(yǎng)5周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料，然后喂養(yǎng)1周的正常粉狀飼料(1wR)；第5組喂養(yǎng)5周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料，然后喂養(yǎng)3周的正常粉狀飼料(3wR)；第6組喂養(yǎng)5周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料，然后喂養(yǎng)6周的正常粉狀飼料(6wR)；在預(yù)定的處理時(shí)間結(jié)束時(shí)收集每組動(dòng)物的腦組織。小鼠首先被麻醉后通過左側(cè)腦室灌注。取腦組織后在胼胝體-紋狀核(紋狀體)及海馬回水平上制作一系列的皮質(zhì)切片。腦組織切片用石蠟包埋進(jìn)行免疫組化檢測(cè)和原位雜交。
組織學(xué)組織的制備1個(gè)體積的甲醛(Fluka，36％p.a.)和1個(gè)體積的無菌PBS用8個(gè)體積的無菌水稀釋制備成福爾馬林溶液。將10ml PBS加入到蠕動(dòng)泵能適用的能安裝20G、1-1/5針頭的硅管內(nèi)，然后連續(xù)地加入40ml福爾馬林，小心加入以避免形成氣泡。
在賁門內(nèi)灌注固定劑以便進(jìn)行隨后的器官和組織的組織學(xué)分析前，用無菌PBS1∶1稀釋的濃度為3mg/100ml的戊巴比妥鈉(Sanofi)麻醉動(dòng)物。每只鼠腹膜內(nèi)注射0.05ml(0.75mg/kg)。一旦動(dòng)物出現(xiàn)昏睡就用針頭(25G 5/8needles)穿過皮膚將動(dòng)物的四肢固定在泡沫聚苯乙烯板上。用酒精清潔每只動(dòng)物的腹部，用無菌剪在外皮的水平上切開皮膚。然后向右側(cè)和左側(cè)進(jìn)一步切開。用一副鑷子提起外皮，切開對(duì)角以露出腹膜，在與切口垂直的方向上再向兩側(cè)切開以暴露胸腔正中跳動(dòng)的心臟。用鑷子提起心臟，立刻切開右心房，讓血液流出。讓10ml PBS和40ml福爾馬林循環(huán)流過每只小鼠。每只動(dòng)物的腦和脊髓小心取下后放置到裝有10ml福爾馬林溶液的50ml硅管中浸泡2小時(shí)。然后用10ml無菌PBS替換福爾馬林溶液，置于4℃過夜。然后再更換PBS溶液置于4℃數(shù)小時(shí)。
腦半球和脊髓切成約0.5cm切片，置于包埋機(jī)配套的塑料盒中。腦和脊髓的石蠟包埋用自動(dòng)的Tissue Tek Vacuum Infiltration Processor E150/E300(MilesInc.Diagnostics)按照下列程序進(jìn)行50％乙醇中30分鐘70％乙醇中60分鐘60％乙醇中60分鐘80％乙醇中60分鐘80％乙醇中90分鐘96％乙醇中30分鐘96％乙醇中90分鐘96％乙醇中120分鐘100％二甲苯30分鐘100％二甲苯60分鐘石蠟中孵育4次，每次60分鐘，最后一次用于包埋。
所有的溶液都維持在40℃，石蠟維持在65℃。一旦組織切片準(zhǔn)備好，就將腦和脊髓的切片按照預(yù)定的方位放置到制備石蠟包埋塊的塑料盒內(nèi)。導(dǎo)入石蠟液體，置于冷卻板上使其快速冷卻到0℃。石蠟塊在切片機(jī)上切成5-10μm的切片。然后將切片放置到硅烷處理的玻璃載玻片上(SuperFrost-PlusTM，Menzelcat.no.041300)。切片放置好以后將載玻片置于無塵的環(huán)境中。
細(xì)胞培養(yǎng)Oli-neu鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞系(Oli-neu)細(xì)胞通過離心富集，然后重懸于Sato培養(yǎng)液中(Trotter等，1989)。細(xì)胞在75ml培養(yǎng)瓶中置于37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)液中直接加入1mM dbcAMP使其分化。用Trizol試劑提取RNA(見下)。
RNA提取用Trizol提取試劑盒(Life Technologies AG，巴塞爾，瑞士)從cuprizone處理的鼠腦切片及不同發(fā)育階段的出生后小鼠的全腦中提取總RNA。然后用QiagenOligotexTMcolumns(QIAGEN Inc.，28159 Stanford Avenue，Valencia，CA 91355，USA)從總RNA樣品中制備多聚(A)+RNA。
利用cDNA芯片進(jìn)行DGE分析芯片實(shí)驗(yàn)是在Incyte Genomics(Incyte Genomics Inc.，3160 Porter Drive，Palo A1to，California 94304，USA)進(jìn)行的。利用Incyte的鼠GEMTM1基因表達(dá)芯片進(jìn)行DGE分析(http//www.incyte.com/reagents/gem/products.shtml).
用于這些分析實(shí)驗(yàn)的Incyte芯片加載了8734個(gè)基因的相應(yīng)cDNA分子，包括已知的和未知的(EST序列)。Incyte的技術(shù)可以使每種基因的微量樣品點(diǎn)到一個(gè)芯片上。已知基因或EST相應(yīng)的每一種cDNA分子的長(zhǎng)度為500-500bp。Incyte的說明書給出的一個(gè)樣品中每種mRNA的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為2-2000pg。每次芯片實(shí)驗(yàn)所需要的RNA量為600ng多聚(A)+RNA。可檢測(cè)的差異表達(dá)水平是比例大于1.75。
信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化和表達(dá)水平的確定兩種熒光強(qiáng)度的比例定量地提供了被分析的兩個(gè)細(xì)胞樣品內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)水平。每種基因的比例是在標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平的基礎(chǔ)上計(jì)算出來的。標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)是通過將第二個(gè)樣品(P2)的總表達(dá)量除以第一個(gè)樣品(P1)而得到的。這個(gè)系數(shù)可被用于計(jì)算P2中每個(gè)基因的表達(dá)水平。一旦經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化步驟，基因比例就可以按照下列規(guī)則來計(jì)算E1代表樣品1中給定基因的表達(dá)水平，E2代表樣品2中同一基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平；如果E2＞E1，則比例＝E2/E1，否則比例＝-E1/E2。
由于樣品的雜交是競(jìng)爭(zhēng)性的同時(shí)進(jìn)行的，因此Incyte芯片技術(shù)在確定表達(dá)量的相對(duì)變化方面是比較精確的，但在測(cè)量絕對(duì)表達(dá)水平方面就不太可信。然而，可以用這些表達(dá)水平值來比較樣品RNA群體對(duì)，這些樣品RNA群體實(shí)際上沒有在芯片上進(jìn)行比較。這種原位比較不十分可信，但它們可提供額外的機(jī)制信息，這些信息可用于被測(cè)定的系統(tǒng)。
結(jié)果用于分析骨橋蛋白不同表達(dá)水平的模型表IV所列的是各種模型，用于如上所述的mRNA提取和芯片雜交(DGE分析)。
表IV用于DGE分析的模型
DGE陽(yáng)性對(duì)照髓磷脂特異性基因的調(diào)節(jié)作為陽(yáng)性對(duì)照，如果髓磷脂特異性基因的不同調(diào)節(jié)能用DGE來分析則首先檢測(cè)它。
表V所列的是Incyte芯片上髓磷脂特異性基因的調(diào)節(jié)。每個(gè)基因的不同表達(dá)水平值都是cuprizone治療3周和5周后得到的。這個(gè)數(shù)據(jù)是陽(yáng)性對(duì)照以證明芯片的可靠性。由于在我們的實(shí)驗(yàn)條件下髓磷脂結(jié)構(gòu)基因的調(diào)節(jié)是已被很好特征化的，因此在芯片上所觀察到的這些基因的表達(dá)可用于說明，a)該技術(shù)的準(zhǔn)確度，和b)我們模型的可重復(fù)性。
表V基因芯片分析髓磷脂體內(nèi)模型中髓磷脂特異性基因在體內(nèi)的調(diào)節(jié)。
*出生后2/10天的小腦上表顯示的是某些髓磷脂特異性基因是如何被調(diào)節(jié)的，所用的分析方法是RNA基因芯片，所用的RNA來源于不同的研究脫髓鞘、髓鞘再生以及髓鞘發(fā)育體內(nèi)動(dòng)物模型。這些髓磷脂特異性基因表達(dá)的變化說明可以利用基因芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平研究髓鞘化過程。
Cuprizone處理3周后在鼠腦內(nèi)的特定區(qū)域可以觀察到脫髓鞘效應(yīng)。因此在3周的時(shí)候預(yù)計(jì)可以檢測(cè)到與髓磷脂合成和/或髓磷脂維持相關(guān)的各種基因的下調(diào)表達(dá)。通過基因芯片分析所觀察到的髓磷脂特異性基因表達(dá)的下調(diào)可以作為本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)精確度和可靠性的確證。表V中的數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照組相比，cuprizone處理3周后在mRNA水平上MBP表達(dá)下調(diào)13.6倍，環(huán)核苷酸磷酸二酯酶1(CNPase)表達(dá)下調(diào)2.9倍。但是cuprizone處理5周后這兩個(gè)基因RNA水平的表達(dá)只比正常水平分別低1.3倍和1.1倍，說明生物系統(tǒng)在試圖通過促進(jìn)髓磷脂結(jié)構(gòu)蛋白的合成來建立髓鞘再生機(jī)制。
骨橋蛋白的不同變化通過芯片分析，cuprizone處理3周時(shí)骨橋蛋白上調(diào)2.2倍，處理5周時(shí)骨橋蛋白上調(diào)2.8倍。
實(shí)施例2通過實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR分析(TagMan)確證骨橋蛋白基因的不同表達(dá)水平方法cDNA模板的制備TagMam分析所用的cDNA模板是用TagMan反轉(zhuǎn)錄試劑(P/N N808-0234)通過反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)從總RNA樣品中制備的。所有的RT反應(yīng)都在100μl體系中進(jìn)行，該體系含有10μl TagMan RT緩沖液，22μl 25mM的MgCl2溶液(5.5mM)，20μl脫氧核苷三磷酸混合物(每種dNTP 500μM)，5μl隨機(jī)引物(2.5μM)，2μlRNA酶抑制劑(0.4U/μl)，2.5μl MultiScribeTM反轉(zhuǎn)錄酶(1.25U/μl)和38.5μl溶于無RNA酶水中的RNA樣品(共1μg)。反應(yīng)在Eppendorf MasterCycler上進(jìn)行，反應(yīng)條件為25℃10分鐘(孵育步驟)，48C30分鐘(反轉(zhuǎn)錄)，以及95℃5分鐘(滅活步驟)。所有合成的cDNA都分裝成20μl的體積儲(chǔ)存在-20℃條件下。
引物的設(shè)計(jì)和確證所有要檢測(cè)的基因和GAPDH基因(對(duì)照的看家基因)的SYBR Green Real Time PCR正向和反向引物都是用PE Biosystems的Primer Express軟件根據(jù)所發(fā)表的序列設(shè)計(jì)的，從Interactiva(InteractivaThe Virtual Laboratory，Sedanstrasse 10，D-89077Ulm)定購(gòu)，濃度為0.02μM。每一引物對(duì)的特異性及最佳濃度都經(jīng)過了驗(yàn)證。基因組DNA的潛在污染通過PCR反應(yīng)監(jiān)測(cè)，該P(yáng)CR反應(yīng)所用的模板為在無RT酶的條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的陰性對(duì)照cDNA樣品。是否存在非特異性的擴(kuò)增是通過在3.5％MetaPhor凝膠或預(yù)成形的NuSieve4％凝膠上進(jìn)行PCR產(chǎn)物的凝膠電泳確定的。
上表所顯示的是基因特異性引物的序列，這些引物用于TagMan分析來確證那些經(jīng)芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)出現(xiàn)變化的基因表達(dá)水平。該表還列出了每一引物對(duì)相應(yīng)的基因名稱及用Primer Express軟件涉及每對(duì)引物時(shí)所依據(jù)的序列的GenBank序列號(hào)。
表VI用于RT-PCR分析的引物
TagMan反應(yīng)SYBR Green Real-Time PCR反應(yīng)體系如下每孔5μl RT產(chǎn)物(0.5ng總RNA)，25μl SYBR Green PCR主混合物(master mix)(Applied Biosystems，CA，USA)和AmpErase Uracil N-糖基化酶(UNG)(0.5U/孔)和20μl引物(300nM)。PCR反應(yīng)條件是50℃2分鐘(AmpErase UNG孵育以消除任何由于去除前面TagMan循環(huán)中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物中摻入的尿嘧啶而造成的污染)，95℃10分鐘(AmpliTag Gold活化)。然后將樣品放入ABI PRISM7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Sequence Detection System)中，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，條件是95℃15秒，60℃1分鐘。反轉(zhuǎn)錄初的cDNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增并確定其CT(閾循環(huán))值。所有的CT值都用看家基因GADPH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如果可能，樣品應(yīng)設(shè)2個(gè)復(fù)孔或3個(gè)復(fù)孔以檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性。通過電泳分析可以看到所有的待測(cè)基因和GADPH都是單一的特異性條帶。
通過循環(huán)閾值(CR)計(jì)算基因表達(dá)的變化利用SYBR Green PCR主混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)原理的基礎(chǔ)在于直接測(cè)量SYBRGreen染料與雙鏈DNA結(jié)合而產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的增加值。這就可以根據(jù)PCR產(chǎn)物增加曲線來定量地計(jì)算出基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)增加量。
某種特定cDNA相對(duì)于對(duì)照樣品的定量是根據(jù)該特異性基因的mRNA所轉(zhuǎn)錄出的cDNA相對(duì)于作為生理參考的校正樣品的量來計(jì)算的。校正值是從對(duì)照或未處理樣品中得到的。某種特定cDNA的相對(duì)量是通過與內(nèi)源性對(duì)照(本例中是GADPH)相比后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化而得到的，并且考慮到各種因素的變化，如用于制備模板cDNA的總RNA的初始濃度和質(zhì)量，以及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率。相對(duì)值的計(jì)算方法如下取各個(gè)樣品進(jìn)行復(fù)制反應(yīng)時(shí)的平均CT值計(jì)算出靶樣品與內(nèi)源性對(duì)照樣品之間平均CT值的差值(CT)，靶基因的CT減去靶基因校正子的平均CT就得到CT，最后，靶基因的相對(duì)值就用2-CT表示，以代表基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的水平。
TagMan反應(yīng)中熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化SYBR Green-雙鏈DNA復(fù)合物熒光信號(hào)是通與被動(dòng)參照或不含模板DNA的陰性對(duì)照反應(yīng)比較而標(biāo)準(zhǔn)化的。實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)中SYBR Green-雙鏈DNA復(fù)合物所發(fā)射的熒光強(qiáng)度除以被動(dòng)參照組所發(fā)射的熒光強(qiáng)度而標(biāo)準(zhǔn)化的。這樣就得到了反應(yīng)的Rn比率(標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告因子)Rn+＝含有包括模板DNA在內(nèi)的所有組分的反應(yīng)的Rn值Rn-＝未反應(yīng)樣品(不包括模板DNA在內(nèi))Rn值Rn＝(Rn+)-(Rn-)，其中Rn+＝(SYBR Green-雙鏈DNA復(fù)合物所發(fā)射的熒光強(qiáng)度)/含有模板的PCR(被動(dòng)參照組所發(fā)射的熒光強(qiáng)度)Rn-＝(SYBR Green-雙鏈DNA復(fù)合物所發(fā)射的熒光強(qiáng)度)/無模板的PCR(被動(dòng)參照組所發(fā)射的熒光強(qiáng)度)從循環(huán)閾值(CT)計(jì)算調(diào)節(jié)的倍數(shù)Rn代表了在一組給定PCR條件下進(jìn)行特異性反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度。循環(huán)閾值這個(gè)參數(shù)表示一個(gè)基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)增加值，代表了該基因的特異性轉(zhuǎn)錄子在試驗(yàn)組cDNA群中豐度。它代表了一個(gè)固定的循環(huán)點(diǎn)，在這點(diǎn)上可以最先檢測(cè)到Rn出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著升高。閾值定義為早期循環(huán)的Rn的平均標(biāo)準(zhǔn)差，再乘以校正因子。循環(huán)閾值這個(gè)參數(shù)可被用于表示基因表達(dá)量的差異。每一個(gè)基因特異性增長(zhǎng)曲線都有一個(gè)特異性的閾值，根據(jù)曲線上的點(diǎn)或循環(huán)就可以計(jì)算出來，在該點(diǎn)上可以檢測(cè)到熒光強(qiáng)度明顯升高到背景水平以上。
所有相對(duì)值的計(jì)算方法如下取各個(gè)樣品進(jìn)行復(fù)制反應(yīng)時(shí)的平均CT值計(jì)算出靶樣品與內(nèi)源性對(duì)照樣品之間平均CT值的差值(CT)，靶基因的CT減去靶基因校正子的平均CT就得到CT，最后，靶基因的相對(duì)值就用2-CT表示，以代表基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的水平。
結(jié)果實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR(TagMan)提供了一種靈敏而且可靠的確定和檢測(cè)基因表達(dá)變化的方法。TaqMan序列檢測(cè)器(ABI PRISM7700序列檢測(cè)系統(tǒng)，AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)集成了PCR分析和硬件/軟件裝置，組成了一個(gè)高通量的核酸定量系統(tǒng)。它結(jié)合了熱循環(huán)、熒光檢測(cè)及程序特異性的軟件，使每一個(gè)循環(huán)中特異性PCR產(chǎn)物的增加量都能被檢測(cè)到。
通過芯片分析找到的幾個(gè)表達(dá)變化很大的基因用TagMan檢測(cè)平臺(tái)得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。在每一個(gè)案例中，所用模型系統(tǒng)的時(shí)間過程都被包括在內(nèi)。這使我們可以收集到更多關(guān)于特異性基因在整個(gè)過程中的行為的數(shù)據(jù)利用TagMan系統(tǒng)可以定量地檢測(cè)基因表達(dá)的變化，該系統(tǒng)通過測(cè)定SYBRGreen染料與雙鏈DNA結(jié)合后產(chǎn)生的熒光直接檢測(cè)PCR產(chǎn)物的增加量，這些雙鏈DNA代表了所要分析的基因的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。某種特定cDNA相對(duì)于對(duì)照樣品的定量是根據(jù)該特異性基因的mRNA所轉(zhuǎn)錄出的cDNA相對(duì)于作為生理參考的校正樣品的量來計(jì)算的。校正值是從對(duì)照或未處理樣品中得到的。某種特定cDNA的相對(duì)量是通過與GADPH相比后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化而得到的，并且考慮到各種因素的變化，如用于制備模板cDNA的總RNA的初始濃度和質(zhì)量，以及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率。
分泌型磷蛋白1(骨橋蛋白)基因表達(dá)的分析是在一個(gè)跨越脫髓鞘/髓鞘再生cuprizone模型的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行的。
Cuprizone髓鞘再生模型中骨橋蛋白表達(dá)的TagMan實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(A)所示。Cuprizone處理3周(3w.Cup.)后鼠前腦內(nèi)骨橋蛋白mRNA的表達(dá)水平上調(diào)18倍，處理5周(5w.Cup.)后上調(diào)25倍。
Cuprizone處理5周后分別停止1、3和6周(5w.cup.+1w，3w.和6w.)，骨橋蛋白的表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果說明骨橋蛋白在模型的脫髓鞘及髓鞘再生過程中發(fā)揮重要作用，因?yàn)槊撍枨蔬^程還在持續(xù)時(shí)髓鞘再生就已經(jīng)開始了。
圖1(B)顯示的是孵育的小腦內(nèi)骨橋蛋白的表達(dá)水平變化結(jié)果。出生后發(fā)育的早期，C4到C8天，是小腦髓鞘化的起始階段，骨橋蛋白的mRNA表達(dá)出現(xiàn)瞬時(shí)上調(diào)。
芯片分析結(jié)果表明cuprizone處理后鼠的前腦內(nèi)骨橋蛋白的表達(dá)上調(diào)。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了cuprizone處理模型的脫髓鞘期和髓鞘再生期都有骨橋蛋白的表達(dá)，顯示cuprizone處理模型的脫髓鞘期骨橋蛋白的表達(dá)出現(xiàn)峰值，而在恢復(fù)期其表達(dá)又下降到接近基線水平。這些結(jié)果列在下面的表VII中。
TagMan分析結(jié)果證實(shí)了cuprizone喂養(yǎng)3周和5周的小鼠腦內(nèi)骨橋蛋白的表達(dá)上調(diào)。
表VIIcuprizone處理模型中骨橋蛋白表達(dá)的TagMan分析結(jié)果
實(shí)施例3RNA印跡確證骨橋蛋白表達(dá)的變化方法雜交的準(zhǔn)備利用鼠多組織Northern雜交實(shí)驗(yàn)(Clontech Labs，1020 East Meadow Circle，Palo Alto CA)分析特定基因的組織表達(dá)特異性。每個(gè)泳道含2μg成年小鼠不同組織的多聚(A)+RNA。體內(nèi)和體外基因表達(dá)的變化分別用不同的雜交實(shí)驗(yàn)來分析。一組雜交都包括從cuprizone處理3周、5周以及處理后1周、3周和6周(最多達(dá)6周)的小鼠腦組織提取的RNA。第二組雜交包括出生后不同時(shí)間的小鼠全腦組織RNA。最后，從雙丁酰-cAMP處理不同時(shí)間的體外培養(yǎng)的Oli-neu細(xì)胞中提取RNA，這些RNA用于第三組雜交。用每種基因的特異性探針進(jìn)行新的雜交以達(dá)到最大的檢測(cè)效率并且使雜交后不均勻洗滌造成結(jié)果變異達(dá)到最小。所有的雜交都進(jìn)行兩次，首先與待測(cè)基因的探針雜交，洗滌后與鼠甘油醛-3-磷酸酯(mGADPH)的探針雜交以控制RNA上樣量的變化。
RNA(10μg/上樣孔)上樣到1.2％變性瓊脂糖凝膠上，該凝膠含有甲醛和5×MOPS(209.27g 3-(N-嗎啉代)-丙磺酸，20.5g醋酸鈉，50mL 0.5M EDTA pH 8.0，溶于5L無菌水中，然后用12M的NaOH將pH調(diào)節(jié)到7.0)。每種RNA樣品都和2μl溴化乙啶(0.01mg/ml)、2μl 5×3-(N-嗎啉代)-丙磺酸(MOPS)、3.5μl 37％甲醛和10μl甲酰胺混和。然后將樣品在65℃加熱10分鐘，迅速置于冰上。2μlRNA上樣緩沖液(50％甘油，1mM EDTA，0.4％溴酚藍(lán)和二甲苯藍(lán))在上樣前立即加入到每個(gè)樣品中。
每個(gè)凝膠在1×MOPS電泳緩沖液(1L＝330ml 37％的甲醛，400ml 5×MOPS，270mlDEPC處理的水)中電泳約3小時(shí)，所用的電壓為5V cm-1(凝膠長(zhǎng)度)。然后在SSC溶液(Terry Brown，UNIT 4.9，Current Protocols，1993[ed.F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith和K.Struhl])中過夜將RNA轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上(HybondTM-N，Amersham Life Sciences，AmershamPlace，Little Chalfont，Buckinghamshire，England HP7 9NA)。通過在紫外燈下觀察膜和凝膠檢查RNA轉(zhuǎn)移的效率。RNA是通過Stratalinker(Stratagene，USA)與膜交聯(lián)的。雜交膜放在兩層Whatman 3MM濾紙中間置于室溫中直到進(jìn)行下一步的雜交實(shí)驗(yàn)。
探針的制備放射性同位素32P標(biāo)記的探針是用凝膠純化的待測(cè)基因cDNA限制性酶切片段(約500～800bp)制備的。DNA片段用HighPrimeTM標(biāo)記系統(tǒng)(Roche Diagnostics AG，Industriestraβe 7，6343 Rotkreuz，瑞士)進(jìn)行32P-dCTP隨機(jī)標(biāo)記，其特異性活性應(yīng)＞109cpm ml-1。未摻入的32P-dCTP用含Sephadex G-25介質(zhì)的Pharmacia NAP-5柱(含有0.15％KathonxCG/ICP Biocide的蒸餾水中的DNA等價(jià))通過離心從探針混合物中去除。
雜交和信號(hào)檢測(cè)用ExpressHybTM(Clontech Labs，1020East Meadow Circle，Palo Alto CA)按照操作說明書進(jìn)行探針雜交。雜交后將膜與HyperfilmTMMP(Amersham PharmaciaBiotech，England)壓在一起放到放射自顯影盒中-80℃曝光。將膜置于無菌H2O/5％SDS溶液中90-100℃孵育10分鐘然后使膜冷卻10分鐘來洗脫曝光后的探針。洗脫的膜用塑料薄膜封存，置于-20℃保存直到再次雜交。
結(jié)果Northern雜交分析以前就被作為一種輔助的確證技術(shù)用在大規(guī)模的基因表達(dá)差異研究中。(Chang等，2000)。其所具有的高敏感性和精確度使之不僅可用于分析給定基因在各種組織中表達(dá)的特異性，而且還可用于比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組基因表達(dá)水平變化的幅度。這使其稱為確證基因芯片分析出的DGE結(jié)果的一種可靠方法。而且，Northern雜交技術(shù)還可以提供與轉(zhuǎn)錄子大小有關(guān)的信息及與可能出現(xiàn)的待測(cè)基因相應(yīng)的選擇性剪切亞型有關(guān)的信息。
本發(fā)明中Northern雜交所用的RNA是從cuprizone處理鼠及對(duì)照鼠腦組織中提取的。這些RNA與放射性標(biāo)記DNA片段雜交，該DNA片段是從Incyte Genomics提供給我們的克隆中制備的。Northern雜交技術(shù)重現(xiàn)TagMan分析所得到的結(jié)果的能力通過鼠骨橋蛋白的放射性標(biāo)記探針與從cuprizone處理鼠的腦組織中分離出的RNA雜交得到證實(shí)。
通過這種方式，可以比較用Northern雜交分析及TagMan分析所得到的cuprizone模型中骨橋蛋白表達(dá)的結(jié)果。
圖3顯示的是插入到pT7T3D-Pac載體中的鼠骨橋蛋白基因的開放閱讀框架，該載體是從Incyte Genomics定購(gòu)的?；疑珔^(qū)代表編碼區(qū)，箭頭代表骨橋蛋白的完整cDNA序列。克隆片段插入到EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間。用HincII和StyI限制性內(nèi)切酶消化該載體切下一個(gè)893bp的片段制備雜交用的探針以分析該基因在組織中的表達(dá)情況。這個(gè)片段經(jīng)過凝膠純化，標(biāo)記后用作探針。
鼠骨橋蛋白的表達(dá)通過Northern雜交進(jìn)行檢測(cè)，雜交所用的RNA來自cuprizone處理鼠模型各個(gè)階段的腦組織，其中包括恢復(fù)期的和未處理對(duì)照組腦組織。首先用鼠骨橋蛋白cDNA的放射性標(biāo)記片段作為探針進(jìn)行雜交，雜交膜曝光后洗滌，然后用鼠GADPH的放射性標(biāo)記片段作為談?wù)俅坞s交。這個(gè)雜交作為陽(yáng)性對(duì)照來說明所觀察到的表達(dá)差異變化基于印跡上各個(gè)泳道中RNA的總量。
Cuprizone處理鼠腦組織中骨橋蛋白的表達(dá)在處理后3周和5周達(dá)到高峰，其中5周時(shí)表達(dá)更高一些。在恢復(fù)期，骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平快速下降，在停止cuprizone處理1周后出現(xiàn)明顯減少。在6周后骨橋蛋白mRNA的水平恢復(fù)到接近正常水平。這個(gè)結(jié)果與用TaqMan分析所得到的cuprizone處理模型中骨橋蛋白表達(dá)水平結(jié)果(見圖1A)實(shí)質(zhì)一致。
實(shí)施例4Oli-neu細(xì)胞中骨橋蛋白表達(dá)的變化。
用TaqMan分析來檢測(cè)cAMP處理的少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oli-neu)中骨橋蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在圖4中。柱1到柱4代表了少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的結(jié)果。與對(duì)照組(值＝1)相比，cAMP處理6小時(shí)(柱1)就會(huì)導(dǎo)致骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平的上調(diào)。cAMP處理2天(柱2)，表達(dá)上調(diào)12倍。延長(zhǎng)處理6天到10天(柱3和柱4)確導(dǎo)致骨橋蛋白mRNA的低水平表達(dá)。通過與cuprizone模型中骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平(柱5和柱6)的比較發(fā)現(xiàn)cuprizone處理3周和5周后前腦內(nèi)骨橋蛋白的表達(dá)水平與cAMP處理2天后少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的骨橋蛋白表達(dá)水平相似。
實(shí)施例5骨橋蛋白在少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)方法Oli-neu細(xì)胞用磷酸鈣沉淀法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。主要過程是在轉(zhuǎn)染前一天將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的oli-neu細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板上(105個(gè)細(xì)胞/孔)。將100μl 250mM的CaCl2溶液與5μg質(zhì)粒DNA混和。將等量的(100μl)添加磷酸鹽(從300mM的pH＝7.05的Na2HPO4和NaH2PO4儲(chǔ)存液中稀釋得到的)的2×HEPES溶液(140mM NaCl，50mM HEPES，pH7.05)加到上述Ca/DNA溶液中。1分鐘后，將混合物緩慢加入培養(yǎng)板內(nèi)，在37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4小時(shí)。然后用新鮮的培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液，細(xì)胞繼續(xù)孵育24-72小時(shí)，然后收獲細(xì)胞用于Western雜交分析。
結(jié)果插入到pDEST12.2載體中的不同鼠橋接素基因構(gòu)建體(pDEST12.2-骨橋蛋白-EGFP，pDEST12.2-骨橋蛋白-His6，pDEST12.2-骨橋蛋白，見圖4-7，和空白載體pCIE-EGFP)轉(zhuǎn)染到oli-neu細(xì)胞中。帶有EGFP尾巴的構(gòu)建體使監(jiān)測(cè)更容易，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，與轉(zhuǎn)染pCIE-EGFP的對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)特異性變化(少突膠質(zhì)細(xì)胞突起增加)，這說明骨橋蛋白誘導(dǎo)鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞株oli-neu向更成熟的形態(tài)變化。骨橋蛋白轉(zhuǎn)染oli-neu細(xì)胞的形態(tài)與髓磷脂形成細(xì)胞少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)十分相似。
這些結(jié)果證明骨橋蛋白在少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)有助于細(xì)胞向髓鞘化的方向發(fā)育，因而提示骨橋蛋白在治療與少突膠質(zhì)細(xì)胞功能喪失有關(guān)的疾病時(shí)具有積極的效果。
實(shí)施例6cuprizone模型中腦內(nèi)特定區(qū)域的骨橋蛋白表達(dá)水平取cuprizone處理模型脫髓鞘及髓鞘再生期間各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)cuprizone處理5周后在脫髓鞘的胼胝體和紋狀體區(qū)域出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上脫髓鞘區(qū)域內(nèi)會(huì)出現(xiàn)明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞再生。為了觀察活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，在一個(gè)連續(xù)的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行CD68染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同樣的表達(dá)模式，說明骨橋蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。
令人感興趣的是在前腦室上分布的細(xì)胞內(nèi)也有骨橋蛋白的表達(dá)。這個(gè)區(qū)域被稱為成年亞腦室區(qū)，含有能分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞。用NG2、PSA-NCAM、PDGFα受體雙染色來觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞內(nèi)骨橋蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例7骨橋蛋白蛋白對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響用t-neu癌基因進(jìn)行永生化處理的鼠初級(jí)少突膠質(zhì)細(xì)胞系(Oli-neu細(xì)胞系)用于本實(shí)驗(yàn)。Oli-neu細(xì)胞系的建立、特性及培養(yǎng)條件參見Jung等(1995)的描述。
本實(shí)驗(yàn)的目的在于用oli-neu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析OPN對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。將細(xì)胞接種到培養(yǎng)板上。在用對(duì)照蛋白或重組蛋白處理前加入無胰島素的培養(yǎng)液使細(xì)胞饑餓24小時(shí)。根據(jù)Alamar藍(lán)染色后所發(fā)出的熒光估計(jì)細(xì)胞數(shù)目。增加值的計(jì)算是基于和IGF1(對(duì)照)標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較。增殖抑制率的計(jì)算是基于與dbcAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較。
材料儀器設(shè)備和軟件Wallac Victor 2多標(biāo)記計(jì)數(shù)器(激發(fā)波長(zhǎng)530-560nm，發(fā)射波長(zhǎng)590nm)Graph Pad Prism軟件試劑oli-neu細(xì)胞系(Eur J Neuro 7125-1265(1995))Alamar藍(lán)(Biosourcelntl.Inc.，Camarillo，CA93012)Sato培養(yǎng)液的成分如下
BioCoat平底板分別用多聚D賴氨酸(356461，Becton Dickinson)；、R3-IGF1(11146，Sigma)；DbcAMP(D-0627，Sigma)包被。
方法用于體外生物分析的細(xì)胞的培養(yǎng)oli-neu細(xì)胞是能在多聚L賴氨酸基質(zhì)上生長(zhǎng)的粘附細(xì)胞。將細(xì)胞接種到BioCoatTM多聚賴氨酸預(yù)包被96孔板上。細(xì)胞每周傳代2-3次。為了傳代，先用PBS洗滌細(xì)胞，然后用PBS加上1mM EDTA使細(xì)胞分離。細(xì)胞在濕潤(rùn)的10％CO2孵箱中培養(yǎng)。
所用的凍存液是含20％FCS和10％DMSO的Sato培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)中所用的oli-neu細(xì)胞傳代不超過16代。所用細(xì)胞的終濃度為96孔板中每孔加入4000個(gè)細(xì)胞，用無胰島素的Sato培養(yǎng)基培養(yǎng)使之饑餓24小時(shí)。
Alamar藍(lán)染色在CO2孵箱中孵育48小時(shí)后，每孔中加入10μl Alamar藍(lán)，繼續(xù)孵育2.5小時(shí)。在530-560nm激發(fā)波長(zhǎng)和590nm反射波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)其熒光強(qiáng)度。培養(yǎng)板最多可在4小時(shí)時(shí)讀數(shù)，最大讀數(shù)可達(dá)1000000相對(duì)熒光單位。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)作為對(duì)照的是100ng/ml R3-IGF-1(陽(yáng)性對(duì)照)、1mM dbcAMP(陰性對(duì)照)、無胰島素的培養(yǎng)液、或100nM煮沸滅活的OPN。實(shí)驗(yàn)樣品分別為1nM，10pM，0.1pM，0.01pM or 100nM的重組骨橋蛋白。對(duì)照樣品和實(shí)驗(yàn)樣品都用無胰島素的Sato培養(yǎng)基稀釋成期望濃度的終體積為50μl的液體然后加入到孔中。Oli-neu細(xì)胞在無胰島素的培養(yǎng)基終生長(zhǎng)24小時(shí)，然后用PBS加1mM EDTA消化收獲細(xì)胞。將細(xì)胞稀釋到300000/ml，每孔加50μl。然后在37℃濕潤(rùn)C(jī)O2孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)。加入10μl Alamar藍(lán)，然后再放入孵箱中培養(yǎng)2.5小時(shí)。每孔取70μl轉(zhuǎn)移到黑色96孔板中，立刻測(cè)定熒光強(qiáng)度。
加入不同劑量的骨橋蛋白后24小時(shí)測(cè)定未分化的oli-neu細(xì)胞的增殖情況，所加入的骨橋蛋白是用昆蟲細(xì)胞(BacOPN)或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(HEK OPN)制備的。用熒光生長(zhǎng)測(cè)定/比色生長(zhǎng)測(cè)定指示劑，Alamar藍(lán)測(cè)定細(xì)胞的代謝活性來量化細(xì)胞的生長(zhǎng)率。該指示劑含有一種氧化-還原指示劑，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)使培養(yǎng)基化學(xué)分解時(shí)可以出現(xiàn)熒光及顏色變化。該試劑及實(shí)驗(yàn)方法見Ahmed等(1994)和美國(guó)專利5,501,959中的描述。
結(jié)果結(jié)果顯示在圖8到圖10中。
桿狀病毒和HEK細(xì)胞表達(dá)的重組骨橋蛋白都表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。將蛋白煮沸降解后會(huì)如預(yù)期的那樣破壞其生物學(xué)活性。加入桿狀病毒表達(dá)的骨橋蛋白(BacOPN)和HEK細(xì)胞表達(dá)的OPN(HEK OPN)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)劑量依賴性的增殖(圖8)，BacOPN的IC50為3.7nM，HekOPN的IC50為0.05nM(圖9)。另外，具有1-168位氨基酸的OPN亞型a的N末端OPN構(gòu)建體(見圖2，N-term.OPN-a)也可以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。用增殖實(shí)驗(yàn)將純化出的蛋白與全長(zhǎng)蛋白作了比較。這種截短的蛋白也是有活性的(10nM，100nM)，見圖10。
實(shí)施例8骨橋蛋白對(duì)混和皮質(zhì)培養(yǎng)物中髓鞘化標(biāo)記物表達(dá)的影響在蓋玻片上生長(zhǎng)的混和皮質(zhì)培養(yǎng)物用Bac OPN(100nM)處理12天，從DIV(體外培養(yǎng)天數(shù))的5天開始到17天結(jié)束。在體外培養(yǎng)的第17天，將培養(yǎng)物固定，然后用抗MBP抗體染色。結(jié)果表明BacOPN蓋玻片與對(duì)照相比具有更多的高度分支的MBP陽(yáng)性少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖11)。另外，雖然在對(duì)照培養(yǎng)物中(圖11A)沒有看到髓鞘化的少突膠質(zhì)細(xì)胞，但OPN處理的培養(yǎng)物(圖B、C和D)中富含少突膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞包裹在軸突周圍，形成髓磷脂片段和結(jié)間段(圖11B和D)。通過對(duì)片段簇計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組沒有片段出現(xiàn)，而三個(gè)不同OPN劑量處理組出現(xiàn)16，22和18個(gè)片段簇。這些結(jié)果說明骨橋蛋白處理皮質(zhì)混和細(xì)胞可以使少突膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)分化表型，這些表型使髓磷脂化少突膠質(zhì)細(xì)胞的特征。
實(shí)施例9MBP ELISA檢測(cè)骨橋蛋白對(duì)混和皮質(zhì)培養(yǎng)物中MBP表達(dá)的影響MBP ELISA方法用于監(jiān)測(cè)OPN和LIF處理的混和皮質(zhì)培養(yǎng)物中MBP蛋白表達(dá)的增加及因此而產(chǎn)生的髓鞘化。
初級(jí)培養(yǎng)材料來源于小鼠胚胎腦組織，這些胚胎是從交配后16天的懷孕NMR1雌性小鼠中分離的。按照Lubetzki等的方法剪開胚胎，用胰蛋白酶消化皮質(zhì)分離出細(xì)胞(包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元前體細(xì)胞)，然后將細(xì)胞接種到多聚L賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中，每孔加入105個(gè)細(xì)胞，體積為50μl。
重組蛋白處理處理所用的是重組蛋白(陽(yáng)性對(duì)照，重組鼠白細(xì)胞抑制因子(LIF)購(gòu)自AMRAD實(shí)驗(yàn)室，濃度分別為1μg/ml、100ng/ml和10ng/ml；桿狀病毒表達(dá)的全長(zhǎng)骨橋蛋白，濃度分別為100nM、10nM和10pM)。所有的蛋白質(zhì)在加到細(xì)胞培養(yǎng)物前都用培養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)濃度。培養(yǎng)物在體外生長(zhǎng)5天然后處理17天。每3天更換一次培養(yǎng)液。
從微孔板上收獲細(xì)胞樣品的操作方法在體外培養(yǎng)17天(DIV17)后將細(xì)胞裂解并收集樣品。細(xì)胞裂解所用的試劑為三倍去污劑緩沖液。
三倍去污劑緩沖液終濃度50ml Tris pH 8.01M50mM8.77g NaCl150mM2ml NaN3(10％) 0.02％5ml SDS 20％ 0.1％10ml NP40 1％5g去氧膽酸鈉 0.5％在使用前將一粒蛋白酶抑制劑(Roche no.1836170)加到三倍去污劑緩沖液中。
將已接種到96孔預(yù)包被培養(yǎng)板中的混和皮質(zhì)培養(yǎng)物的培養(yǎng)基去除。細(xì)胞用50μl1×PBS溫和洗滌兩次，然后每孔中加入50μl三倍去污劑緩沖液。所有含裂解樣品的微孔板都儲(chǔ)存于-20℃直到進(jìn)行下一步的分析。
BCA蛋白質(zhì)測(cè)定Pierce BCA蛋白質(zhì)測(cè)定是一種基于二金雞鈉酸(BCA)的通過比色法檢測(cè)和定量總蛋白質(zhì)的去污劑相容性分析方法。該方法結(jié)合了已知的堿性介質(zhì)中蛋白質(zhì)對(duì)Cu+2到Cu+1的還原作用和利用含二金雞鈉酸的獨(dú)特試劑高敏感性高選擇性地比色檢測(cè)一價(jià)銅陽(yáng)離子(Cu+1)。
本分析方法中紫色反應(yīng)產(chǎn)物是通過BCA與一價(jià)銅離子兩個(gè)分子的鰲合作用形成的。這個(gè)水溶性的復(fù)合物在562nm處有很強(qiáng)的吸收，并且在20μg/ml到2000μg/ml之間蛋白濃度與吸光度值成良好的線性關(guān)系。BCA方法不是一種真正的端點(diǎn)方法一最終顏色繼續(xù)加深，但是隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，顏色深度變化速度放緩到足以在一輪反應(yīng)中完成大量樣品的測(cè)定。據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu)、肽鍵的數(shù)目以及四種氨基酸的存在(半胱氨酸、半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸)對(duì)與BCA形成的顏色有影響。
微孔板法確定總蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)品(BSA濃度2000μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml)和樣品各取25μl加入到微孔板的適當(dāng)孔中?？瞻卓字屑尤?5μl稀釋劑(三倍去污劑緩沖液)(工作范圍20-2000μg/ml)。
200μl工作試劑(50份BCA試劑A和1份BCA試劑B的混合物)加入到每個(gè)孔中。微孔板振蕩30秒，37℃孵育30分鐘。孵育結(jié)束后測(cè)定570nm處的吸光度值。
MBP夾心ELISA96孔平底無菌微孔板(Costar)與1×PBS 1∶5000稀釋的抗MBP抗體(Chemicon，MAB5274)在4℃孵育過夜。每孔中加入50μl稀釋的抗體。
第二天，將微孔板所有孔中的抗體溶液去除，每孔中加入50μl用1×PBS稀釋的1％BSA溶液進(jìn)行封閉。在室溫下封閉1小時(shí)。封閉結(jié)束后用PBS/Tween機(jī)械洗滌3次。
用1％BSA/PBS稀釋樣品和一系列濃度的MBP肽標(biāo)準(zhǔn)品，加入到微孔板中進(jìn)行孵育。100ng/ml的MBP肽儲(chǔ)存液進(jìn)行倍比稀釋。本實(shí)驗(yàn)所用的稀釋度是根據(jù)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出總蛋白含量后確定的。其含量如下100μg；50μg；25μg；12.5μg；6.2μg；3.1μg.
與MBP標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品孵育后，微孔板再用1％BSA/PBS洗滌3次。1％BA/PBS稀釋的抗MBP多克隆抗體與微孔板在室溫下進(jìn)行2小時(shí)的第二次孵育。孵育后再將微孔板用上述的方法洗滌3次。
將羊抗兔生物素(Vector BA-1000，1∶10000)用1％BSA/PBS稀釋，然后每孔中加入50μl，室溫下孵育1小時(shí)。孵育后再將微孔板用上述的方法洗滌3次。
最后一步孵育是用50μl 1×PBS稀釋的鏈親和素連接的辣根過氧化物酶(strep-HRP)(Amersham RPN 1051，1∶8000)。微孔板在室溫下孵育1小時(shí)。
經(jīng)過洗滌后，加入鄰苯二胺二鹽酸(0PD)(Sigma，將1粒溶解到20ml水中配制成的溶液)開始反應(yīng)。通過加入3M HCl或30％H2SO4終止反應(yīng)。用多掃描熒光板閱讀器(multi-scan fluoroplate reader)(Labsystems Multiskan EX)測(cè)定492nm處的光密度值。
結(jié)果如圖12所示，與對(duì)照組相比，DIV17時(shí)bac0PN(10nM)處理的培養(yǎng)物中MBP蛋白的水平增高3倍。這一結(jié)果支持前面所得到的桿狀病毒表達(dá)的OPN對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和髓鞘化具有促進(jìn)效應(yīng)的結(jié)果。
實(shí)施例10骨橋蛋白對(duì)CG4細(xì)胞增殖的影響CG4是一種永生化的大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞系，該細(xì)胞系是從初級(jí)A2B5少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞自然演變而成的。CG4細(xì)胞是一種研究少突膠質(zhì)細(xì)胞分化或存活的常用細(xì)胞系。它具有下列特征●如少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(O2A-樣)一樣具有高增殖活性(GD3、A2B5陽(yáng)性細(xì)胞)；●在條件培養(yǎng)基(含有有效濃度的生長(zhǎng)因子)中培養(yǎng)費(fèi)用低，條件培養(yǎng)基來自于ATCC的B104大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(Louis J.C.等，1992)。
●短期內(nèi)的增殖實(shí)驗(yàn)用確定成分的培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS)(添加FGF2+PDGF)代替B104條件培養(yǎng)基；●在確定成分的培養(yǎng)基中可以被誘導(dǎo)分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞(O4，GalC陽(yáng)性)；●培養(yǎng)基中存在存在FBS時(shí)被誘導(dǎo)分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性)。
傳到35代的CG4細(xì)胞用于測(cè)定兩種骨橋蛋白(大腸桿菌表達(dá)的和昆蟲細(xì)胞表達(dá)的)對(duì)其增殖的影響。R&D系統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)的骨橋蛋白(Cat.441-OP)用于本實(shí)驗(yàn)，在體外用蛋白激酶2(GST融合的)將其磷酸化，60μl的反應(yīng)反應(yīng)體系含有下列成分激酶緩沖液6×Hepes 50mMMgCl210mMDTT 1mM
釩酸鈉0.2Mmβ磷酸甘油25mM樣品緩沖液2×pH6Tris-Cl 0.125甘油20％DTT 0.2M溴酚藍(lán)0.02％ATP混合物(60μM)30μl 600μM的ATP5μl32pATP265μl H2O2加入ATP混合物以啟動(dòng)反應(yīng)，在37℃孵育1小時(shí)。在30℃孵育(加攪拌)90分鐘后將100μl谷胱甘肽瓊脂糖顆粒(Pharmacia)加入到反應(yīng)混和液中，在加入前先有PBS洗滌反應(yīng)混和液以去除蛋白激酶。然后將混合物在室溫下溫和振蕩孵育1小時(shí)。懸液500g離心5分鐘將瓊脂糖顆粒沉淀下來。然后用PBS在4℃將上清液透析過夜。蛋白用BCA(Pierce)定量。
激酶反應(yīng)10μl酪蛋白激酶0.05μg/μl10μl大腸桿菌OPN 0.5μg/μl20μl 50mM Tris-Cl pH810μl激酶緩沖液6×10μl ATP混合物增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)10pM、10nM、100nM的Bac OPN和體外磷酸化的OPN蛋白對(duì)CG4細(xì)胞的增殖作用。如Avellana等(1996)所描述的用BrdU(Amersham)作為讀出器。細(xì)胞培養(yǎng)液分別用70％N1確定成分的培養(yǎng)基(DMEM，含有4.5g/1葡萄糖，2mM谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100pg/ml鏈霉素和1mM丙酮酸鈉，并添加5pg/ml運(yùn)鐵蛋白，100mM四甲烯二胺，30nM亞硒酸鈉和10ng/ml生物素)和30％B104條件培養(yǎng)基(無生物素的N1)(Louis J.C.等，1992)。實(shí)驗(yàn)在多聚鳥氨酸(100μg/ml)處理的24孔板上進(jìn)行，每孔加入3×104個(gè)細(xì)胞。同時(shí)加入10nM BrdU，然后孵育18小時(shí)。固定后用抗BrdU抗體進(jìn)行免疫組化檢測(cè)以觀察細(xì)胞的分裂情況。細(xì)胞液可用Hoechst44432(Sigma)染色以計(jì)數(shù)總的細(xì)胞數(shù)目。照相后用Leica QWin圖象分析系統(tǒng)分析所得到的照片。
結(jié)果結(jié)果描述在圖13中。
桿狀病毒表達(dá)的骨橋蛋白可以使CG4細(xì)胞的增殖能力提高。盡管100nM的OPN也可以使細(xì)胞增殖，但最大效應(yīng)出現(xiàn)在OPN為10nM時(shí)。經(jīng)過體外的磷酸化，大腸桿菌表達(dá)的OPN也可以使CG4細(xì)胞出現(xiàn)微小的增殖。
將OPN處理的CG4細(xì)胞形態(tài)與未處理的做了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPN處理的細(xì)胞大部分都出現(xiàn)的分化，而未處理的細(xì)胞沒有觀察到分化現(xiàn)象。用桿狀病毒表達(dá)的OPN處理細(xì)胞的分化現(xiàn)象更明顯，而經(jīng)體外磷酸化的大腸桿菌OPN也可以使CG4細(xì)胞出現(xiàn)分化(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例11骨橋蛋白在MOG誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎小鼠模型上的效應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康墓菢虻鞍?OPN；AS900011)是一種具有多種功能的細(xì)胞因子，其中包括對(duì)各種類型細(xì)胞的黏附、遷移、分化、存活及細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)。利用差異基因表達(dá)技術(shù)對(duì)OPN進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)髓鞘再生和少突膠質(zhì)細(xì)胞功能的效應(yīng)(見實(shí)施例1)。重組的桿狀病毒表達(dá)的OPN(AS900011)可以劑量依賴的方式促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖(IC503.7pM，見實(shí)施例7)。另外，AS900011還具有使CG4細(xì)胞和初級(jí)神經(jīng)球分化的作用(見實(shí)施例8)。Cuprizone處理鼠腦部脫髓鞘的胼胝體區(qū)域有OPN的表達(dá)，其中小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)最強(qiáng)(見實(shí)施例1)。另外，在亞腦室區(qū)(SVZ)也觀察到了OPN的表達(dá)，以前的研究已經(jīng)證實(shí)這一區(qū)域能產(chǎn)生參與髓鞘化的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(見實(shí)施例4)。從這些結(jié)果中可以推測(cè)出具有多種免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子骨橋蛋白也有調(diào)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的作用。
本實(shí)驗(yàn)的目的在于檢測(cè)OPN對(duì)MOG誘導(dǎo)EAE小鼠模型的治療效果。
試驗(yàn)方法用于本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)EAE模型的方法在Sahrbacher等(1998)描述的說明書中已經(jīng)被采用。對(duì)本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)是按照Italian D.L.于1992年1月27日頒布的86/609/EEC第116號(hào)管理規(guī)程執(zhí)行的。動(dòng)物飼養(yǎng)的場(chǎng)地和設(shè)備是按照EEC委員會(huì)86/609管理規(guī)程設(shè)置的。研究所是被Competent Veterinary Health Authorities授權(quán)的。本說明書涉及動(dòng)物的所有部分已被官方獸醫(yī)批準(zhǔn)。本說明書已被意大利衛(wèi)生部授權(quán)(51/99-B號(hào)令)。
實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)動(dòng)物種類，品系，亞系和性別來源于IFFA CREDO(Saint Germain sur I’Arbresle，F(xiàn)rance)的C57 BL6/JICO雌性小鼠，由Charles River Italia(Calco，Lecco，Italy)提供。
選擇本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的理由C57 BU6/JICO小鼠選為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；該品系小鼠已被文獻(xiàn)證實(shí)對(duì)EAE敏感。
動(dòng)物提供者Charles River Italia S.p.A.
Via Indipendenza，1123885-Calco(Lecco)動(dòng)物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)在實(shí)驗(yàn)開始前至少5天開始飼養(yǎng)。在此期間每天觀察以確定其是否適合于本實(shí)驗(yàn)。
年齡和體重約8周齡；18-22g。
動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)地空調(diào)房間，每籠10只動(dòng)物。
溫度22±2℃相對(duì)濕度55％±10空氣變化約15-20/小時(shí)過濾HEPA 99.99％燈光12小時(shí)輪換(7a.m.-7p.m.)籠子Makrolon籠子，42.5×26.6×15h，每只配備一個(gè)帶不銹鋼蓋的飼料盒。籠子底部是網(wǎng)格狀的。通過網(wǎng)格漏到籠子底部的廢物定期清理。
動(dòng)物鑒別打耳號(hào)。籠子的標(biāo)牌標(biāo)出實(shí)驗(yàn)編號(hào)、劑量組和給藥時(shí)間。
食物Charles River Italia’s feed licensee Mucedola S.r.l.，Settimo Milanese生產(chǎn)的GLP 4RF25 top certificate顆粒狀食物。為了增加生病動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)，從第7天開始每天在籠子底部放置濕的顆粒。生長(zhǎng)廠商提供食物營(yíng)養(yǎng)及污染的分析證明，污染物的含量要在EPA-TSCA(44FR44053-44093，1979年7月26日)建議的范圍之內(nèi)。RBM每年至少再分析兩次動(dòng)物食物內(nèi)的細(xì)菌污染。動(dòng)物隨意進(jìn)食。
水水取自市政主要水系統(tǒng)。水經(jīng)過過濾，并且通過一個(gè)自動(dòng)閥門系統(tǒng)使動(dòng)物隨意飲水。在自動(dòng)供水系統(tǒng)上加裝塑料瓶。定期分析水內(nèi)微生物的含量、重金屬含量、其它物質(zhì)的污染(如溶媒，殺蟲劑)以及其它化學(xué)和物理特征。飲水的可接受限度是根據(jù)EEC 80/778號(hào)管理規(guī)程的要求執(zhí)行的。
可能會(huì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)?zāi)康漠a(chǎn)生干擾的污染物都不應(yīng)該出現(xiàn)在食物和飲水中。
實(shí)驗(yàn)材料含6組氨酸尾巴的鼠骨橋蛋白(AS900011)和mIFNβ。
免疫過程在小鼠左腹部皮下注射(0天)0.2ml乳劑進(jìn)行免疫，該乳劑含有200μg溶于含0.5mg結(jié)核桿菌的完全福氏佐劑(CFA，DIFCO，Detroit，U.S.A.)中的MOG35-55肽(Neosystem，Strasbourg，F(xiàn)rance)。免疫立刻在腹膜內(nèi)注射500ng百日咳毒素(ListBiological Lab.，Campbell，CA，U.S.A.)，毒素溶于400μl緩沖液(0.5M NaCl，0.017％Triton X-100，0.015M Tris，pH＝7.5)中。第2天再再腹膜內(nèi)注射500ng百日咳毒素。第7天，在小鼠右腹部皮下注射溶于CFA中的200μg MOG35-55肽進(jìn)行第二次免疫。大約從8-10天開始，動(dòng)物出現(xiàn)進(jìn)行性的麻痹，從尾巴開始逐漸上升到前肢。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分為7組，每組15只動(dòng)物。所有組動(dòng)物都按照免疫操作說明書用溶于CFA的MOG35-55肽和百日咳毒素進(jìn)行免疫，各組的處理方案如下第1組陽(yáng)性對(duì)照組，OPN溶劑(PBS+0.1％BSA)皮下注射。
第2組陽(yáng)性對(duì)照組mIFNβ(PBS)，皮下注射。
第3組皮下注射1μg/kg骨橋蛋白(AS900011)。
第4組皮下注射10μg/kg骨橋蛋白(AS900011)。
第5組皮下注射100μg/kg骨橋蛋白(AS900011)。
第6組皮下注射1μg/kg骨橋蛋白(AS900011)加上20000U/1只鼠mIFNβ。
第7組皮下注射20000U/1只鼠mIFNβ。
每組動(dòng)物的數(shù)目是能夠準(zhǔn)確評(píng)價(jià)所得到的藥理學(xué)效果的最小數(shù)目。
載體PBS+0.1％BSA用于將骨橋蛋白稀釋到適當(dāng)濃度。PBS用于將mIFNβ稀釋到適當(dāng)濃度。
給藥途徑劑量分別為1、10和100μg/kg的骨橋蛋白(AS900011)以10ml/kg的體積皮下注射。劑量分別為20000U/1只鼠的mIFNβ以200μl/kg的體積皮下注射。第1組皮下注射10ml/kg的PBS+0.1％BSA，第2組皮下注射200μl/PBS/1只鼠。
實(shí)驗(yàn)周期本實(shí)驗(yàn)中各組開始治療的時(shí)間是在每只動(dòng)物的臨床分?jǐn)?shù)1時(shí)，然后連續(xù)治療35天。
給藥劑型化合物和mIFNβ都是以溶于適當(dāng)載體中的溶液形式注射的。按照Sponsor指導(dǎo)手冊(cè)制備各自的制劑。
臨床表現(xiàn)從免疫后7天開始觀察每只動(dòng)物的麻痹出現(xiàn)情況，以臨床分?jǐn)?shù)的形式表示0＝無發(fā)病跡象0.5＝部分尾出現(xiàn)麻痹1＝尾麻痹1.5＝尾麻痹+單側(cè)后肢部分麻痹2＝尾麻痹+后肢弱麻痹或部分麻痹2.5＝尾麻痹+后肢部分麻痹(低位骨盆)3＝尾麻痹+后肢完全麻痹3.5＝尾麻痹+后肢完全麻痹+失禁4＝尾麻痹+后肢麻痹+前肢弱麻痹或部分麻痹5＝垂死或死亡在安靜的室內(nèi)觀察動(dòng)物。每天由技術(shù)人員雙盲監(jiān)測(cè)每個(gè)治療組動(dòng)物的臨床表現(xiàn)，技術(shù)人員不知道每組動(dòng)物治療的情況。
每天測(cè)量動(dòng)物的體重。
由專業(yè)獸醫(yī)師或權(quán)威人士判斷動(dòng)物是否處于痛苦或垂死狀態(tài)。如果需要就人道地處死以使動(dòng)物免受過度的痛苦或折磨。
血樣采集最后一次治療后24小時(shí)，采集每只動(dòng)物的血樣(戊巴比妥麻醉)。按常規(guī)操作分離血清，儲(chǔ)存在-20℃。然后將冷凍的血清送到SPRI確定血清中化合物的濃度。
組織病理學(xué)檢測(cè)在治療結(jié)束后，動(dòng)物用戊巴比妥麻醉，通過左心室灌注4％甲醛進(jìn)行固定。然后小心地分離出骨髓并用福爾馬林固定。脊髓切片用石蠟塊包埋。石蠟塊切片后分別用蘇木精和伊紅檢查炎癥反應(yīng)，用Kluver-PAS(LUXOL速藍(lán)(fast blus)加Periodic Acid Schiff染色)以檢查脫髓鞘情況。
數(shù)據(jù)分析臨床檢測(cè)結(jié)果用每組內(nèi)的分?jǐn)?shù)均值(±SEM)表示。檢測(cè)物的療效與載體處理陽(yáng)性對(duì)照組的療效進(jìn)行比較。組間臨床分值的差異通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行分析，如果有明顯差異再用Wilcoxon配對(duì)檢驗(yàn)分析每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)。體重?cái)?shù)據(jù)的評(píng)價(jià)用單向ANOVA，有明顯差異的數(shù)據(jù)再用Tukey檢驗(yàn)。所用的分析軟件是S-Plus。
結(jié)果本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖14到圖16中。
通過血管周圍炎癥侵潤(rùn)的組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)OPN治療動(dòng)物血管周圍炎癥侵潤(rùn)有減輕的趨勢(shì)，特別是最低劑量組(1μg/kg)的動(dòng)物。IFNβ是一種已知的具有多發(fā)性硬化癥治療效果的化合物，當(dāng)OPN與其聯(lián)合使用時(shí)，比單獨(dú)使用OPN或IFN的治療效果更好(圖14)。
另外，也測(cè)量了脫髓鞘區(qū)域所占的百分率(圖15)。OPN治療組的動(dòng)物其脫髓鞘區(qū)域也有減少的趨勢(shì)。聯(lián)合使用IFN和OPN可以使脫髓鞘區(qū)域明顯減少，甚至比IFN單獨(dú)治療組低很多(圖15)。
圖16總結(jié)了本實(shí)驗(yàn)中在治療結(jié)束時(shí)所觀測(cè)到的臨床分?jǐn)?shù)、炎癥侵潤(rùn)和脫髓鞘區(qū)域。盡管OPN治療組的臨床分?jǐn)?shù)與對(duì)照組相比沒有顯著的降低，但OPN和IFN聯(lián)合治療確實(shí)可以使脫髓鞘區(qū)域明顯減少，與陽(yáng)性對(duì)照干擾素治療組一樣。這一結(jié)果與所觀察到的炎癥侵潤(rùn)及脫髓鞘范圍一致。用OPN和IFNβ治療后這兩個(gè)指標(biāo)都顯著降低(圖16)。
總之，本實(shí)驗(yàn)可以得到下列結(jié)果單獨(dú)皮下注射1、10、100mg/kg的骨橋蛋白(AS900011)不能使血管周圍炎癥侵潤(rùn)和脫髓鞘區(qū)域出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著降低。用mIFNβ治療(20000U/1只鼠，皮下注射)可以誘導(dǎo)血管周圍炎癥侵潤(rùn)降低(55％)和脫髓鞘區(qū)域減少(53％)。當(dāng)相同劑量的mIFNβ與100mg/kg的AS900011聯(lián)合進(jìn)行皮下注射時(shí)，可以觀察到炎癥侵潤(rùn)顯著降低(71％)，脫髓鞘區(qū)域明顯減少(81％)。
在35天(治療結(jié)束時(shí))將動(dòng)物處死收集脊髓后進(jìn)行組織學(xué)分析，所觀察到的數(shù)據(jù)與臨床分?jǐn)?shù)一致。單獨(dú)皮下注射1、10、100mg/kg的骨橋蛋白(AS900011)不能顯著減輕疾病的嚴(yán)重程度。用mIFNβ治療(20000U/1只鼠，皮下注射)可以顯著減輕疾病的嚴(yán)重程度。當(dāng)相同劑量的mIFNβ與100mg/kg的AS900011聯(lián)合進(jìn)行皮下注射時(shí)，可以觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的臨床癥狀緩解。
這些結(jié)果說明骨橋蛋白和mIFNβ聯(lián)合治療可以有效減輕鼠EAE模型的臨床癥狀和病理效應(yīng)，因而可以有效治療多發(fā)性硬化癥。
實(shí)施例12骨橋蛋白對(duì)坐骨神經(jīng)壓迫誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)病的保護(hù)性效應(yīng)縮寫詞CMAP混和肌肉動(dòng)作電位EMG肌電描記法IGF-1胰島素樣生長(zhǎng)因子SC皮下的s.e.m.均值的標(biāo)準(zhǔn)差vs對(duì)前言神經(jīng)病通常是選擇性的，根據(jù)受影響的外周神經(jīng)元類型(如感覺神經(jīng)對(duì)迷走神經(jīng))或神經(jīng)元亞型(小神經(jīng)對(duì)大神經(jīng))的不同而不同。外周神經(jīng)的Axotomy是一種最常用的評(píng)價(jià)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的動(dòng)物模型。創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、神經(jīng)叢損傷記背根神經(jīng)損傷是意外事故最嚴(yán)重的并發(fā)癥。另外，能造成髓磷脂損傷的周圍神經(jīng)壓迫在神經(jīng)疾病中也很常見，如腕管綜合征或與脊柱矯形并發(fā)癥有關(guān)的疾病。Axotomy出現(xiàn)的變化有細(xì)胞死亡、軸突傳導(dǎo)速度下降及損傷神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)的改變等。壓迫造成的損傷可以恢復(fù)，另一個(gè)感興趣的過程與神經(jīng)病變的狀態(tài)有關(guān)(McMahon S.和Priestly J.V.1995)。
細(xì)胞生物學(xué)的一個(gè)基本問題就是損傷或疾病后神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)。功能性的神經(jīng)再生不僅需要軸突的發(fā)芽和延伸，而且還需要有新的髓磷脂合成。髓鞘再生對(duì)正常神經(jīng)傳導(dǎo)的恢復(fù)及保護(hù)軸突免受新的神經(jīng)變性性免疫攻擊是必須的。研究神經(jīng)變性疾病的主要目標(biāo)是最終開發(fā)出能預(yù)防神經(jīng)死亡、維持神經(jīng)元的表型及修復(fù)神經(jīng)元和髓磷脂損傷的干預(yù)措施。已有許多研究致力于解釋axotomized脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元完全再生的分子及細(xì)胞機(jī)制(Fawcett等，1990；Funakoshi等，1993)。損傷所誘導(dǎo)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及相應(yīng)受體的表達(dá)可能在神經(jīng)再生過程中發(fā)揮重要作用。以前的研究已經(jīng)證明各種肽類或非肽類化合物能明顯促進(jìn)神經(jīng)的再生，如胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、ACTH(Lewis等，1993；Strand等，1980)，睪丸酮(Jones，1993)，SR57746A(Fournier等，1993)和4-甲基兒茶酚(Kaechi K等，1993，1995；Hanaoka Y等，1992)。
本實(shí)驗(yàn)的目的在于評(píng)價(jià)不同劑量骨橋蛋白治療小鼠內(nèi)的神經(jīng)再生情況。在本模型中，OPN對(duì)神經(jīng)元及軸突(感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)的存活和再生，對(duì)髓鞘化或巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)的積極療效可以使運(yùn)動(dòng)功能得以恢復(fù)。神經(jīng)再生是根據(jù)感覺運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況及形態(tài)學(xué)研究來評(píng)價(jià)的。因此本研究中電生理學(xué)記錄和組織形態(tài)學(xué)分析同時(shí)進(jìn)行。
材料和方法動(dòng)物84只8周齡的C57bl/6RJ小鼠(levage Janvier，Le Genest-St-Isle，F(xiàn)rance)分為7組(n＝12)(a)載體假處理組；(b)載體神經(jīng)壓迫組；(c)神經(jīng)壓迫/骨橋蛋白組(1μg/kg)；(d)神經(jīng)壓迫/骨橋蛋白組(10μg/kg)；(e)神經(jīng)壓迫/骨橋蛋白組(100μg/kg)；(f)神經(jīng)壓迫/4-甲基兒茶酚組(10μg/kg)；(g)神經(jīng)壓迫/變性骨橋蛋白組(100μg/kg)。
小鼠分組飼養(yǎng)(每只籠子5只小鼠)，置于恒溫(21-22℃)的飼養(yǎng)室內(nèi)，白天和黑夜顛倒(12h/12h)，隨意進(jìn)食和飲水。所有操作都按照研究指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行。
坐骨神經(jīng)的損傷動(dòng)物腹膜內(nèi)注射60mg/kg鹽酸氯胺酮(Imalgéne 500，Rhóne Mérieux，Lyon，F(xiàn)rance)使之麻醉。在大腿中部手術(shù)暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，在離其三根分叉部約5mm壓迫。用止血鉗(1.5mm寬；Koenig；Strasbourg；France)夾住坐骨神經(jīng)90度旋轉(zhuǎn)壓迫兩次，每次30秒。
實(shí)驗(yàn)計(jì)劃及藥物治療在手術(shù)前記錄一次肌電圖(基線)，在手術(shù)后3周內(nèi)每周再記錄一次。
神經(jīng)壓迫手術(shù)的當(dāng)天為0天(D)。手術(shù)后4天內(nèi)不再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
每天幾率動(dòng)物體重和存活率。
從手術(shù)當(dāng)天開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每天皮下注射骨橋蛋白和變性的骨橋蛋白，腹膜內(nèi)注射4-甲基兒茶酚。
在第4周每組處死4只小鼠，分離坐骨神經(jīng)，觀察其形態(tài)學(xué)的改變。
電生理記錄用Neuromatic 2000M電生理記錄儀(EMG)(Dantec，Les Ulis，F(xiàn)rance)記錄電生理信號(hào)。小鼠腹膜內(nèi)注射100mg/kg鹽酸氯胺酮(Imalgéne 500，Rhóne Mérieux，Lyon，F(xiàn)rance)使之麻醉。用加熱燈加熱使其維持正常的30℃體溫，在尾巴上放置一個(gè)接觸溫度計(jì)(Quick，Bioblock Scientific，Illkirch，F(xiàn)rance)控制溫度。
以超極限強(qiáng)度(12.8mA)的電流給予坐骨神經(jīng)一個(gè)0.2ms的刺激后測(cè)量腓腸肌的混和肌肉動(dòng)作電位(CMAP)。記錄動(dòng)作電位的幅度(mV)、潛伏期(ms)和持續(xù)時(shí)間(去極化和復(fù)極化所需要的時(shí)間)。幅度是反映活性運(yùn)動(dòng)單位數(shù)目的指標(biāo)，而遠(yuǎn)端潛伏期間接反映了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)和神經(jīng)肌肉傳遞速率。
形態(tài)學(xué)分析壓迫神經(jīng)后3周進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。每組隨機(jī)挑選4只動(dòng)物用于本實(shí)驗(yàn)。小鼠腹膜內(nèi)注射100mg/kg鹽酸氯胺酮使之麻醉。取5mm的坐骨神經(jīng)片段用于組織學(xué)分析，組織用溶于磷酸緩沖液(pH＝7.4)中的4％戊二醛水溶液(Sigma，L’lsled’Abeau-Chesnes，F(xiàn)rance)固定過夜，戊二醛水溶液使用前保存在30％蔗糖中，于4℃儲(chǔ)存。神經(jīng)在磷酸緩沖液溶解的2％四氧化鋨(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，F(xiàn)rance)固定2小時(shí)，然后用一系列乙醇溶液脫水，再用環(huán)氧樹脂包被。包被的組織置于70℃使之聚合3天。用切片機(jī)切出1.5μm的橫切面，用1％甲苯胺藍(lán)(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，F(xiàn)rance)染色2分鐘，脫水后置于Eukitt上。每個(gè)樣品切20個(gè)切片，用光學(xué)顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)觀察，每個(gè)樣品隨機(jī)取6個(gè)切片用半自動(dòng)數(shù)碼影像分析軟件(Biocom，F(xiàn)rance)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。每個(gè)切片分析兩個(gè)視野。計(jì)算下列參數(shù)變性纖維百分率(每個(gè)視野)和總纖維數(shù)。
數(shù)據(jù)分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Gglobal分析時(shí)用一種因素或重復(fù)測(cè)量對(duì)方差的分析(anova)以及用單向anova和非-參數(shù)實(shí)驗(yàn)(mann whitney實(shí)驗(yàn))。適當(dāng)時(shí)可進(jìn)一步進(jìn)行dunnett實(shí)驗(yàn)。顯著性差異的水平設(shè)定為p＜0.05。結(jié)果以均值的平均標(biāo)準(zhǔn)差(s.e.m.)表示。
結(jié)果經(jīng)神經(jīng)壓迫處理后所有的動(dòng)物都存活下來。一只鼠(神經(jīng)壓迫/載體n°2)死于第7天，2只鼠(載體假處理n°3和N°6)死于第14天，死亡是在進(jìn)行EMG評(píng)價(jià)期間由麻醉造成的。
動(dòng)物體重如圖17所示，整個(gè)實(shí)驗(yàn)中體重增加量在組間存在顯著性差異[F(6，132)＝1.93和p＜0.001；重復(fù)測(cè)量ANOVA]。
在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中所有組的動(dòng)物體重都有所增加。
電生理學(xué)檢測(cè)混和肌肉動(dòng)作電位的幅度(圖18)整個(gè)實(shí)驗(yàn)中CMAP的幅度在組間存在顯著性差異[F(6，18)＝49.185和p＜O.001；重復(fù)測(cè)量ANOVA](圖19)。
神經(jīng)損傷后，所有經(jīng)過神經(jīng)壓迫手術(shù)的動(dòng)物與假處理組的動(dòng)物相比其CMAP幅度明顯下降(p＜0.001；Dunnett實(shí)驗(yàn))。
而且，在第7天和第14天，100μg/kg骨橋蛋白處理組小鼠或10μg/kg 4-甲基兒茶酚處理組小鼠的CMAP幅度比神經(jīng)壓迫/載體組小鼠的CMAP幅度顯著升高(p＜0.05；Dunnett實(shí)驗(yàn))。
神經(jīng)壓迫/載體組與神經(jīng)壓迫/變性骨橋蛋白100μg/kg組之間無顯著性差異。
混和肌肉動(dòng)作電位的潛伏期(圖19)如圖20所示，CMAP的潛伏期在組間存在顯著性差異[F(6，18)＝2.521和p＜0.001；重復(fù)測(cè)量ANOVA]。在第21天，神經(jīng)壓迫組的CMAP潛伏期比假處理組顯著延長(zhǎng)(p＜0.001；Dunnett實(shí)驗(yàn))。而且，10μg/kg和100μg/kg的骨橋蛋白表現(xiàn)出顯著的治療效果，這兩組的CMAP潛伏期比神經(jīng)壓迫/載體組顯著縮短(p＝0.017；Dunnett實(shí)驗(yàn))。
神經(jīng)壓迫/載體組與神經(jīng)壓迫/變性骨橋蛋白100μg/kg組之間無顯著性差異。
混和肌肉動(dòng)作電位的持續(xù)時(shí)間(圖20)CMAP的持續(xù)時(shí)間[F(6，18)＝25.15和p＜0.001；重復(fù)測(cè)量ANOVA](圖20)。
從第7天開始，神經(jīng)壓迫組的CMAP持續(xù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(假處理組對(duì)神經(jīng)壓迫組p＜0.001；Dunnett實(shí)驗(yàn))。而且在第7天，神經(jīng)壓迫/骨橋蛋白100μg/kg組的CMAP持續(xù)時(shí)間比神經(jīng)壓迫/載體組的CMAP持續(xù)時(shí)間明顯縮短(p＜0.001；Dunnett實(shí)驗(yàn))。在第14天和第21天，有三組的CMAP持續(xù)時(shí)間比神經(jīng)壓迫/載體組顯著縮短(a)神經(jīng)壓迫/骨橋蛋白10μg/kg組；(b)神經(jīng)壓迫/骨橋蛋白100μg/kg組；(c)神經(jīng)壓迫/4-甲基兒茶酚10μg/kg組。
然而神經(jīng)壓迫/載體組與神經(jīng)壓迫/變性骨橋蛋白100μg/kg組之間無顯著性差異。
形態(tài)學(xué)分析變性纖維的百分率(圖21)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明每個(gè)區(qū)域內(nèi)變性纖維的百分率在組間存在顯著性差異(p＜0.001；單向ANOVA)(圖22)。所有神經(jīng)壓迫組的變性纖維百分率都顯著增加(p＜0.001，Dunnett實(shí)驗(yàn))。而且神經(jīng)壓迫/治療組的小鼠變性纖維百分率與神經(jīng)壓迫/載體組的小鼠相比顯著降低(p＜0.001；Dunnett實(shí)驗(yàn))。
另外，變性骨橋蛋白(100μg/kg)處理組與骨橋蛋白處理組相比其變性纖維百分率顯著升高(p＜0.001；Dunnett實(shí)驗(yàn))。
纖維總數(shù)(圖22)神經(jīng)纖維切片用光學(xué)顯微鏡觀察，通過Visiolab 2000軟件(Biocom，Paris，F(xiàn)rance)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。每只動(dòng)物分析5個(gè)切片，每個(gè)切片分析兩個(gè)視野。只有功能性髓鞘化的纖維才被計(jì)算機(jī)記錄(所有髓鞘變性的變性纖維不記錄在內(nèi))。
結(jié)論通過神經(jīng)壓迫可以造成很好的周圍神經(jīng)病模型。神經(jīng)被壓迫后大多數(shù)大直徑的神經(jīng)纖維立刻就會(huì)失去功能，由于機(jī)械損傷其CMAP幅度顯著下降。CMAP潛伏期不會(huì)立刻受到影響，但是在21天時(shí)會(huì)延長(zhǎng)，這是由于受次級(jí)的免疫介導(dǎo)的變性作用(巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞)影響小直徑纖維出現(xiàn)變性。CMAP持續(xù)時(shí)間在第7天時(shí)開始延長(zhǎng)，14天達(dá)到高峰，21天時(shí)又恢復(fù)到第7天的水平。這是由于在21天時(shí)壓迫所造成的損傷得以恢復(fù)，另一個(gè)感興趣的過程與神經(jīng)病變的狀態(tài)有關(guān)。在3周時(shí)對(duì)照組的軸突發(fā)芽/再生現(xiàn)象也是很明顯的。
骨橋蛋白對(duì)神經(jīng)壓迫模型鼠具有保護(hù)作用。感覺運(yùn)動(dòng)功能在損傷后7、14和21天時(shí)以劑量依賴的方式明顯恢復(fù)，壓迫后21天的形態(tài)學(xué)分析表明變性纖維的百分率顯著降低，總纖維數(shù)顯著增加。骨橋蛋白作為一個(gè)對(duì)照分子用在本實(shí)驗(yàn)中被證明是有效的，4-甲基兒茶酚和熱滅活的變性O(shè)PN對(duì)功能性或組織學(xué)指標(biāo)無任何有顯著意義的影響。這種對(duì)功能性或組織學(xué)指標(biāo)的正效應(yīng)是由于OPN具有以下效應(yīng)-直接保護(hù)纖維免受次級(jí)免疫介導(dǎo)變性損傷的影響；-加速髓鞘再生和保護(hù)軸突；-加速受損軸突的再生/發(fā)芽；-促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除髓磷脂碎片。
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序列表<110>應(yīng)用研究系統(tǒng)ARS股份公司(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)<120>骨橋蛋白在制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物中的用途<130>037562F1<150>01111296<151>2001-05-17<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>314<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu20 25 30Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro35 40 45Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu50 55 60Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu65 70 75 80Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His85 90 95Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp100 105 110Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu115 120 125Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu130 135 140
Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly145 150 155 160Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg165 170 175Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His180 185 190Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala195 200 205Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser210 215 220Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His225 230 235 240Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu245 250 255His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu260 265 270Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp275 280 285Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His290 295 300Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn305 310<210>2<211>299<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu20 25 30
Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro35 40 45Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Leu Pro Ser Lys Ser Asn50 55 60Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp65 70 75 80His Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val85 90 95Asp Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Aspl00 105 110Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr115 120 125Glu Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg130 135 140Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg145 150 155 160Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser165 170 175His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val180 185 190Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp195 200 205Ser Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser210 215 220His Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn225 230 235 240Glu His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg245 250 255Glu Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val260 265 270
Asp Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser275 280 285His Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn290 295<210>3<211>286<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Asn Ala20 25 30Val Ser Ser Glu Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser35 40 45Lys Ser Asn Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp50 55 60Asp Asp Asp His Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser65 70 75 80Asp Asp Val Asp Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His85 90 95His Ser Asp Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu100 105 110Pro Ala Thr Glu Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr115 120 125Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys130 135 140Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp145 150 155 160Ile Thr Ser His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala165 170 175
Ile Pro Val Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg180 185 190Gly Lys Asp Ser Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu195 200 205Thr His Ser His Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp210 215 220Glu Ser Asn Glu His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys225 230 235 240Val Ser Arg Glu Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met245 250 255Leu Val Val Asp Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe260 265 270Arg Ile Ser His Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn275 280 285<210>4<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4agcctgcacc cagatcctat ag 22<210>5<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5gcgcaaggag attctgcttc t2權(quán)利要求
1.骨橋蛋白在制備促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞系增殖和分化的藥物中的用途，所述骨橋蛋白的多肽序列與SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO1的1到168氨基酸或SEQ ID NO1的1到170氨基酸至少有90％的同一性。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述藥物是用于治療神經(jīng)疾病，選自創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、腦卒中、CNS或PNS的脫髓鞘疾病、神經(jīng)病和神經(jīng)變性性疾病、精神分裂癥和腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中，所述神經(jīng)疾病是由先天性代謝障礙引起的。
4.如上述任一權(quán)利要求所述的用途，其中，所述神經(jīng)疾病是周圍神經(jīng)病。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述神經(jīng)疾病是糖尿病性神經(jīng)病。
6.如權(quán)利要求2所述的用途，其中，所述脫髓鞘疾病是多發(fā)性硬化癥(MS)。
7.如權(quán)利要求2所述的用途，其中，所述神經(jīng)變性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病、亨庭頓舞蹈病和肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述骨橋蛋白是融合蛋白。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述骨橋蛋白與一種能促進(jìn)透過血腦屏障的載體分子、肽或蛋白質(zhì)融合。
10.如權(quán)利要求8或9所述的用途，其中，所述骨橋蛋白是PEG化的。
11.如權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述融合蛋白含有一個(gè)免疫球蛋白(Ig)融合子。
12.上述任一權(quán)利要求所述的用途，其中，所述藥物還含有同時(shí)、相繼或分別使用的干擾素。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中，所述干擾素是干擾素β。
14.核酸分子在制備用于促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞系增殖和分化的藥物中的應(yīng)用，其中，所述核酸分子含有編碼多肽的核酸序列，該多肽含有選自以下的氨基酸序列a)與SEQ ID NO1至少有90％同一性的多肽；b)與SEQ ID NO1的1到168或1到170氨基酸至少有90％同一性的多肽；c)與SEQ ID NO2至少有90％同一性的多肽；d)與SEQ ID NO3至少有90％同一性的多肽；e)(a)-(d)任一項(xiàng)的融合蛋白。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，所述核酸分子還含有表達(dá)載體序列。
16.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其特征在于用于制備基因治療的藥物。
17.經(jīng)過基因改造能產(chǎn)生骨橋蛋白的細(xì)胞在制備用于促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞系增殖和分化的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及骨橋蛋白或骨橋蛋白活性激動(dòng)劑在治療或預(yù)防神經(jīng)疾病中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P25/18GK1939538SQ20061013176
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2002年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月17日
發(fā)明者U·伯斯切特, G·非格, R·西爾瓦拉居, R·帕珀恩, L·伯納斯康尼 申請(qǐng)人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司